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1、10申请公布号CN104152558A43申请公布日20141119CN104152558A21申请号201410389101222申请日20140808201410052601720140217CNC12Q1/68200601C12N15/1120060171申请人苏州红冠庄国药股份有限公司地址215343江苏省苏州市昆山市千灯镇石浦机场路歇马桥富民路89号72发明人党平宋平王瑜杜雨威74专利代理机构昆山四方专利事务所32212代理人盛建德54发明名称鹿牛羊马驴猪动物皮组织DNA的PCR鉴定用引物体系57摘要本发明公开了一种鹿牛羊马驴猪动物皮组织DNA的PCR鉴定用引物体系，该引物体系可一次。
2、性检测多达六个动物物种，达到对常见动物物种基本覆盖的目的；且本发明引物均仅对各自物种目标片段进行特异性扩增，不会与其他物种起反应，因此也能适用于一次PCR反应中导入两种及以上引物对的多重PCR反应，从而能有效缩短实验时间；此外在进行PCR时，使用优化的特定PCR反应体系及反应程序，采用统一PCR检测方法，简化了检测流程，建立了快速高效且特异性高的鉴定方式，从而有效地鉴定鹿皮/鹿皮胶制品的真伪及掺假情况，为鹿皮产品的质量控制提供了现代分子生物学的检测手段；此外该引物体系还能配合相关试剂制成试剂盒，方便使用，同时为工业化生产及应用提供了可能，其应用前景极好。66本国优先权数据51INTCL权利要求。
3、书2页说明书7页序列表5页附图5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书7页序列表5页附图5页10申请公布号CN104152558ACN104152558A1/2页21一种鹿牛羊马驴猪动物皮组织DNA的PCR鉴定用引物，其特征在于由下列引物对组成1对鹿12SRRNA基因进行扩增生成鹿特异性扩增片段的引物对正向引物5CAGCCTTCCTATTGACCCTTAAT3反向引物5CGGCTGTAAAGTTACTTTCGTTG3；2对牛CYTB基因进行扩增生成牛特异性扩增片段的引物对正向引物5GGCCCTCTTACTAATTCTAGCT3反向引物5CCGATGGTGATAT。
4、ATGGGTGTT3；3对羊CYTB基因进行扩增生成羊特异性扩增片段的引物对正向引物5GGCGCCATGCTACTAATTCTTGTT3反向引物5GAGGAAGGGTACAAGTACTAAGAT3；4对马16SRRNA基因进行扩增生成马特异性扩增片段的引物对正向引物5CAAGCTCAACGACACATCTATC3反向引物5CCCTGAAGGTTAAGGTTTGTG3；5对驴16SRRNA基因进行扩增生成驴特异性扩增片段的引物对正向引物5CAAGCTCAACGTCACACATATC3反向引物5CCTGTGTTGGGTTAACAATAGTC3；6对猪16SRRNA基因进行扩增生成猪特异性扩增片段的。
5、引物对正向引物5GCGTTAAAGCTCAACAAATTCAC3反向引物5CCTTTGTGGTTGAGTTGTTTAAC3。2基于权利要求1所述鹿牛羊马驴猪动物皮组织DNA的PCR鉴定用引物的鉴定方法，其特征在于以样品总DNA为模板，利用所述引物对、引物对、引物对、引物对、引物对和引物对分别进行PCR扩增实验，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果；所述样品总DNA模板来自鹿、牛、羊、马、驴和猪物种动物皮组织的混合，或上述各物种动物皮组织产品中的一种。3根据权利要求2所述基于鹿牛羊马驴猪动物皮组织DNA的PCR鉴定用引物的鉴定方法，其特征在于所述PCR扩增实验中的特定PCR反应体系包括下列组分双。
6、蒸水49体积份、10PCR反应缓冲液1体积份、2MMEACH的DNTPS1体积份、25U/L的热启动高效TAQ酶01体积份、经稀释1000倍的总DNA模板1体积份、2M正向引物1体积份和2M反向引物1体积份。4根据权利要求3所述基于鹿牛羊马驴猪动物皮组织DNA的PCR鉴定用引物的鉴定方法，其特征在于所述PCR扩增实验中的特定PCR反应体系包括下列组分双蒸水49L、10PCR反应缓冲液1L、2MMEACH的DNTPS1L、25U/L的热启动高效TAQ酶01L、经稀释1000倍的总DNA模板1L、2M正向引物1L和2M反向引物1L。5根据权利要求2所述基于鹿牛羊马驴猪动物皮组织DNA的PCR鉴定用。
7、引物的鉴定方法，其特征在于所述PCR扩增实验中特定PCR反应程序为依次进行94下预变性3MIN，94变性30S，63退火30S，72延伸45S，进行40次循环，72下延伸10MIN，最后在4下保持1MIN后结束。6根据权利要求2至5中任一权利要求所述基于鹿牛羊马驴猪动物皮组织DNA的PCR权利要求书CN104152558A2/2页3鉴定用引物的鉴定方法，其特征在于所述琼脂糖凝胶电泳结束后判定结果时，判定依据为所述引物对、引物对、引物对、引物对、引物对和引物对分别扩增出的DNA片段大小；其中鹿物种的引物对扩增出的DNA片段大小为376BP；牛物种的引物对扩增出的DNA片段大小为360BP；羊物种。
8、的引物对扩增出的DNA片段大小为231BP；马物种的引物对扩增出的DNA片段大小为586BP；驴物种的引物对扩增出的DNA片段大小为232BP；猪物种的引物对扩增出的DNA片段大小为577BP。7基于权利要求1所述鹿牛羊马驴猪动物皮组织DNA的PCR鉴定用引物的试剂盒，其特征在于包括所述引物对、引物对、引物对、引物对、引物对和引物对。8根据权利要求7所述基于鹿牛羊马驴猪动物皮组织DNA的PCR鉴定用引物的试剂盒，其特征在于所述试剂盒用于单物种总DNA模板进行鹿、牛、羊、马、驴和猪的物种鉴定。9根据权利要求7所述基于鹿牛羊马驴猪动物皮组织DNA的PCR鉴定用引物的试剂盒，其特征在于所述试剂盒用于。
9、多物种混合总DNA模板进行鹿、牛、羊、马、驴和猪的物种鉴定。10根据权利要求7所述基于鹿牛羊马驴猪动物皮组织DNA的PCR鉴定用引物的试剂盒，其特征在于所述试剂盒用于鹿皮产品的真伪及掺假判定。权利要求书CN104152558A1/7页4鹿牛羊马驴猪动物皮组织DNA的PCR鉴定用引物体系技术领域0001本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及鹿、牛、羊、马、驴和猪动物皮组织DNA的PCR鉴定用引物体系及PCR鉴定方法，以及相应的试剂盒，适用于上述六种动物皮组织及其制品的快速检测及鉴定，尤其适用于鹿皮及鹿皮胶的快速防伪鉴定。背景技术0002鹿皮是我国的传统中药，药用历史悠久。早在本草纲目中就有鹿皮“补气。
10、，涩精，敛疮”功效的记载；四川中药志中也记载了其“能补气，涩虚滑，治妇女白带，血崩不止，肾虚滑精，涂一切疮”。以梅花鹿或马鹿的皮为原料加工精制而成的鹿皮胶富含多种氨基酸与微量元素，具有补血止血、补肾壮阳等多种营养保健作用。北京市中药炮制规范描述鹿皮胶味咸，性温，归肝，肾经，主治补气，涩虚精，强筋健骨，可用于身体瘦弱，腰酸耳鸣，头晕目眩，虚弱久咳，痰中带血，虚喘气短，妇女经血不调，崩漏带下，性偏于温，既能补阳，又可滋阴补血、止血。0003利用现代技术测定鹿皮胶成分张潇予，徐厚平，刘代成，鹿皮胶的成分分析，山东师范大学学报，2010，254，发现其中包括8种必需氨基酸，包括赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸。
11、、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸，均为人类不能自身合成的必需氨基酸，对于身体发育、新陈代谢都具有重要作用。将鹿皮胶的氨基酸组成与阿胶即驴皮胶进行对比，结果显示二者基本一致。这些都说明鹿皮胶与阿胶一样，具有很大的药用保健价值及市场价值。然而对鹿皮产品完整的科学数据，特别是特型鉴定方面的数据尚无处可查，尤其是当鹿皮、驴皮等原材料制成皮胶产品后单单利用传统目测及理化分析并不能很有效地判别这些性质十分相似的皮胶样品。0004在这种情况下，利用高科技的技术建立分子生物学鉴定手段，能够为人们提供经现代科学技术鉴定的高质量鹿皮及鹿皮胶产品。现代分子生物学技术具有可靠、灵敏、快速的特点，尤其是对于干。
12、燥、加热、蒸煮等处理过的样品仍旧能保持检测的准确性。利用聚合酶链式反应PCR技术可以从微量DNA样品中灵敏地扩增出特定的DNA片段，并且通过引物序列的差异来有效保证反应的特异性。因此PCR技术被广泛应用于物种鉴定、检测等领域，在防止假冒、掺假、保证产品质量、维护消费者权益方面发挥了巨大的作用。0005本公司公开号为CN103424546A的中国专利公开了鹿皮胶中所含鹿皮胶特异DNA序列的PCR扩增实验鉴定。目前国内外尚无鹿皮及鹿皮胶PCR鉴定的其他专利/文献可循。另外，对于多个常见物种包括牛羊马驴猪等动物皮组织DNA的PCR同步鉴定方法尚没有建立，例如公开号为CN102747167A的中国专利。
13、采用PCR的方法用于鉴定阿胶，就只是区分了驴皮及马皮/骡皮。这样容易造成物种的漏检，不能有效防止假冒、掺假现象。因此，建立鹿及常见物种动物皮组织DNA的PCR鉴定方法十分必要。0006本公司前期申请的发明专利CN102876805B建立了鹿及猪牛羊马驴兔鸡常见物种动物血液DNA的PCR鉴定技术。但是由于皮肤组织与血液的DNA组成差别巨大，血液中占绝大比例的红细胞不含基因组DNA，仅白细胞含有少量基因组DNA；而皮肤组织中基因组说明书CN104152558A2/7页5DNA占绝大比例，因此DNA成分更为复杂，极易对PCR结果造成干扰。实验检测中也证实了非特异性干扰的存在。因此本发明在前述发明的基。
14、础上，针对鹿及牛羊马驴猪常见物种动物皮组织DNA的PCR条件进行了优化，并且对马、猪两个物种的鉴定引物进行了重新设计及有效性验证。发明内容0007为了克服上述现有技术中存在的不足，本发明提供了一种鹿牛羊马驴猪动物皮组织DNA的PCR鉴定用引物体系，该引物体系及基于该引物体系进行的鉴定方法可快速且高特异性的检测鹿牛羊马驴猪动物皮制品的真伪及其是否有掺假，尤其适用于鹿皮和鹿皮胶产品鉴定与检测，其对常见物种的检测覆盖面广泛，可信度高。0008本发明为了解决其技术问题所采用的技术方案是0009一种鹿牛羊马驴猪动物皮组织DNA的PCR鉴定用引物，由下列引物对组成00101对鹿12SRRNA基因进行扩增生。
15、成鹿特异性扩增片段的引物对0011正向引物5CAGCCTTCCTATTGACCCTTAAT30012反向引物5CGGCTGTAAAGTTACTTTCGTTG3；00132对牛CYTB基因进行扩增生成牛特异性扩增片段的引物对0014正向引物5GGCCCTCTTACTAATTCTAGCT30015反向引物5CCGATGGTGATATATGGGTGTT3；00163对羊CYTB基因进行扩增生成羊特异性扩增片段的引物对0017正向引物5GGCGCCATGCTACTAATTCTTGTT30018反向引物5GAGGAAGGGTACAAGTACTAAGAT3；00194对马16SRRNA基因进行扩增生成马特。
16、异性扩增片段的引物对0020正向引物5CAAGCTCAACGACACATCTATC30021反向引物5CCCTGAAGGTTAAGGTTTGTG3；00225对驴16SRRNA基因进行扩增生成驴特异性扩增片段的引物对0023正向引物5CAAGCTCAACGTCACACATATC30024反向引物5CCTGTGTTGGGTTAACAATAGTC3；00256对猪16SRRNA基因进行扩增生成猪特异性扩增片段的引物对0026正向引物5GCGTTAAAGCTCAACAAATTCAC30027反向引物5CCTTTGTGGTTGAGTTGTTTAAC3。0028本发明通过对鹿、牛、羊、马、驴和猪六个物种。
17、线粒体DNA中的遗传不保守区域基因包括12SRRNA、16SRRNA和CYTB，分别设计了各物种的特异性PCR引物对并进行了实验验证，其仅对相应的物种皮组织总DNA模板有扩增信号，对其他物种没有目的扩增信号，因此能够快速准确的对各物种进行定性检测。本发明的引物对均可通过利用本领域技术人员公知的化学合成方法进行DNA合成技术来获得。0029本发明还提供了一种基于上述鹿牛羊马驴猪动物皮组织DNA的PCR鉴定用引物对的鉴定方法，该方法为以样品总DNA为模板，利用所述引物对、引物对、引物对、引物对、引物对和引物对分别进行PCR扩增实验，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果；所述样品总DNA模板来自鹿、。
18、牛、羊、马、驴和猪物种皮组织的混合，或上述各物种动说明书CN104152558A3/7页6物皮组织产品中的一种。0030所述PCR扩增实验中的特定PCR反应体系包括下列组分双蒸水49体积份、10PCR反应缓冲液1体积份、2MMEACH的DNTPS1体积份、25U/L的热启动高效TAQ酶01体积份、经稀释1000倍的总DNA模板1体积份、2M正向引物1体积份和2M反向引物1体积份。其最优组分为双蒸水49L、10PCR反应缓冲液1L、2MMEACH的DNTPS1L、25U/L的热启动高效TAQ酶01L、经稀释1000倍的总DNA模板1L、2M正向引物1L和2M反向引物1L。0031所述PCR扩增实。
19、验中特定PCR反应程序为依次进行94下预变性3MIN，94变性30S，63退火30S，72延伸45S，进行40次循环，72下延伸10MIN，最后在4下保持1MIN后结束。0032本发明所述鉴定方法中进行琼脂糖凝胶电泳结束后判定结果时，判定依据为所述引物对、引物对、引物对、引物对、引物对和引物对分别扩增出的DNA片段大小；其中0033鹿物种的引物对扩增出的DNA片段大小为376BP；0034牛物种的引物对扩增出的DNA片段大小为360BP；0035羊物种的引物对扩增出的DNA片段大小为231BP；0036马物种的引物对扩增出的DNA片段大小为586BP；0037驴物种的引物对扩增出的DNA片段大。
20、小为232BP；0038猪物种的引物对扩增出的DNA片段大小为577BP。0039本发明还提供了一种基于鹿牛羊马驴猪动物皮组织DNA的PCR鉴定用引物的试剂盒，包括所述引物对、引物对、引物对、引物对、引物对和引物对。可以将本发明所述各引物对以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。其中所述相关试剂可以为本发明中所述的特定PCR反应体系中除了总DNA模板以外的其他试剂；也可以为其他适用的除样品总DNA模板外的试剂，如用于PCR反应的一些常规试剂，或由本领域技术人员经有限次实验得到的常规试剂的组合物等。此外本发明试剂盒中还包括有实施本发明所需的基本用具。0040本发明试剂盒可以是由多个隔断所形成，用以。
21、容纳固定一个或多个如管或小瓶类的容器。这些容器中可以分别装有本发明中各物种的引物对，也可以将各物种的引物对按照一定比例混合成引物对混合物后装于其中，根据实际需要各物种的引物对或引物对混合物可以是冻干形式或者溶于前述相关试剂中的状态。0041本发明所述试剂盒用于单物种动物皮组织总DNA模板进行鹿、牛、羊、马、驴和猪动物皮的物种鉴定。且所述试剂盒用于多物种动物皮组织混合总DNA模板进行鹿、牛、羊、马、驴和猪动物皮的物种鉴定。所述试剂盒尤其适用于鹿皮产品及鹿皮胶产品的真伪及掺假判定。0042本发明的有益技术效果是通过使用本发明的引物体系，可以一次性检测多达六个物种的动物皮组织DNA，达到对常见动物物。
22、种基本覆盖的目的；并且本发明的引物均仅对各自物种的目标片段进行特异性扩增，不会扩增到其它区域且不会与其他物种起反应，因此也能适用于一次PCR反应中导入两种或两种以上引物对的多重PCR反应，从而能有效的缩短实验时间；此外在进行PCR反应时，使用优化的特定PCR反应体系及反应程序，采用说明书CN104152558A4/7页7统一的PCR检测方法，简化了检测流程，建立了快速高效且特异性高的鉴定方式，从而有效的鉴定鹿皮产品及鹿皮胶生物制品的真伪及掺假情况，为鹿皮及鹿皮胶产品的质量控制提供了现代分子生物学的检测手段；此外该引物体系还能配合相关试剂制成试剂盒，方便使用，同时为工业化生产及应用提供了可能，其。
23、应用前景极好。附图说明0043图1是本发明所述六种动物皮组织提取出的总DNA模板的琼脂糖凝胶电泳图；0044图2是以本发明所述鹿12SRRNA基因的引物对作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；0045图3是以本发明所述牛CYTB基因的引物对作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；0046图4是以本发明所述羊CYTB基因的引物对作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；0047图5是以本发明所述马16SRRNA基因的引物对作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；0048图6是以本发明所述驴16SRRNA基因的引物对作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；0049图7是以本发明。
24、所述猪16SRRNA基因的引物对作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；0050图8是以本发明所述各物种动物皮总DNA样品按同体积混合后的混合总DNA样品为模板，使用各物种特异性引物分别与此混合总DNA模板进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；0051图9是以本发明所述鹿牛羊马驴猪各引物对与鹿皮胶产品DNA模板进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；0052其中M代表标准核算分子量标签，图1中该标签自上向下依次为2KBP、1KBP、750BP、500BP、250BP和100BP；图2至图9中该标签自上向下依次为500BP、400BP、350BP、300BP、250BP、200BP、150BP、1。
25、00BP和50BP。具体实施方式0053以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商建议的条件进行。0054一、材料和试剂0055试剂组织总DNA提取试剂盒为BLOODTISSUEKIT，购自QIAGEN公司；热启动高效TAQ酶BLENDTAQPLUS试剂盒购自东洋纺上海生物科技有限公司；DNA标记物为分子量标准50BPDNALADDERMARKER，D2000DNAMARKER购自天根生化科技北京有限公司；琼脂糖购自SIGMA公司；DNA荧光染料GELRED购自BIOTIUM公司；各物种引物序列由生工生物工程上海股份。
26、有限公司合成。0056二、各物种特异性引物的设计0057利用美国国立生物技术信息中心NCBI核酸序列数据库，针对鹿、牛、羊、马、驴说明书CN104152558A5/7页8和猪六个物种的线粒体DNA进行序列比对分析，并选定遗传多变的特定基因目标区域，包括12SRRNA、16SRRNA和CYTB3个基因，针对上述基因各序列上的特异性碱基位点分别设计了各物种的特异性PCR引物对，并经NCBIBLAST数据进行在线比对，用于PCR扩增目的片段，且经实验验证各引物对的有效性及物种特异性。0058各引物如下所述0059对鹿12SRRNA基因进行扩增生成鹿特异性扩增片段的引物对0060正向引物5CAGCCT。
27、TCCTATTGACCCTTAAT3SEQIDNO10061反向引物5CGGCTGTAAAGTTACTTTCGTTG3；SEQIDNO20062对牛CYTB基因进行扩增生成牛特异性扩增片段的引物对0063正向引物5GGCCCTCTTACTAATTCTAGCT3SEQIDNO30064反向引物5CCGATGGTGATATATGGGTGTT3；SEQIDNO40065对羊CYTB基因进行扩增生成羊特异性扩增片段的引物对0066正向引物5GGCGCCATGCTACTAATTCTTGTT3SEQIDNO50067反向引物5GAGGAAGGGTACAAGTACTAAGAT3；SEQIDNO60068对马。
28、16SRRNA基因进行扩增生成马特异性扩增片段的引物对0069正向引物5CAAGCTCAACGACACATCTATC3SEQIDNO70070反向引物5CCCTGAAGGTTAAGGTTTGTG3；SEQIDNO80071对驴16SRRNA基因进行扩增生成驴特异性扩增片段的引物对0072正向引物5CAAGCTCAACGTCACACATATC3SEQIDNO90073反向引物5CCTGTGTTGGGTTAACAATAGTC3；SEQIDNO100074对猪16SRRNA基因进行扩增生成猪特异性扩增片段的引物对0075正向引物5GCGTTAAAGCTCAACAAATTCAC3SEQIDNO1100。
29、76反向引物5CCTTTGTGGTTGAGTTGTTTAAC3。SEQIDNO120077三、各物种动物皮组织总DNA的抽提0078取25MG上述六种动物皮组织样品中的一种，按BLOODTISSUEKIT操作说明进行，最后洗脱下来的200L总DNA样品冻存于20。0079由上述步骤抽提所得各动物物种的总DNA样品进行1WT琼脂糖凝胶电泳实验，并在凝胶中加入GELRED核酸染料进行染色。采用120V电泳40分钟，当溴酚蓝条带迁移至凝胶边缘时停止电泳，则凝胶成像。其中各加样孔上样量为10L。0080所得结果如图1所示。本发明所述各动物皮组织抽提所得的总DNA样品经电泳染色后，可以看出样品DNA均存。
30、在条带弥散的现象，说明DNA存在降解，成分复杂。0081四、各物种特异性引物对进行PCR实验0082采用步骤二中合成所得各动物物种的特异性引物对进行PCR实验，所选用的总DNA模板可以为步骤三中各动物物种的总DNA样品，也可以为将步骤三中所得各动物物种总DNA样品按一定比例混合后的混合总DNA样品。在本发明中，针对所述各物种总DNA样品和混合总DNA样品均在同样的PCR反应系统和同样的PCR反应程序下进行。具体如下所述。0083实施方式一0084以所述各物种总DNA样品为DNA模板说明书CN104152558A6/7页900851各物种总DNA样品的处理将所述六种动物皮组织的总DNA样品各取1。
31、L用DDH2O稀释1000倍，作为总DNA模板，并将引物用DDH2O稀释至2M；00862反应体系的配制在PCR薄壁管中加入如下各反组分，反应体系10L/管。内含双蒸水49L、10PCR反应缓冲液1L、2MMEACH的DNTPS1L、25U/L的热启动高效TAQ酶01L、1中所述总DNA模板1L、2M正向引物1L和2M反向引物1L；其中TAQ酶为热启动高效TAQ酶BLENDTAQPLUS参见TOYOBO公司的说明书。00873PCR反应程序的制定依次进行94下预变性3MIN，94变性30S，63退火30S，72延伸45S，进行40次循环，72下延伸10MIN，最后在4下保持1MIN后结束，得P。
32、CR反应产物。008842WT琼脂糖凝胶电泳将3中所得PCR反应产物进行2WT琼脂糖凝胶电泳，凝胶中加入GELRED进行核酸染色，然后120V电泳40分钟，当溴酚蓝条带迁移至凝胶边缘时停止电泳，则凝胶成像。0089所得凝胶成像结果如图2至图7所示。0090其中图2是分别采用六种动物皮组织的总DNA模板，以鹿12SRRNA基因的引物对作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。结果显示鹿物种特异引物对仅对鹿皮组织总DNA模板特异扩增出376BP大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。0091图3是分别采用六种动物皮组织的总DNA模板，以牛CYTB基因的引物对作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。结。
33、果显示牛物种特异引物对仅对牛皮组织总DNA模板特异扩增出360BP大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。0092图4是分别采用六种动物皮组织的总DNA模板，以羊CYTB基因的引物对作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。结果显示羊物种特异引物对仅对羊皮组织总DNA模板特异扩增出231BP大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。0093图5是分别采用六种动物皮组织的总DNA模板，以马16SRRNA基因的引物对作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。结果显示马物种特异引物对仅对马皮组织总DNA模板特异扩增出586BP大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。0094图6是分别采用六种动物皮组织的总。
34、DNA模板，以驴16SRRNA基因的引物对作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。结果显示驴物种特异引物对仅对驴皮组织总DNA模板特异扩增出232BP大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。0095图7是分别采用六种动物皮组织的总DNA模板，以猪16SRRNA基因的引物对作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。结果显示猪物种特异引物对仅对猪皮组织总DNA模板特异扩增出577BP大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。0096通过上述实验及实验结果可知，当上述各物种的单对引物均分别与六种动物皮组织总DNA模板进行PCR实验时，确定该引物对仅对其自身物种的总DNA模板有反应，而对其他五个物种的总D。
35、NA模板没有反应，以单物种DNA模板方式验证了各物种引物的特异性。0097实施方式二0098以所述各物种皮组织总DNA样品按照一定比例混合后的混合总DNA样品为模板00991混合总DNA样品的处理将所述六种动物皮组织的总DNA样品等体积混合，其中每种各占125VOL，所得为混合总DNA样品。取1L该混合总DNA样品并用DDH2O稀释1000倍，作为混合总DNA模板；说明书CN104152558A7/7页1001002反应体系的配制在PCR薄壁管中加入如下各反应组分，反应体系10L/管。内含双蒸水49L、10PCR反应缓冲液1L、2MMEACH的DNTPS1L、25U/L的热启动高效TAQ酶01。
36、L、1中所述混合总DNA模板1L、2M正向引物1L和2M反向引物1L；其中TAQ酶为热启动高效TAQ酶BLENDTAQPLUS参见TOYOBO公司的说明书。01013PCR反应程序的制定该反应程序同实施例一中的反应程序。010242WT琼脂糖凝胶电泳该电泳过程及条件同实施例一中的电泳。0103所得凝胶成像结果如图8所示。该方法以各物种特异性引物分别与皮组织混合总DNA模板进行PCR扩增反应，进一步验证了复杂总DNA模板条件下各物种特异性引物的有效性和特异性。由图8可以看出，各物种特异性引物均能很好的从总DNA混合模板中扩增出其对应物种的特异性大小的条带。0104实施方式三0105以前述动物皮组。
37、织总DNA提取方法提取鹿皮胶总DNA，作为DNA模板；01061DNA样品的处理将所述鹿皮胶总DNA样品用DDH2O稀释1000倍，作为混合总DNA模板；01072反应体系的配制在PCR薄壁管中加入如下各反应组分，反应体系10L/管。内含双蒸水49L、10PCR反应缓冲液1L、2MMEACH的DNTPS1L、25U/L的热启动高效TAQ酶01L、1中所述鹿皮胶总DNA模板1L、2M正向引物1L和2M反向引物1L；其中TAQ酶为热启动高效TAQ酶BLENDTAQPLUS参见TOYOBO公司的说明书。01083PCR反应程序的制定该反应程序同实施例一中的反应程序。010942WT琼脂糖凝胶电泳该电。
38、泳过程及条件同实施例一中电泳。0110所得凝胶成像结果如图9所示。当以鹿皮胶总DNA为模板时，在六个泳道中分别加入各物种特异性引物对，各引物对分别和鹿皮胶总DNA模板进行PCR扩增反应，仅鹿特异性引物对扩增出376BP大小的条带，而其他物种引物对无非特异性扩增。0111根据上述实施例一、实施例二和实施例三中所述的PCR反应体系，本发明所述引物体系可以配合相关试剂制成不同组合的试剂盒，可用于对鹿、牛、羊、马、驴和猪的物种鉴定，尤其适用于用于鹿皮产品及鹿皮胶产品的真伪及掺假判定。说明书CN104152558A101/5页1100010002序列表CN104152558A112/5页120003序列表CN104152558A123/5页130004序列表CN104152558A134/5页140005序列表CN104152558A145/5页15序列表CN104152558A151/5页16图1图2说明书附图CN104152558A162/5页17图3图4说明书附图CN104152558A173/5页18图5图6说明书附图CN104152558A184/5页19图7图8说明书附图CN104152558A195/5页20图9说明书附图CN104152558A20。