根特异性启动子及其用途 【技术领域】
本发明涉及植物遗传工程领域。更具体地，本发明涉及一种植物根特异性表达的启动子序列，含有该启动子的重组核酸序列，构建体和表达系统，及其驱动功能基因在植物根内特异性表达和优先表达的用途。
背景技术
高等植物细胞分化的分子本质是不同基因差异表达的结果，大多数发育调控基因的表达都具有时间性和空间性。时间性是指特定基因的表达是不连续的、短暂的，而空间性便是特定基因具有在生物体内特定部位表达即组织特异性表达(tissue-specific expression)的特性，组织特异性表达包括组织专一性表达(tissue-unique expression)和组织增强性表达(tissue-enhanced expression)，前者是只在特定组织中存在的基因表达，如大豆球蛋白基因等，而后者是指相对其他组织，在特定组织中具有高表达水平的基因表达。
采用分子生物学对农作物进行遗传改良过程中，常常期望插入的外源基因能够限制在特定的组织中表达，而且这一组织应该是外源基因表达最为显著的部位。这有两个重要的原因：首先，相对于整体和持续性表达而言，限制性表达(restricted expression)对于植株自身新陈代谢的影响是最小的；其次，当外源表达蛋白与植株上人或动物的食用部位没有关系时，外源基因最好直接表达在这些食用部位以外的其他部位中，特别是在人或动物摄取外源表达蛋白的后果还不十分清楚的时候，第二条原因显得更为重要。
高等植物根的结构简单、组成稳定，是研究器官发生与发育的良好模式系统，有效的根特异表达启动子是利用将抗病虫基因、抗逆性基因、促进矿物质吸收的基因以及促进特定次生物质代谢的基因等有益目的基因导入农作物并在植物根中驱动表达的必要前提。
目前，已报导的组织特异性的启动子有在叶片、根、花粉绒毡层、胚胎、内皮层、糊粉层以及韧皮部等器官或组织中特异性表达的多种类型地启动子，其中已发现的根特异性启动子还屈指可数，目前已在美国专利局注册的有烟草RB7根启动子(U.S.Pat.No.5459252)，玉米MR7(U.S.Pat.No.5837848)等，此外还有芸苔属植物根特异基因调控序列(U.S.Pat.No.5401836)等与根特异启动子有关的DNA序列。
【发明内容】
发明概述
针对上述现有技术中的需要，本发明人经过长期的探索和大量的研究，最终成功地获得了一种可以驱动功能基因在根内特异性表达或优先表达的启动子序列，并且对其序列和功能进行了深入的研究，从而完成了本发明。
因此，在本发明的一个方面，提供了一种植物根特异性表达的启动子序列或者其功能等价物，变体，或者片段。
在本发明的另一个方面，提供了一种含有上述启动子的重组核酸序列。
在本发明的另一个方面，提供了一种含有上述重组核酸序列的构建体。
在本发明的另一个方面，提供了一种含有上述构建体表达系统。
在本发明的再一个方面，提供了上述的启动子，含有该启动子的重组核酸序列，构建体或表达系统在驱动功能基因在植物根内特异性表达和优先表达方面的用途。
但是，在阅读了以下的“发明详述”，尤其是“实施例”部分的公开内容的基础上，本发明的其它方面和优点对本领域的普通技术人员来说是显而易见的。
【附图说明】
附图1：DcRB7启动子序列。
附图2：植物转化载体示意图。
附图3：植物转化载体的酶切鉴定，其中：M：λDNA/EcoRI+Hind III；1：pCAMBIA-C10/SspI；2：pCAMBIA-C10/Ncol+Hind III；3：pCAMBIA-CE/Ssp I。
附图4：转基因烟草植株GUS基因表达的组织化学染色。
附图5：转基因烟草GUS表达活性在各组织部位的荧光定量分析，其中：1.DcRB7启动子-GUS重组表达载体pCAMBIA-C10；2.干燥处理下的DcRB7启动子-GUS重组表达载体pCAMBIA-C10；3.CaMV35S-GUS重组表达载体pCAMBIA1305.1；4.无启动子的GUS表达载体pCAMBIA-CE；5.无表达载体的对照植株。
发明详述
在本说明书的上下文中，除非特别指明，否则本说明书所用的任何技术术语具有本领域普通技术人员在本领域中通常理解的含义，而未注明具体条件的实验方法是按照常规实验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。
特别是，在本申请的说明书上下文和权利要求书中使用以下的术语具有如下的含义：
“功能等价物”是指在严格的杂交条件下与一个目的DNA分子序列杂交的任何DNA分子，该DNA分子具有类似于所述的目的DNA分子的生物活性。
“严格的杂交条件”是指实验条件为：1，杂交在65℃和5×SSPE(0.75M NaCl，50mM NaH2PO4，5mM EDTA)，0.2％SDS，5×Denhardt(0.1％polyvenylpyrrolidon，0.1％BSA，0.1％ ficoll 400)and 0.2mg/ml鲑精DNA杂交液中进行12小时；2，洗膜条件为68℃，洗膜液I(5×SSC，0.1％SDS)20分钟，洗膜液II(2×SSC，0.1％SDS)洗20分钟，洗膜液III(1×SSC，0.1％SDS)20分钟。
“变体”是指对一个目的DNA序列进行一个或者多个碱基的任何取代，变异，修饰，替换，缺失或者添加所产生的序列，该序列仍然表现出类似于所述的目的DNA序列的活性。
“片段”是指基本DNA序列的一个或者多个区域，其仍然具有类似于基本DNA序列的活性。
“异源基因”在本发明中是指抗病虫基因、抗逆性基因、促进矿物质吸收的基因以及促进特定次生物质代谢的基因等有益基因。
本发明人从胡萝卜胚根cDNA文库中筛选得到一个完整cDNA片断，其DNA序列与烟草根特异表达基因TobRB7(Yamamoto，YT.et al.，1991)的DNA序列同源性达到72％，其推测的氨基酸序列与TobRB7氨基酸序列的同源性达到80％，蛋白结构预测含有6个跨膜区段，并含有水通道蛋白的标志性NPA基序。因此，认为该基因是从胡萝卜中分离得到的一个新的水通道蛋白基因，它命名为DcRB7。
对DcRB7进行Northern杂交分析，结果表明DcRB7基因是一个根特异表达的基因。利用反向PCR的方法，从胡萝卜基因组中获得了DcRB7基因上游的一段DcRB7启动子序列，它包括了从翻译起始密码子ATG上游66bp到-601bp的范围。将这段序列(+48bp至-601bp)通过体外重组整合到植物表达载体，并转化烟草(Nicotiana tabacum L.)NC89。对转基因烟草进行GUS报告基因活性检测后，发现该启动子序列可以驱动功能基因在根内特异性表达或优先表达，具有一定的根特异性驱动活性。
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验方法进行，或按照厂商所建议的操作说明进行。
【具体实施方式】
实施例1：DcRB7启动子片段的获得
一.参照CTAB法(王关林等，1998)提取胡萝卜基因组DNA。
(1)在离心管中加入10ml CTAB提取缓冲液(2％CTAB，1.4M NaCl，20mMEDTA，100mM Tris·HCL pH8.0，0.2％β-mercaptoethanol)，65℃预热；
(2)称取1-2克新鲜叶片，在研钵中用液氮研磨成粉，转入离心管中，边加边搅拌，使之混合均匀；
(3)65℃水浴保温0.5-1小时，中间温和混匀几次；
(4)冷却至室温后，加入的等体积(10ml)氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻缓颠倒混匀10分钟；
(5)室温离心10000rpm，10分钟，去沉淀，上清转入新管中；
(6)上清中加入2/3体积的异丙醇，轻缓颠倒混匀，室温放置10-20分钟；
(7)室温离心10000rpm，10分钟，弃上清；
(8)用2ml 75％乙醇洗涤沉淀两次以除盐；
(9)倒去乙醇，37℃干燥，(约20分钟)溶于60μl TE缓冲液；
(10)加入5μl RNaseA(10mg/ml)，37℃保温30分钟；
(11)等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提1-3次；
(12)室温离心(10000rpm，10分钟)，取上清，转入新管；
(13)加入1/10体积的4 M NaCl(终浓度0.1-4M)，加入两倍体积无水乙醇，室温放置20分钟后，离心10000rpm，5分钟，弃上清；
(14)DNA沉淀用75％乙醇洗涤，2-3次，37℃保温箱中干燥后溶于适量TE缓冲液中-20℃保存备用。
二.反向PCR法获得DcRB7启动子片段
DNA的酶切、电泳、回收、连接、亚克隆以及质粒的提取转化等均参照《分子克隆实验指南(第三版)》(Joseph Sambrook等著，黄培堂等译)描述的方法。模板制备：将胡萝卜基因组DNA用Hind III酶完全消化，在DNA浓度低于2g/ml条件下进行自身环化连接。采用酚∶氯仿抽提连接产物，乙醇沉淀后溶于TE溶液。
PCR反应体系为(试剂皆购于Promega公司)：
模板DNA 2μl
引物(10μM) 1μl
引物(10μM) 1μl
dNTP(10mM) 0.4μl
Mg++(25mM) 1.6μl
10×Buffer 2μl
Taq酶 2unit
ddH2O 11.5μl
总体积 20μl
根据DcRB7的序列设计了四条嵌套引物(由赛百胜公司合成)：
P1：上游外侧5’-gaggcctaacaaattgaagaaga-3’(SEQ ID NO：2)
P2：上游内侧5’-ggctgccaattgatatcttc-3’(SEQ ID NO：3)
P3：下游内侧5’-ctgagtttattgccaccctt-3’(SEQ ID NO：4)
P4：下游外侧5’-ccgaaggtgtagtgtttgagat-3’(SEQ ID NO：5)
以Hind III酶切后自身环化的胡萝卜基因组DNA为模板，以P2、P3为引物进行第一次PCR扩增。反应条件为：
95℃ 5min 1个循环
72℃ 10min 1个循环
以第一次PCR产物为模板，以P1、P4为引物进行第二次PCR扩增。反应条件为：
95℃ 5min 1个循环
72℃ 10min 1个循环
PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确认，大小约为1.3kb的单一片段。将该片段与pGEM-Teasy(promega公司)载体进行体外重组，获得含有DcRB7启动区的克隆pGEM-RP。提取pGEM-RP质粒DNA，进行核苷酸序列测定。
用Hind III和Nco I限制性内切酶消化pGEM-RP，得到的约650bp的片段即为实施例2中所鉴定的启动子片段，它包括了DcRB7基因的上游启动子片段和pGEM-Teasy载体多克隆位点上NcoI到EcoRI的25bp的序列(参见Promega pGEM-T and pGEM-Teasy Vector Systems说明书)。
所获得的启动子序列经过测序，其序列(SEQ ID NO：1)如附图1所示。
实施例2启动子的转基因功能鉴定
一.植物转化载体的构建
用Hind III和NcoI限制性内切酶消化pGEM-RP，回收约650bp的目的片段，同时用Hind III和NcoI限制性内切酶对双元表达载体pCAMBIA1305.1(CAMBIA，Australia)进行消化，回收载体片段，然后将目的片段与载体进行体外定向重组获得克隆命名为pCAMBIA-C10。pCAMBIA-C10是以DcRB7启动子取代pCAMBIA1305.1原有的CaMV35S启动子后获得的植物表达载体。
用EcoRI消化pCAMBIA-C10，回收载体部分，并对载体片段进行自连接，得到克隆pCAMBIA-CE，该载体为GUS报告基因前没有启动子的阴性对照载体(图2)。以SspI、NcoI、Hind III对这两个阳性克隆进行酶切鉴定，NcoI和HindIII消化pCAMBIA-C10，获得约650bp的插入片段；以SspI酶切pCAMBIA-CE可以获得约7.3kb和约4.7kb的片段(图3)。
二.农杆菌侵染烟草叶片外植体及转基因烟草的培育
参照Bevan方法(Bevan，1984)用pCAMBIA-C10、pCAMBIA-CE、pCAMBIA1305.1三种载体分别转化农杆菌EHA105(Hood et al.1993)。将带有pCAMBIA-C10、pCAMBIA-CE、pCAMBIA1305.1的农杆菌通过叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacum L.)NC89(购自中国农科院)，再生获得转基因小植株。
三.GUS基因表达检测
组织化学染色检测：参照Jefferson et al(1987)描述的方法进行，将植株放置于GUS染液(0.1M磷酸钠缓冲液；5mM亚铁氰化钾；5mM铁氰化钾；10mM Na2EDTA；0.5mg/ml X-Gluc)中，在37℃保温数小时至过夜。转入70％乙醇中脱色2-3次，白色背景上的蓝色的部分即为GUS基因表达的结果(见图4)。
荧光定量测定GUS酶活性：参照Jefferson et al(1987)的方法，分别测定待测植株根、茎、叶组织中的GUS活性。参照Bradford(1976)蛋白测定法对植株总蛋白进行测定。测定结果见图5。
结果表明，DcRB7基因上游序列(+48bp至-601bp)通过体外重组整合到植物表达载体，并转化烟草后发现，该启动子序列可以驱动功能基因在根内特异性表达或优先表达，具有一定的根特异性驱动活性。
参考文献：
王关林等，《植物基因工程原理与技术》(第一版)，ISBN 7-03-006452-6，科学出版社，北京，600-601(1998)。
Hood，E.E.，S.B.Gelvin，L.S.Melchers，and A.Hoekema.植物转基因操作的新农杆菌辅助质粒(New Agrobacterium helper plasmids forgene transfer to plants).Transgen.Res.2：208-218(1993)。
Bevan M.，植物转化的双元农杆菌载体(Binary Agrobacterium vectorsfor plant transformation).Nucleic Acids Res.，12，8711-21(1984)。Bradford MM，运用染料结合蛋白原理的一种快速灵敏的测量微克级蛋白的方法(A rapid and sensitive method for the quantitation ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle ofprotein-dye binding).Anal Biochem 7；72：248-54(1976)。
Jefferson，RA.，Kavanagh，TA.，Bevan，MW.，GUS融和物：β-葡萄糖苷酸酶，一种高等植物的灵敏而通用的基因融和标记(GUS fusions：beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusionmarker in higher plants).EMBO J，6，3901-7(1987).
Sambrook，J.，Russell DW.黄培堂等译，分子克隆实验指南(第三版).ISBN 7-03-010338-6，科学出版社，北京，(2002)。
Yamamoto，YT.et al.烟草中指导基因根特异表达的顺式作用元件的描述(Characterization of cis-Acting Sequences Regulating Root-specific Gene Expression in Tobacco).The plant cell.，3：371-82(1991)。
序列表
<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120>根特异性启动子及其用途
<130>I030697
<160>5
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>701
<212>DNA
<213>胡萝卜
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(701)
<223>
<400>1
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<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<221>上游外侧引物
<222>(1)..(23)
<223>
<400>2
gaggcctaac aaattgaaga aga 23
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<221>引物
<222>(1)..(20)
<223>
<220>
<221>上游内侧引物
<222>(1)..(20)
<223>
<400>3
ggctgccaat tgatatcttc 20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<221>下游内侧引物
<222>(1)..(20)
<223>
<400>4
ctgagtttat tgccaccctt 20
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<221>下游外侧引物
<222>(1)..(22)
<223>
<400>5
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