玉竹多糖的提取方法、药物制剂制备方法及其用途 【技术领域】
本发明涉及一种玉竹多糖的提取方法、药物制剂制备方法及其用途。
背景技术
心血管疾病目前已成为影响我国人民健康的最主要疾病之一，高脂血症既是一种常见心血管病症，又是动脉粥样硬化(AS)和冠心病的重要致病因素，降血脂药可以延缓和部分逆转动脉粥样硬化病灶的进展，预防斑块破裂和改善内皮功能，而明显降低心血管病的发病率和死亡率。目前调血脂药物按其作用可分为：①主要降低血胆固醇的药物：包括胆酸络合剂、羟甲戊二酰辅酶(HMG-CoA)还原酶抑制剂、甾体衍生物、谷固醇等；②降血TG药：包括烟酸类、苯氧酸类、多不饱和脂肪酸类、粘多糖及多糖类等；③具有抗脂质过氧化作用的药物；④其他调血脂药物。其中第一类药物大多具有异味或胃肠道反应而服用不便，且价格昂贵，长期服用可妨碍脂溶性维生素A、D、E、K的吸收，应用不广泛。目前临床上广泛应用的是他汀类药物，属HMG-CoA还原酶抑制剂，调血脂疗效确切，但长期应用有肝脏毒性和其他副作用。另外，烟酸类、粘多糖及多糖类抗动脉粥样硬化药物，如肝素，具有调血脂、抗血栓、保护动脉内皮、抑制动脉壁平滑肌细胞增生等作用，但因其抗凝血作用强，可导致出血等不良反应，且体内半衰期短，限制了其临床应用。而甾体衍生物、谷固醇、苯氧酸类、多不饱和脂肪酸类、丙丁酚、维生素类药物则缺乏广泛的临床支持。中药在高血脂的治疗方面非常有前途，从改善脂蛋白代谢及脂蛋白组成异常来看，中药具有化学合成药物不具备的药理作用特点。高脂血症属于中医学“痰”的范畴，治则有消食化积、健脾利湿、温阳益元、豁痰祛浊、清肝利胆、护阴化浊、利尿化浊、通腑涤浊、化瘀祛脂等。已报道地单味降血脂中药有人参、柴胡、黄芩、绞股蓝、牛膝、大蒜、山楂等，复方降血脂中药有大柴胡汤、小柴胡汤等。已上市中药及成方制剂有山楂精降脂片、血脂康等，但有效成分不明确，缺乏严格对照和药理研究依据，机理不清楚，妨碍了调血脂药物的深入研究。
玉竹Polygonatum odoratum(Mill.)Druce是我国的传统中药，始载于《神农本草经》，列为上品，其来源于百合科植物玉竹的干燥根茎。主含甾体皂苷、多糖、黄酮及蒽醌类化学成分。有养阴润燥，生津止渴的功能。大鼠灌服玉竹浸剂，对肾上腺素、葡萄糖及四氧嘧啶引起的高血糖均有抑制作用。玉竹甲醇提取物中水溶部分和正丁醇部分对链脲霉素高血糖小鼠有明显抑制作用，推测与肝糖元酵解有关。给实验性高脂血症兔灌服玉竹煎剂或注射液3至4月可预防血脂升高缓解动脉粥样硬化斑形成，在治疗组可使三酰甘油、胆固醇、β脂蛋白下降。我们的实验研究首次表明从玉竹水提取液中分离的玉竹多糖能显著降低实验性高血脂动物的血脂水平。
文献报道(见佘靖主编.现代中药研究，学苑出版社，1998年)玉竹含有玉竹粘多糖(Odoratan)，其组成为D-果糖(D-Fructose)、D-甘露糖(D-Mannose)、D-葡萄糖(D-Glucose)和D-半乳糖醛酸(D-Galacluronicacid)；摩尔比为6∶3∶1∶1.5，另含玉竹果聚糖(Polygonatum-fructan)A，B，C，D，糖的组成为果糖和葡萄糖。
多糖具有多种生理功能，且细胞毒性极低。因而多糖药物作为生物反应调节剂将有更广阔的前景。目前，从天然产物或发酵产物中分离制备多糖，一般利用多糖溶于水、稀酸、碱或盐溶液，而不溶于醇，醚，丙酮等有机溶剂的特点，将原药材用低极性有机溶剂脱脂脱色素，然后将残渣用以水为主体的溶液提取多糖，即冷水、热水、稀酸、碱或盐溶液提取，提取液浓缩后，先用三氯乙酸、三氟三氯乙烷法或Sevag法去除杂蛋白，然后透析去除小分子杂质，浓缩后冻干或用等量或数倍的甲醇或乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀即获得多糖产物。多糖的精制多采用离子交换、制备性区域电泳、凝胶过滤、超滤及制备性高压液相色谱方法。上述多糖制备方法存在以下不足：1、具有较深的黄色、棕色，并难以脱色；2、提取过程复杂时间长、成本高，规模化生产难度大；3、在提取精制过程中使用了有机溶剂；4、大多含有单糖。总之，以上方法，不易获得高纯度的多糖。
同时，对玉竹的研究也存在以下不足：1、对含玉竹的中药复方研究较多，对单一玉竹研究少；2、虽然有关于玉竹降血糖及血脂的报道，但没有弄清楚玉竹药理作用的活性成分或活性成分群。3、未见玉竹多糖提取、制备方法的报道；4、玉竹在传统中医里主要是滋阴补肾，在中药复方中可以用来降血糖，有关于玉竹浸膏口服使血糖先升后降的报道，以及浸膏对肾上腺素、葡萄糖、四氧嘧啶引起的高血糖有抑制作用的报道(见马清钧，王淑玲主编.临床实用中药学，江西科学技术出版社，2002年。)，但未见玉竹多糖降血糖、特别是降血脂的文献报道；5、未见关于玉竹多糖成分、分子量与药理作用关系的报道。本发明制备的玉竹多糖分子量在3000～40,000间具有降血糖及降血脂作用，且多糖纯度高(98％以上)。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题是根据玉竹所含多糖的特性，开发以玉竹生药为原料到高纯度玉竹多糖的适用于工业化大生产的玉竹多糖的提取方法、药物制剂制备方法及其用途。
解决本发明技术问题所采用的技术方案是该玉竹多糖的提取方法有以下两种：
1.是将玉竹生药切成小块，加放4～16倍量水，煮沸提取1-4小时，提取液过滤，残渣另加入6～12倍的水，煮沸提取1～2小时，提取液过滤，将2次提取液合并，离心处理，得上清液减压浓缩，至相对密度1.08～1.25(45-60℃)，放置至室温，加入4～8倍的95％的乙醇液，搅拌静置12-48小时，分离取沉淀物，加冷蒸馏水0.5～2倍洗涤，沉淀物加热蒸馏水溶解，加入0.5～4倍量的95％乙醇沉淀，静置12～48小时，分取沉淀物，以0.5～3倍量的95％乙醇洗涤三次，弃去醇洗液，沉淀物冷冻干燥一段时间后，再在温度为60℃下真空干燥至干，取出、粉碎，得白色粉末。
2.超滤法：按1法制得相对密度1.08～1.25(45-60℃)的提取液放置室温，加95％医用乙醇至醇浓度为80％，放置8-16个小时(过夜)。弃去上清液，将醇沉物用水溶解，配成1∶10(醇沉物∶水)混悬液，离心，除去不溶物。先用相对分子量截留值为4万的中空纤维超滤柱除去相对分子量大于4万的树胶等大分子物质，流速为20ml/min，压力为0.15×106Pa；再用相对分子量截留值为3000中空纤维超滤器除去相对分子量小于3000的小分子物质，流速为15ml/min，压力为0.1×106Pa。合并、浓缩相对分子量3000～4万馏份，冷冻、干燥，得玉竹多糖。
用本发明的方法获得的玉竹多糖为白色粉末，溶于水，尤易溶于热水，不溶于高浓度的乙醇和丙酮，Molish反应和蒽酮-浓硫酸反应成阳性，说明白色粉末中含多糖；茚三酮反应为阴性，说明无蛋白质。经检测不含单糖，分子量为3000～40,000的玉竹多糖成分群，多糖含量为98％以上。
玉竹多糖药物制剂的制备方法：将上述制得的玉竹多糖加入适当的辅料，可以制备成片剂、胶囊剂、颗粒剂、口含片、咀嚼片、分散片类等固体剂型，也可以制备成口服液、合剂类等液体剂型。
药物制剂的制备配方及工艺：
胶囊剂配方(重量份)：玉竹多糖 50～300份
微粉硅胶 50～200份
糊精 50～200份
将处方量的微粉硅胶、糊精混匀，再加入到处方量的多糖中，混匀，真空干燥(真空度0.08-0.09Mpa)，粉碎，混匀，装胶囊(零～2号)，约得1000粒。每粒胶囊重0.15～0.7g，含玉竹多糖0.05g～0.3g。
片剂配方(重量份)：
玉竹多糖 50～300份
羟丙甲纤维素(K4M) 30～60份
乳糖 50～240份
3％羟丙甲纤维素水溶液 适量
硬脂酸镁 1～5份
每片重0.13～0.60g，每片含玉竹多糖0.05g～0.3g
详细制作步骤包括：
a、分别取玉竹多糖、乳糖、羟丙甲纤维素、硬脂酸镁过120目筛，在105℃烘烤1h，备用。
b、按配方比例称取主药、乳糖、羟丙甲纤维素，充分混合均匀；
c、加入大致处方量的3％羟丙甲纤维素水溶液，充分混合均匀，制软材；
d、16目筛制粒，60℃干燥，同目整粒，加硬脂酸镁混匀，压片；
e、质检、包装，印签，即得。
本发明的用途及使用要求：本发明从玉竹药材中提取了分子量为3000～40,000的玉竹多糖成分群，纯度在98％以上，将上述多糖加入适当的辅料，可以制备成片剂、胶囊剂、颗粒剂、口含片、咀嚼片、分散片等固体剂型，也可以制备成口服液、合剂等液体剂型。玉竹多糖药剂用于降血糖、特别是降血脂，对高血脂及高血糖病人，可以起到降血糖和降血脂作用。以上制剂均以口服方式给药。用法与用量：口服，每次服用玉竹多糖0.1～0.5g，一日三次。
本发明从玉竹中分离提取了玉竹多糖，并将其按一定要求制备成口服固体或液体制剂，可以降低高血糖、高血脂动物的血糖及血脂，适用于糖尿病患者和高血脂患者。本发明以下面所述的动物实验证实了提取的玉竹多糖的上述有益效果。
(一)玉竹多糖降脂作用的实验研究
1、材料与方法
1.1实验动物
纯种新西兰兔30只，雌雄各半，5月龄，体重(2.4±0.2)kg。随机分5组：血脂康组、舒降之组、玉竹1组、玉竹2组和玉竹3组，每组6只。
1.2方法
1.2.1高脂血症模型的建立 用常规饲料加5％猪油和0.5％胆固醇喂养动物，10天后禁食10小时测定血脂浓度，待其有显著的血脂升高后给予降脂及实验药物，并维持高脂饮食至实验结束。
1.2.2给药方法 血脂康组：300mg·kg-1·d-1血脂康加入40ml饮用水溶解，分二次于动物进食后喂服；舒降之组：5mg·kg-1·d-1舒降之溶于20ml饮用水，于动物进食后一次喂服；玉竹1、2、3组：分别将0.2g、0.4g、0.4g·kg-1·d-1的玉竹多糖溶于40ml饮用水，分二次于动物进食后喂服。
1.2.3血脂测定 实验前随机选择12只动物禁食10小时测定其血糖含量，实验末禁食10小时检查全部实验动物血脂含量，测定方法为钟点法。
1.2.4主动脉形态及光镜观察 实验后处死全部动物，取其主动脉进行大体形态观察，并取其部分主动脉用10％甲醛固定后石蜡色埋切片，HE染色和光镜观察。
1.3统计处理
实验数据以x±s表示，统计分析为配对t检验、多个均数之间两两比较的q检验和多个标本比较的x2检验。
2结果
2.1高胆固醇饮食后动物血脂变化(表1)
从表1可看出，经高胆固醇饮食喂养后，试验动物CHO、LDL、Lp(a)均显著升高，形成了明显的高脂血症。
2.2各组实验动物用药前后的血脂变化(表2)
从表2可看出，玉竹多糖3组治疗前后血脂CHO、LDL、Lp(a)浓度显著降低；除Lp(a)下降外，玉竹1、2组治疗前后各指标均无显著变化。
2.3实验后各组动物血脂变化比较(表3)
表3表示实验末各治疗组之间血脂浓度的变化无显著差异，说明各组均有降血脂作用。
2.4主动脉粥样硬化的情况
2.4.1大体形态观察 血脂康组有一例样本主动脉可见少量脂质条纹形成，余实验动物均未见明显的脂质条纹或粥样斑块形成。
2.4.2光镜观察 部分实验动物主动脉内膜见不同程度的泡沫内膜形成，其结果见表4。
从表4可看出，玉竹多糖组主动脉内膜泡沫细胞形成显著少于血脂康组、舒降之组(P＜0.05)，且玉竹多糖组各组间呈剂量依赖关系。
(二)玉竹多糖降糖作用的实验研究
1、材料与方法
1.1实验动物
BALB/C小鼠24只，雌雄各半，2月龄，体重(25.2±2.4)g，随机分4组：美吡达组、糖脉康组、玉竹多糖1、2组，每组6只。
1.2方法
1.2.1糖尿病模型的建立 小鼠腹腔注射脲佐菌素40mg·kg-1·d-1，连续5天。10天后禁食6小时剪尾测定其血糖含量，待有明显血糖升高后给予对照及实验药物。
1.2.2给药方法 美吡达组：8mg·kg-1·d-1美吡达加入生理盐水0.5ml溶解，每日一次灌胃给予；糖脉康组：12.5g·kg-1·d-1糖脉康加入1ml生理盐水溶解，分二次灌胃给予，玉竹多糖1、2组，分别将0.2g、1g··kg-1·d-1的玉竹多糖溶入生理盐水1ml，分二次灌胃给予。
1.2.3检测方法 实验前每组随机选择3只动物禁食6小时后剪尾测定其血糖含量，注射链脲佐菌素后同上法检测实验动物血糖含量，实验末禁食6小时取眶动脉血测定血糖及HbA1C含量。检测方法分别为葡萄糖氧化酶法和层析柱法。
1.3统计处理
实验数据以x±s表示，统计分析为配对t检验和多个均数之间两两比较q检验。
2结果
2.1实验动物注射链脲佐菌素后血糖变化(表5)
从表5可看出，实验小鼠注射链脲佐菌素后空腹血糖显著升高，形成了典型的实验性糖尿病模型。
2.2各组实验动物治疗前后血糖变化(表6)
从表6可看出，经玉竹多糖及美吡达治疗后，FBS具有非常显著性差异(p＜0.01)，糖脉康组治疗后FBS下降无显著性意义(P＞0.05)。
2.3实验后各组动物FBS及HbA1C含量的变化(表7)
从表7可看出，各治疗组的降糖效果比较无显著性意义(P＞0.05)；但玉竹1、2组降低HbA1c的作用与美吡达组及糖脉康组比较有非常显著的意义(P＜0.01)。
【具体实施方式】
以下结合实施例对本发明作进一步的描述。
具体实施例1
干燥玉竹生药9Kg切成小块，加放10倍量水，煮沸提取1小时，提取液过滤，药渣另加入10倍的水，煮沸提取1小时，提取液过滤，将2次提取液合并，离心处理，得上清液减压浓缩，至相对密度1.15(50℃)，放置至室温，加入95％的乙醇液使之含醇量为80％，搅拌静置12小时，分离取沉淀物，加冷蒸馏水1.5倍洗涤，沉淀物加热蒸馏水溶解，加入95％乙醇使之含醇量为70％，静置12小时，分取沉淀物，以3倍量的95％乙醇洗涤三次，弃去醇洗液，沉淀物冷冻干燥12小时后，再在温度为60℃下真空干燥至干，取出、粉碎，得白色粉末340克，得率3.8％，多糖含量为98.6％。
具体实施例2
干燥玉竹生药10Kg切成小块，加放10倍量水，煮沸提取1小时，提取液过滤，药渣另加入10倍的水，煮沸提取1小时，提取液过滤，将2次提取液合并，离心处理，得上清液减压浓缩，至相对密度1.15(50℃)，放置至室温，加入95％的乙醇液使之含醇量为80％，静置12小时，分离取沉淀物，加冷蒸馏水1.5倍洗涤，将醇沉物用水溶解，配成1∶10(醇沉物∶水)混悬液，离心，除去不溶物。先用相对分子量截留值为4万的中空纤维超滤柱除去相对分子量大于4万的树胶等大分子物质，流速为20ml/min，压力为0.15×106Pa；再用相对分子量截留值为3000中空纤维超滤器除去相对分子量小于3000的小分子物质，流速为15ml/min，压力为0.1×106Pa。合并、浓缩相对分子量3000～4万馏份，冷冻、干燥，得玉竹多糖400克，得率4.0％，多糖含量为98.5％。
具体实施例3
胶囊制备：玉竹多糖 50g
微粉硅胶 50g
糊精 50g
约能制成1000粒
将处方量的微粉硅胶、糊精混匀，再加入到处方量的多糖中，混匀，真空干燥(真空度0.08-0.09Mpa)，粉碎，混匀，装胶囊(2号)，约得1000粒。每粒胶囊重0.15g，每粒含玉竹多糖0.05g。
具体实施例4
胶囊制备：玉竹多糖 300g
微粉硅胶 200g
糊精 200g
约制成1000粒
将处方量的微粉硅胶、糊精混匀，再加入到处方量的多糖中，混匀，真空干燥(真空度0.08-0.09Mpa)，粉碎，混匀，装胶囊(零号)，约得1000粒。每粒胶囊重0.7g，含玉竹多糖0.3g。
具体实施例5
片剂配方、工艺：
玉竹多糖 50g
羟丙甲纤维素(K4M) 30g
乳糖 50g
3％羟丙甲纤维素水溶液 适量
硬脂酸镁 1g
共制成1000片，每片重0.13g，每片含玉竹多糖0.05g。
详细操作步骤
1、分别取玉竹多糖、乳糖、羟丙甲纤维素、硬脂酸镁过120目筛，在105℃烘烤1h，备用。
2、处方比例称取主药、乳糖、羟丙甲纤维素，充分混合均匀；
3、加入大致处方量的3％羟丙甲纤维素水溶液，充分混合均匀，制软材；
4、16目筛制粒，60℃干燥，同目整粒，加硬脂酸镁混匀，压片；
5、质检、包装，印签，即得。
具体实施例6
片剂配方、工艺：
玉竹多糖 300g
羟丙甲纤维素(K4M) 60g
乳糖 240g
3％羟丙甲纤维素水溶液 适量
硬脂酸镁 5g
共制成1000片，每片重0.60g，每片含玉竹多糖0.3g
详细操作步骤
1、分别取主药、乳糖、羟丙甲纤维素、硬脂酸镁过120目筛，在105℃烘烤1h，备用。
2、按处方比例称取主药、乳糖、羟丙甲纤维素，充分混合均匀；
3、加入大致处方量的3％羟丙甲纤维素水溶液，充分混合均匀，制软材；
4、16目筛制粒，60℃干燥，同目整粒，加硬脂酸镁混匀，压片；
5、质检、包装，印签，即得。
用法与用量：本品口服，每次服用玉竹多糖0.1～0.5g。
表1 高脂饮食后动物血脂变化
n TG(mmol/L) CHO(mmol/L) HDL(mmol/L) LDL(mmol/L) Lp(a)(mg/L)
高脂饮食前12 0.68±0.23 1.38±0.27 0.63±0.13 0.46±0.20 163.7±25.3
高脂饮食后30 0.41±0.12 11.32±1.34* 0.91±0.14 9.18±124* 681.5±124.3*
*P＜0.01
表2 各实验组治疗前后血脂变化
n TG CHO HDL LDL Lp(a)
治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后
血脂康组6 0.39±0.67 0.27±0.07 11.45±1.67 8.33±5.12 0.85±0.14 1.14±0.36 10.25±2.12 7.31±5.25 752.4±111.3 37.4±10.5*
舒降之组6 0.46±0.15 0.37±0.10 10.73±1.54 6.41±3.66Δ 0.81±0.08 0.97±0.22 9.87±1.41 5.24±3.52Δ727.1±125.3 47.7±12.8*
玉竹1组6 0.48±0.08 0.53±0.12 11.21±1.21 12.47±5.84 0.78±0.08 0.66±0.21 9.48±1.32 10.36±5.48 613.5±137.3 44.7±8.6*
玉竹2组6 0.54±0.06 0.41±0.23 10.92±1.38 6.83±3.87 0.84±0.14 1.46±0.27 9.56±1.24 5.27±3.13Δ652.8±134.8 49.6±12.4*
玉竹3组6 0.51±0.06 0.69±0.31 11.71±1.75 5.42±1.63* 0.87±0.12 1.62±0.43 10.63±1.48 4.51±1.34* 640.5±107.8 358±12.1*
与治疗前比较，*P＜0.01，ΔP＜0.05
表3 实验后各组动物血脂变化比较
n TG CHO HDL LDL Lp(a)
血脂康组 6 0.27±0.07 8.33±5.12 1.14±0.36 7.31±5.25 37.4±10.5
舒降之组 6 0.37±0.10 6.41±3.66 0.97±0.22 5.24±3.52 47.7±12.8
玉竹1组 6 0.53±0.12 12.47±5.84 0.66±0.21 10.36±5.48 44.7±8.6
玉竹2组 6 0.41±0.23 6.83±3.87 1.46±0.27 5.27±3.13 49.6±12.4
玉竹3组 6 0.69±0.31 5.42±1.63 1.62±0.43 4.51±1.34 35.8±12.1
P均＞0.05
表4 主动脉内膜泡沫细胞形成情况
分组 检验样本数 合计 发生率
有泡沫细胞形成 无泡沫细胞形成
血脂康组 5 1 6 83.3％
舒降之组 3 3 6 50％
玉竹1组 2 4 6 33.3％
玉竹2组 1 5 6 16.7％*
玉竹3组 1 5 6 16.7％*
与血脂康组、舒降之组、玉竹1组比较，*P＜0.05
表5 实验性糖尿病动物血糖变化
n FBS(mmol/L) P值
注射前 12 5.83±0.44
0.001
注射后 24 9.14±0.82
表6 各实验组用药前后血糖变化
FBS(mmol/L)
n P值
治疗前 治疗后
美吡达组 6 8.71±0.54 6.12±0.93 0.001
糖脉康组 6 8.21±0.37 7.47±2.03 0.587
玉竹1组 6 9.22±0.61 6.17±0.94 0.001
玉竹2组 6 8.84±0.46 7.37±0.45 0.005
表7 实验后各组FBS、HbA1C含量变化
n FBS(mmol/L) HbA1C(％)
美吡达组 6 6.1 8±0.87* 3.08±0.36
糖脉康组 6 7.52±2.18* 3.23±0.16
玉竹1组 6 6.33±1.12* 2.31±0.33Δ
玉竹2组 6 7.25±0.38* 1.94±0.27Δ
*各组间比较，P＞0.05
Δ与美吡达组及糖脉康组比较，P＜0.01