耐辐射异常球菌 R1 trkA 基因培育抗旱植物的应用 技术领域 本 发 明 涉 及 耐 辐 射 异 常 球 菌 R1（Deinococcus radiodurans R1） trkA 基 因 （DR1666， GeneID:1798231） 的新功能， 具体涉及该基因在增强植物抗旱抗性方面的应用。
背景技术
钾元素是植物必需的三大矿质元素 (N、 P、 K) 之一， 对植物体具有重要的生理作 + 用。当植物受到盐胁迫时， 大量 Na 从根部进入植物体内， 使 K+ 的吸收受到抑制， 形成低的 + + + + K /Na 比， 从而对植物造成伤害。在这种情况下， 如果能够调节植物体内 K /Na 平衡， 就能 + 抵御过量的 Na 对植物造成的伤害。
HKT(high-affinity K+transporter) 基因家族转运蛋白具有可以调节植物体 + + 内 K /Na 平衡的能力， 广泛存在于植物、 真菌、 真细菌和古细菌中。耐辐射异常球菌 R1 （D.radiodurans R1） 含有 2 个 HKT 类蛋白， 与植物 Na+ 转运关系密切密切相关， 对长期的干 燥和强氧化胁迫具有极强的抗性。
钾是植物体必需的营养元素之一 , 钠是植物生长的功能元素 , 对于大多数植物而 言 , 少量有益 , 过量则会产生毒害。植物对它们的吸收主要靠其体内的通道蛋白和转运载 体。植物 HKT 转运蛋白与真菌 Trk 转运蛋白、 原核生物的 KtrB 和 TrkH 的 K 转运蛋白的联 系紧密 , 真菌中 Trk 转运蛋白是低 K 浓度下主要的 K 吸收系统。大多数植物中都可能存在 HKT 转运蛋白 , 这个基因家族并不是很大 , 在拟南芥中该家族只有一个成员。序列分析推 测 , 这个家族的转运蛋白可能由细菌的 2 次跨膜结构的 K 通道进化而来 , 形成现在的 8 次 跨膜和 4 个圈的一孔结构蛋白。HKT 家族基因主要分为 2 个亚家族 , 亚家族 1 成员是特异 性的 Na 低亲合转运蛋白 , 大部分分布于根系中柱的细胞质膜上 , 尤其是木质部薄壁细胞 膜上 , 负责从木质部汁液中重新获取 Na 而阻止其向地上部的运输 ; 而亚家族 2 成员是 K/ Na 高亲合转运蛋白 , 尤其在 K 缺乏条件下负责对 Na 的吸收从而促进作物的生长 , 主要分 布于根系的皮层和内皮层细胞膜上。
Deinococcus radiodurans（D.radiodurans） 是至今已知生物中最高的辐射抗性 的生物之一。 该菌具有对致死剂量的电离辐射、 UV 辐射以及 DNA 损伤试剂的极端抗性， 能将 电离 辐射造成上百个 DNA 双链断裂的基因组完整恢复如初， 且不发生突变的能力。其极端 的耐辐射能力及其 DNA 损失修复分子机制引起科学界的极大兴趣， 不仅对探索 DNA 修复分 子机理的基础学科有着十分重要意义， 而且对促进新的 DNA 技术的发展以及在环境保护和 生物修复、 人类健康、 生物技术， 乃至地外空间的开发和利用等方面的具有极大潜在应用前 景。 1999 年基因研究所 (TIGR) 完成和公布了 D.radiodurans 基因组全序列 （White1999） 。
尽管已知 D.radiodurans R1 耐辐射菌株中 trkA 编码的蛋白属于 HKT 类蛋白成员， 可能与植物 Na+ 转运在进化上具有协同性， 但目前未见 trkA 在增强植物抗旱抗性功能方面 的研究报道。 发明内容本发明的目的是从 D.radiodurans R1 基因组中发现能够增强植物对高盐的抗性 基因。并将该基因转入植物， 使转入该基因的植物获得耐盐的能力。
本发明通过如下研究， 首次发现， SEQ ID NO:1 所示序列的高亲和钾离子转运体 Deinococcus radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666， GeneID:1798231） 具有抗干旱胁迫的功 能， 可用于培育抗干旱性状的植物 ：
1、 获得含有 D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666） 的重组工程菌株
1）通 过 PCR 方 法， 从 D.radiodurans R1（DSM20539）菌 株 基 因 组 扩 增 出 D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666） ， 基因序列号为 ： GeneID ： 1798231。 其大小为 681bp， 该基因编码 226 个氨基酸， 将其克隆于载体 pGEMT-easy 上， 构建了含有完整 trkA 基因的重 组质粒 pGEMT-trkA ；
2）将 trkA 基因 （DR1666）连接于 pRADZ3 穿梭质粒上， 该质粒含有能在大肠杆 菌和耐辐射异球菌中都起作用的 groEL 启动子， 构建含有 groEL 启动子的完整 trkA 基因 （DR1666） 重组质粒 pRADZ3-trkA G ；
3） 将导入 trkA 基因 （DR1666） 的重组质粒 pRADZ3-trkA G 转入受体大肠杆菌 JM109 中， 获得工程菌株 JM-trkA（详见实施例 1） ；
所述工程菌株任何人都能够通过公开渠道得到。
2、 含有 D.radiodurans R1trkA 基因工程菌株的抗旱实验
实验证实， 经高浓度 （3M） 山梨醇 （Sorbitol） 冲击后， 含有 D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666) 的 JM-trkA 重组菌株生长状况良好， 菌落数高于只含空质粒的 JM-Z3 菌株 （见实施例 2 及图 4） 。 该工程菌株具有耐受 3M 山梨醇 （Sorbitol） 冲击的能力。 （因 Sorbitol 具有吸湿性， 高浓度的 Sorbitol 溶液可以模拟干旱的环境， 详见实施例 2） ， 此实验表明 ： D.radioduransR1 trkA 基因 （DR1666) 具有增强原核生物抗旱的能力。
3、 trkA 基因 （DR1666） 在油菜中表达及转基因植株的干旱抗性鉴定
1） 将 D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666） 连接到植物表达载体 pBI121 中， 构 建具有 trkA 基因 （DR1666） 的重组质粒 pBI121-lea ；
2） 将 pBI121-lea 重组质粒转化油菜中， 获得了能够抗干旱胁迫的转基因油菜植 株；
此实验表明 ： D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666） 具有培育抗干旱植物的用途 （见实施例 3 及图 5 ～ 8） 。 附图说明 ：
图 1 是含有 D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666） 序列的 PCR 产物验证电泳图 谱；
图 2 是含有 D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666） 及 groEL 启动子的原核表达 载体的构建验证电泳图谱 ；
图 3 是在高浓度 3M 山梨醇 （Sorbitol） 冲击前的含有空载体和含有 D.radiodurans R1trkA 基因 （DR1666） 序列的原核表达载体的大肠杆菌的生长状况的菌落照片， 其中 ：
a 是含有空表达载体的大肠杆菌 JM109 菌株 ；
b 是含有 D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666） 表达载体的大肠杆菌重组菌株 ；图 4 是含有 D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666） 的原核表达载体及空载体的 大肠杆菌 （E.coli） 在含 4M NaCl 培养基中的生长情况的菌落照片， 图中的菌株如下 ：
a 是含有空表达载体的大肠杆菌 JM109 菌株 ；
b 是含有 D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666） 表达载体的大肠杆菌重组菌株。
图 5 是干旱胁迫 5 天时非转基因油菜和转 trkA 基因 （DR1666） 油菜的生长状态照 片。
图 6 是干旱胁迫 30 天时非转基因油菜和转 trkA 基因 （DR1666） 油菜的生长状态 照片。
图 5 和图 6 中， 左边是非转基因油菜， 右边是转 trkA 基因 （DR1666） 油菜。 具体实施方式
以下实施例中所举的质粒、 菌株只用于对本发明作进一步详细说明， 并不对本发 明的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的， 均为按照本领域技术人员熟知的常规 条件， 例如 Sambrook 等分子克隆 ： 实验室手册 （New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989） 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
实施例中所举的质粒、 菌株来源如下 ： 克隆载体 pGEMT-easy ： 为 Promrga 公司市售产品 ； 穿梭质粒 pRADZ3 ： 为本实验室保存 ； 植物表达载体 pBI121 ： 为 Clontech 公司市售产品 ； 大肠杆菌 JM109 ： 为北京全式金公司市售产品。根癌农杆菌 EHA105 由本实验室保存。 实施例 1D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666） 序列在大肠杆菌中的表达
根据已公布的 D.radiodurans R1 基因组中的 trkA 基因 （DR1666） 序列设计 1 对 PCR 特异性引物 ：
Up 5 ＇ ATTAACTAGT GTGTGCTCTACACTCAGC3 ＇
Down 5 ＇ ACGCCATATG TTATTCCCCCAGATACCG3 ＇
通过 PCR 方法从 D.radiodurans R1 基因组 DNA 中扩增出目的基因序列。反应条 件： 94℃ 10min， [94℃ 30sec， 58℃ 30sec， 72℃ 1min]35 个循环， 72℃ 10min。PCR 产物经胶 回收后， 克隆于载体 pGEMT-easy 上， 命名为 pGEMT-trkA， 并测序验证 ； 然后通过 SpeI/NdeI 双酶切获得含有粘性末端的 trkA 基因 （DR1666） 及含有启动子 groEL 的 pRADZ3 载体， 将 trkA 基因 （DR1666） 连接于 pRAD Z3 载体上， 构建大肠杆菌表达载体 pRADZ3-trkA G， 将该 表达载体转化大肠杆菌 JM109， 经 PCR、 酶切， 测序验证插入序列正确 （见图 1,2） ， 将该菌株 命名为 JM-trkA。
将含有 pRADZ3 空质粒的 E.coli JM109 命名为 JM-Z3。
实施例 2 含 D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666） 重组菌株的抗旱实验
一、 实验方法
1、 将实施例 1 中获得的 2 个重组的大肠杆菌分别接种于 20mL LB 液体培养基 （含 Amp 抗生素） 中， 摇瓶过夜培养后 （37℃） ， 再转接于 100mL 的 LB 液体培养基中， 尽量保持接 种量的一致， 培养至 OD600 约 0.5 左右 （尽量保持 OD600 值一致） 。
2、 取 10mL 的菌液离心后， 在等体积的 3M 的山梨糖醇溶液中冲击 2h， 每个样品立即 -4 用无菌去离子水倍比稀释至 10 ， 取 10μL 点在 LB 固体培养基表面， 经 37℃培养 16h， 观察 菌落形成情况并照相。
二、 实验结果
图 3 显示， 3M 的山梨糖醇溶液冲击前， 含有 D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666） 的 JM-trkA 菌株与含空质粒的 JM-Z3 菌株生长状态基本一致 ； 4M NaCl 溶液冲击后， 含有 D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666） 的 JM-trkA 重组菌株生长状况良好， 菌落数多于只 含空质粒的 JM-Z3 菌株 （见图 4） 。3M 的山梨糖醇均为高渗溶液， 可模拟干旱胁迫。
三、 实验结论
D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666） 增强了原核生物抗旱的能力。
实施例 3 trkA 基因 （DR1666） 在油菜中表达及转基因植株的干旱抗性鉴定
（一） 农杆菌介导转化油菜实验
1. 根癌农杆菌 EHA105 感受态的制备
1） 挑取单菌落， 接种于 5mL YEB 液体培养基 （含利福平 Rif50mg/L） ， 28℃， 250rpm 振荡培养过夜 ；
2） 取 2mL 菌液， 加入 50mL YEB 液体培养基 （含 Rif50mg/L） 中， 28℃， 250rpm 振荡 培养至 OD600 约 0.6 左右 ；
3） 将菌液转至 50mL 无菌离心管中， 冰浴 30min， 5000×g 离心 5min ；
4） 弃上清， 沉淀用 2mL 20mM CaCl2 重悬， 每份 100μL 分装到 1.5mL 离心管中， 液 氮中保存备用。
2. 重组质粒 DNA 转入农杆菌
1） 将约 1μg 的 pBI121-trkA 质粒 DNA 分别加入到 100μL EHA105 感受态细胞中， 混匀， 冰浴 5min ；
2） 将离心管置液氮中冷冻 8min， 迅速转至 37℃水浴中温浴 5min ；
3） 加入 1mL YEB 液体培养基， 在 28℃摇床上 250rpm 复苏 4 ～ 5h ；
4） 取适量菌液涂布到含利福平 （Rif） 50mg/L 和卡那霉素 （Kan） 100mg/L 的 YEB 固 体培养基上， 置 28℃培养 24 ～ 48h。
3. 农杆菌质粒 DNA 的提取
1） 挑取菌落于含利福平 （Rif)50mg/L 和卡那霉素 （Kan） 100mg/L 的 YEB 液体培养 基中 （YEB ： 胰蛋白胨 5g/L， 酵母提取物 1g/L， 蔗糖 5g/L， 硫酸镁 0.5g/L） ， 28℃， 250rpm 振荡 培养 20h ；
2） 取 1.5mL 菌液离心后， 弃上清， 用 STE 溶液 （Tris-HCI10mM pH8.0， NaCl10mM， EDTA10mM pH8.0） 洗涤 2 次， 弃上清， 加入预冷的溶液 （ I 50mM 葡萄糖， 25mM Tris-HCl pH8.0， 10mM EDTA pH8.0， RNase A100μg/mL） 300μL， 用移液器反复抽吸混匀， 室温静置 10min ；
3） 加入新鲜配置的溶液 II（0.2M NaOH,1%SDS） 600μL， 上下颠倒几次混匀 ；
4） 加入预冷的溶液 III （5M 乙酸钾 pH5.2， 冰醋酸 11.5mL， 加水至 100mL） 450 μL， 充分混匀， 冰浴 5min， 4℃ 12000×g 离心 5min， 上清加入 0.6 倍体积的异丙醇沉淀 ；
5） 沉淀加 50μL TE（Tris-HCl10mmol/L,1mmol/L EDTA,pH8.0） 溶解后， 经 PCR、 Bam HI、 Sac I 双酶切验证。4. 油菜无菌苗的准备及农杆菌介导的 trkA 基因 （DR1666） 遗传转化
1） 油菜无菌苗的培养
甘蓝型油菜 （Brassica napus L.） （84100-18） 种子在超净工作台上用灭菌水浸 泡 10min， 10% 的 NaClO 灭菌 12min， 再用 0.1% 的升汞溶液消毒 7-8min， 用灭菌水洗 3-5 遍， 并把灭菌的油菜种子均匀地摆放在无激素的预培养基上 （7.5% 琼脂） 。 光照培养， 4-5d 龄油 菜幼苗最适于遗传转化。
2） 预培养
用 75% 的酒精和高温消毒灭菌的剪刀剪掉子叶和生长点， 剪取油菜无菌苗紧邻 生长点下约 0.5cm 长的下胚轴， 置于预培养基 （MS+6-BA2mg/L+2,4-D1mg/L+AgNO32.5mg/ L+AS19.62mg/L） 上， 光照预培养 2d。
3） 农杆菌的培养
在 50mL LB 液 体 培 养 基 （含 卡 那 霉 素 100mg/L、利 福 平 50mg/L）中 加 入 0.1mLlea-EHA105 菌液， 28℃下 220rpm 振荡培养 16h 左右， 室温下 4000×g 离心 10min， 弃 上清液， 菌体用灭菌的 MS 液体培养基 （含 AS100μmol/L） 悬浮， 稀释到原体积的 5-20 倍， 在 28℃下 220rpm 振荡培养 1h， 使菌液的 OD600 达 0.5 左右。 4） 共培养
把预培养 2d 的下胚轴放入菌液中浸染 1min， 用药勺捞出下胚轴， 放在灭菌的吸水 纸上， 吸干下胚轴上的多余菌液， 再放到覆盖有灭菌滤纸的预培养基上， 用封口膜封好培养 皿， 25℃左右， 于暗处共培养约 2d（暗培养） 。
5） 诱导培养
把共培养 2d 的下胚轴放到诱导培养基 （MS+6-BA2mg/L+AgNO32.5mg/L） 上， 用封口 膜封好培养皿， 25℃左右光照培养， 每 2 周继代 1 次， 直至长出膨大的愈伤组织。
6） 选择培养
把膨大的愈伤组织转移到筛选培养基 （MS+6-BA2mg/L+AgNO32.5mg/L+Kan100mg/ L） 上， 用封口膜封好培养皿， 25℃左右光照培养， 每 2 周继代 1 次， 直至长出苗。
7） 生根培养
当 幼 芽 长 到 1-2cm 高 时， 把 它 们 从 愈 伤 组 织 上 分 离， 转移到生根培养基上 （1/2MS+NAA0.5mg/L+Kan25mg/L） 进行生根培养。在抗生素筛选条件下， 约 87% 的芽在 2 周 后形成根。
8） 炼苗和移栽
生根后的幼苗长到 5-6cm 高时， 半敞开培养瓶盖子， 进行炼苗 ； 待幼苗适应外界环 境以后， 转移到室内灭菌的蛭石中栽种培养， 并用 1/2MS 培养液浇灌。当幼苗生长至 7-9cm 时， 将幼苗移植到泥土中生长， 然后再进行下一步实验。
（二） 含 trkA 基因 （DR1666） 序列转基因油菜的抗旱性鉴定
1、 实验目的
鉴于该核苷酸序列已被证明在大肠杆菌中对干旱胁迫具有抗性， 进一步对转基因 植株进行抗旱性鉴定。
2、 实验方法
进行了 30 株转基因油菜植株和 30 株非转基因油菜植株的实验， 方法是对苗期的
转基因油菜植株和非转基因油菜植株均分别一次性浇足营养液后不再浇水， 并进行以下实 验对比 ：
1） 观察油菜植株的生长情况
从浇足营养液后的当天开始起算， 第 2 天～第 27 天不再浇水及营养液 ；
第 28 天起恢复浇水， 并在第 28 天当日浇足营养液， 之后仅酌情浇水。
2） 测定叶片含水量
从停止浇水第二天起， 每隔一天测定叶片相对含水量 (Relativewatercontent) ；
含水量的测定方法 ： 从植株上取下约 0.1g 叶片后， 立即称取鲜重 (FW)， 然后将叶 片浸入去离子水中 4h， 取出用滤纸吸去表面水分， 称取饱和鲜重 (TW)， 然后将叶片放入烘 箱于 70℃烘干至恒重， 称取干重 (DW)。
相对含水量 （RWC） 按下式计算 ：
RWC(%) ＝ (FW-DW)/(TW-DW)×l00%。
3、 实验结果
1） 油菜植株的生长情况对比结果
干早胁迫第 6 天时， 非转基因油菜在叶片己经开始萎蔫 ； 转基因油菜叶片饱满， 生 长正常 ； （见图 5）
干旱胁迫第 12 天时， 非转基因油菜失水严重， 叶片萎蔫 ； 转基因油菜依然正常生长； 干旱胁迫第 18 天时， 非转基因油菜叶片萎蔫、 变黄 ； 转基因油菜的叶片才开始萎 蔫； 干旱胁迫第 30 天时， 非转基因油菜干枯死亡， 转基因油菜叶片萎蔫 （见图 6） ；
第 28 天起恢复浇水， 在第 30 天非转基因油菜已死亡 ； 而转 trkA 基因 （DR1666） 的 油菜复水后迅速恢复生长， 叶片变绿。
表 1 转基因油菜和非转基因油菜对干旱胁迫的比较
2） 叶片含水量测定结果
从以下表 2 可看出 ： 在干早胁迫处理的 30 天中， 非转基因油菜叶片相对含水量急 剧下降， 转 trkA 基因 （DR1666） 油菜叶片失水速度明显比非转基因油菜缓慢， 叶片相对含水 量逐渐下降 ；
随着干旱处理时间的延长， 转基因油菜与非转基因油菜相对含水量的差异逐渐明 显； 在干早胁迫第 30 天时， 非转基因油菜的叶片相对含水量降至 32.67%， 而转基因油菜的 叶片相对含水量为 72.98%， 约为非转基因油菜含水量的 2 倍多。
表 2 在干旱胁迫下转基因油菜和非转基因油菜叶片相对含水量比较
注： 表 2 中数据是转基因油菜 30 棵植株和非转基因油菜各 30 棵植株分别计算的 4、 实验结论 上述所有结果均表明， 所克隆的 trkA 基因 （DR1666） 具有对干旱胁迫的抗性。平均值。
背景技术
钾元素是植物必需的三大矿质元素 (N、 P、 K) 之一， 对植物体具有重要的生理作 + 用。当植物受到盐胁迫时， 大量 Na 从根部进入植物体内， 使 K+ 的吸收受到抑制， 形成低的 + + + + K /Na 比， 从而对植物造成伤害。在这种情况下， 如果能够调节植物体内 K /Na 平衡， 就能 + 抵御过量的 Na 对植物造成的伤害。
HKT(high-affinity K+transporter) 基因家族转运蛋白具有可以调节植物体 + + 内 K /Na 平衡的能力， 广泛存在于植物、 真菌、 真细菌和古细菌中。耐辐射异常球菌 R1 （D.radiodurans R1） 含有 2 个 HKT 类蛋白， 与植物 Na+ 转运关系密切密切相关， 对长期的干 燥和强氧化胁迫具有极强的抗性。
钾是植物体必需的营养元素之一 , 钠是植物生长的功能元素 , 对于大多数植物而 言 , 少量有益 , 过量则会产生毒害。植物对它们的吸收主要靠其体内的通道蛋白和转运载 体。植物 HKT 转运蛋白与真菌 Trk 转运蛋白、 原核生物的 KtrB 和 TrkH 的 K 转运蛋白的联 系紧密 , 真菌中 Trk 转运蛋白是低 K 浓度下主要的 K 吸收系统。大多数植物中都可能存在 HKT 转运蛋白 , 这个基因家族并不是很大 , 在拟南芥中该家族只有一个成员。序列分析推 测 , 这个家族的转运蛋白可能由细菌的 2 次跨膜结构的 K 通道进化而来 , 形成现在的 8 次 跨膜和 4 个圈的一孔结构蛋白。HKT 家族基因主要分为 2 个亚家族 , 亚家族 1 成员是特异 性的 Na 低亲合转运蛋白 , 大部分分布于根系中柱的细胞质膜上 , 尤其是木质部薄壁细胞 膜上 , 负责从木质部汁液中重新获取 Na 而阻止其向地上部的运输 ; 而亚家族 2 成员是 K/ Na 高亲合转运蛋白 , 尤其在 K 缺乏条件下负责对 Na 的吸收从而促进作物的生长 , 主要分 布于根系的皮层和内皮层细胞膜上。
Deinococcus radiodurans（D.radiodurans） 是至今已知生物中最高的辐射抗性 的生物之一。 该菌具有对致死剂量的电离辐射、 UV 辐射以及 DNA 损伤试剂的极端抗性， 能将 电离 辐射造成上百个 DNA 双链断裂的基因组完整恢复如初， 且不发生突变的能力。其极端 的耐辐射能力及其 DNA 损失修复分子机制引起科学界的极大兴趣， 不仅对探索 DNA 修复分 子机理的基础学科有着十分重要意义， 而且对促进新的 DNA 技术的发展以及在环境保护和 生物修复、 人类健康、 生物技术， 乃至地外空间的开发和利用等方面的具有极大潜在应用前 景。 1999 年基因研究所 (TIGR) 完成和公布了 D.radiodurans 基因组全序列 （White1999） 。
尽管已知 D.radiodurans R1 耐辐射菌株中 trkA 编码的蛋白属于 HKT 类蛋白成员， 可能与植物 Na+ 转运在进化上具有协同性， 但目前未见 trkA 在增强植物抗旱抗性功能方面 的研究报道。 发明内容本发明的目的是从 D.radiodurans R1 基因组中发现能够增强植物对高盐的抗性 基因。并将该基因转入植物， 使转入该基因的植物获得耐盐的能力。
本发明通过如下研究， 首次发现， SEQ ID NO:1 所示序列的高亲和钾离子转运体 Deinococcus radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666， GeneID:1798231） 具有抗干旱胁迫的功 能， 可用于培育抗干旱性状的植物 ：
1、 获得含有 D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666） 的重组工程菌株
1）通 过 PCR 方 法， 从 D.radiodurans R1（DSM20539）菌 株 基 因 组 扩 增 出 D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666） ， 基因序列号为 ： GeneID ： 1798231。 其大小为 681bp， 该基因编码 226 个氨基酸， 将其克隆于载体 pGEMT-easy 上， 构建了含有完整 trkA 基因的重 组质粒 pGEMT-trkA ；
2）将 trkA 基因 （DR1666）连接于 pRADZ3 穿梭质粒上， 该质粒含有能在大肠杆 菌和耐辐射异球菌中都起作用的 groEL 启动子， 构建含有 groEL 启动子的完整 trkA 基因 （DR1666） 重组质粒 pRADZ3-trkA G ；
3） 将导入 trkA 基因 （DR1666） 的重组质粒 pRADZ3-trkA G 转入受体大肠杆菌 JM109 中， 获得工程菌株 JM-trkA（详见实施例 1） ；
所述工程菌株任何人都能够通过公开渠道得到。
2、 含有 D.radiodurans R1trkA 基因工程菌株的抗旱实验
实验证实， 经高浓度 （3M） 山梨醇 （Sorbitol） 冲击后， 含有 D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666) 的 JM-trkA 重组菌株生长状况良好， 菌落数高于只含空质粒的 JM-Z3 菌株 （见实施例 2 及图 4） 。 该工程菌株具有耐受 3M 山梨醇 （Sorbitol） 冲击的能力。 （因 Sorbitol 具有吸湿性， 高浓度的 Sorbitol 溶液可以模拟干旱的环境， 详见实施例 2） ， 此实验表明 ： D.radioduransR1 trkA 基因 （DR1666) 具有增强原核生物抗旱的能力。
3、 trkA 基因 （DR1666） 在油菜中表达及转基因植株的干旱抗性鉴定
1） 将 D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666） 连接到植物表达载体 pBI121 中， 构 建具有 trkA 基因 （DR1666） 的重组质粒 pBI121-lea ；
2） 将 pBI121-lea 重组质粒转化油菜中， 获得了能够抗干旱胁迫的转基因油菜植 株；
此实验表明 ： D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666） 具有培育抗干旱植物的用途 （见实施例 3 及图 5 ～ 8） 。 附图说明 ：
图 1 是含有 D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666） 序列的 PCR 产物验证电泳图 谱；
图 2 是含有 D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666） 及 groEL 启动子的原核表达 载体的构建验证电泳图谱 ；
图 3 是在高浓度 3M 山梨醇 （Sorbitol） 冲击前的含有空载体和含有 D.radiodurans R1trkA 基因 （DR1666） 序列的原核表达载体的大肠杆菌的生长状况的菌落照片， 其中 ：
a 是含有空表达载体的大肠杆菌 JM109 菌株 ；
b 是含有 D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666） 表达载体的大肠杆菌重组菌株 ；图 4 是含有 D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666） 的原核表达载体及空载体的 大肠杆菌 （E.coli） 在含 4M NaCl 培养基中的生长情况的菌落照片， 图中的菌株如下 ：
a 是含有空表达载体的大肠杆菌 JM109 菌株 ；
b 是含有 D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666） 表达载体的大肠杆菌重组菌株。
图 5 是干旱胁迫 5 天时非转基因油菜和转 trkA 基因 （DR1666） 油菜的生长状态照 片。
图 6 是干旱胁迫 30 天时非转基因油菜和转 trkA 基因 （DR1666） 油菜的生长状态 照片。
图 5 和图 6 中， 左边是非转基因油菜， 右边是转 trkA 基因 （DR1666） 油菜。 具体实施方式
以下实施例中所举的质粒、 菌株只用于对本发明作进一步详细说明， 并不对本发 明的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的， 均为按照本领域技术人员熟知的常规 条件， 例如 Sambrook 等分子克隆 ： 实验室手册 （New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989） 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
实施例中所举的质粒、 菌株来源如下 ： 克隆载体 pGEMT-easy ： 为 Promrga 公司市售产品 ； 穿梭质粒 pRADZ3 ： 为本实验室保存 ； 植物表达载体 pBI121 ： 为 Clontech 公司市售产品 ； 大肠杆菌 JM109 ： 为北京全式金公司市售产品。根癌农杆菌 EHA105 由本实验室保存。 实施例 1D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666） 序列在大肠杆菌中的表达
根据已公布的 D.radiodurans R1 基因组中的 trkA 基因 （DR1666） 序列设计 1 对 PCR 特异性引物 ：
Up 5 ＇ ATTAACTAGT GTGTGCTCTACACTCAGC3 ＇
Down 5 ＇ ACGCCATATG TTATTCCCCCAGATACCG3 ＇
通过 PCR 方法从 D.radiodurans R1 基因组 DNA 中扩增出目的基因序列。反应条 件： 94℃ 10min， [94℃ 30sec， 58℃ 30sec， 72℃ 1min]35 个循环， 72℃ 10min。PCR 产物经胶 回收后， 克隆于载体 pGEMT-easy 上， 命名为 pGEMT-trkA， 并测序验证 ； 然后通过 SpeI/NdeI 双酶切获得含有粘性末端的 trkA 基因 （DR1666） 及含有启动子 groEL 的 pRADZ3 载体， 将 trkA 基因 （DR1666） 连接于 pRAD Z3 载体上， 构建大肠杆菌表达载体 pRADZ3-trkA G， 将该 表达载体转化大肠杆菌 JM109， 经 PCR、 酶切， 测序验证插入序列正确 （见图 1,2） ， 将该菌株 命名为 JM-trkA。
将含有 pRADZ3 空质粒的 E.coli JM109 命名为 JM-Z3。
实施例 2 含 D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666） 重组菌株的抗旱实验
一、 实验方法
1、 将实施例 1 中获得的 2 个重组的大肠杆菌分别接种于 20mL LB 液体培养基 （含 Amp 抗生素） 中， 摇瓶过夜培养后 （37℃） ， 再转接于 100mL 的 LB 液体培养基中， 尽量保持接 种量的一致， 培养至 OD600 约 0.5 左右 （尽量保持 OD600 值一致） 。
2、 取 10mL 的菌液离心后， 在等体积的 3M 的山梨糖醇溶液中冲击 2h， 每个样品立即 -4 用无菌去离子水倍比稀释至 10 ， 取 10μL 点在 LB 固体培养基表面， 经 37℃培养 16h， 观察 菌落形成情况并照相。
二、 实验结果
图 3 显示， 3M 的山梨糖醇溶液冲击前， 含有 D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666） 的 JM-trkA 菌株与含空质粒的 JM-Z3 菌株生长状态基本一致 ； 4M NaCl 溶液冲击后， 含有 D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666） 的 JM-trkA 重组菌株生长状况良好， 菌落数多于只 含空质粒的 JM-Z3 菌株 （见图 4） 。3M 的山梨糖醇均为高渗溶液， 可模拟干旱胁迫。
三、 实验结论
D.radiodurans R1 trkA 基因 （DR1666） 增强了原核生物抗旱的能力。
实施例 3 trkA 基因 （DR1666） 在油菜中表达及转基因植株的干旱抗性鉴定
（一） 农杆菌介导转化油菜实验
1. 根癌农杆菌 EHA105 感受态的制备
1） 挑取单菌落， 接种于 5mL YEB 液体培养基 （含利福平 Rif50mg/L） ， 28℃， 250rpm 振荡培养过夜 ；
2） 取 2mL 菌液， 加入 50mL YEB 液体培养基 （含 Rif50mg/L） 中， 28℃， 250rpm 振荡 培养至 OD600 约 0.6 左右 ；
3） 将菌液转至 50mL 无菌离心管中， 冰浴 30min， 5000×g 离心 5min ；
4） 弃上清， 沉淀用 2mL 20mM CaCl2 重悬， 每份 100μL 分装到 1.5mL 离心管中， 液 氮中保存备用。
2. 重组质粒 DNA 转入农杆菌
1） 将约 1μg 的 pBI121-trkA 质粒 DNA 分别加入到 100μL EHA105 感受态细胞中， 混匀， 冰浴 5min ；
2） 将离心管置液氮中冷冻 8min， 迅速转至 37℃水浴中温浴 5min ；
3） 加入 1mL YEB 液体培养基， 在 28℃摇床上 250rpm 复苏 4 ～ 5h ；
4） 取适量菌液涂布到含利福平 （Rif） 50mg/L 和卡那霉素 （Kan） 100mg/L 的 YEB 固 体培养基上， 置 28℃培养 24 ～ 48h。
3. 农杆菌质粒 DNA 的提取
1） 挑取菌落于含利福平 （Rif)50mg/L 和卡那霉素 （Kan） 100mg/L 的 YEB 液体培养 基中 （YEB ： 胰蛋白胨 5g/L， 酵母提取物 1g/L， 蔗糖 5g/L， 硫酸镁 0.5g/L） ， 28℃， 250rpm 振荡 培养 20h ；
2） 取 1.5mL 菌液离心后， 弃上清， 用 STE 溶液 （Tris-HCI10mM pH8.0， NaCl10mM， EDTA10mM pH8.0） 洗涤 2 次， 弃上清， 加入预冷的溶液 （ I 50mM 葡萄糖， 25mM Tris-HCl pH8.0， 10mM EDTA pH8.0， RNase A100μg/mL） 300μL， 用移液器反复抽吸混匀， 室温静置 10min ；
3） 加入新鲜配置的溶液 II（0.2M NaOH,1%SDS） 600μL， 上下颠倒几次混匀 ；
4） 加入预冷的溶液 III （5M 乙酸钾 pH5.2， 冰醋酸 11.5mL， 加水至 100mL） 450 μL， 充分混匀， 冰浴 5min， 4℃ 12000×g 离心 5min， 上清加入 0.6 倍体积的异丙醇沉淀 ；
5） 沉淀加 50μL TE（Tris-HCl10mmol/L,1mmol/L EDTA,pH8.0） 溶解后， 经 PCR、 Bam HI、 Sac I 双酶切验证。4. 油菜无菌苗的准备及农杆菌介导的 trkA 基因 （DR1666） 遗传转化
1） 油菜无菌苗的培养
甘蓝型油菜 （Brassica napus L.） （84100-18） 种子在超净工作台上用灭菌水浸 泡 10min， 10% 的 NaClO 灭菌 12min， 再用 0.1% 的升汞溶液消毒 7-8min， 用灭菌水洗 3-5 遍， 并把灭菌的油菜种子均匀地摆放在无激素的预培养基上 （7.5% 琼脂） 。 光照培养， 4-5d 龄油 菜幼苗最适于遗传转化。
2） 预培养
用 75% 的酒精和高温消毒灭菌的剪刀剪掉子叶和生长点， 剪取油菜无菌苗紧邻 生长点下约 0.5cm 长的下胚轴， 置于预培养基 （MS+6-BA2mg/L+2,4-D1mg/L+AgNO32.5mg/ L+AS19.62mg/L） 上， 光照预培养 2d。
3） 农杆菌的培养
在 50mL LB 液 体 培 养 基 （含 卡 那 霉 素 100mg/L、利 福 平 50mg/L）中 加 入 0.1mLlea-EHA105 菌液， 28℃下 220rpm 振荡培养 16h 左右， 室温下 4000×g 离心 10min， 弃 上清液， 菌体用灭菌的 MS 液体培养基 （含 AS100μmol/L） 悬浮， 稀释到原体积的 5-20 倍， 在 28℃下 220rpm 振荡培养 1h， 使菌液的 OD600 达 0.5 左右。 4） 共培养
把预培养 2d 的下胚轴放入菌液中浸染 1min， 用药勺捞出下胚轴， 放在灭菌的吸水 纸上， 吸干下胚轴上的多余菌液， 再放到覆盖有灭菌滤纸的预培养基上， 用封口膜封好培养 皿， 25℃左右， 于暗处共培养约 2d（暗培养） 。
5） 诱导培养
把共培养 2d 的下胚轴放到诱导培养基 （MS+6-BA2mg/L+AgNO32.5mg/L） 上， 用封口 膜封好培养皿， 25℃左右光照培养， 每 2 周继代 1 次， 直至长出膨大的愈伤组织。
6） 选择培养
把膨大的愈伤组织转移到筛选培养基 （MS+6-BA2mg/L+AgNO32.5mg/L+Kan100mg/ L） 上， 用封口膜封好培养皿， 25℃左右光照培养， 每 2 周继代 1 次， 直至长出苗。
7） 生根培养
当 幼 芽 长 到 1-2cm 高 时， 把 它 们 从 愈 伤 组 织 上 分 离， 转移到生根培养基上 （1/2MS+NAA0.5mg/L+Kan25mg/L） 进行生根培养。在抗生素筛选条件下， 约 87% 的芽在 2 周 后形成根。
8） 炼苗和移栽
生根后的幼苗长到 5-6cm 高时， 半敞开培养瓶盖子， 进行炼苗 ； 待幼苗适应外界环 境以后， 转移到室内灭菌的蛭石中栽种培养， 并用 1/2MS 培养液浇灌。当幼苗生长至 7-9cm 时， 将幼苗移植到泥土中生长， 然后再进行下一步实验。
（二） 含 trkA 基因 （DR1666） 序列转基因油菜的抗旱性鉴定
1、 实验目的
鉴于该核苷酸序列已被证明在大肠杆菌中对干旱胁迫具有抗性， 进一步对转基因 植株进行抗旱性鉴定。
2、 实验方法
进行了 30 株转基因油菜植株和 30 株非转基因油菜植株的实验， 方法是对苗期的
转基因油菜植株和非转基因油菜植株均分别一次性浇足营养液后不再浇水， 并进行以下实 验对比 ：
1） 观察油菜植株的生长情况
从浇足营养液后的当天开始起算， 第 2 天～第 27 天不再浇水及营养液 ；
第 28 天起恢复浇水， 并在第 28 天当日浇足营养液， 之后仅酌情浇水。
2） 测定叶片含水量
从停止浇水第二天起， 每隔一天测定叶片相对含水量 (Relativewatercontent) ；
含水量的测定方法 ： 从植株上取下约 0.1g 叶片后， 立即称取鲜重 (FW)， 然后将叶 片浸入去离子水中 4h， 取出用滤纸吸去表面水分， 称取饱和鲜重 (TW)， 然后将叶片放入烘 箱于 70℃烘干至恒重， 称取干重 (DW)。
相对含水量 （RWC） 按下式计算 ：
RWC(%) ＝ (FW-DW)/(TW-DW)×l00%。
3、 实验结果
1） 油菜植株的生长情况对比结果
干早胁迫第 6 天时， 非转基因油菜在叶片己经开始萎蔫 ； 转基因油菜叶片饱满， 生 长正常 ； （见图 5）
干旱胁迫第 12 天时， 非转基因油菜失水严重， 叶片萎蔫 ； 转基因油菜依然正常生长； 干旱胁迫第 18 天时， 非转基因油菜叶片萎蔫、 变黄 ； 转基因油菜的叶片才开始萎 蔫； 干旱胁迫第 30 天时， 非转基因油菜干枯死亡， 转基因油菜叶片萎蔫 （见图 6） ；
第 28 天起恢复浇水， 在第 30 天非转基因油菜已死亡 ； 而转 trkA 基因 （DR1666） 的 油菜复水后迅速恢复生长， 叶片变绿。
表 1 转基因油菜和非转基因油菜对干旱胁迫的比较
2） 叶片含水量测定结果
从以下表 2 可看出 ： 在干早胁迫处理的 30 天中， 非转基因油菜叶片相对含水量急 剧下降， 转 trkA 基因 （DR1666） 油菜叶片失水速度明显比非转基因油菜缓慢， 叶片相对含水 量逐渐下降 ；
随着干旱处理时间的延长， 转基因油菜与非转基因油菜相对含水量的差异逐渐明 显； 在干早胁迫第 30 天时， 非转基因油菜的叶片相对含水量降至 32.67%， 而转基因油菜的 叶片相对含水量为 72.98%， 约为非转基因油菜含水量的 2 倍多。
表 2 在干旱胁迫下转基因油菜和非转基因油菜叶片相对含水量比较
注： 表 2 中数据是转基因油菜 30 棵植株和非转基因油菜各 30 棵植株分别计算的 4、 实验结论 上述所有结果均表明， 所克隆的 trkA 基因 （DR1666） 具有对干旱胁迫的抗性。平均值。
9CN 102807990 A
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