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1、10申请公布号CN104136466A43申请公布日20141105CN104136466A21申请号201280070938X22申请日2012122061/631,26820111230USC08B15/02200601C12P19/14200601C10G3/00200601C12P7/14200601C12P7/1020060171申请人麦兰特公司地址美国马萨诸塞州72发明人汪斌Z威尔森R辛格74专利代理机构北京市中咨律师事务所11247代理人张双双刘金辉54发明名称集成生物精制57摘要本发明涉及使用木质纤维素生物质作为碳源制备生物燃料或可再生化学原料的生物精制操作。本发明提供在回收可。
2、发酵糖中预处理生物质纤维素生物质的成本有效的方法。更具体而言，本发明描述了由木质纤维素生物质有效回收和使用六碳和五碳糖与附加值寡糖如木糖型寡糖的集成方式，使得制备生物燃料或可再生化学原料的成本显著降低。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014082986PCT国际申请的申请数据PCT/US2012/0709022012122087PCT国际申请的公布数据WO2013/101650EN2013070451INTCL权利要求书1页说明书21页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书21页附图2页10申请公布号CN104136466ACN104136。
3、466A1/1页21一种水解木质纤维素材料的方法，包括如下步骤A在水性介质中在半纤维素解聚的最佳的温度和压力下对木质纤维素材料进行预处理步骤以产生淤浆而不对木质纤维素材料中的纤维素和木质组分产生任何显著影响；B任选对经预处理的木质纤维素材料进行酶水解步骤；C对由步骤A得到的淤浆进行第一分离方法以得到含有由步骤A中的半纤维素的解聚得到的产物的水相和含有纤维素和木素的未溶解的材料；D加工步骤C中得到的水相以回收木糖型寡糖与木糖单体；E在有利于纤维素解聚为包含葡萄糖的淤浆的条件下对由步骤C得到的未溶解材料进行第二水解步骤；F对由步骤E得到的淤浆进行第二分离方法以得到含有葡萄糖的水相和包含主要木素的固。
4、体部分。2根据权利要求1的方法，其中所述木素纤维素材料选自农业废物、林业废物、城市废物和能量作物。3根据权利要求1的方法，其中所述木素纤维素材料为硬木或软木。4根据权利要求1的方法，其中所述木素纤维素材料选自玉米秸秆或玉米芯。5根据权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括紧邻预处理步骤之后的温和酶处理。6根据权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括使由第一分离方法得到的水相经受内木聚糖酶的作用而得到木糖型寡糖的步骤。7根据权利要求1的方法，其中所述木糖型寡糖包含其他单体糖残留物。8根据权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括将来自步骤B的不溶性部分溶于离子液体并用去离子水使不溶性部分再生的步骤。
5、。9一种水解木质纤维素材料的方法，包括如下步骤A提供具有主要为木聚糖的半纤维素和木素含量小于1WT的纤维素浆；B将半纤维素由步骤A中的浆料提取至苛性溶液，由此形成半苛性溶液和经洗涤的浆料；C将半苛性溶液分离为浓缩的半纤维素溶液和浓缩的苛性溶液；D将浓缩的半纤维素溶液酸化并以浓缩形式回收半纤维素；E对步骤D中回收的半纤维素进行酶水解以产生木糖型寡糖；和F对步骤B中得到的经洗涤的浆料进行酶水解以产生葡萄糖。10根据权利要求9的水解木质纤维素材料的方法，其中浆料衍生自增溶的木质纤维素材料。权利要求书CN104136466A1/21页3集成生物精制0001相关申请的交叉引用0002本申请要求2011年。
6、12月30日提交的序列号为61/631,268的美国临时申请的优先权。发明领域0003本发明属于使用生物催化剂制备生物燃料和可再生化学原料的领域，使所述生物催化剂经受基因工程以提高其利用可再生碳资源的能力。更具体地，本发明提供了一种操作集成生物精制的方法，其使用木质纤维素生物质制备生物燃料和可再生化学原料以及可用作营养物的附加值的木糖型寡糖XYLOOLIGOSACCHARIDE。0004发明背景0005对使用可再生资源开发替代运输燃料和化学原料越来越感兴趣。用于本发明中的术语替代运输燃料也称为生物燃料指通过微生物发酵使用可再生生物原料制备的包括乙醇和正丁醇在内的燃料醇。用于本发明中的术语可再生。
7、化学原料也称为可再生生物化学品或可再生化学品指由生物质通过微生物发酵得到的碳源制备的化学品，与通过化学反应使用石化原料制备的相同种类化学品不同。0006题为“TOPVALUEADDEDCHEMICALSFROMBIOMASS”的2004年美国能源部报告确定了12种可由可再生原料制备的结构嵌段化学品。所述12种基于糖的结构嵌段化学品为1,4二酸琥珀酸、富马酸和马来酸，2,5呋喃二羧酸，3羟基丙酸，天冬氨酸，葡糖二酸，谷氨酸，衣康酸，乙酰丙酸，3羟基丁内酯，甘油，山梨糖醇和木糖醇/阿拉伯糖醇。结构嵌段化学品为具有多个官能团的分子，其具有转化为适用于化学合成聚合物的新种类有用分子的可能性。因此，这些。
8、12种结构嵌段可随后转化为大量高价值的生物基化学品或材料。0007近年来，通过基因操作显著提高了用于制备适于工业使用的单体化学化合物的微生物的效率。然而，目前通过生物发酵方法制备工业化学品的成本仍然非常高；与可再生原料相关的成本明显归因于制造方法。0008用于制备生物燃料和可再生化学原料的第一代碳水化合物材料来自也是人和动物食物来源的谷物颗粒和糖类作物。糖类作物如甘蔗和糖用甜菜包含易于发酵的蔗糖。谷类作物如玉米和小麦包含淀粉作为其主要的碳水化合物材料并在糖发酵前要求预水解。然而，从长远来看，由于对人类食品安全和土地使用问题的关注，在生物燃料和可再生化学原料的制备中连续使用第一代原料是不可持续的。
9、。尝试开发将降低生物燃料和可再生化学品的制备成本的第二代原料。0009在本发明中使用的术语第二代原料指非食品木质纤维素生物质。木质纤维素是地球上最丰富的可再生碳形式。用于生物燃料制备和可再生化学原料制造的木质纤维素生物质可分为两类。1生物废料，包括稻草、玉米残留物秸秆、纤维和芯、木质废料/碎屑、林业残留物、旧纸/纸板、甘蔗渣、麦糟、城市固体废料、农业残留物油籽浆、甜菜浆等；2能量作物，包括但不限于短期轮作作物，例如蒿柳SALIXVIMINALIS、奇岗说明书CN104136466A2/21页4MISCANTHUSGIGANTEUS、苜蓿MEDICAGOSATIVA、柳枝稷PANICUMVIGR。
10、ATUM、芦竹ARUNDODONAX、黑麦草等。0010来自美国能源部的题为“USBILLIONTONUPDATEBIOMASSSUPPLYFORABIOENERGYANDBIOPRODUCTSINDUSTRY”的最新报道预计到2030年美国将具有1116亿吨用于工业生物加工的可持续生物质。生物加工工业面临的挑战是以成本有效方式由木质纤维素生物质回收可发酵糖。0011制备生物燃料和工业化学品的发酵方法的成本可通过在发酵过程中使用木质纤维素生物质作为碳源而显著降低。木质纤维素生物质约由4050己糖和1030戊糖组成。本领域已知己糖是C6糖。本领域已知戊糖是C5糖。在水解时，木质纤维素材料产生包括。
11、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖在内的糖的混合物。然而，目前用于制备生物燃料和工业化学品的发酵方法的大部分生物催化剂使用纯葡萄糖作为它们生长和代谢的碳源。例如，描述于美国专利7,223,567中的用于发酵制备乳酸的大肠杆菌菌株使用补充有葡萄糖的丰富培养基作为碳源。JANTAMA等2008A；2008B以及公开的PCT专利申请WO/2008/021141A2和WO2010/115067A2中描述的用于制备琥珀酸的大肠杆菌菌株KJ122需要极少补充有葡萄糖的培养基。0012微生物同时利用多种糖的能力受到某些生物化学调节系统存在的限制。微生物细胞中的这些生物化学调节系统具有遗传基础。目前，工业。
12、微生物在包含葡萄糖或蔗糖作为碳源的培养基中生长。葡萄糖在生长培养基中的存在抑制了其它糖在大肠杆菌和其它工业微生物物种中的使用。这些微生物对其它糖如木糖、戊糖的消耗仅在完全消耗生长培养基中的葡萄糖后才开始。与工业微生物中碳利用相关的该现象称作分解代谢物阻抑或双峰生长。在以商业规模制备工业化学品的过程中通过减轻分解代谢物阻抑使微生物同时利用不同的糖如C5和C6糖的方法对降低通过发酵制备的工业化学品的成本是关键的。或者，可以分开的料流回收来自木质纤维素水解产物的C5和C6糖，随后在不同的时间供给生物催化剂，以最大程度地利用从木质纤维素生物质回收的C5和C6可发酵糖。因此，通过利用从木质纤维素原料回收。
13、的C5和C6糖，可显著降低使用木质纤维素生物质制造生物燃料和可再生化学原料的成本。降低使用木质纤维素生物质制造生物燃料和可再生化学原料的成本的另一种方法为除了从木质纤维素生物质回收可发酵糖外，从木质纤维素生物质回收某些附加值的化学品。例如，除了可发酵糖外，可从木质纤维素水解产物回收有附加值的营养膳食纤维。0013膳食纤维为耐受人体消化酶的消化的复杂碳水化合物。它们可分为不溶性纤维和可溶性纤维。天然存在于食品中的纤维称为不溶性膳食纤维。富含纤维丰富的碳水化合物的膳食可改善葡萄糖和胰岛素浓度，且还有助于具有II型糖尿病人群的血脂降低。然而，引起这些有益效果所需的纤维水平高高达35G/天，这对于人来。
14、说难以仅使用天然存在于食物中的不溶性纤维实现。为此，可溶膳食纤维SDF的开发越来越重要。0014SDF包括果胶、葡聚糖、果聚糖、寡糖、某些半纤维素、瓜尔胶和树胶。例如，聚右旋糖为葡萄糖的不能消化的合成聚合物。其用作食品成分，并被美国食品和药物管理局FDA归为可溶性纤维。作为降低卡路里的方式，其常用于代替糖。其为由右旋糖葡萄糖外加约10山梨糖醇和1柠檬酸合成的多用途食品成分。美国FDA在1981年批准了它。说明书CN104136466A3/21页50015不能消化的寡糖实际上是单糖和多糖之间的低分子量碳水化合物。它们的工业应用在最近几年增加迅速。官能寡糖据报道具有冠心病风险降低、重量控制、糖尿病。
15、患者的葡萄糖控制、血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇浓度降低等的作用。0016木糖型寡糖XOS为高价值物质，通常用作益生元物质或功能性食品组分AACHARY和PRAPULLA，2011。XOS可通过使存在于木质纤维素材料的半纤维素木聚糖分解而得到。XOS通常包含27个木糖分子。其甜度为蔗糖的04倍，且提供了增加的粘度，这使得口感改善。XOS具有高水分保持能力和低水活性，这防止了食品过度干燥，并有助于控制微生物生长。此外，XOS在低PH和高温下比其它寡糖更稳定。其不能被口腔菌群使用，且因此可用作低生龋齿糖替代物。XOS不能被人体消化系统代谢，且因此合适用于甜的低卡路里抗肥胖膳食，和糖尿病个体的消耗。
16、。0017作为膳食纤维，XOS用于预防便秘。不能消化的XOS可到达大肠，其中其被肠道菌群主要发酵为短链脂肪酸SCFA。制备SCFA具有许多健康益处，包括肠道功能、钙吸收、脂质代谢和降低结肠癌风险。XOS有助于抑制血液胆固醇水平，尤其是LDL胆固醇，其通过在胃肠道中与由胆固醇构成的胆汁酸键合，并使其作为废物排出体外。其也抑制了消化道中的脂质吸收。此外，SDF在结肠中的发酵产生丙酸，其可抑制胆固醇的合成。XOS提高双歧杆菌种群的能力在所有目前可用的寡糖中是最好的。最近的报道显示双歧杆菌可用于促进胃肠的健康，防止可能的致病细菌和腐败细菌的增殖，并增强免疫系统。还发现XOS显示出抑制70的人体白血病H。
17、L60细胞的DNA的合成，因此具有作为癌细胞凋亡诱导剂的可能用途。包含木糖和其它糖残基如阿拉伯糖的寡糖据报道有益于人体健康。例如，包含阿拉伯糖基木聚糖的SDF据报道降低餐后葡萄糖并改善具有II型糖尿病的人群的代谢控制。0018在食品和药物工业中，对作为甜味剂、益生元、防龋齿化合物和免疫刺激剂的寡糖具有增加的市场需求。例如，通过引入MILKYWAYII，MARS成为尝试得到或留住关注卡路里和脂肪的消费者的第一糖果制造商。MILKYWAYII中的部分糖被聚右旋糖，一种非常类似于纤维素衍生的寡糖的低卡路里碳水化合物称为纤维寡糖COS代替。所得糖果块的总卡路里降低25，且比原始的MILKYWAY的脂肪。
18、卡路里少50。0019木糖型寡糖XOS是一种新型寡糖，其提高双歧杆菌种群的能力在所有目前可用的寡糖中是最好的。近年来，制备和消耗XOS经历了快速增长。在日本，从1993年至2002年，XOS的市场需求的平均年增长超过76。如果考虑在其他亚洲国家中国、韩国等和欧洲的消耗以及在南美的潜在市场，可预见对XOS具有持续的高需求。截止到2011年，取决于XOS制剂的纯度在中国以10/KG至50/KG的销售价格销售的XOS产品多于200种。0020XOS显示出在人体内用作益生元。益生元通常为寡糖，其促进人体肠道中健康显微菌群的生长，包括双歧杆菌和乳酸杆菌。这些细菌有助于分解食物并吸收基本营养素。此外，XO。
19、S为消费者提供一系列其它膳食益处，包括纤维类似性能、降低胆固醇、改善钙吸收和用作抗氧化剂。0021发明概述0022本发明提供了制备可用于人体营养物的木糖型低聚物以及可用于生物精制制造生物燃料和可再生化学品的可发酵糖的的集成方法。本发明集成方法使用衍生自农业废物、林业废物、城市固体废物和能量农作物的木质纤维素生物质作为通过生物催化剂的发酵方法中的碳源。衍生自木质纤维素生物质的糖通过生物催化剂用于发酵制备生物燃料和说明书CN104136466A4/21页6可再生化学品。根据本发明适用于生物精制的生物催化剂包括天然存在以及基因修饰的酵母、真菌和细菌物质。除了获得可用于在生物精制中制备生物燃料和化学原。
20、料的可发酵糖以外，本发明所述集成方法允许从木质纤维素生物质回收附加值的寡糖。除了来自木质纤维素生物质的可发酵糖，得到附加值化学品的能力允许制备生物燃料和可再生化学原料的生物精制的整个操作的成本显著降低。0023在一个实施方案中，本发明提供了两阶段水解方法以由木质纤维素生物质获得木糖型寡糖XOS和可发酵糖。术语木糖低聚物和木糖型寡糖在本发明中互换使用。在第一阶段水解方法中，对木质纤维素生物质进行热或热化学处理，以实现木质纤维素材料的半纤维素组分的解聚。任选地，起初的热或热化学处理之后为酶处理以由木质纤维素生物质回收剩余半纤维素组分。对由木质纤维素生物质的第一阶段水解和/或酶处理得到的水相进行合适。
21、的分离方法FRACTIONATIONPROCESSES以回收XOS和木糖单体。由该组合的起初热化学和酶水解反应得到的XOS为附加值产物，而木糖单体在生物燃料和可再生化学原料制备中用作可发酵糖。0024在本发明的一个方面，对木质纤维素生物质进行脱木质方法，然后对其进行第一阶段水解方法以回收木糖单体和XOS。0025在本发明的优选实施方案中，对木质纤维素生物质进行机械研磨操作以实现尺寸降低，这将提高用于随后水解反应的化学试剂的渗滤效率。0026在由半纤维素释放木糖和XOS的酶水解方法之后，木质纤维素生物质中的纤维素组分的解聚通过酶分解进行，导致产生可发酵葡萄糖。0027在另一实施方案中，本发明提供。
22、了由衍生自木质纤维素生物质的木浆回收XOS的方法。在本发明的一个方面，至少部分漂白用于回收XOS的木浆。将部分漂白的木浆与碱性或苛性溶液合并，并在升高的温度下对其进行处理。对所得溶液进行纳滤且纳滤膜排斥的半纤维素组分作为浓缩的半纤维素料流离开纳滤系统。将半纤维素料流酸化以使半纤维素组分沉淀。对所得白色半纤维素糊状物进行水解反应而获得XOS和木糖单体。在本发明的一个方面，使用合适的水解酶可使通过酸沉淀回收的半纤维素完全水解而获得木糖单体，其可在生物燃料和可再生化学原料制备中通过生物催化剂用作可发酵糖来源。在本发明的优选方面，使用内木聚糖酶ENDOXYLANSE对白色半纤维素糊状物进行酶水解而制备。
23、XOS。0028在本发明的另一优选实施方案中，在制浆之前可使粗纤维素原料增溶。增溶是有利的，这是因为这使木质纤维素材料内的半纤维素部分分解并使其分子量降低。与未经增溶的半纤维素相比，增溶的半纤维素更易于由纤维素纤维除去。0029在本发明中，提出一种稳定的集成生物精制方法以从木质纤维素生物质有效和经济地回收木糖单体和木糖低聚物与可发酵糖。在生物精制操作中随后的下游工艺链的集成方法的改进导致XOS的回收，这与本领域已知用于由木质纤维素生物质回收XOS的方法差别很大。由木质纤维素生物质回收XOS和可发酵糖的本发明的新型集成方法提供了灵活性，提高方法稳定性并使使用木质纤维素生物质作为原料的生物精制的操。
24、作中的盈利最大。0030在本发明的另一实施方案中，集成生物精制包括以高纯度形成回收木质纤维素生物质的木素组分的工艺步骤，导致进一步降低基于木质纤维素生物质的生物精制的操作成说明书CN104136466A5/21页7本。0031附图简述0032包括以下附图以说明本发明的某些方面，并不应认为是排外的实施方案。公开的主题可对本领域熟练技术人员而言存在显著的改变、变化、组合，和形成和功能上的等价物且具有公开内容的益处。0033图1为由木质纤维素生物质回收XOS的方法。在一种途径中，对木质纤维素生物质进行第一水解反应，其中对木质纤维素生物质进行热或热化学处理。该第一水解反应也称为预处理。在由木质纤维素生。
25、物质回收XOS的第二种途径中，预处理第一水解之后为木质纤维素生物质的酶分解。在由木质纤维素生物质回收XOS的第三种途径中，直接对木质纤维素生物质进行酶分解而无需任何热或热化学水解步骤。在这三种回收XOS的不同途径各自结束时，对衍生自木质纤维素生物质的水性提取物进行各种下游加工以获得呈商业上合适的形式的XOS。0034图2为由木质纤维素材料在这种情况为玉米芯粉回收XOS并分离可用于发酵制备生物燃料和生物化学品的单体糖的集成方法。对玉米芯粉进行温和的酸处理。将经酸处理的纤维素材料在140170下保持2040分钟，然后在PH50和50下用内木聚糖酶进行酶分解2448小时。在酶分解之后，过滤玉米芯粉悬。
26、浮液以除去包含C6糖的纤维素组分和木质纤维素生物质的木素组分。滤液包含XOS，进一步对其进行超滤和纳滤。由纳滤步骤排出的级分包含XOS，可使其通过精加工进一步纯化且借助蒸发浓缩。包含单体糖如木糖和葡萄糖的渗透物可用于其它产品如生物燃料和生物化学品的发酵制备。0035图3为使用HPLC设备分离的木糖型寡糖的代表性特性。图中所示的为木四糖、木三糖、木二糖、木糖、果糖、葡萄糖和阿拉伯糖的代表峰。括号中的相应数代表各个组分的保留时间。0036图4为在使用内木聚糖酶的酶分解过程中各木糖型寡糖的释放动力学。酶分解进行48小时。0037优选实施方案的详述0038大量易于得到的木质纤维素生物质可用于本发明。理。
27、想的是使用已知具有显著量半纤维素组分的木质纤维素生物质材料使得XOS和其它所需SDF的回收具有商业利润。例如，农业的作物残留物，甘蔗渣，硬木，玉米芯，大麦壳，酒糟，杏仁壳，玉米秸秆和玉米纤维，稻壳，亚麻纤维，麦秆和竹子据报道适合用于XOS制备且所有这些木质纤维素生物质材料也适合用于本发明集成生物精制的操作。在各种木质纤维素生物质来源中，玉米芯和玉米纤维对于本发明生物精制操作而言是希望的材料，这是因为这些来源据报道具有高半纤维素含量且预期得到商业上显著量的XOS。在具有高水平的半纤维素含量的木质纤维素生物质中，最优选在半纤维素组分中具有高比例木糖的来源。玉米芯一般包含约35半纤维素主要包含木糖和。
28、38纤维素。来自湿磨装置的玉米纤维包含约20淀粉，15纤维素和35半纤维素大部分为阿拉伯糖基木聚糖。0039半纤维素为由环状5碳和6碳糖构成的线性聚合物。存在五种主要类型的半纤维素，即半乳糖基葡甘露聚糖、阿拉伯糖基葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯半乳聚糖、葡糖醛酸木聚糖和葡甘露聚糖。在天然状态中，硬木半纤维素具有约200的平均聚合度DP，且8090的基本单体组分为无水D木糖。说明书CN104136466A6/21页80040在本发明中使用的术语木聚糖指天然存在的木糖，一种5碳糖的聚合物。木聚糖也称为戊聚糖。0041纤维素为木材的主要组分，占总干质量的4050。如同半纤维素，纤维素为线性聚合物。然而，纤维。
29、素的DP高得多，通常为1,00010,000，且纤维素链完全由无水D葡萄糖单元组成。0042木素为包含苯基丙烷单体的网状聚合物，即对相豆醇，松柏醇，和芥子醇，一般称作肉桂醇，且通常称为木素C9单元。其占软木、硬木和木质杂草干质量的约1535。木素沉积在各木纤维之间且用作细胞间粘合剂，使各木纤维粘合在一起。0043木质纤维素生物转化为燃料的关键步骤为尺寸降低、预处理、水解和燃料制备。在对木质纤维素生物质进行预处理方法之前，将生物质清洁并调节大小和水分含量。本领域已知许多机械方法用于将木质纤维素生物质的尺寸降至最佳尺寸使得作为随后热化学和酶处理的结果，实现由木质纤维素生物质回收XOS和可发酵糖最大。
30、化。例如刀磨和锤磨可用于降低生物质尺寸。0044尺寸降低的木质纤维素材料的水性淤浆用作本发明的原料。将基于重量为总淤浆的530的水加入木质纤维素材料。适量水取决于所用木质纤维素材料的性质和在预处理方法过程中由木质纤维素生物质释放半纤维素组分使用的增溶技术类型。预处理方法的目的为提高生物质颗粒的多孔性以提高纤维素和其它多糖对水解酶可接近性ACCESSIBILITY。然而，大多数预处理方法也导致部分水解。最广泛使用的预处理方法包括将木质纤维素生物质在稀酸如09H2SO4中的水性淤浆加热。在180下在09H2SO4中处理持续短至一分钟可导致高达90木聚糖增溶。推测增溶与两种类型的化学反应相关A木聚糖。
31、水解为单体糖和寡糖，其具有比完整木聚糖更高的溶解性，和B木素木聚糖或木聚糖木聚糖酯和多糖上的乙酰基的水解。由于认为显著量的木聚糖通过氢键键合于纤维素微纤维的表面，推测酸预处理在一定程度使纤维素微纤维暴露，通过木聚糖水解以及通过由通过与木聚糖的链接与纤维素间接缔合释放木素。其它方法如氨纤维膨胀引起类似效果。0045本发明中使用的术语“增溶”指使木质纤维素生物质暴露于高的压力和温度并保持规定的时间，在催化添加剂下或在无催化添加剂下。一般而言，增溶通过在加压容器中在至约250的升高温度下在约70以下的PH下热水提取实现，得到包含半纤维素组分的水性提取物。在优选实施方案中，对木质纤维素生物质进行蒸汽喷。
32、发STEAMEXPLOSION。使木质纤维素生物质在100250的温度下加压2180分钟。在优选实施方案中，使用蒸汽枪使生物质在100250的温度下经受蒸汽2180分钟。在某些优选的增溶程序中，可加入酸以提高来自生物质的半纤维素组分的增溶。在生物质在半纤维素糖上具有不足的乙酸酯残基的情况下，可使用酸以充分酸化混合物。合适酸的实例包括乙酸，硫酸，硝酸，盐酸，磷酸和碳酸。在预处理过程中也可加入碱以除去木素。在使用蒸汽枪的增溶过程中，在增溶结束时排出挥发物，并对水性淤浆进行分离方法，由此将水性级分与不溶相分离。在增溶步骤后，水相和不溶相的分离可通过任一本领域已知的方法实现。例如挤出机或离心机可用于分。
33、离水相与不溶相。0046由富含木聚糖的木质纤维素材料制备XOS通常包括化学方法，酶方法以及化学和酶方法的组合。使用化学方法制备XOS可通过蒸汽、无机酸的稀释溶液或碱溶液进行。用说明书CN104136466A7/21页9蒸汽或酸提取木聚糖产生大量单糖和其脱水产物。木聚糖的蒸汽或水解的降解，称为自动水解，包括木聚糖脱乙酰化而产生乙酸，其使半纤维素水解。该方法消除了用于木聚糖提取的腐蚀化学品的使用。然而，需要可在高温下操作的特殊设备。使用包含木聚糖的材料的直接酶处理制备XOS为用于敏感性材料如柑橘皮的唯一合适的方法。为了使用化学和酶方法制备XOS，通常使用热水或酸或碱性物质如KOH或NAOH从木质纤。
34、维素材料中提取木聚糖，并且使提取的木聚糖通过具有低外木聚糖酶和/或木糖苷酶活性的木聚糖酶转化为XOS。与自动水解相反，酶方法是更希望的，这是因为不得到不希望的副产物或大量单糖且不要求特殊设备。0047使用不同的膜通过超滤和纳滤将由木质纤维素生物质得到的XOS产物分离。通过10KDA膜实现完成除去木聚糖酶和未水解的木聚糖而不损失具有5或更小的DP的任何寡糖。在两步膜加工之后，得到主要包含寡糖的渗透物。0048图1中的途径1和途径2均具有优点和缺点。当自动水解用于XOS制备时，通常得到合适XOS产率要求180。宽范围DP的XOS存在于液体。单体木糖与长链低聚物10共存。当化学品如稀H2SO4用作催。
35、化剂时，反应难以控制，且木糖和/或一定量的降解化合物如糠醛、HMF或甲酸将出现在水解产物中。这些降解产物与硫酸盐需要额外的清洁处理。在途径2中，将内木聚糖酶用于降解木聚糖。该酶非常有助于使DP达到合适范围。但是加入内木聚糖酶也会提高制备成本。如果预处理步骤太温和，则酶剂量必须大且水解持续时间将更长，这使得引起污染担忧。如果预处理步骤严苛，则酶剂量可保持低，但将得到大量木糖，这象征着高XOS产率损失。最佳操作条件不易确定。折衷点对原料和操作设备的变化敏感。0049为了确保所有半纤维素组分由木质纤维素生物质提取，第一热化学水解步骤之后可为酶分解。该阶段合适的酶的列举包括各种内木聚糖酶，其能够由木质。
36、纤维素生物质释放木糖型寡糖。在该任选酶处理结束时，水相和不溶相使用一种或多种本领域熟知的技术分离。酶处理前后得到的水相可汇集在一起并经受一种或多种本领域已知回收XOS的熟知分离方法。合并的水相预期具有木聚糖、XOS和单体糖的混合物。0050水相中的木聚糖可通过酸水解或酶处理分解为XOS。应记住酸处理具有某些潜在问题。XOS的产率在使用酸水解下最小，这是因为酸优选将木聚糖裂解为各木糖单元并产生几种毒性化合物，包括糠醛。木聚糖的酶处理不产生毒性副产物，但仍产生显著量的木糖。0051本领域已知的各种木聚糖酶可用于根据本发明由木质纤维素生物质获得XOS。适合用于本发明的内木聚糖酶可衍生自各种来源如真菌。
37、物质如NEOCALLIMASTIXFRONTALIS和NEOCALLIMASTIXPATRICIARUM。木聚糖酶的固定化形式可通过以100500U木聚糖酶/1G载体EUDERGITC比例加入来自橄榄绿链霉菌STREPTOMYCESOLIVACEOVIRIDISE8647KDA的木聚糖酶溶液。将适量酶加入0212MOL/L磷酸盐缓冲液PH4378，均匀搅拌，加入EUDERGITC，在425下固定1260小时，过滤，并洗涤以获得固定化木聚糖酶。来自海洋中温菌GLACIECOLAMESOPHILAKMM241的冷适应性木聚糖酶XYNB也适用于本发明。该酶具有的最佳PH为6070且最佳温度为35。由。
38、嗜碱芽孢杆菌BACILLUSHALODURANS得到的内木聚糖酶是可用于本发明的另一酶来源。来自木霉属TRICHODERMASPK9301的内木聚糖酶也适用于本发明。0052所有本发明实施方案包括两个水解步骤图2。在第一水解步骤结束时，木质纤说明书CN104136466A8/21页10维素生物质的半纤维素组分作为单糖或寡糖回收。在优选实施方案中，在第一水解步骤结束时，木质纤维素生物质的原半纤维素组分作为寡糖混合物回收。在本发明最优选的实施方案中，在第一水解步骤结束时，存在于木质纤维素生物质中的原半纤维素组分作为可用于人体营养而无需进一步纯化的高度富含木糖型寡糖的部分回收。对在第一水解步骤结束时。
39、得到的水性淤浆进行微滤方法以除去由主要存在于木质纤维素生物质的原纤维素组分代表的不溶性材料。来自微滤的滤液包含单体糖和木糖型寡糖的混合物。还对来自微滤步骤的滤液进行纳滤方法以回收保留物中的木糖型寡糖和滤液中的可发酵糖单体。木糖型寡糖的含量和其组成通过使用离子交换层析和其它合适技术测定。0053对由第一水解步骤得到的包含大多数存在于原木质纤维素材料的纤维素的不溶性材料进行第二水解步骤。目前，第二轮水解由可将纤维素和半纤维素同时水解为自由糖FREESUGAR的酶催化。在本发明的一个优选方面，仅用纤维素酶进行第二水解步骤，使得在第二水解步骤结束时仅回收葡萄糖。0054半纤维素的热化学降解释放出许多对。
40、发酵微生物呈毒性的抑制剂。例如，糠醛、5羟甲基糠醛和弱酸如乙酸、甲酸和乙酰丙酸衍生自半纤维素的热化学转化。开发出许多策略如中和、灰处理过度OVERLIMING、活性炭、离子交换、乙基乙酸酯灰处理过度、旋转蒸发ROTOEVAPORATION、基于膜的分离方法以除去发酵抑制剂。借助于如下的两阶段水解，可消除与纤维素酶的抑制剂相关的问题。在第一阶段中用较少量的酸除去半纤维素，可避免在较高酸浓度下存在的木糖至糠醛的降解。0055在第二水解步骤中，首先使由第一水解步骤得到的不溶性部分的尺寸降低以提高表面积并进行酶水解。由第一水解步骤得到的不溶性部分富含纤维素且几乎不含木糖、糠醛和羟甲基糠醛。木糖、糠醛和。
41、羟甲基糠醛抑制第二水解步骤中所用的纤维素酶。因此，本发明的两步水解的优点涉及第二步骤中所用的纤维素酶的效率增加。使富含纤维素的不溶性部分与水解纤维素酶在合适的容器中混合并保持在适合纤维素酶活性的温度下。在优选实施方案中，使来自第一水解步骤的不溶性部分与一种或多种纤维素酶在常规旋转式水泥混合器ROTARYCEMENTMIXER中混合并保持在适合纤维素酶活性的4045下。在规定温育时间之后，终止第二水解步骤并将由纤维素水解得到的葡萄糖通过合适的分离程序回收并供于生物精制操作。或者，同时糖化和发酵方法借助在第二水解步骤开始之后的规定时间时加入合适的生物催化剂进行。0056在不溶性纤维素部分的酶水解阶。
42、段中，可将辅助酶如葡糖苷酶、木聚糖酶和纤维素酶辅助因子如GH61与纤维素酶一起加入以显著提高纤维素酶混合物的水解效率。0057在另一个实施方案中，衍生自木质纤维素生物质的纸浆材料用作回收XOS的原料。本发明中使用的术语制浆指以化学方式或机械方式释放木材中的各纤维素的方法。硫酸盐法制浆方法为主要的制浆方法，但是存在其它制浆方式如亚硫酸盐法制浆、蒽醌烧碱法制浆，溶剂法制浆和机械法制浆。硫酸盐法制浆是一种化学制浆方法，其中将碎木在高温氢氧化钠溶液和亚硫酸钠蒸煮液中蒸煮或浸解。在蒸煮过程中，木素和半纤维素大分子断裂并溶剂化，由此使木材纤维之间的分子间粘合破裂且允许浆料提取物料流与纤维素浆料分离。牛皮浆。
43、和碱法浆工厂为能量自足的且通常产生可由相关造纸厂使用的过量蒸汽和电力。0058纸浆提取物为半纤维素来源且用苛性溶液在半纤维素提取系统中提取，导致产生说明书CN104136466A109/21页11半苛性溶液，其为含有溶解的半纤维素的水溶液。借助对半苛性溶液进行纳滤而得到浓缩的半纤维素溶液。将浓缩的半纤维素溶液酸化而得到高度纯化的半纤维素制剂的糊状物。对高度纯化的半纤维素制剂进行酶分解以得到木糖型寡糖。0059用纤维素酶对高度富含纤维素的纤维素浆进行酶分解以获得可在生物精制中用作有机碳源的葡萄糖。可在130下使纤维素部分溶于离子液体如1丁基3甲基咪唑氯化物2H并然后用去离子水再生以在随后使用纤维。
44、素酶的酶水解过程中提高葡萄糖产率。0060在本发明的另一实施方案中，在制浆之前对粗木质纤维素原料进行增溶方法。增溶的半纤维素与未经预水解的半纤维素相比更易于由纤维素纤维中除去，由此导致半纤维素提取系统中的半纤维素提取加速。0061为了制备食品级XOS，必须通过除去单糖和非糖化合物而对所得液体进行精制，以得到XOS含量尽可能高的浓度。商业XOS的通常浓度为7095。市售XOS糖浆或粉末对聚合度DP有要求。通常70XOS糖浆的DP值为X2450和X2770。对于95的XOS粉末，DP值为X2465和X2795。0062可对XOS液进行许多精制策略如溶剂沉淀、溶剂提取、冷冻干燥和脱蜡以得到所需浓度和。
45、纯度。离子交换层析、膜过滤和活性碳处理也可用于纯化XOS。纳滤可用于分离木糖与XOS。纳滤、离子交换和碳吸附的组合处理有效清洁和浓缩XOS糖浆。0063用1V/V硫酸的单阶段酸水解玉米芯得到可发酵糖与各种发酵抑制剂如糠醛，酚类化合物和乙酸。酸水解产物可使用灰处理过度方法或灰处理过度和活性炭而脱毒。这些脱毒方法有效除去大部分糠醛和显著量酚类化合物和乙酸。灰处理过度方法通过加入CAO至PH70并用亚硫酸钠调节至PH50。活性炭处理通过在40下加入3活性炭并通过以200RPM振摆1小时而进行。0064在本发明的另一实施方案中，使木质纤维素生物质用有机溶剂提取从而以高纯形式回收木素，其还可进一步转化许。
46、多商业上重要的化合物，由此有助于生物精制操作的成本降低。可使脱木质的生物质根据本发明经受水解反应以回收XOS。0065试验部分0066一般性说明0067分析程序0068按照美国能源部的国家可再生能量实验室NREL提供的几个实验方案分析在本发明中得到的试验样品。0069生物质淤浆和液体方法样品中的水分含量、总固体含量和总溶解固体含量使用NREL在1994年7月5日发行的实验室分析程序102LAP012测定。0070制备的样品按照由NREL在2005年9月28日发行的题为“PREPARATIONOFSAMPLESFORCOMPOSITIONALANALYSIS”技术报告NREL/TP5104262。
47、0的实验室分析程序进行组分分析。0071本发明的各生物质样品的提取按照由NREL在2005年7月17日发行的题为“DETERMINATIONOFEXTRACTIVESINBIOMASS”技术报告NREL/TP51042619的实验室分析程序提供的方案测定。0072本发明的各生物质衍生的样品中的灰分含量的测定按照由NREL在2005年7月17说明书CN104136466A1110/21页12日发行的题为“DETERMINATIONOFASHINBIOMASS”技术报告NREL/TP51042622的实验室分析程序进行。0073本发明的各生物质衍生的样品中的结构碳水化合物和木素的测定按照由NREL。
48、在2005年8月25日发行的题为“DETERMINATIONOFSTRUCTURALCARBOHYDRATESANDLIGNININBIOMASS”技术报告NREL/TP51042618的实验室分析程序进行。0074各试验样品中的木糖低聚物浓度使用高效液相色谱HPLC测定。将样品用氢氧化钠中和至PH5575。将样品用去离子DI水稀释至10MG/ML糖浓度。使用具有BIORADAMINEXHPX42A柱和BIORADMICROGUARDDEASHING阴离子和阳离子保护柱的AGILENT1100HPLC装置。将DI水用作移动相且流速为06ML/分钟。在50下使用折射率检测仪。在该HPLC条件下，。
49、完全分离木四糖、木三糖、木二糖、木糖、果糖和阿拉伯糖，可得到这些糖组分各自的准确量。所有单体标样来自FISHERSCIENTIC或SIGMAALDRICH。木糖低聚物标样购自MEGAZYME。0075使用离子层析系统ICS测定样品中的阴离子浓度。将具有DIONEXASRS3004MM抑制器、DIONEXIONPACAS11HC柱和DIONEXIONPACAG11HC保护柱的DIONEX1100离子层析系统用于测定样品中的阳离子浓度。将28MM氢氧化钠用作洗脱剂。将约1000ML高纯水加入2000ML容量瓶中，将56ML10N氢氧化钠溶液加入容量瓶中的水中，用高纯水将容量瓶中的总流体体积达到2000ML，通过反转充分混合并转移至ICS中的洗脱剂瓶中。将多种元素的阴离子标样用于得到校准曲线。将至少三种不同的校准标样20，10和1PPM用于形成各离子的校准曲线。使用去离子水稀释用于分析的液体样品并滤过02M过滤器。将固体样品溶于合适体积的去离子水中并滤过02M过滤器。在ICS运行中使用如下参数。流速15ML/分钟；柱温30；池温35；抑制器电流104MA；样品传输速度4ML/分钟；分析时间13分钟；延迟体积125ML；冲洗因子5；数据收集速率5HZ。0076使用离子层析系统。