测定D2羟基戊二酸D2HG或D2羟基己二酸的工具和方法.pdf

本发明涉及检测样品中的(D)-2-羟基戊二酸或(D)-2-羟基己二酸的方法，所述方法包括步骤为：a)将样品与试剂混合物接触，其中所述试剂混合物包含:(i)溶剂,(ii)具有氧化态和还原态的染料,其中还原态可以与氧化态区分并且其中染料初始以氧化态存在，(iii)电子转移剂，(iv)(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶，和(v)辅因子；和b)通过测量染料的还原态的生产检测(D)-2-羟基戊二酸或(D)-2-羟基己二酸。本发明还涉及用于诊断和/或监控对象中(D)-2-羟基戊二酸相关的疾病的方法。本发明也涵盖用于诊断对象中的异柠檬酸脱氢酶(IDH)基因中或(D)-2-羟基戊二酸(D2HG)脱氢酶基因中的突变的方法。此外，本发明提供了试剂盒，所述试剂盒包含(i)溶剂,(ii)具有氧化态和还原态的染料,其中还原态可以与氧化态区分并且其中染料初始以氧化态存在，(iii)电子转移剂，(iv)(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶，和(v)辅因子。

1.  检测样品中的(D)-2-羟基戊二酸或(D)-2-羟基己二酸的方法，所述方法包括:
a)将样品与试剂混合物接触，其中所述试剂混合物包含:
(i)溶剂,
(ii)具有氧化态和还原态的染料,其中还原态可以与氧化态区分并且其中染料初始以氧化态存在,
(iii)电子转移剂,
(iv)(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶,和
(v)辅因子；和
b)通过测量染料的还原态的生产检测(D)-2-羟基戊二酸或(D)-2-羟基己二酸。

2.  用于诊断和/或监控对象中(D)-2-羟基戊二酸相关的疾病的方法,所述方法包括:
a)将所述对象的样品与试剂混合物接触,其中所述试剂混合物包含:
(i)溶剂,
(ii)具有氧化态和还原态的染料,其中还原态可以与氧化态区分并且其中染料初始以氧化态存在,
(iii)电子转移剂,
(iv)(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶,和
(v)辅因子；和
b)通过测量染料的还原态的生产检测(D)-2-羟基戊二酸,从而诊断和/或监控所述对象中(D)-2-羟基戊二酸相关的疾病。

3.  权利要求2的方法，其中所述(D)-2-羟基戊二酸相关疾病是选自由弥散性神经胶质瘤、急性髓性白血病(AML)、软骨肉瘤、胆管癌和甲状腺癌组成的组的肿瘤性疾病；或其中所述(D)-2-羟基戊二酸相关的疾病是戊二酸尿症。

4.  权利要求3的方法，其中所述弥散性神经胶质瘤是WHO II级星形细胞瘤(AII)、WHO III级星形细胞瘤(AIII)、WHO II级少突胶质细胞瘤(OII)、WHO III级少突胶质细胞瘤(OIII)、WHO II级少突星形细胞瘤(OAII)、WHO III级少突星形细胞瘤(OAIII)、或继发性成胶质细胞瘤。

5.  诊断对象中异柠檬酸脱氢酶(IDH)基因中或(D)-2-羟基戊二酸(D2HG)脱氢酶基因中的突变的方法，所述方法包括:
a)将所述对象的样品与试剂混合物接触，其中所述试剂混合物包含：
(i)溶剂,
(ii)具有氧化态和还原态的染料,其中还原态可以与氧化态区分并且其中染料初始以氧化态存在,
(iii)电子转移剂,
(iv)(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶,和
(v)辅因子；和
b)通过测量染料的还原态的生产检测(D)-2-羟基戊二酸，其中在对象的样品中存在(D)-2-羟基戊二酸提示在所述对象的异柠檬酸脱氢酶(IDH)基因中或在(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶基因中的突变。

6.  权利要求5的方法，其中所述异柠檬酸脱氢酶(IDH)基因中的突变是IDH1基因或IDH2基因中的突变。

7.  权利要求1、2或5中的任一项的方法，其中在步骤a)中可以荧光测定地区分染料的还原态与染料的氧化态并且其中在步骤b)中经过荧光光谱学测量染料的还原态的产生。

8.  权利要求1、2或5中的任一项的方法，其中在步骤a)中可以比色地区分染料的还原态与染料的氧化态并且其中在步骤b)中经过可见光谱学测量染料的还原态的产生。

9.  权利要求1、2或5中的任一项的方法，其中在步骤a)中染料是刃天青或四唑盐，优选地XTT(2,3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-羧基苯胺,二钠盐)。

10.  权利要求1、2或5中的任一项的方法，其中在步骤a)中电子转移剂是心肌黄酶或PMS(N-甲基二苯并吡嗪甲基硫酸盐)或麦尔多拉蓝。

11.  权利要求1、2或5中的任一项的方法，其中在步骤a)中辅因子是NAD+或NADP+。

12.  权利要求11的方法，其中在步骤a)中酶是哺乳动物或原核生物(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶。

13.  权利要求12的方法，其中(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶来自发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)。

14.  权利要求1、2或5中的任一项的方法，其中样品是组织、组织切片、生物活组织检查、细胞、细胞裂解物、血样品、血清样品、血浆样品或尿样品。

15.  试剂盒，其包含(i)溶剂，(ii)具有氧化态和还原态的染料,其中还原态可以与氧化态区分并且其中染料初始以氧化态存在，(iii)电子转移剂，(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶，和辅因子。

测定(D)-2-羟基戊二酸(D2HG)或(D)-2-羟基己二酸的工具和方法
本发明涉及检测样品中(D)-2-羟基戊二酸或(D)-2-羟基己二酸的方法,所述方法包括步骤为:a)将样品与试剂混合物接触，其中所述试剂混合物包含:(i)溶剂，(ii)具有氧化态和还原态的染料，其中还原态可以与氧化态区分并且其中染料初始以氧化态存在，(iii)电子转移剂，(iv)(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶，和(v)辅因子；和b)通过测量染料的还原态的生产检测(D)-2-羟基戊二酸或(D)-2-羟基己二酸。本发明还涉及诊断和/或监控对象中(D)-2-羟基戊二酸相关的疾病的方法。本发明也涵盖了诊断对象中异柠檬酸脱氢酶(IDH)基因中和/或(D)-2-羟基戊二酸(D2HG)脱氢酶基因中的突变的方法。此外，本发明提供了试剂盒，所述试剂盒包含(i)溶剂，(ii)具有氧化态和还原态的染料，其中还原态可以与氧化态区分并且其中染料初始以氧化态存在，(iii)电子转移剂，(iv)(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶，和(v)辅因子。
异柠檬酸脱氢酶(IDH)催化两步反应中的异柠檬酸至α酮戊二酸的氧化脱羧，导致NADH或NADPH的生产。在人中，已知三种IDH同种型。这些同种型中的两个，即同二聚体IDH2(NADP⁺依赖的)和异三聚体IDH3(NAD⁺依赖的)定位于线粒体中，在这里它们参与Krebs循环(柠檬酸循环)。与之相反，同二聚体IDH1(NADP⁺依赖的)在细胞质和过氧化酶体中有活性(Geisbrecht等人,1999,J.Biol.Chem.,274:3052730533)。
已经在神经代谢病症和肿瘤性疾病中鉴定了在编码异柠檬酸脱氢酶的基因中的突变。
I型戊二酸尿症或酸血症(戊二酰-CoA脱氢酶(GCDH)缺陷)是遗传的病症，其由编码异柠檬酸脱氢酶2的IDH2基因中的或编码(D)-2-羟基戊二酸(D2HG)降解酶，即D2HG脱氢酶的基因中的突变引起，导致所述酶的酶促功能损伤(Kranendijk等人,2010,Science 330:336)。在这两种情况下，D2HG在携带突变的患者的体内积累并最终随尿排泄。戊二酸尿症首 先在1975年描述(Goodman等人,1975,Biochem.Med.12:12-21)。回顾性和前瞻性研究包括来自具有高携带者频率的两个北美遗传分离系的患者：阿米什团体(Amish Community)(Strauss等人,2003,Am.J.Med.Genet.121C:38-52；Strauss等人,2007,Brain 130:1905-1920)和Saulteaux/Ojibwa(Oji-Cree)印第安人(Greenberg等人,2002,Mol.Gen.Metab.75:70-78)以及欧洲患者(Hoffmann等人,1991,Pediatrics 88:1194-1203；Hoffmann等人,1996,Neuropediatrics 27:115-123；Busquets等人,2000,Pediatr.Res.48:315-322；Kyllerman等人,2004,Mov.Disord.9:22-30)。已经报道了评估描述了115名患者的42个公开的病例报告的该疾病的元分析(Bjugstad等人,2000,J.Pediatr.137:681-686)。也已经公开了招募了279名患者的国际横断面研究(等人,2006,J.Pediatr.137:681-686)。最近，已经引入了诊断和管理I型戊二酸尿症的指南(等人,2007,J.Inherit.Metab.Dis.30:5)，并且已经确认了使用该指南的有益效果(Heringer等人,2010,Ann.Neurol.68:743-752)。这些报告大大拓宽了I型戊二酸尿症的临床谱，包括了具有非进行性锥体束外综合征的儿童以及甚至生物化学上受影响但临床上正常的具有I型戊二酸尿症的儿童。目前，在世界范围已经报道了多于500名患者。结果是，戊二酸尿症现在被认为是最常见的可鉴别的与进行性或非进行性锥体束外疾病相关的代谢的先天性障碍之一。近年来，用于扩展的新生儿筛查的基于串联质谱的程序的发展提供了在急性脑病发作之前诊断多种儿童(Lindner等人,2006,J.Inherit.Metab.Dis.29:378-382)以及开展前瞻性随访研究(Strauss等人,2003,在上述引文中；Naughten等人,2004,J.Inherit.Metab.Dis.27:917-920；等人,2007,Pediatr.Res.62:353-362；Bijarnia等人,2008,J.Inherit.Metab.Dis.31:503-507；Boneh等人,2008,Mol.Genet.Metab.94:287-291)的机会。
琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)缺陷是罕见的代谢的先天性障碍的另一实例，主要由尿有机酸筛查揭示。患有证明的SSADH缺陷的患者除了γ-羟基丁酸(GHB)，排泄相当大量的D2HG(Struys等人,2006,Molecular  Genetics and Metabolism 88(1):53–57)。
在最近的癌症基因组测序项目中，细胞质异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)中的杂合的体细胞突变主要发现于继发性成胶质细胞瘤(GBM)中(83％)，较少发现于原发性GBM中(7％)(Parsons等人,2008,Science 321:1807-1812)。这些结果可通过进一步研究证明，其中IDH1突变能够在弥散的星形细胞瘤(71％)、WHO II级和III级的少突胶质细胞瘤和少突星形细胞瘤中频繁检测到(Balss等人,2008,Acta Neuropathol.,116:597 602；Hartmann等人,2009,Acta Neuropathol.,118:469474)。此外，已经鉴定了线粒体异柠檬酸脱氢酶(IDH2)中的突变，尽管频率较低(3％)。IDH突变不仅在弥散性神经胶质瘤中发生，也在急性髓性白血病(AML)(IDH1:6-8.5％；IDH2:8.7-11％)(Abbas等人,2010,Blood,116:2122-2126；Mardis等人,2009,New England Journal of Medicine,361:1058 1066；Paschka等人,2010,J.Clin.Oncol.,28:36363643；Schnittger等人,2010,Blood,116:5486-5496)、软骨肉瘤(56％)(Amary等人,2011,J.Pathol.,224:334-343)、肝内胆管癌(～25％)(Borger等人,2012,The Oncologist 17:72-79)和血管免疫母细胞T细胞淋巴癌(～45％)(Cairns等人,2012,Blood)中发生。
在IDH基因中发生的突变导致在两个不同位置的氨基酸交换，即在IDH1基因中的100或132位，在132位的精氨酸至组氨酸的点突变(R132H)代表弥散性神经胶质瘤中最频繁的突变，并且在IDH2基因中在两个不同位置，即140或172位。突变共同定位于酶促结构域，其中结合并转化异柠檬酸(Soundar和Colman,2000,J.Biol.Chem.,275:5606-5612)。这些位点特异性突变使酶失去了将异柠檬酸转化为α酮戊二酸的正常的能力(Yan等人,2009,Cancer Res.,69:9175-9159；Zhao等人,2009,Science,324:261-265)并赋予了酶新功能，即催化α酮戊二酸NADPH依赖性还原为(D)-2-羟基戊二酸的能力(Dang等人,2009,Nature,462:739-744；Ward等人,2011,Oncogene,doi:10.1038/onc.2011.416)。在甲状腺癌中描述了其他IDH突变，然而，尚未可知，这些突变是否导致(D)-2-羟基戊二酸的生 产(Murugan等人,2010,BBRC 393:555-559)。
目前，低级神经胶质瘤的诊断是通过IDH1 R132H特异性抗体的标准化使用来进行的。所述肿瘤性疾病中该点突变的频率为约90％。因此，可以通过使用所述抗体的免疫组织分析诊断大量的弥散性神经胶质瘤发生(Capper等人,2009,Acta Neuropathol.,218:599 601；Capper等人,2011,International Journal of Cancer/Journal International Du Cancer,doi:10.1002/ijc26425)。然而，IDH基因中的其他突变目前仅能够通过相应外显子的DNA测序检测。
此外，迄今，检测肿瘤组织中的和低级神经胶质瘤的石蜡包埋的组织中的(Sahm等人,2010,Brain Pathology,doi:10.1111/j.1750 3639.2011.00506.x)和AML患者血清中的(Sellner等人,2010,Eur.J.Haematol.,85:457-459)(D)-2-羟基戊二酸只能够通过GC-MS(气相色谱-质谱)进行。然而，此方法与由于劳动密集和耗时的用于分析的样品制备的高成本相关联。此外，GC-MS不适于样品的高通量分析。
鉴于以上，用于检测(D)-2-羟基戊二酸的其他工具和方法是必要的，但尚不可获得。
在最近的研究中，已经将来自异柠檬酸脱氢酶的癌症相关突变应用至高异柠檬酸脱氢酶的活性位点中的同源残基以得到催化2-氧代己二酸转化为(R)-2-羟基己二酸的酶，该步骤是肥酸生产的关键步骤(Reitman等人,Nature Chemical Biology(2012)8:887-889)。在另一公开中，已经假定了肥酸的生物技术生产过程(Parthasarathy等人,Biochemistry,2001 May 3,50(17):3540-50；erratum in Biochemistry,2011 May 24,50(20):4392)。
因此，需要用于监控肥酸生成的工具和方法，所述工具和方法迄今尚不可获得。
因此，构成本发明的技术问题可以视为提供用于满足前述需求的工具和方法。该技术问题由在权利要求和下文中表征的实施方案解决。
本发明涉及检测样品中(D)-2-羟基戊二酸的方法,所述方法包括步骤为:
a)将样品与试剂混合物接触，其中所述试剂混合物包含:
(i)溶剂,
(ii)具有氧化态和还原态的染料,其中还原态可以与氧化态区分并且其中染料初始以氧化态存在,
(iii)电子转移剂,
(iv)(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶,和
(v)辅因子；和
b)通过测量染料的还原态的生产检测(D)-2-羟基戊二酸。
迄今在2-羟基戊二酸相关疾病的临床筛选中通常用于测定2-羟基戊二酸(2HG)的GC-MS(气相色谱-质谱)不能区分2-羟基戊二酸的两种对映异构体，即两种对映异构体均被所述方法检测到。因此，GC-MS之后必须进行其他的分析步骤，使用例如，用于鉴定具体对映异构体的手性色谱柱。此外，GC-MS昂贵，主要是因为用于分析的样品的制备是劳动密集并且耗时的。因此需要约1天半才能获得GC-MS分析的结果。此外，GC-MS不适于样品的高通量分析。
与之相反，本发明的方法提供了用于特异性检测2-羟基戊二酸的D-(或R-)对映异构体，即(D)-2-羟基戊二酸(D2HG)的简单和可靠的酶促测定法。此外，所述方法是快速的，因为其能够在约2至3小时中进行。此外，其适于96孔形式并甚至可以进一步小型化至384孔形式，从而允许同时对许多样品的平行分析。
本发明还涉及检测样品中(D)-2-羟基己二酸的方法,所述方法包括步骤为:
a)将样品与试剂混合物接触，其中所述试剂混合物包含:
(i)溶剂,
(ii)具有氧化态和还原态的染料,其中还原态可以与氧化态区分并且其中染料初始以氧化态存在,
(iii)电子转移剂,
(iv)(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶,和
(v)辅因子；和
b)通过测量染料的还原态的生产检测(D)-2-羟基己二酸。
最近，已经由Parthasarathy和同事假设了肥酸的生物技术生产过程(Parthasarathy等人,Biochemistry,2001 May 3,50(17):3540-50；erratum in Biochemistry,2011 May 24,50(20):4392)。肥酸是聚酰胺尼龙-6,6和若干聚酯的构件。因为(D)-2-羟基己二酸是上述肥酸的生物技术生产过程中的中间体，能够使用本发明的检测(D)-2-羟基己二酸的方法，例如用于监控所述过程或用于生产肥酸的任何其他过程，其中(D)-2-羟基己二酸被用作中间体。例如，最近发现能够通过突变高异柠檬酸脱氢酶的活性位点中的特异性残基获得特异性的(R)-2-羟基己二酸脱氢酶(Reitman等人,Nature Chemical Biology(2012)8:887-889)。所述(R)-2-羟基己二酸脱氢酶能够催化2-氧代己二酸转化为(R)-2-羟基己二酸，这是肥酸生产的关键步骤。
此外，本发明涉及用于诊断和/或监控对象中(D)-2-羟基戊二酸相关的疾病的方法，所述方法包括:
a)将所述对象的样品与试剂混合物接触，其中所述试剂混合物包含:
(i)溶剂,
(ii)具有氧化态和还原态的染料，其中还原态可以与氧化态区分并且其中染料初始以氧化态存在,
(iii)电子转移剂,
(iv)(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶,和
(v)辅因子；和
b)通过测量染料的还原态的生产检测(D)-2-羟基戊二酸,从而诊断和/或监控所述对象中(D)-2-羟基戊二酸相关的疾病。
优选地，将在步骤b)中检测到的(D)-2-羟基戊二酸的量与来自不携带IDH1基因、IDH2基因、或D2HG脱氢酶基因中的突变的健康对象或健康对象的组的(D)-2-羟基戊二酸的参考量作比较。该参考量为约6μM(D)-2-羟基戊二酸，这是通过具有各基因的两个野生型等位基因的健康对象的血清中的GC/MS测定的。如果在步骤b)中检测到的在测试的对象的样品中 的(D)-2-羟基戊二酸的量高于此参考量，这提示所述对象中的(D)-2-羟基戊二酸相关的疾病。因为本发明的方法允许特异性检测2-羟基戊二酸的D-(或R-)对映异构体，即(D)-2-羟基戊二酸(D2HG)，所述方法能够用于诊断和/或监控对象中的(D)-2-羟基戊二酸相关的疾病。在优选的实施方式中，所述(D)-2-羟基戊二酸相关的疾病是选自主要由弥散性神经胶质瘤、急性髓性白血病(AML)、软骨肉瘤、肝内胆管癌和血管免疫母细胞T细胞淋巴癌组成的组的肿瘤性疾病。也已经描述了(D)-2-羟基戊二酸相关的甲状腺癌的罕见病例。其他(D)-2-羟基戊二酸相关的疾病包括非肿瘤性戊二酸尿症、琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)缺陷、Ollier’s疾病和Maffucci综合征。优选地，所述弥散性神经胶质瘤是WHO II级星形细胞瘤(AII)、WHO II级少突胶质细胞瘤(OII)或WHO II级少突星形细胞瘤(OAII)。弥散性神经胶质瘤也发生在含有WHO III级间变性星形细胞瘤(AIII)、WHO III级间变性少突胶质细胞瘤(OIII)和WHO III级间变性少突星形细胞瘤(OAIII)的恶性间变性变体中。全部弥散性神经胶质瘤具有发展为高度恶性的继发性成胶质细胞瘤的潜能。
“星形细胞瘤”是来自脑内的前体细胞的能够星形细胞分化的神经胶质瘤。相信正常星形细胞源自这些前体细胞。星形细胞的生理学作用是储存神经细胞的信息和养分。少突胶质细胞瘤是软的、浅灰色-粉色肿瘤。其通常含有固体矿物沉积物-其主要是钙-称为钙化。如本文所用的“少突星形细胞瘤”是“混合的神经胶质瘤”肿瘤，含有具有星形细胞和具有少突胶质细胞分化二者的肿瘤细胞。在本文别处以更多细节表征弥散性神经胶质瘤。如本领域技术人员所理解的，本发明的所述方法能够用于发现或筛选其他(D)-2-羟基戊二酸相关的疾病或病症，例如，肿瘤性疾病或神经代谢病症。优选地，所述疾病或病症与IDH和/或D2HG脱氢酶基因中的突变相关。
本发明还涉及诊断对象中异柠檬酸脱氢酶(IDH)基因中和/或(D)-2-羟基戊二酸(D2HG)脱氢酶基因中的突变的方法，所述方法包括:
a)将所述对象的样品与试剂混合物接触，其中所述试剂混合物包含:
(i)溶剂,
(ii)具有氧化态和还原态的染料,其中还原态可以与氧化态区分并且其中染料初始以氧化态存在,
(iii)电子转移剂,
(iv)(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶,和
(v)辅因子；和
b)通过测量染料的还原态的生产检测(D)-2-羟基戊二酸,其中对象的样品中存在(D)-2-羟基戊二酸提示所述对象中异柠檬酸脱氢酶(IDH)基因和/或(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶基因中的突变。
可以例如，通过所述一个或多个基因中相应外显子的DNA测序或本领域已知的其他方法，检测异柠檬酸脱氢酶(IDH)基因中和/或(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶基因中的突变。
优选地，所述异柠檬酸脱氢酶(IDH)突变是人IDH1基因中，和/或人IDH2基因中和/或人D2HG脱氢酶基因中的突变。
约70％至90％，可能甚至多至100％的弥散性神经胶质瘤患者(罹患AII、AIII、OII、OIII、OAII、OAIII、或继发性成胶质细胞瘤)携带IDH1和/或IDH2基因中的突变(Parsons等人,2008,Science 321,1807-1812；Balss等人,2008,Acta Neuropathol.,116:597-602；Hartmann等人,2009,Acta Neuropathol.,118:469-474)。IDH突变也能够在急性髓性白血病(AML)(IDH1:6-8.5％；IDH2:8.7-11％)和血管免疫母细胞T细胞淋巴癌(Abbas等人,2010,Blood,116:2122-2126；Mardis等人,2009,New England Journal of Medicine,361:1058-1066；Paschka等人,2010,J.Clin.Oncol.,28:3636-3643；Schnittger等人,2010,Blood,116:5486-5496；Cairns等人,在上述引文中)、软骨肉瘤(56％)(Amary等人,2011,J.Pathol.,224:334-343)和肝内胆管癌(Borger,在上述引文中)中鉴定。在AML中，已经描述了具有IDH1和IDH2基因二者中的突变的两个病例(Abbas等人,在上述引文中)。尽管非常罕见，已经描述了在甲状腺癌(约0.1％)和结肠癌中的IDH中的突变(等人,2006,Science 314: 268-274)。
优选地，所述突变是如表1中所示或如本文别处所描述的点突变。
表1:IDH1和IDH2中的突变及其在不同肿瘤性疾病中的发生。
IDH1中残基(R)100和132处的氨基酸位置分别对应于IDH2中的位置140和172，因为在IDH2中，存在40个氨基酸的线粒体信号序列。发生的氨基酸交换在括号中，按照频率分类，即在左侧的突变代表最频繁的突变。
表1

已经发现AML与IDH1的132位处的点突变相关，在所述点突变中精氨酸(R)被替换为半胱氨酸(C)、组氨酸(H)、丝氨酸(S)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或甘氨酸(G)。
已经发现软骨肉瘤与IDH1的132位处的点突变相关，在所述点突变中精氨酸(R)被替换为半胱氨酸(C)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、亮氨酸(L)或丝氨酸(S)。
在结肠癌细胞系中，已经在IDH1的97位处鉴定了点突变，其中甘氨酸(G)被替换为天冬氨酸(D)(等人,在上述引文中)。
已经发现弥散性神经胶质瘤与下述位置处的点突变相关(i)IDH1的100位，其中精氨酸(R)被替换为谷胺酰胺(Q)和/或(ii)IDH1的132位，其中精氨酸(R)被替换为组氨酸(H)、半胱氨酸(C)、丝氨酸(S)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或甘氨酸(G)。
人IDH1的核酸序列和氨基酸序列在登录号NP_005887.2中显示。
还已经发现AML与下述位置处的点突变相关(i)IDH2的140位，其中 精氨酸(R)被替换为谷胺酰胺(Q)或色氨酸(W)和/或(ii)172位，其中精氨酸(R)被替换为色氨酸(W)、赖氨酸(K)、或丝氨酸(S)。
已经发现软骨肉瘤与IDH2的172位处的点突变相关，其中精氨酸(R)被替换为丝氨酸(S)。
已经发现弥散性神经胶质瘤与下述位置处的点突变相关(i)IDH2的140位，其中精氨酸(R)被替换为谷胺酰胺(Q)和/或(ii)172位，其中精氨酸(R)被替换为色氨酸(W)、赖氨酸(K)、或丝氨酸(S)。
人IDH2的核酸序列和氨基酸序列在登录号NP_002159.2中显示。
(D)-2-羟基戊二酸尿症是遗传的病症，其中IDH2基因或D2HG脱氢酶基因中的突变导致D2HG在身体中积累和随后D2HG排泄到尿中。在登录号NP_689996.4中显示了优选的(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶基因。优选的突变是由Kranedijk,在上述引文中和由等人,在上述引文中描述的那些。
尽管能够通过使用IDH1 R132H特异性抗体的免疫组织分析诊断大量的弥散性神经胶质瘤(Capper等人,2009,Acta Neuropathol.,218:599-601；Capper等人,2011,International Journal of Cancer/Journal InternationalDu Cancer,doi:10.1002/ijc26425)，IDH基因中的其他突变目前只能通过相应外显子的DNA测序检测。有利地，本发明的方法提供了新颖和简单的测定法，其允许快速诊断对象中的异柠檬酸脱氢酶(IDH)基因突变和/或D2HG脱氢酶基因突变。此类突变已发现于肿瘤性疾病中，诸如弥散性神经胶质瘤、AML、血管免疫母细胞T细胞淋巴癌、软骨肉瘤、肝内胆管癌和罕见地，甲状腺癌和结肠癌；或神经代谢病症戊二酸尿症(I型)，例如，(D)-2-羟基戊二酸尿症和本文别处提到的其他疾病和综合征。
如本领域技术人员显而易见的，本发明的方法能够用于鉴定上述基因中的其他的、迄今尚未知的突变，例如-而不是限制性的-额外的点突变、移框突变、无义突变、插入，缺失或剪接变体。为此，能够通过用本发明的方法测量染料的还原态的生产来检测(D)-2-羟基戊二酸。在对象的样品中存在(D)-2-羟基戊二酸提示了所述对象中的柠檬酸脱氢酶(IDH)基因中和/ 或(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶基因中的突变。例如，通过对所述基因的外显子测序，能够鉴定异柠檬酸脱氢酶(IDH)基因中或(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶基因中的相应的突变。测序是本领域公知的；参见，例如Molecular cloning:A laboratory manual/Sambrook,Joseph；Russell,David W.,第3版,New York:Cold Spring Harbor Laboratory,2001。
如本文所用的“点突变”意指单个核苷酸交换为另一核苷酸。在经翻译的蛋白质中，所述核苷酸交换可能导致氨基酸交换，所述氨基酸交换可以分类为(i)沉默突变，其中核苷酸交换编码相同的氨基酸，(ii)错义突变，其中核苷酸交换编码不同的氨基酸或(iii)无义突变，其中核苷酸交换编码能够截断蛋白质的终止密码子。如本文所用“插入”指向DNA中添加一个或多个额外的核苷酸。基因的编码区中的插入可改变mRNA的剪接(剪接位点突变)，或导致读框的移动(移框)，这两者均能够显著改变基因产物。如本文所用的“缺失”指从DNA移除一个或多个核苷酸。与插入类似，这些突变能够改变基因的读框。
如本文所述的术语“2-羟基戊二酸(2-hydroxyglutarate)”(2HG)或“2-羟基戊二酸(2-hydroxyglutaric acid)”或“α-羟基戊二酸”是α-羟基酸。相应的CAS号是2889-31-8。在人中，该化合物是通过羟基酸-酮酸转氢酶形成的，然而在细菌中其是通过2-羟基戊二酸合酶形成的。该化合物能够通过2-羟基戊二酸脱氢酶的作用转化为α-酮戊二酸，所述2-羟基戊二酸脱氢酶在人中是称为D2HGDH和L2HGDH的两种酶。这两种酶中任一的缺陷导致称为2-羟基戊二酸尿症的神经代谢疾病，如本文别处以更多细节所示。
如本文所用，术语“(D)-2-羟基戊二酸((D)-2-hydroxyglutarate)”或“(D)-2-羟基戊二酸((D)-2-hydroxyglutaric acid)”或“D2HG”或“(R)-2-羟基戊二酸((R)-2-hydroxyglutarate)”或“(R)-2-羟基戊二酸((R)-2-hydroxyglutaric acid)”意指2-羟基戊二酸的D-立体异构体。对应的CAS号是636-67-9。大量(D)-2-羟基戊二酸的组织积累是遗传的神经代谢病症“(D)-2-羟基戊二酸尿症”的生物化学标志。(D)-2-羟基戊二酸尿症的 主要特征是发展迟缓、惊厥、弱肌肉张力(张力减退)，和脑的最大部分(大脑)中的异常，所述部分控制许多重要的功能诸如肌肉运动、语言、视觉、思维、感情、和记忆。(D)-2-羟基戊二酸尿症的症状可以严重或轻微。严重形式的发作通常在6个月龄前发生。除了此病症的主要特征之外，严重形式的征和症状通常包括缺少能量(昏睡)、阵发性呕吐、面部异常诸如突出的额头或非常小的下颌(小颌畸形)、视觉问题、衰弱的和扩大的心脏(心肌病)、和呼吸异常。轻微形式的(D)-2-羟基戊二酸尿症的发作通常在6月龄和3岁之间发生。此形式的症状多变但通常包括惊厥和轻微发育迟缓。在罕见的病例中，症状如此轻微使得未发现异常。如本文所用的术语“(D)-2-羟基戊二酸尿症”涵盖组合的(D)-2-羟基戊二酸尿症
也在罹患弥散性神经胶质瘤、AML、血管免疫母细胞T细胞淋巴癌、软骨肉瘤、肝内胆管癌和，尽管较不频繁地，甲状腺癌或结肠癌的患者中产生(D)-2-羟基戊二酸。如本文别处所示，异柠檬酸脱氢酶基因IDH1和/或IDH2中的突变是所述肿瘤性疾病的共同特征。通过特异性地检测(D)-2-羟基戊二酸，本发明的方法能够用于诊断上述病症和/或IDH基因或D2HG脱氢酶基因中的突变。
如本文所用的术语“(L)-2-羟基戊二酸((L)-2-hydroxyglutaric acid)”或“(L)-2-羟基戊二酸((L)-2-hydroxyglutarate)”或(S)-2-羟基戊二酸((S)-2-hydroxyglutaric acid)”或“(S)-2-羟基戊二酸((S)-2-hydroxyglutarate)”意指2-羟基戊二酸的L-立体异构体。对应的CAS号是13095-48-2。(L)-2-羟基戊二酸是在“L-2-羟基戊二酸尿症”(神经代谢病症,OMIM 236792)中积累的代谢物，并已经在多个患者中报道，所述患者患有具有锥体束外和小脑征的进行性神经退化、惊厥、和白质中海绵样变性(OMIM 600721)和Spondyloenchondrodysplasia(OMIM 271550)的临床表型。(L)-2-羟基戊二酸尿症也破坏脑，特别是参与协调运动的区域，小脑。结果是，感染的个体具有平衡和肌肉协调的问题(共济失调)。额外的征和症状包括智力残疾、惊厥、语言受损、身材矮小、和异常大的头(巨头)。通常，此病症的征和症状开始于婴儿期或早期幼儿期期间。(L)-2-羟 基戊二酸尿症的症状通常进展缓慢，但严重残疾的发生到早期成年期为止。在一些病例中，症状的发作被延迟直到青春期或成年期，并且与在婴儿期期间开始的病例相比症状倾向于较轻微。
已经在少数婴儿中报道了组合的(D)-2-羟基戊二酸尿症和(L)-2-羟基戊二酸尿症。征和症状严重并且发生于生命的第一个月中。
样品中2HG的手性能够通过本领域已知的方法评估或验证，例如，通过二乙酰-L-酒石酸酐衍生和LC-MS分析，如Dang等人,2009,在上述引文中所描述的。例如，为了测定样品中2HG的手性，能够用二乙酰-L-酒石酸酐衍生2HG，其然后允许通过反相LC分离2HG的(S)和(R)对映异构体和通过串联质谱检测产物。例如，通过使用外消旋的和(R)-2HG或(S)-2HG标准物，能够确认对应于2HG的(S)和(R)异构体的峰。能够用于特异性地测定2HG或2-羟基己二酸对映异构体中的哪个存在于样品中的其他方法包括GC-MS、HPLC或MS。
如本文所用的术语“α-酮己二酸”或“2-氧代己二酸(2-oxoadipate)”或“2-氧代己二酸(2-oxohexanedioic acid)”是赖氨酸和色氨酸代谢中的中间体。对应的CAS号是3184-35-8。α-酮己二酸的其他信息可见于，例如，Parthasarathy等人,Biochemistry,2001 May 3,50(17):3540-50；erratum in Biochemistry,2011 May 24,50(20):4392中。简而言之，在此研究中尤其分析了这三种酶，来自发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)的2-羟基戊二酸脱氢酶和戊烯二酸CoA-转移酶以及来自共生梭菌(Clostridium symbiosum)的2-羟基戊二酰-CoA脱水酶是否能够将2-氧代己二酸转化为2-己烯二酸。此不饱和的二羧酸的还原将导致以2008年世界规模二百四十万吨从苯化学生产的肥酸(己二酸)。肥酸是聚酰胺尼龙-6.6和若干聚酯的组分。
如本文所用的术语“(D)-2-羟基己二酸((D)-2-hydroxyadipic acid)”或“(R)-2-羟基己二酸((R)-2-hydroxyadipic acid)”或“(D)-2-羟基己二酸((D)-2-hydroxyadipate)”或“(R)-2-羟基己二酸((R)-2-hydroxyadipate)”是2-羟基己二酸(2-hydroxyadipic acid)(2-羟基己二酸(2-hydroxyadipate)或2- 羟基己二酸(2-hydroxyhexanedioic acid))的D(或R)立体异构体，其CAS号是18294-85-4。令人感兴趣的是，在最近的研究中已经发现，与野生型小鼠相比，IL10^-/-小鼠的尿中的2-羟基己二酸和2-羟基戊二酸的水平较低(Lin等人,Journal of Proteome Research(2009),8,2045-2057)。(D)-2-羟基己二酸是通过高异柠檬酸脱氢酶在NADPH依赖性反应中从(2R,3S)-高异柠檬酸生成的，所述(2R,3S)-高异柠檬酸是真菌中赖氨酸生物合成的中间体。此外，其是假设的基于生物的肥酸生产测定法中的中间体；参见Parthasarathy等人,在上述引文中。其他信息可见于Reitman等人,Nature Chemical Biology(2012)8:887-889中。
根据本发明方法的术语“诊断”包括检测、监控、验证、子分类、和预测本文所示的(D)-2-羟基戊二酸相关的疾病、其症状或风险。如本文所用的术语“检测”意指发现或确信本文所称的(D)-2-羟基戊二酸或(D)-2-羟基戊二酸-相关疾病或(D)-2-羟基己二酸的现存或存在。为此，例如，如以下实施例所证明的，能够通过本发明的方法测量料想罹患(D)-2-羟基戊二酸相关的疾病的对象的样品中(D)-2-羟基戊二酸的量。如本文所用的术语“监控”指记录已经诊断的(D)-2-羟基戊二酸相关的疾病或并发症，例如，以分析疾病的发展或结果或特别的治疗对疾病或并发症的发展的影响。例如，所述监控包括筛选患者样品中(D)-2-羟基戊二酸的水平或量的调节，以检测和/或跟踪本文所称的肿瘤性疾病或神经代谢疾病。所述(D)-2-羟基戊二酸(D2HG)的水平或量的调节可以是，例如，该化合物的量的增加或减少。优选地，增加或减少是与在先前的时间点测定的所述化合物的量相比，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、或甚至更多的调节。例如，能够在多个时间点(T)T0、T1、T2、T3等测量D2HG的量，以测定或跟随疗法的效力。罹患如本文所称的D2HG相关的疾病的患者的样品中的D2HG的量的统计学显著的增加能够提示所述疾病的恶化或能够是所述疾病复发的征。罹患如本文所称的D2HG相关的疾病的患者的样品中的D2HG的量的统计学显著的减少能够提示所述疾病的改善，例如，通过恰当治疗所述疾病。使用多种公知的统计学评估工具，例如测定置信区间、p 值测定、Student′s t-测试、Mann-Whitney测试等，能够确定D2HG的量的增加或减少是否是统计学显著的。细节见于Dowdy和Wearden,Statistics for Research,John Wiley&Sons,New York,2004中。优选的置信区间是至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。P值优选是0.1、0.05、0.01、0.005、或0.0001。(D)-2-羟基己二酸能够用作肥酸的生物技术生产过程中的中间体。因此，能够利用本发明的检测(D)-2-羟基己二酸的方法，例如，用于监测所述生物技术生产过程或用于生产肥酸的任何其他过程，所述过程中(D)-2-羟基己二酸被用作中间体。“验证”涉及使用各疾病的典型症状或其他指示物或标记物加强或证实已经实施的诊断。“子分类”涉及根据诊断的疾病的不同子类进一步定义诊断，例如，根据疾病的轻微和严重形式定义。“预测”指在其他症状或标记物变得明显或变得显著改变前对疾病或并发症进行的预后。
如本文所用的术语“对象”指动物，优选哺乳动物，和，更优选人。优选地，对象是料想患有或罹患本文所称的(D)-2-羟基戊二酸相关的疾病的人患者。人患者可以是大于18岁的成年患者，也可以是18岁或小于18岁的儿童患者。如本文所称的术语“儿童患者”也包含新生儿。新生儿是出生若干小时、天或至多几周内的婴儿。在医学背景下，新生儿或初生儿通常指出生后首个28天中的婴儿。如本文所用的“儿童患者”通常包含年龄多至并包括18岁的儿童。儿童可以被更具体地亚分组为婴儿(1月至12月龄)，1至9岁的幼儿，和年龄较大儿童和青少年(10至18岁)。术语“婴儿”源自拉丁语词语“infans”，意为“不能说话”或“无言语”。其通常用于1月和12月龄之间的儿童；然而，在出生和三岁之间的定义可变化。将婴儿期之前的人发育阶段描述为产前或胎儿。
如本文所用的,定义为“X到Y”的时间间隔等于定义为“X和Y之间”的时间间隔。这两种时间间隔都具体地包括上限和下限。这意味着，例如，“从1月到12月龄”的时间间隔包括“1月”和“12月”和之间的任意时间间隔。此定义加上必要的变更应用于本文指出的任何数量范围诸如浓度范围、pH范围、容积范围等。
本发明的方法能够有利地用作怀孕期间对来自胎儿的细胞的酶促测试以测定胎儿是否罹患(D)-2-羟基戊二酸相关的疾病。此测试所需要的胎儿的样品能够例如，通过绒毛膜取样术(CVS)或羊膜穿刺术获得。此外，本发明的所述方法能够用于新生儿筛查，以分析新生儿是否患有(D)-2-羟基戊二酸相关的疾病。此外，因为多种肿瘤性疾病与由于IDH或D2HG脱氢酶基因中的突变的(D)-2-羟基戊二酸的生产有关，本发明的方法能够用于诊断和/或监控，例如，弥散性神经胶质瘤、软骨肉瘤、急性髓性白血病(AML)、血管免疫母细胞T细胞淋巴癌、肝内胆管癌或甲状腺或结肠癌。此外，本发明的所述方法能够用于发现与上述基因中的突变相关的其他肿瘤性疾病或神经代谢疾病。
如本文所用的术语“肿瘤”或“肿瘤性疾病”或“肿瘤性病症”指异常的组织团，当细胞分裂多于应当时，例如，由于去调控的增殖，或当细胞应当死亡而不死亡时，例如由于去调控的凋亡，造成所述异常的组织团。肿瘤可以是良性的(不是癌症)，或恶性的(癌症)。肿瘤也可以称为瘤。优选地，如本文所称的术语“肿瘤”或“肿瘤性疾病”或“肿瘤性病症”包含神经胶质瘤，更优选地，弥散性神经胶质瘤、软骨肉瘤、急性髓性白血病(AML)、血管免疫母细胞T细胞淋巴癌、肝内胆管癌和甲状腺或结肠癌。对本领域技术人员显而易见，也可通过本发明的工具和方法鉴定携带IDH1和/或IDH2和/或D/L2HGDH基因中的突变的其他肿瘤。
如本文所称的“弥散性神经胶质瘤”指来自脑或脊髓的胶质细胞或其前体的全部瘤细胞生长。基于它们是否主要表现出星形细胞或少突胶质细胞形态学对神经胶质瘤进行组织学分类，并通过细胞性、核异型性、坏死、有丝分裂象、和微血管增殖-与生物学攻击性行为相关的全部特征，对神经胶质瘤分级。神经胶质瘤能够以不同形态学(分类的基础)并且以范围从WHO I级到WHO IV级并且表现出从良性经过半恶性到恶性到高度恶性的临床行为的不同级别显现。良性的神经胶质瘤显示极少的脑浸润并且表现出缓慢生长并通常根据WHO I级分级。特别地，此组包括青少年毛细胞型星形细胞瘤。半恶性神经胶质瘤包括WHO II级的弥散性星形细胞瘤、 少突胶质细胞瘤和少突星形细胞瘤，其弥散性地浸润并且表现出中等生长速度。恶性神经胶质瘤包括星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤和少突星形细胞瘤的间变性形态，全部分级为也表现出弥散性浸润和实质性生长的WHOIII级。高度恶性的神经胶质瘤包括WHO IV级的原发和继发性成胶质细胞瘤。
在2007年，WHO批准了影响中枢神经系统的瘤的综合性分类的新版本。脑肿瘤的分类基于每类肿瘤源自特异性细胞类型的异常生长的前提。就肿瘤行为与基础细胞类型相关的程度来说，肿瘤分类决定疗法的选择并预测预后。新的WHO系统在此方面特别有用，仅具有一些值得注意的例外(例如，全部或几乎全部肥胖细胞型星形细胞瘤实际上是间变性的并且因此是III级或甚至IV级，而不是由WHO系统指定的II级)。WHO分类也提供了对于每种肿瘤类型的平行的评级系统。在此评级系统中，大多数命名的肿瘤具有单个确定的级别。WHO系统提供了美国和全世界的不同中心之间交流的标准。在下文提供了此分类的概要。
根据WHO分类，神经胶质瘤被分为四个级别(WHO I、II、III、和IV级)并且治疗和预后取决于肿瘤级别(Claus和Black,2006,Cancer,106:1358)。更常见的亚类是：弥散性星形细胞瘤。通常在个体近四十岁时在个体中诊断出这些肿瘤。毛细胞型星形细胞瘤是最多发生于小于25岁的人中的肿瘤。少突胶质细胞瘤是能够缓慢生长的肿瘤。混合的神经胶质瘤由多种肿瘤亚型的混合物组成，例如弥散性星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤。这些肿瘤倾向于与弥散性星形细胞瘤行为类似。如本文所称的弥散性神经胶质瘤优选地意为WHO II级星形细胞瘤、WHO III级间变性星形细胞瘤、WHO II级少突胶质细胞瘤、WHO III级间变性少突胶质细胞瘤、WHO II级少突星形细胞瘤、WHO III级间变性少突星形细胞瘤和WHO IV级继发性成胶质细胞瘤。
根据WHO系统能够将星形细胞神经胶质瘤如下分类：具有原生质性、肥胖细胞型、纤维性变体的WHO II级星形细胞瘤；可进一步分类为半球性的、间脑性的、眼睛性的、脑干、和小脑性的WHO III级间变性(恶性) 星形细胞瘤；具有巨细胞成胶质细胞瘤和胶质肉瘤变体的WHO IV级原发和继发性成胶质细胞瘤；可进一步分类为半球性的、间脑性的、眼睛性的、脑干、和小脑性的WHO I级毛细胞型星形细胞瘤；WHO I级室管膜下巨细胞星形细胞瘤和WHO I级多形性黄色星形细胞瘤。
根据WHO系统能够将少突胶质神经胶质瘤如下分类：WHO II级少突胶质细胞瘤和WHO III级间变性少突胶质细胞瘤、WHO II级少突星形细胞瘤和WHO III级间变性少突星形细胞瘤。术语少突星形细胞瘤和混合的神经胶质瘤用作同义词。
根据WHO系统能够将室管膜神经胶质瘤如下分类:具有细胞的、乳头状的、上皮的、透明细胞、和混合的变体的WHO II级室管膜瘤、WHOII级间变性室管膜瘤、WHO I级粘液乳头状室管膜瘤和WHO I级亚室管膜瘤。
根据WHO系统能够将不确定谱系的神经胶质瘤如下分类：WHO IV级极性成胶质细胞瘤、WHO IV级星形母细胞瘤和WHO IV级大脑神经胶质瘤病。
根据WHO系统能够将脉络丛的肿瘤如下分类：脉络丛乳头状瘤,脉络丛癌(间变性脉络丛乳头状瘤).
根据WHO系统能够将神经元和混合的神经元-神经胶质肿瘤如下分类：神经节细胞瘤,小脑的发育异常的神经节细胞瘤(Lhermitte-Duclos),神经节神经胶质瘤,间变性(恶性)神经节神经胶质瘤,促结缔组织增生性婴儿神经节神经胶质瘤包括促结缔组织增生性婴儿星形细胞瘤,dentral神经细胞瘤,胚胎发育不良性神经上皮瘤,嗅神经母细胞瘤(成感觉神经母细胞瘤)包括嗅神经上皮瘤。
根据WHO系统能够将松果体肿瘤如下分类：松果体瘤、成松果体细胞瘤和中度分化的松果体实质肿瘤、松果体区的乳头状瘤。
根据WHO系统能够将胚胎性肿瘤如下分类：髓上皮瘤、具有多能分化的原始神经外胚层肿瘤包括成神经管细胞瘤与髓母肌母细胞瘤、黑素细胞成神经管细胞瘤、和促结缔组织增生性成神经管细胞瘤变体、和大脑原 始神经外胚层肿瘤；包括成神经节细胞瘤变体、成视网膜细胞瘤和成室管膜细胞瘤的成神经细胞瘤。
神经胶质瘤也可以被亚分类为侵入性的或非侵入性的，尽管这并不是WHO系统的正式部分，非侵入性肿瘤类型在以下提示。
其他CNS瘤包括包含垂体腺瘤、垂体癌和颅咽管瘤的鞍区肿瘤；包含原发性恶性淋巴瘤、浆细胞瘤和其他的造血肿瘤；包含生殖细胞瘤、胚胎性癌、卵黄囊瘤(内胚窦瘤)、绒毛膜癌、畸胎瘤的生殖细胞肿瘤和混合的生殖细胞肿瘤；包含包括脑膜上皮、纤维移行、砂粒、血管瘤、微囊、分泌、透明细胞、脉络膜、富含淋巴浆细胞、化生亚型变体的脑膜瘤、非典型脑膜瘤和间变性(恶性)脑膜瘤的脑膜肿瘤；包括骨软骨肿瘤、脂肪瘤、纤维性组织细胞瘤和其他的脑膜的非脑膜上皮肿瘤；包括软骨肉瘤、血管外皮细胞瘤、横纹肌肉瘤、脑膜的肉瘤病和其他的恶性间质肿瘤；包括弥散性黑素沉着病黑素细胞瘤和具有变体脑膜黑素瘤病的恶性黑素瘤的原发黑素细胞损伤；包括恶性淋巴癌、浆细胞癌和粒细胞肉瘤的造血瘤；包括成血管细胞瘤(毛细血管成血管细胞瘤)的不确定组织发生的肿瘤；颅和脊神经的肿瘤，其包含包括细胞、丛状和黑素亚型的许旺氏细胞瘤(神经鞘瘤(neurinoma)、神经鞘瘤(neurilemoma))、包括局限性(孤立性)神经纤维瘤和丛状神经纤维瘤的神经纤维瘤、包括上皮样的、相异间质或上皮分化和黑素变体的恶性外周神经鞘肿瘤；来自包含副神经节瘤(化学感受组织瘤)、脊索瘤、软骨瘤、软骨肉瘤和癌的区域性肿瘤的局部延伸；转移性的肿瘤；未分类的肿瘤；囊肿和肿瘤样损伤，其包含拉克氏囊肿、第三脑室的表皮样的、皮样的、胶质的囊肿、肠生性囊肿、神经胶质囊肿、粒细胞肿瘤迷芽瘤、垂体细胞瘤、下丘脑神经元错构瘤、鼻神经胶质异位和血浆细胞肉芽肿。
多种其他分级系统可通常用于星形细胞系的肿瘤(即星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤和成胶质细胞瘤)，诸如St.Anne/Mayo或Kernohan分级系统。在这些系统中，仅基于肿瘤的显微外观指定级别。然而，给予给定肿瘤的数字级别能够依赖于所使用的分级系统而变化。因此，当指明级别时 指明所提及的分级系统是重要的。St.Anne/Mayo级别已经证明比先前通常的Kernohan分级系统更好地与存活率相关。其仅能够应用于星形细胞系的侵入性肿瘤；此外其与WHO分级系统相似。
简而言之,如本文所称的星形细胞肿瘤的WHO分级可以总结为如下:
毛细胞型星形细胞瘤:WHO I级
星形细胞瘤:WHO II级
间变性(恶性)星形细胞瘤:WHO III级
成胶质细胞瘤:WHO IV级
弥散性神经胶质瘤的诊断和疗法为本领域所知(Ferroli等人,2010,World Neurosurg 73:234–236；Hartmann等人,2011,Clinical Cancer Research 17:4588–4599；Mukasa等人,Cancer Science:doi:10.1111/j.1349-7006.2011.02175.x；Sanai,Chang&Berger,2011,Journal of Neurosurgery 115:948–965；Sherman,Weintraub,Lopes&Schiff,2011,Primary Central Nervous System Tumors,第173–194页,于<http://www.springerlink.com/content/nrw13t1501v1wg33/>；Soffietti等人,2010,European Journal of Neurology 17:1124–1133；Thon等人,2012,Cancer 118:452–460；van den Bent等人,2010,Clinical Cancer Research 16:1597–1604；Weller,2011,Swiss Med Wkly 141,w13210)。
如本文所用的术语“急性髓性白血病”(AML)，也称为“急性骨髓性白血病”，是血细胞的骨髓细胞系的癌症，特征在于异常白血细胞的快速生长，所述白血细胞在骨髓中积累并且干扰正常血细胞的生产。AML是影响成人的最常见的急性白血病，并且其发生率随年龄增加。在美国每年有约12000名成人被诊断患有急性髓性白血病(AML)，年龄中位数为67岁。尽管治疗和支持性护理的进步，大多数AML患者死于其疾病。占患有AML成人的约10％的急性早幼粒细胞白血病是此一般性陈述的重要例外。在该亚型中，在此处不考虑细节，用基于蒽环霉素的化疗、全反式维甲酸，和三氧化二砷的组合治愈了多于75％的患者。对于一些APL患者，能够排除一同的细胞毒性化疗并用三氧化二砷和全反式维甲酸单独实现治愈。对 于AML的全部其他亚型，初始治疗的支柱是在几乎40年前开发的阿糖胞苷(ara-C)与蒽环霉素的组合，并且此方案仍然是世界范围内的标准护理。约70％-80％的小于60岁的患者将实现完全缓解，但大多数最终复发并且5年总体存活率仅为40％-45％。在大于60岁的患者中，40％-50％的具有良好表现状态的患者的能够实现完全缓解，但治愈率低于10％并且中位存活率少于1年。在30年中，较老AML患者的前景并未改变，并且对于具有不利的细胞遗传学和/或差的表现状态的较老患者甚至更差。
在最近几年中，在AML的诊断和治疗中存在若干种改变实践的发展。基于细胞遗传风险组的旧的“有利的、中等的、和不利的”预后类别不再是适当的。基因组技术的进步已经将AML鉴定为遗传上高度异质性的疾病，并且基于其潜在的分子遗传缺陷，越来越多的AML患者现在能够被分类到不同的临床病理学亚组中。构成最大亚组并且组织学上被指定为“中等的”预后的细胞遗传正常的患者，现在能够被进一步分为多个分子亚组，其中一些已知具有显著的预后含义。例如，FLT3-ITD(FML-样酪氨酸激酶3内部串联重复)中的突变已经与攻击性的疾病表型和差的后果相关联。相反地，具有CEBPA(CCAAT增强子结合蛋白α)和NPM1(核仁磷酸蛋白1)中的双等位基因突变而不具有伴随的FLT3-ITD中的突变的患者具有显著更有利的后果。也已经在具有异常细胞遗传学的患者中鉴定了预后上重要的突变；例如KIT中的突变可能否定先前与t(8；21)相关的“有利的”分类。迄今仅将FLT3-ITD、NPM1、和双等位基因CEBPA突变并入AML临床实践指导方针。
AML的诊断和疗法为本领域所知(Chou等人,2011,Leukemia于<http://dx.doi.org/10.1038/leu.2011.215>；Damm等人,2011,Leukemia 25:1704–1710；&Gaidzik,2011,ASH Education Program Book,第36–42页；Georgiou等人,2011,Leukemia于<http://dx.doi.org/10.1038/leu.2011.280>；Rakheja等人,2011,British Journal of Haematology 155:125–128；Ravandi等人,Cancer:doi:10.1002/cncr.26580)。
本文的术语“软骨肉瘤”用于源自软骨组织或其前体的间质瘤类型。根据FNCLCC(French Federation Nationale des Centre des Lutte Contre le Cancer)的分级系统对软骨肉瘤进行分级，所述分级系统是用于肉瘤的Coindre分类系统的修改。软骨肉瘤以不同的恶性级别和以不同的变体发生。疗法依赖于手术、放射和化疗，然而疗法的长期成功差。在软骨肉瘤的一部分中存在IDH突变使得它们是靶向疗法的候选对象。具有IDH突变的软骨肉瘤中增加的(D)-2-羟基戊二酸水平使得它们是生物化学测试的候选对象。
本文的术语“胆管癌”用于源自肝中胆管的癌类型。胆道的肿瘤包括胰腺癌、胆囊癌和法特壶腹癌。胆管癌的疗法依赖于手术、化疗和辐射。除非进行完整的手术切除，疗法成功差。在胆管癌的一部分中，特别地肝内胆管癌中存在IDH突变使得它们是靶向疗法的候选对象。具有IDH突变的胆管癌中增加的(D)-2-羟基戊二酸水平使得它们是生物化学测试的候选对象。
如本文所用的术语“血管免疫母细胞T细胞淋巴癌”(AITL)指罕见并复杂的淋巴增殖性病症，临床表征为广泛的淋巴结病、结外病、免疫介导的溶血和多克隆高丙球蛋白血症。自从将其识别为具有在独特的恶性微环境中的相关的B细胞和内皮细胞去调控的克隆性T细胞病症，已经在理解AITL中取得了显著的进步。然而，因为对常规化疗的应答尚未是可持久的，使用当前的治疗方法的预后仍然是悲观的。最初在1974年被Rappaport和Lukes报告为“免疫母细胞淋巴结病”，在当前的世界卫生组织(WHO)分类中将血管免疫母细胞T细胞淋巴癌(AITL)识别为具有不同临床病理学特征的外周T细胞淋巴癌(PTCL)。全球内，AITL代表了全部PTCL的约20％并且占非霍奇金淋巴癌(NHL)的大约2-5％，在分布和发病率上具有显著的地理变异。在国际T细胞淋巴癌研究组的报道中，发现AITL在欧洲更为流行，其占PTCL病例的28％，与北美15％和亚洲17％相比(Alizadeh和Advani,2008,Clin.Advances in Hematol.and Oncol.6(12):899-909)。
如本文所用的术语“甲状腺癌”是恶性的甲状腺瘤。其能够用放射性碘或手术切除甲状腺治疗。可以使用化疗或放疗。
如本文所用的术语“结肠癌”指开始于大肠(结肠)或直肠(结肠末尾)的结肠或结肠直肠癌。根据美国癌症学会，结肠直肠癌是美国癌症相关死亡的主要原因之一。然而，早期诊断通常导致完全治愈。几乎全部结肠癌开始于在结肠和直肠内层中的腺体中。结肠癌无单一原因。几乎全部结肠癌以非癌性(良性)息肉开始，其缓慢发展为癌症。某些遗传综合征也增加发展结肠癌的风险。最常见的两个是家族性腺瘤性息肉病(FAP)和遗传性非息肉结肠直肠癌(HNPCC)。结肠癌的许多病例没有症状。然而，以下症状可能提示结肠癌：下腹部腹疼和敏感、便血、腹泻、便秘，或排便习惯的其他改变、粪便狭窄、和不明原因的体重减轻。以适当的筛查，能够在症状发展前检测结肠癌，此时其最可治愈。粪便潜血测试(FOBT)可检测粪便中少量的血，这可能提示结肠癌。然而，此测试在患有结肠癌的患者中通常是阴性的。出于此原因，FOBT必须连同结肠镜检查术或乙状结肠镜检查术进行。结肠癌的阶段是：阶段0：在肠最里层上的非常早期的癌症；阶段I：在结肠内层中的癌症；阶段II：癌症已经扩散通过结肠的肌肉壁；阶段III：癌症已经扩散至淋巴结；阶段IV：癌症已经扩散到其他器官。测试包括癌胚抗原(CEA)和CA 19-9的肿瘤标志物的血液测试可用于诊断。结肠癌的治疗部分取决于癌症的阶段。一般而言，治疗可包括：手术(最常见是结肠切除术)以移除癌细胞，化疗以杀死癌细胞以及放疗以破坏癌组织。可以通过移除癌细胞，通常在结肠镜检查术过程中，治疗阶段0结肠癌。对于阶段I、II、和III癌症，需要更大的手术以移除生癌的结肠部分。有一些争论即具有阶段II结肠癌的患者是否应当在手术后接受化疗。几乎全部具有阶段III结肠癌的患者应当在手术后接受化疗约6-8个月。已经显示化疗药5-氟尿嘧啶增加某些患者中的治愈几率。化疗也用于改善症状并延长具有阶段IV结肠癌的患者的存活。伊立替康(irinotecan)、奥沙利铂(oxaliplatin)、卡培他滨(capecitabine)、和5-氟尿嘧啶是三种最常用的药物。包括西妥昔单抗(cetuximab)(Erbitux)、 帕尼单抗(panitumumab)(Vectibix)、贝伐珠单抗(bevacizumab)(Avastin)的单克隆抗体，和其他药物已经被单独使用或与化疗组合使用。尽管偶尔在具有结肠癌的患者中使用放疗，其通常与化疗组合用于具有阶段III直肠癌的患者。对于具有已经扩散到肝脏的阶段IV疾病的患者，能够使用特异性针对肝脏的多种治疗。这可包括：烧伤癌症(消融)、直接将化疗或放射递送到肝脏中、冷冻癌症(冷冻疗法)、或手术。
如本文所用的术语“复发的或复发”指在患者得到缓解后，(D)-2-羟基戊二酸相关疾病的征和症状的回归。例如，在AML中使用化疗和/或人干细胞移植的常规肿瘤治疗后，肿瘤患者可进入缓解，没有肿瘤的征或症状，保持缓解若干年，但然后复发并不得不再次治疗肿瘤。因此，在具体的实施方案中，本发明的方法能够用于检测如本文所称的肿瘤性疾病的复发或源自原发肿瘤的转移。
能够通过本发明的方法检测、诊断或监控的另一种(D)-2-羟基戊二酸相关疾病是(D)-2-羟基戊二酸尿症。此疾病是遗传的病症，其中IDH2基因中的突变导致D2HG的生产。D2HG脱氢酶基因中的其他突变导致功能性受损的酶，其也导致D2HG在身体内的积累。在这两种情况下，D2HG随尿排泄。
表现出轻微升高的D2HG的其他代谢病症包括多种乙酰CoA脱氢酶缺陷、二氢硫辛酸脱氢酶缺陷、丙酮酸脱羧酶缺陷和丙酮酸羧化酶缺陷。这些病症也能够通过本发明的方法检测、诊断或监控。
如本文所用的术语“治疗”在最广泛的意义上意为旨在减轻本文所称的(D)-2-羟基戊二酸相关疾病的医学程序或应用。
如本文所用的术语“改善”与改进是同义词。如果患者的罹患如本文所称的(D)-2-羟基戊二酸相关疾病的状况显示改善，患者明显更好-她或他的临床状况有一些改进。例如，如果能够实现所述疾病的稳定化，即疾病不再是进行性的，其可为患者状况改进。此疾病阶段也称为稳定的疾病。
如本文所用的术语“样品”指不含细胞的样品或包含细胞的样品，诸如体液样品、分离的和/或分开的细胞、细胞裂解物或细胞(培养物)上清 液的样品或来自组织或器官的样品，包括活组织检查或组织切片。可以通过公知的技术获得体液样品，并且包括，优选地，血液、血浆、血清或尿样品。可从任意组织或器官获得组织或器官样品，例如，通过活组织检查。通过分离技术诸如离心或细胞分选(FACS)，可从体液或组织或器官获得分离的和/或分开的细胞。样品可以是冷冻的或石蜡包埋的。优选地，本发明的方法中使用的样品是血液样品、血清样品、血浆样品、尿样品、或本文所称的肿瘤的肿瘤组织的活组织检查或组织切片。样品优选来自如本文所定义的对象。例如，样品可以源自如本文定义的新生儿、儿童患者或成年患者。样品也可以源自胎儿，所述样品可通过，例如，CVS或羊膜穿刺术获得。
如本文所称的术语“测定(D)-2-羟基戊二酸(D2HG)的量”或“测定(D)-2-羟基己二酸的量”涉及测量D2HG或(D)-2-羟基己二酸的量或浓度，优选地半定量地或定量地测量。可以直接或间接进行测量。直接测量涉及基于信号测量D2HG或(D)-2-羟基己二酸的量或浓度，所述信号是从D2HG或(D)-2-羟基己二酸本身获得的并且其强度与样品中存在的D2HG或(D)-2-羟基己二酸的分子数直接相关。例如，通过测量D2HG或(D)-2-羟基己二酸的具体物理或化学性质的强度值，可获得此类信号。间接测量包括测量从次级组分，即不是D2HG或(D)-2-羟基己二酸本身的组分，或生物读出系统(例如，可测量的细胞应答、配体、标签、或酶促反应产物)获得的信号。
如本文所用的术语“量”涵盖本文所称的D2HG或(D)-2-羟基己二酸的绝对量，D2HG或(D)-2-羟基己二酸的相对量或浓度以及与之相关的任何值或参数。此类值或参数包含通过直接测量例如质谱或NMR谱中的强度值从D2HG或(D)-2-羟基己二酸获得的来自全部具体物理或化学性质的强度信号值。此外，涵盖通过本说明书别处指明的间接测量获得的全部值或参数，例如应答D2HG或(D)-2-羟基己二酸的生物读出系统或从特异性结合的配体获得的的强度信号。应当理解与前述量或参数相关的值也能够通过全部标准数学运算获得。
如本文所用的术语“接触”或“孵育”指使得至少两种不同的化合物物理上临近以允许所述化合物的物理和/或化学相互作用。在本发明的方法中，如本文所称的反应混合物与怀疑包含D2HG或(D)-2-羟基己二酸的样品接触。为此目的可以使用的样品在本文别处定义。应当在足以允许检测样品所包含的D2HG或(D)-2-羟基己二酸的时间中和条件下接触反应混合物。如本文所用的“接触”也可在包含或含有D2HG或(D)-2-羟基己二酸的宿主细胞中发生。宿主细胞可以是，例如，细菌细胞(例如大肠杆菌)、真菌细胞、植物细胞或哺乳动物细胞(例如人宿主细胞)。所述时间和条件将取决于样品所包含的D2HG或(D)-2-羟基己二酸的量。本领域技术人员熟知取决于宿主细胞、样品种类等需要应用哪些条件。在其他方面，“接触”发生在包含D2HG或(D)-2-羟基己二酸的无细胞系统中。当将其与本文所称的反应混合物接触时，无细胞系统应当允许测量D2HG或(D)-2-羟基己二酸。优选地，本发明的方法在体外进行。
如本文所用的术语“反应混合物”包含溶剂，所述溶剂可以是，例如，水或如本文定义的缓冲剂。其还包含如本文定义的具有氧化态和还原态的染料，其中还原态可以与氧化态区分并且其中染料初始以氧化态存在。反应混合物还包含电子转移剂、(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶和如本文的定义的适当的辅因子。
如本文所用的术语“溶剂”优选地意为缓冲剂,例如,Tris-HCl缓冲剂(Tris缓冲剂),K⁺-磷酸盐缓冲剂、HEPES缓冲剂、MOPS缓冲剂或TES缓冲剂，pH 7.4至8.0。优选地，缓冲剂是0.1M HEPES,pH 8.0。
如本文所用的术语“染料”优选地意为刃天青或四唑盐，诸如XTT、INT、MTT、MTS、TTC、CTC、NBT、WST-1、WST-3、或WST-5、或AmplexRed或AmplexRed Ultra。
术语“电子转移剂”优选地指心肌黄酶、PMS、麦尔多拉蓝(8-二甲基氨基-2,3-苯并吩恶嗪半(氯化锌)盐)、DPIP(2,6-二氯酚靛酚)、或MPMS(1-甲氧基-PMS)。
如本文所用的术语“(D)-2羟基戊二酸脱氢酶”(EC1.1.99.6)是催化尤 其是以下化学反应的酶：

因此，此酶的两种底物是(D)-2-羟基戊二酸和受体，而其两种产物是α酮戊二酸和被还原的受体；也参见图1A。也由此酶催化的另一个化学反应显示在图1B中。受体或辅因子可以是，例如，NAD⁺或NADP⁺或FAD。具有对(D)-2-羟基戊二酸特异性的酶存在于哺乳动物(Achouri等人,2004,Biochem.J.381:35-42)、植物(Engqvist等人,2009,J.Biol.Chem.284(37):25026-37)和细菌(Buckel,1980,Eur.J.Biochem.,106:439-447；Sponholz等人,1981,Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung,172:264-268)中。本发明的工具和方法所优选的(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶显示在图10中。在本发明的方法中，例如，能够以从0.01至0.25微克的量使用(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶，用于检测D2HG。在本发明的方法中，优选地，使用0.1微克的(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶/微量滴定板孔用于检测D2HG；也参见以下实施例。对于估计(D)-2-羟基己二酸的本发明的测定法，需要更高浓度的(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶，例如1至10微克/孔，优选4微克/孔；见图11和实施例2。如本文所用的(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶包含天然的或重组的酶并且也涵盖前述(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶的变体。此类变体与(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶至少具有相同本质的生物学和免疫学性质。特别地，它们共享相同本质的生物学和免疫学性质如果它们能够被本说明书中所称的相同的特异性测定法检测到，例如，被使用特异性识别(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶的多克隆或单克隆抗体的ELISA测定法检测到。此外，应当理解根据本发明所称的变体应当具有由于至少一个氨基酸替换、缺失和/或添加而不同的氨基酸序列，其中变体的氨基酸序列仍然优选地与(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶，优选地发酵氨基酸球菌的(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶的氨基酸序列至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同。(Buckel,1980,Eur.J.Biochem.,106:439-447)。两条氨基酸序列之间的同一性程度原理上可以通过本领域公知的算法测定。优选地，通过在比较窗口上比较两条最优比对的序列测 定同一性程度，其中比较窗口中的氨基酸序列片段较之用于最优比对的参考序列(所述参考序列不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(例如，空位或突出)。通过测定在两条序列中出现相同氨基酸残基的位置数以得到匹配的位置数，用匹配的位置数除以比较窗口中的位置总数并将结果乘以100以得到序列同一性百分比，计算百分比。优选地，序列同一性是在经比较的/比对的序列的全长上。用于比较的最优序列比对可通过Smith和Waterman的局部同源性算法,1981,Add.APL.Math.2:482，通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法，1970,J.Mol.Biol.48:443，通过Pearson和Lipman的相似性搜索方法，1988,Proc.Natl.Acad Sci.(USA)85:2444，通过这些算法的计算机化实施(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、PASTA、和TFASTA,Genetics Computer Group(GCG),575 Science Dr.,Madison,WI)，或通过视觉检查进行。如果已经鉴定了两条序列用于比较，优选采用GAP和BESTFIT以测定其最优比对和，因此，同一性程度。优选地，使用的空位权重的默认值是5.00而空位权重长度是0.30。上文所称的变体可以是等位基因变体或任何其他物种特异性的同源物、旁系同源物、或直向同源物。此外，本文所称的变体包括(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶或前述变体类型的片段，只要这些片段具有如上所称的本质的免疫学和/或生物学性质。此类片段可以是，例如，(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶的降解产物。优选地，所述片段至少50、60、70、80、90、100、150、200或300个氨基酸残基长并具有(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶活性。还包括的是由于翻译后修饰诸如磷酸化或十四烷基化而不同的变体。优选地，如本文所用的(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶也涵盖(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶的前体蛋白。优选地，本文所称的(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶是原核生物或哺乳动物的(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶。人(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶的氨基酸序列描述于登录号Q8N465(版本87)中。人(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶的活性已经由Wickenhagen和同事测定(J.Inherit.Metab.Dis.,2009,32:264-8)。更优选地，(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶是或源自发酵氨基酸球菌的(Buckel,1980,Eur.J.Biochem.,106:439-447；Sponholz等人,1981,Zeitschrift für  Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung,172:264-268；Martins等人,FEBS J.2005 Jan；272(1):269-81)。术语“(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶来自发酵氨基酸球菌”意为(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶包含来自发酵氨基酸球菌(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。例如，在Martins等人,FEBS J.2005 Jan；272(1):269-81(见图1)和在登录号1XDW_A(版本1XDW_A GI:62738423；10.10.2012)中显示了来自发酵氨基酸球菌的(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶的对应的氨基酸序列。此公开物也提供了(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶蛋白家族的其他成员的氨基酸序列，其通过参考并入本文。“源自”意为，例如，所述酶或编码所述酶的基因最初是从发酵氨基酸球菌分离的并且然后通过本领域已知的重组方法已经进一步修饰(例如优化)对应的核酸或氨基酸序列。此类方法可以是，例如，为了提高酶促活性的位点特异性突变等。也涵盖了如本文定义的来自发酵氨基酸球菌的(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶的变体。变体也涵盖了包含这样的核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列能够与编码(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶，优选地来自发酵氨基酸球菌的(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶的特别的核酸序列优选在严格条件下杂交。这些严格条件是本领域技术人员所知晓的并且可见于，例如，在Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.,1989,6.3.1-6.3.6中。严格杂交条件的优选的实例是在约45℃的6 x氯化钠/柠檬酸钠(＝SSC)中的杂交条件，随后为在50至65℃的0.2 x SSC,0.1％SDS中的一个或多个洗涤步骤。技术人员知晓这些杂交条件取决于核酸的类型和，例如，当有机溶剂存在时，关于缓冲剂的温度和浓度而不同。例如，在“标准杂交条件下”温度取决于在浓度为0.1至5x SSC(pH 7.2)的水性缓冲剂中的核酸类型在42℃和58℃之间而不同。如果有机溶剂存在于上述缓冲剂中，例如50％甲酰胺，在标准条件下的温度约为42℃。DNA:DNA杂合体的杂交条件优选为0.1x SSC和20℃至45℃，优选在30℃和45℃之间。DNA:RNA杂合体的杂交条件优选为0.1x SSC和30℃至55℃，优选在45℃和55℃之间。上述杂交温度是对于例如约100bp(＝碱基对)长和G+C含量50％的核酸在不存在甲酰胺的条件下测定的。通过参考教 科书诸如上述教科书，或如下教科书，技术人员知晓如何测定所需的杂交条件：Sambrook等人,1989,“Molecular Cloning”,Cold Spring Harbor Laboratory；Hames和Higgins(编辑),1985,“Nucleic Acids Hybridization:A Practical Approach”,IRL Press at Oxford University Press,Oxford；Brown(编辑),1991,“Essential Molecular Biology:A Practical Approach”,IRL Press at Oxford University Press,Oxford。对于本领域技术人员显而易见，源自不同生物的(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶或使用D2HG作为底物的其他酶也能够用于本发明的方法中，只要它们能够生成合适的读出，诸如NADH或NADPH的生产或转化。备选地，所述酶可以与能够生成此类读出的另一种酶偶联。
辅因子优选是NAD⁺。
样品优选是组织活体检查或组织切片、细胞或细胞裂解物、培养的细胞的上清、血液样品、血清样品、血浆样品，或尿样品。样品也可以是冷冻的细胞或组织或石蜡包埋的细胞或组织。在本发明的方法的一些优选的实施方案中，样品来自罹患如本文别处定义的肿瘤或肿瘤性疾病或另一种疾病或病症的人患者。然而，在本发明的方法的具体实施方案中，设想样品是不含细胞的样品。
优选地，在本发明的方法前，将样品脱蛋白质如果其含有蛋白质。可以通过，例如在37℃过夜孵育含有蛋白质的样品与蛋白酶K实现脱蛋白质。之后，可以用高氯酸沉淀被降解的蛋白质。随后，可以在本发明的方法中分析样品中D2HG的存在。
因此，在本发明的优选的实施方案中，在本发明所述方法的步骤a)前，通过(i)在37℃用蛋白酶K孵育过夜和(ii)用高氯酸蛋白质沉淀，将样品脱蛋白质。
用于测定D2HG或(D)-2-羟基己二酸的存在和/或量的本发明的方法依赖于染料从一个状态转化为另一个状态。例如，在典型的形式中，在反应前染料吸收第一辐射波长。然后染料转变为吸收第二(并且不同的)光波长的产物。通过监控染料从一个状态转化为另一个状态，能够测定D2HG 或(D)-2-羟基己二酸的存在和/或量。本领域已知用于此目的的多种适合的染料。这些指示剂中最常用的是电子受体染料诸如四唑盐。四唑盐在现有技术中是已知的并且包括，例如，MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)、XTT(3'-{(1-苯氨-羰基)-3,4-四唑}-双(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠水合物)、和MTS(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基-l)-2H-四唑,内盐)。
使用四唑盐MTS用于分析细胞活性和增殖的典型测定法已经由Buttke等人,1993,J.Immunol.Methods,157:233-240)描述。Dunigan和同事(1995,BioTechniques,19:640-649)继续描述了代谢的标志之一是经过有机分子的复杂的氧化还原反应生成能量。这些反应中的许多利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐(NADPH)作为氢供体。尽管理论上能够经过分光光度法直接监控NADH和NADPH浓度，从实践的出发点来说，由于存在吸收NADH和NADPH的最大吸收(259nm的λ最大处ε＝16,900)附近的光的众多组分，直接的分光光度法分析是受限的。例如，NAD+、NADP+、DNA、RNA，和大多数蛋白质在约260nm处具有最大吸收。
在本发明方法的一个优选的实施方案中，在XTT/甲臜(formazan)测定法中使用四唑盐XTT，例如在图1C中所示。此测定法使用偶联的两步反应：在第一步中，(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶通过(D)-2-羟基戊二酸氧化为α酮戊二酸催化NAD+还原为NADH和H+(图1A)。备选地，(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶通过(D)-2-羟基己二酸氧化为α酮己二酸催化NAD+还原为NADH和H+(图1B)。在反应的第二步中，XTT(2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-羧基苯胺二钠盐)在电子转移剂N-甲基二苯并吡嗪甲基硫酸盐(PMS)的帮助下被还原为在约490至520nm处强烈吸收的高度有色的甲臜。根据本发明的方法的甲臜的比色检测优选地在450nm处进行。
已经在组织化学定位研究和细胞生物学测定法中广泛使用四唑盐作为检测试剂多年(Altman,1976,Prog.Histochem.Cytochem.9:1-56,Berridge等人,2005,Biotechnology Annual Review 11:127-152)。第二代四 唑染料，XTT(钠2,3,-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(苯氨)-羰基]-2H-四唑内盐)，能够有效用于基于细胞的测定法中以测量细胞生长、细胞毒性、和凋亡(Berridge等人,在上述引文中；Scudiero等人,1988,Cancer Res.48:4827-4833；Marshall等人,1999,Growth Regulation 5:69-84)。XTT被细胞效应子的混合物还原为可溶的、色彩鲜艳的橙色衍生物。通过使用中间体电子载体，PMS(N-甲基二苯并吡嗪甲基硫酸盐)，大大提高了XTT测定法的灵敏度。PMS帮助驱动XTT还原和其甲臜衍生物的形成。
XTT细胞增殖测定法首先由Scudiero等人(在上述引文中)在1988年描述为测量细胞生长和肿瘤细胞系中药物灵敏度的有效方法。XTT是无色或略微黄色的化合物，其在被还原时变为亮橙色。此颜色改变伴随着打破带正电的四级四唑环(Berridge,在上述引文中)。XTT还原的甲臜产物是可溶的并且可以在实时测定法中使用。
认为XTT由于其净负电荷而无法进入细胞(Berridge,在上述引文中)。相当多的证据提示XTT染料还原发生在细胞表面，由跨质膜电子运输协助。认为线粒体氧化还原酶实质性地对XTT应答有贡献，其还原剂被转运至质膜。已经提出XTT测定法实际上测量细胞的吡啶核苷酸的氧化还原状态(Berridge,在上述引文中,Marshall,在上述引文中)。
尽管XTT可以单独作为检测反应使用，然而结果并不是最优的。当一起使用中间体电子受体，诸如PMS(N-甲基二苯并吡嗪甲基硫酸盐)与XTT时，XTT测定法结果大大改善。结果提示PMS通过在细胞表面，或在易接近的质膜位点处获得电子介导XTT还原，并形成然后将XTT还原为其高度有色的甲臜产物的反应性中间体。
在本发明方法的另一个优选的实施方案中，方法使用刃天青/心肌黄酶测定法，例如在图1D中所示。此测定法也使用偶联的两步反应：在第一步中，2-羟基戊二酸脱氢酶通过(D)-2-羟基戊二酸氧化为α酮戊二酸催化NAD+还原为NADH和H+(图1A)。备选地，(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶通过(D)-2-羟基己二酸氧化为α酮己二酸催化NAD+还原为NADH和H+(图1B)。在反应的第二步中，心肌黄酶使用新形成的NADH和H+以催化刃天 青还原为荧光试卤灵。
(D)-2-羟基戊二酸氧化为α酮戊二酸或(D)-2-羟基己二酸氧化为α-酮己二酸导致NADH的生产。在第二个反应中，染料刃天青在反应中被还原，所述反应由在第一个反应中生产的NADH推动并由电子转移剂心肌黄酶催化。优选的电子转移剂心肌黄酶催化刃天青还原为试卤灵，这是由NADH推动的还原。
最终结果是这样的方法，其中通过测量染料的还原间接测量D2HG或(D)-2-羟基己二酸的量，所述还原是经过与底物的氧化(例如，(D)-2-羟基戊二酸至α酮戊二酸的转化或(D)-2-羟基己二酸至α-酮己二酸的转化，通过(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶)连接的反应驱动的。形成的被还原的染料的量与测试的样品中D2HG或(D)-2-羟基己二酸的量成比例。能够量热地或荧光测定地，或通过其他电磁光谱测量仪器测量染料的被还原的形式的生产，取决于染料。可以比色或荧光测定地测量试卤灵。合适的测量仪器是本领域极为知晓的并且可以从众多供应商购买。
特别地，当使用的染料是刃天青时，可以通过吸收比色法或通过荧光测定法检测还原。取决于其纯度水平，刃天青颜色是深蓝色并且基本是无荧光的。试卤灵，刃天青的被还原的形式，是红色并且非常荧光的。当使用比色法时，在本领域公知为试卤灵的最大吸收的波长(约570nm)处监控反应。试卤灵的荧光测量是通过在本领域公知的波长处(约530至560nm)激发并测量发射光谱(本领域知晓在约590nm处具有最大值)进行的。因为荧光测定检测比光谱光度测量检测更灵敏，在本发明的优选的实施方案中，刃天青用作染料并且荧光测定地检测试卤灵的生产。优选地，在此测定法中，在540±10nm处进行激发并在600±10nm处检测发射。
本文描述的方法固有地是定量的，在于生产的染料的被还原的形式的量与分析的样品中的D2HG或(D)-2-羟基己二酸的量是成比例的。本发明的方法也可以用于定性分析，例如，用于检测实体瘤切片中的D2HG。D2HG的测量取决于用于NADH测定的测定法的选择而不同。使用PMS/XTT测定法，优选地在20分钟中每两分钟测定测量值。然后测定线 的斜率以计算D2HG的浓度。使用心肌黄酶/刃天青系统，优选地测量终点，这允许立即计算出测试的样品中D2HG的量。
在本发明的方法的甚至更优选的实施方案中，本发明的方法中的染料的还原态是被由(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶催化的(D)-2-羟基戊二酸至α酮戊二酸的氧化或(D)-2-羟基己二酸至α-酮己二酸的氧化造成的。利用的测定法优选是使用NAD+作为辅因子的刃天青/心肌黄酶测定法。优选地经过荧光光谱学测量如本文所称的染料的还原态的生产。所述测定法的优点从以下实施例中显而易见。
在本发明的方法的另一个优选的实施方案中，方法使用荧光素酶测定法，例如，如图1E中所示。原理上，使用荧光素酶读出的测定法与心肌黄酶/刃天青读出工作方式相同。代替了刃天青，将细菌荧光素酶，FMN和长链醛添加到反应混合物中。在孵育时间(约10-20分钟)后，在酶标仪中测量发光。已经在本领域中描述了荧光素酶测定法(Vaughan&Mopper,1990,Analytica Chimica Acta 231:299–303；Wienhausen&De Luca,1982,Analytical Biochemistry 127:380–388)。
优选地，荧光素酶是细菌荧光素酶。细菌荧光素酶(LU)(I.U.B.:1.14.14.3)通过分子氧催化被还原的黄素单核苷酸(FMNH₂)和长链醛的氧化以产生FMN、对应的酸H₂O和光(Baldwin等人,1975；Balny和Hastings,1975；Becvar和Hastings,1975)。
FMNH₂+RCHO+O₂→FMN+RCO₂H+H₂O+光
在此方面也见Hastings等人,1966的出版物。醛对于反应不是必要的但对发光有惊人的作用。FMN使用Pt或Pd催化剂可以被分子氧还原，或通过连二亚硫酸盐处理还原，但因为FMNH₂如此快速地被空气氧化，NADH的使用是更加可行的实验室方法并且在分析性应用中更有用。J.Woodland Hastings博士的小组研究了细菌荧光素酶发挥产光功能的机制。在描述使用亲和层析部分并快速纯化LU的文章中，Waters等人(1974)描述了高度纯化的荧光素酶的比活性为1.4x10¹⁴量子每秒每毫克。Brolin等人，1971开发了使用细菌荧光素酶的用于痕量代谢中间体的非常灵敏的测 定法，所述中间体可以在吡啶核苷酸依赖性脱氢酶反应中涉及。对于其在测定FMN和FAD中的用途，也见Chappelle和Picciolo，1971。对于其在监控ATP中的用途，见Aflalo和DeLuca，1987。萤火虫荧光素酶作为分子和细胞生物学中的工具的用途的综述由Gould和Subramani，1988给出。酶的临床应用的综述由Kricka,1988给出。
出于以下原因本发明所提供的测定法和方法是有利的：其是均质测定法，易于使用没有要求的溶解步骤。其适于高通量分析并快速地显示结果。此外，其是自动化友好的。测定法是高度灵敏的并且允许检测非常低量的D2HG或(D)-2-羟基己二酸。这特别适用于刃天青/心肌黄酶测定法，如以下实施例中所显示的。最后但并不是最不重要的，所述测定法和方法特征为可复现的准确性：染料吸收与测试的样品中D2HG或(D)-2-羟基己二酸的量成比例。总而言之，本发明提供了用于检测D2HG或(D)-2-羟基己二酸的快速、廉价和灵敏的酶促测定法。例如，D2HG的酶促测定法在肿瘤组织中的定量极限是0.44微摩尔而在血清中是2.77微摩尔。
本发明还涉及包含本文所称的试剂混合物的试剂盒。优选地，试剂盒包含(i)溶剂(优选地缓冲剂，诸如Tris缓冲剂，pH 8.0)，(ii)具有氧化态和还原态的染料(优选地刃天青或四唑盐诸如XTT)，其中还原态可以与氧化态区分，并且其中染料初始以氧化态存在，(iii)电子转移剂(优选地心肌黄酶或PMS或麦尔多拉蓝)，(iv)2-羟基戊二酸脱氢酶，和(v)适当的辅因子(优选地NAD⁺或NADP⁺)。优选地，试剂盒用于测定如本文别处定义的样品中的D2HG或(D)-2-羟基己二酸的存在和/或量。更优选地，试剂盒用于测定罹患如本文别处定义的疾病或病症的对象的样品中的D2HG的存在和/或量。还优选2-羟基戊二酸脱氢酶是或源自发酵氨基酸球菌的。
本发明的方法的定义和实施方案加上必要的变更应用于本发明的试剂盒。
如本文所用的术语“试剂盒”指前述工具的集合，优选地，在单个容器内以单独的形式提供。容器也优选地包含用于实施本发明的方法的说明。本发明因此涉及试剂盒，所述试剂盒包含用于测量本文所称的D2HG或 (D)-2-羟基己二酸的量的所述反应混合物。此类反应混合物的实例以及其使用方法已经在本说明书中给出。试剂盒优选地含有处于即用方式的前述试剂混合物。此外，试剂盒可包含用于建立D2HG或(D)-2-羟基己二酸标准曲线的工具或活性剂，例如预先确定的量的D2HG或(D)-2-羟基己二酸，如在以下实施例中所示。优选地，试剂盒可额外地包含说明，例如，用于建立D2HG或(D)-2-羟基己二酸标准曲线并解释关于由本发明的方法提供的诊断的任何测定的结果的用户手册。特别地，此类手册可包括用于将测定的D2HG的量分配给诊断种类的信息。细节见于本说明书中别处。额外地，此类用户手册可提供关于正确使用试剂盒的组分以测定D2HG或(D)-2-羟基己二酸的一种或多种量的说明。用户手册可以纸或电子形式提供，例如，存储于CD或CD ROM上。本发明也涉及所述试剂盒在根据本发明的任何方法中的用途。
所述试剂盒是有利的因为其是非放射性的并因此是安全的，没有任何有危险的废物。此外当在黑暗中在冷冻下贮藏时，试剂盒在18个月中是稳定的并因此便于贮藏。
此说明书中引用的全部参考文献通过参考关于其整体公开内容和本说明书中具体提及的公开内容以此并入。
附图显示了：
图1：
(A)(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶(D2HG脱氢酶)的反应图解。(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶通过(D)-2-羟基戊二酸氧化为α酮戊二酸催化NAD+还原为NADH和H+。
(B)(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶(D2HG脱氢酶)的反应图解。(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶通过(D)-2-羟基己二酸氧化为α酮己二酸也催化NAD+还原为NADH和H+。
(C)显示使用PMS/XTT测定法的NADH-检测反应，其中经过测量 450nm处的吸收检测生产的甲臜。
(D)描述使用心肌黄酶/刃天青测定法的NADH-检测反应，其中经过荧光测量检测生产的试卤灵，在540nm处激发并在600nm处发射。
(E)显示经过两种额外的酶，心肌黄酶和细菌荧光素酶，并且在氧，黄素单核苷酸(FMN)和长链醛存在下的NADH-检测反应。读出是最后偶联的反应产生的光。
图2：
测定(D)-2-羟基戊二酸(D2HG)的流程图。
(A)通过在37℃用蛋白酶K过夜孵育并随后用高氯酸沉淀对包含蛋白质的样品脱蛋白质。以一式三份实施样品和标准曲线。
(B)D2HG的测量取决于用于NADH测定的测定法的选择而不同：在显示的表中，列出了可能的测定法读出并以细节描述。(i)使用PMS/四唑的吸收测量，(ii)使用心肌黄酶/刃天青的荧光测量，和(iii)使用心肌黄酶/荧光素酶的发光测量。
图3：
分别用于PMS/XTT测定法和心肌黄酶/刃天青测定法的试剂和浓度，用于测量D2HG。
图4：
用于制备D2HG标准曲线的D2HG浓度。
图5：
溶解于水、血清和血浆中并使用PMS/XTT测定法测定的D2HG标准曲线。应用的是针对D2HG的浓度(0至500μM)的斜率。
图6：
使用心肌黄酶/刃天青测定法测量的溶于水中的D2HG标准曲线(一式三份)。
图7：
通过心肌黄酶/刃天青测定法测量的D2HG标准曲线的提取(0至1250pmol D2HG对应于溶于水中的0至50μM)(一式三份)。
图8：
将D2HG在水、血清、和尿中稀释以得到标准曲线(0-375pmol＝0-15μM)。根据图2中的方法制备样品并用心肌黄酶/刃天青读出测定样品。在图中，相对荧光(RFU)是针对D2HG浓度印迹的。
图9：
罹患急性髓性白血病(AML)的患者血清的测量。这些患者携带IDH1突变，所述突变导致D2HG的生产。气相色谱-质谱(GC-MS)(单一测定)和使用心肌黄酶/刃天青读出的本发明的酶测定法(一式三份)的比较。相比之下，已经测试了未携带IDH1突变的健康人的血清。这些样品是D2HG阴性的。
图10：
可以用于本发明的工具和方法的(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶：提示了生物、蛋白长度和登录号。
图11：
分别用于心肌黄酶/刃天青测定法的试剂和浓度，用于测量(D)-2-羟基己二酸。
图12：
使用心肌黄酶/刃天青测定法测量的溶于水中的(D)-2-羟基己二酸标准曲线(一式两份)。
图13：
使用PMS/XTT测定法测量的溶于水中的(D)-2-羟基己二酸的检测(一式两份)。
本发明现由以下实施例进一步说明，然而所述实施例不应理解为限制本发明的范围。
实施例1：测定(D)-2-羟基戊二酸
为了测定(D)-2-羟基戊二酸，使用发酵氨基酸球菌的(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶。该酶最初由Buckel描述(Buckel,1980,Eur.J.Biochem.,106:439-447)，其使用(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶用于测定从戊烯二酸和在发酵饮料诸如酒中酶促形成的D2HG(Buckel,1980,Eur.J.Biochem.,106:439-447；Sponholz等人,1981,Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung,172:264-268)。(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶催化α酮戊二酸至(D)-2-羟基戊二酸的NADH依赖性还原(见图1A)。然而，所述酶也可以在相反方向利用。在酶是活性的中性pH处，反应平衡是在生产D2HG的一侧。因此，当使用所述酶用于测量D2HG时，在仅几个百分比的D2HG已经转化为α-酮戊二酸后反应达到平衡。为了得到完全转化，形成的NADH被PMS/XTT或被心肌黄酶/刃天青不可逆地再氧化，分别导致有色的甲臜或荧光试卤灵。
为了测定D2HG的浓度，在本发明的方法中已经使用了两种不同的方法，即PMS/XTT测定法和心肌黄酶/刃天青测定法：
a)PMS/XTT测定法
在偶联的反应中，四唑盐XXT(2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-羧基苯胺二钠盐)与PMS合作被还原，从而导致可以在450nm波长处检测到的橙色颜色并且可水溶的甲臜(见图1C)。
b)心肌黄酶/刃天青测定法
在偶联的反应中，心肌黄酶使用NADH用于将刃天青还原为荧光试卤灵，所述荧光试卤灵可以在540nm处激发。在600nm处测定发射(见图1D)。
通过使用所述测定法，已经在水、细胞裂解物、血清和血浆和尿中测定了D2HG浓度。在水中测定D2HG不需要测定法之前的任何加工。当使用含有蛋白质的样品时，首先用蛋白酶K在37℃过夜孵育样品。然后，用高氯酸沉淀经消化的蛋白质(见图2(A))。图3显示了用于PMS/XTT测 定法和心肌黄酶/刃天青测定法的试剂和对应的浓度。测定法以96孔形式进行，总测定体积为100μl。平行地，已经建立了具有确定的D2HG浓度的标准曲线(见图4)。标准样品与测试样品进行相同的流程。
如图5中所示，使用PMS/XTT测定法，能够在水、血清或血浆样品中容易地测定D2HG。然而，已经发现在这种情况中，可靠的样品测定仅在含有D2HG浓度大于25μM的样品中是可能的。此外，标准差相对高。
与此相反，使用心肌黄酶/刃天青测定法显著地更灵敏和准确，如从非常小的误差棒和甚至在低D2HG浓度处的高分辨率显而易见的，如可从图6和7得出的。
因此，在测定样品中的D2HG的量中，心肌黄酶/刃天青测定法提供了比PMS/XTT测定法更多的优势。
如在图8中所示，在水、血清和尿中稀释D2HG以得到标准曲线(0 375pmol＝0 15μM)。根据图2的流程制备样品并使用心肌黄酶/刃天青读出测定样品。在图中，相对荧光(RFU)是针对D2HG浓度印迹的。
此外，通过比较气相色谱-质谱(GC-MS，现有技术中的方法选择)和本发明的心肌黄酶/刃天青测定法，已经在AML患者的血清中测定了D2HG，所述患者携带IDH1突变并产生D2HG；见图9。GC-MS测量获得的结果和心肌黄酶/刃天青测定法的结果是可比较的。相比之下，已经测试了未携带IDH1突变的健康人的血清。这些样品是D2HG阴性的。
实施例2：测定(D)-2-羟基己二酸
为了测定(D)-2-羟基己二酸，再次使用发酵氨基酸球菌的(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶(Buckel,在上述引文中)。(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶不仅催化α酮戊二酸至(D)-2-羟基戊二酸的NADH依赖性还原(见图1A)。其也催化α-酮己二酸至(D)-2-羟基己二酸的NADH依赖性还原，尽管亲和力较低(见图1B)。然而，所述酶也可以在相反方向利用。在酶是活性的中性pH处，反应平衡是在生产(D)-2-羟基己二酸的一侧。因此，当使用所述酶用于测量(D)-2-羟基己二酸时，在仅几个百分比的(D)-2-羟基己二酸已经转化为α- 酮己二酸后反应达到平衡。为了得到完全转化，形成的NADH被PMS/XTT或被心肌黄酶/刃天青不可逆地再氧化，分别导致有色的甲臜或荧光试卤灵。
为了测定(D)-2-羟基己二酸的浓度，已经使用了实施例1中提示的两种不同的方法，即PMS/XTT测定法和心肌黄酶/刃天青测定法。
通过使用所述测定法，已经在水中测定了(D)-2-羟基己二酸浓度。在水中测定(D)-2-羟基己二酸不需要测定法之前的任何加工。对于PMS/XTT测定法，如在图3中提示的用于D2HG测量的相同的试剂和浓度已经用于测定(D)-2-羟基己二酸。图11显示了在用于测定(D)-2-羟基己二酸的心肌黄酶/刃天青测定法中使用的试剂和对应的浓度。使用这些测定法以估算(D)-2-羟基己二酸而非D2HG的唯一差异是较高浓度的(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶(用于测量(D)-2-羟基己二酸的多至4微克/孔而非用于测量D2HG的0.1微克/孔)。测定法以96孔形式进行，总测定体积为100μl。平行地，已经建立了具有确定的(D)-2-羟基己二酸浓度的标准曲线(见图4)。标准样品与测试样品进行相同的流程。
使用PMS/XTT测定法，能够在水中容易地测定(D)-2-羟基己二酸；见图13。然而，已经发现在这种情况中，可靠的样品测定仅在含有较高(D)-2-羟基己二酸浓度(高于100微摩尔)的样品中是可能的。此外，标准差相对高。
与此相反，使用心肌黄酶/刃天青测定法显著地更灵敏和准确，如从非常小的误差棒和甚至在更低(D)-2-羟基己二酸浓度处的高分辨率显而易见的；见图12。
因此，再次地，在测定样品中的(D)-2-羟基己二酸的量中，心肌黄酶/刃天青测定法提供了比PMS/XTT测定法更多的优势。