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1、(10)申请公布号 CN 102816202 A (43)申请公布日 2012.12.12 CN 102816202 A *CN102816202A* (21)申请号 201210287132.8 (22)申请日 2012.08.14 C07K 1/24(2006.01) C07H 1/06(2006.01) (71)申请人 上海交通大学 地址 200240 上海市闵行区东川路 800 号 (72)发明人 曹成喜 李国庆 邵菁 樊柳荫 郭陈刚 刘小平 (74)专利代理机构 上海新天专利代理有限公司 31213 代理人 张泽纯 (54) 发明名称 一种整体柱电洗脱装置及其方法 (57) 摘要 一。
2、种整体柱电洗脱装置及其方法， 包括带电 极的电泳槽、 含有目标蛋白质或核酸区带的凝胶 板、 插槽、 透析管以及框架 ； 凝胶板放置在插槽 中， 透析管套设在该插槽外， 且该透析管的两端向 上折叠， 插槽放置在所述的框架内， 且该插槽的长 轴与框架外侧的电极互相平行。本发明通过对实 验用简单材料的组装完成了样品回收这一难题， 具有样品回收率高， 洗脱时间短的特点， 且可同时 进多种样品的洗脱， 操作简单， 可作为理想的洗脱 和预富集方法。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明。
3、书 5 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种整体柱电洗脱装置， 包括带电极的电泳槽 （8） ， 该电泳槽中充满电洗脱缓冲液， 其特征在于 ： 还包括含有目标蛋白质或核酸区带的凝胶板 （1） 、 插槽 （3） 、 透析管 （4） 以及框 架 （5） ； 所述的凝胶板 （1） 放置在插槽 （3） 中， 透析管 （4） 套设在该插槽 （3） 外， 且该透析管 （4） 的两端向上折叠， 插槽 （3） 放置在所述的框架 （5） 内， 且该插槽 （3） 的长轴与框架 （5） 外侧 的电极互相平行。 2. 根据权利要求 1 所述的整体柱电洗脱装置， 其特征在于 ： 所述的插槽 （3） 包括上下 两层。
4、板和位于该上下两层板之间的多个圆柱。 3. 根据权利要求2所述的整体柱电洗脱装置， 其特征在于 ： 所述的圆柱为5个， 圆柱的 直径为 2 mm， 高度为 2-5 mm。 4. 根据权利要求 3 所述的整体柱电洗脱装置， 其特征在于 ： 所述圆柱的高度与含有目 标蛋白质或核酸区带的凝胶板的厚度相适配。 5. 根据权利要求 1 所述的整体柱电洗脱装置， 其特征在于 ： 所述的透析管 （4） 的长度 比所述的插槽的长度长。 6. 根据权利要求 1 所述的整体柱电洗脱装置， 其特征在于 ： 所述框架的长轴前后设有 多个孔道 （7） ， 框架的长轴的左右两侧分别设有洗脱窗口 （6） 。 7. 利用权利。
5、要求 1-6 任一所述的整体柱电洗脱装置的电洗脱方法， 其特征在于， 该方 法包括如下步骤 ： 步骤一、 将含有目标蛋白质或核酸区带的凝胶板放入插槽中 ； 步骤二、 将透析管套在插槽上， 并将透析管一端向上弯折 ； 透析管向下斜 ； 步骤三、 从透析管的另一端加入洗脱液后， 使其向上弯折 ； 步骤四、 将多个套有透析管的插槽放入框架中， 使插槽的长轴与框架外侧的电极平 行 ； 步骤五、 将框架放入电泳槽中进行电洗脱 ； 步骤六、 电洗脱结束后， 取出插槽， 回收蛋白质或核酸。 权 利 要 求 书 CN 102816202 A 2 1/5 页 3 一种整体柱电洗脱装置及其方法 技术领域 0001。
6、 本发明涉及分析化学技术领域， 具体涉及的是一种从凝胶中回收蛋白质或核酸的 整体柱电洗脱装置及其方法。 背景技术 0002 样品的纯化回收是生化实验室的一项常规操作， 也是蛋白质或核酸分析过程中的 关键步骤。 在蛋白质或核酸分析过程中常常需要将特定的蛋白质或核酸从凝胶中分离和提 取出来， 用于后续操作 ( 如 SDS-PAGE、 LC-MS 和 MS 分析鉴定等 )。因此 , 凝胶电泳后蛋白 质或核酸区带的回收直接影响到整个蛋白质或核酸分离分析过程的进程、 结果好坏， 甚至 成败等。 0003 目前， 电泳中蛋白质或核酸区带回收主要有四种洗脱方法。第一种是常规的扩散 方法， 即蛋白质或核酸区带。
7、或斑点从凝胶上切下并切碎放入透析袋中， 之后加入洗脱液进 行洗脱 （Seelert, H., Krause, F., 2008, Electrophoresis, 29, 2617-2636. )。这种 方法简单无需特殊装置， 但洗脱时间较长， 且回收率低。 第二种是基于高速离心的物理提取 方法 （Kurien, B. T., Scoeld, R. H., 2002, Anal. Biochem., 302, 1-9. )。 该方法 操作简单 , 但会导致凝胶污染相应的蛋白质或核酸， 回收损失严重。第三种是通过有机试 剂溶解凝胶回收样品 （Horsten, H.H., 2003, Anal. 。
8、Biochem., 316, 139-141.） 。 这种方 法操作步骤繁琐 , 对操作人员的技术和熟练程度有一定要求， 且涉及有毒化学试剂， 并存 在样品损失， 不适于微量蛋白质或核酸样品的纯化回收。 0004 第四种是蛋白质或核酸区带的电洗脱方法， 也是现在被研究者逐渐接受的方法 （Mondal, S., Mondal, A.K., Mandal, S., 2007, Grana, 46, 9197. )。但常规电洗 脱是将所含蛋白质或核酸区带的凝胶碾碎， 然后电洗脱 ； 因此存在所需时间长、 浓缩作用有 限、 操作繁琐、 回收率低等问题。 发明内容 0005 本发明的目的就是针对以上存在。
9、的洗脱时间长， 低回收率和操作繁琐等问题， 提 供一种蛋白质或核酸整体柱电洗脱装置及其方法， 实现最短时间得到最大回收率的同时， 也可对不同样品进行洗脱。 0006 为了实现上述发明目的， 本发明的技术解决方案如下 ： 一种蛋白质或核酸整体柱电洗脱装置， 包括带电极的电泳槽， 该电泳槽中充满电洗脱 缓冲液， 其特点在于 ： 还包括含有目标蛋白质或核酸区带的凝胶板、 插槽、 透析管以及框 架 ； 所述的凝胶板放置在插槽中， 透析管套设在该插槽外， 且该透析管的两端向上折叠， 此 插槽放置在所述的框架内， 且该插槽的长轴与框架外侧的电极互相平行。 0007 所述的插槽包括上下两层板和位于该上下两层。
10、板之间的多个圆柱。 0008 所述的圆柱为 5 个， 圆柱的直径为 2 mm， 高度为 2-5 mm。 说 明 书 CN 102816202 A 3 2/5 页 4 0009 所述圆柱的高度与含有目标蛋白质或核酸区带的凝胶板的厚度相适配。 0010 所述的透析管的长度比所述的插槽的长度长。 0011 所述框架的长轴前后设有多个孔道、 长轴的左右两侧分别设有洗脱窗口， 保证洗 脱液的自由通过以及电泳洗脱时电流通过。 0012 电泳槽为商品化的常规琼脂糖凝胶电泳仪等， 也可根据实验要求选择合适大小的 电泳槽。 0013 凝胶板可以是琼脂糖凝胶， 也可以是聚丙烯酰胺凝胶。 0014 本发明的具体操作。
11、步骤是 ： 经凝胶电泳分离的含有目标蛋白质或核酸区带的凝胶 板放于插槽中。随后此插槽套上合适的透析管 （长度约为 150 mm， 宽度约为 25 mm） ， 透析管 的长度比插槽稍长， 在透析管中加入约2 ml洗脱液， 插槽两端的透析管向上折叠， 放于电洗 脱框架中。一个框架可用来进行五个插槽的洗脱， 将此组装好的框架放于电泳槽中。注意 插槽的方向平行于电极。只有这种安排才可使蛋白质或核酸电泳迁移距离最短， 从而能够 进行快速、 高效的电洗脱。 0015 与现有技术相比， 本发明的有益效果是 ： （1） 在最短时间得到最大回收率的同时， 也可同时进行不同样品的洗脱， 而且洗脱时间 大大缩短。 。
12、0016 （2） 整个过程无需凝胶的切碎、 融胶、 抽提、 溶解， 离心等操作， 简化了蛋白质或核 酸纯化回收的操作步骤， 避免了操作中有毒化学试剂的使用， 同时也避免了蛋白质或核酸 样品提取、 切碎等步骤中的样品损失。 0017 （3） 制作简单， 成本低廉， 可以同时进行高通量以及多种蛋白质或核酸的洗脱。 0018 附图说明 图 1 是本发明插槽的主视图。 0019 图 2 是本发明插槽的侧视图。 0020 图 3 是本发明插槽的剖视图。 0021 图 4 是本发明的操作示意图。 0022 图 5 是本发明整体柱电洗脱 （A） 与常规电洗脱 （B） 的原理图。 0023 图中 :1. 含有。
13、目标蛋白质或核酸区带的凝胶板， 2. 凝胶， 3. 插槽， 4. 透析管， 5. 框架， 6. 洗脱窗口， 7. 孔道， 8. 电泳槽， 9. 正极， 10. 负极， 11. 含有目标蛋白质或核酸 区带的碎凝胶颗粒。 具体实施方式 0024 以下结合附图并列举实例对本发明的相关内容进行详细阐述。 下述的实验内容都 是在以本发明的相关内容为基础进行试验的， 但是本发明的保护范围不限于下述的实例。 0025 在下列的实验中未注明具体的实验方案和过程， 一般条件下需按照常规条件， 或 者是按照相关的仪器指标或厂商建议的进行操作。 0026 一种蛋白质或核酸电洗脱装置， 包括带电极的电泳槽 8， 该电。
14、泳槽中充满电洗脱缓 冲液， 还包括含有目标蛋白质或核酸区带的凝胶板 1、 插槽 3、 透析管 4 以及框架 5 ； 所述的 凝胶板 1 放置在插槽 3 中， 透析管 4 套设在该插槽 3 外， 且该透析管 4 的两端向上折叠， 插 槽 3 放置在所述的框架 5 内， 且该插槽 3 的长轴与框架 5 外侧的电极互相平行。 说 明 书 CN 102816202 A 4 3/5 页 5 0027 所述的透析管 4 的长度比所述的插槽的长度长。所述框架的长轴前后设有多个孔 道 7、 长轴的左右两侧分别设有洗脱窗口 6。 0028 图 1 是本发明插槽的主视图， 图 2 是本发明插槽的侧视图， 图 3 。
15、是本发明插槽的剖 视图， 如图所示， 本实施例的插槽 3 包括上下两层板和位于该上下两层板之间的 5 个圆柱。 圆柱的直径为 2 mm， 高度为 2-5 mm， 构成大小为 898（2-5） mm 的区室， 圆柱的高度与 含有目标蛋白质或核酸区带的凝胶板的厚度相适配。 透析管规格可根据制作插槽的大小选 择不同的尺寸， 本实施例中透析管的长度约为 150 mm， 宽度约为 25 mm。透析管的长度比插 槽稍长， 在透析管中加入约 2 ml 洗脱液， 插槽两端的透析管向上折叠， 放于电洗脱框架中。 一个框架可用来进行五个插槽的洗脱， 将此组装好的框架放于电泳槽中。注意插槽的方向 平行于电极。 只有。
16、这种安排才可使蛋白质或核酸电泳迁移距离最短， 从而能够进行快速、 高 效的电洗脱。 0029 实施例 1 ： 从琼脂糖凝胶电泳 （AGE） 中电洗脱目标蛋白质 步骤一 ： 进行蛋白质 （如牛血清白蛋白） AGE 用 9 mM 巴比妥缓冲液 （pH 8.6） 制琼脂糖凝胶 （0.8 % 琼脂糖 , w/v） 。样品用标准的 牛血清白蛋白 5 mg 溶解在 5 ml 的 9 mM 巴比妥缓冲液 （pH 8.6） 中， 通过搅拌使其完全溶 解。 然后加入160微升样品溶液上样进行琼脂糖电泳， 电泳电压为100 V， 实验温度为25oC， 电泳时间是35 min。 电泳结束后取出凝胶， 凝胶两边切割下。
17、来进行快速考染， 完成后放回原 胶板处进行未染色蛋白质区带的定位。 0030 步骤二 ： 切割含有目标蛋白质 （如白蛋白） 区带的凝胶板并放入插槽中 根据步骤一定位的目标蛋白质 （如白蛋白） 的部位进行切割， 切下的凝胶板完整移入插 槽中， 可多层放置， 凝胶板的宽度及厚度与插槽吻合， 紧贴在另一侧小圆柱上。 0031 步骤三 ： 插槽套上透析管并加入洗脱液 将准备好的透析管轻轻套在装有含样品凝胶板的插槽上， 插槽两端均多出少许， 随后 一端按住， 倾斜， 在另一端加入 2 ml 9 mM 巴比妥缓冲液 （pH 8.6） ， 排尽气泡。 0032 步骤四 ： 套有透析管的 1-5 个插槽放入框。
18、架中 将处理好的插槽放入框架中， 透析管两端出口向上， 贴在框架上。 制作的框架可同时进 行含有 1-5 个插槽的洗脱。 0033 步骤五 ： 组装好的框架放入电泳槽中进行电洗脱 随后将其安装好的框架放入有洗脱液的电泳槽中进行电泳， 洗脱液是 9 mM 巴比妥缓 冲液 （pH 8.6） ， 电泳电压设置为 100 V， 温度为 25 oC， 电泳时间为 15-20 min。 0034 步骤六 ： 洗脱样品收集 电泳洗脱结束后， 取下插槽， 倒出洗脱液， 离心， 取上清， 测体积。可采用考马斯亮蓝 G-250 染色法测回收蛋白质浓度， 可计算出回收率。 0035 本实施例得到蛋白质回收率可达到 。
19、83%， 而相同条件下采用传统方法仅为 50%， 显 示出巨大的优势。 0036 实施例 2 ： 从聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE） 中电洗脱目标蛋白质 步骤一 ： 进行蛋白质 （如血清蛋白） PAGE PAGE 电泳条件 ： 聚丙烯酰胺分离胶 （T ： 10%， C ： 2.7%） , 聚丙烯酰胺浓缩胶 （T ： 4%, C ： 2.7%） ， 1500 mM Tris-Hcl 分离胶缓冲液 （pH 8.9） ， 500 mM Tris-Hcl 浓缩胶缓冲液 （pH 说 明 书 CN 102816202 A 5 4/5 页 6 6.8） ， 25 mM Tris-Gly电极缓冲液 （pH 8。
20、.3） ， 血清样品溶解于 50 mM Tris-Hcl浓缩胶缓冲 液 （pH 6.8， 含 1% 溴酚蓝） 中， 10 倍稀释， 每孔道 10 微升样品上样， 60 V 电泳直到溴酚蓝 进入分离胶， 然后160 V电泳直至溴酚蓝达到凝胶的下端， 电泳时间是90 min。 电泳结束后 取出凝胶， 凝胶两边切割下来进行快速考染， 完成后放回原胶板处进行未染色蛋白质区带 的定位。 0037 步骤二 ： 切割含有目标蛋白质区带的凝胶板并放入插槽中 根据步骤一定位的目标蛋白质的部位进行切割， 切下的凝胶板完整移入插槽中， 凝胶 板的宽度及厚度与插槽吻合， 紧贴在另一侧小圆柱上。 0038 步骤三 ： 。
21、插槽套上透析管并加入洗脱液 透析管实验前处理好， 长度约为 150 mm， 轻轻套在装有含样品胶条的插槽上， 插槽两端 均多出少许， 随后一端按住倾斜， 在另一端加入 2 ml 25 mM Tris-Gly 缓冲液 （pH 8.3） ， 如 有气泡， 排出。 0039 步骤四 ： 套有透析管的多个插槽放入框架中 将处理好的插槽放入框架中， 透析管两端出口向上， 贴在框架上。 制作的框架可同时进 行含有 1-5 个插槽的洗脱， 满足大量的同类或不同类样品洗脱的需要。 0040 步骤五 ： 组装好的框架放入电泳槽中进行电洗脱 随后将其安装好的框架放入有洗脱液的电泳槽中进行电泳， 洗脱液是 25 m。
22、M Tris-Gly 缓冲液 （pH 8.3） ， 电泳电压设置为 100V， 温度为 25 oC， 电泳时间为 15-30 min。 0041 步骤六 ： 洗脱样品收集 电泳洗脱结束后， 取下插槽， 倒出洗脱液， 离心， 取上清， 测体积。可采用考马斯亮蓝 G-250 染色法测回收蛋白质浓度， 并计算回收率。本实施例得到蛋白质回收率可达到 82%， 而在相同条件下采用传统方法仅为 67%。 0042 实施例 3 ： 从琼脂糖凝胶电泳 （AGE） 中电洗脱目标核酸 步骤一 ： 进行核酸 AGE 按照常规条件进行 DNA 琼脂糖电泳， 胶浓度为 0.5%， 胶中含 EtBr 0.5g/ml, 电。
23、极缓冲 液为 TAE（40 mM， pH 8.0） ， 电压为 4V/cm。电泳完毕后， 凝胶移至紫外灯下 （360 nm） ， 用 高压灭菌过的无菌手术刀片迅速横切出目的条带， 之后关闭紫外灯在可见光下进行后续操 作。 0043 步骤二 ： 将切割好的含有核酸区带的凝胶板并放入插槽中 根据步骤一划出的目标核酸条带， 移出并将完整的凝胶板放入插槽中， 凝胶板的宽度 及厚度与插槽吻合， 紧贴在另一侧小圆柱上。 0044 步骤三 ： 插槽套上透析管并加入洗脱液 将准备好的透析管轻轻套在装有含样品凝胶板的插槽上， 两端均多出少许， 随后一端 按住， 倾斜， 在另一端加入 2 ml 洗脱液 TAE， 。
24、排尽气泡。 0045 步骤四 ： 套有透析管的 1-5 个插槽放入框架中 将处理好的插槽放入框架中， 透析管两端出口向上， 紧贴于框架上。 每个框架可同时进 行含有 1-5 个插槽的洗脱。 0046 步骤五 ： 组装好的框架放入电泳槽中进行电洗脱 随后将其安装好的框架放入有电极液的电泳槽中进行电泳， 电泳电压设置为 8V/cm， 温 说 明 书 CN 102816202 A 6 5/5 页 7 度为 25 oC， 电泳时间为 15-20 min。 0047 步骤六 ： 洗脱样品收集 电泳洗脱结束后， 取下插槽， 倒出洗脱液， 低温离心， 取上清， 测体积。可采用紫外分光 光度法测回收核酸浓度， 可计算出回收率。 说 明 书 CN 102816202 A 7 1/3 页 8 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102816202 A 8 2/3 页 9 图 4 说 明 书 附 图 CN 102816202 A 9 3/3 页 10 图 5 说 明 书 附 图 CN 102816202 A 10 。