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1、(10)申请公布号 CN 102796154 A (43)申请公布日 2012.11.28 CN 102796154 A *CN102796154A* (21)申请号 201210279247.2 (22)申请日 2012.08.07 C07H 17/065(2006.01) C07H 1/08(2006.01) (71)申请人 上海交通大学 地址 200240 上海市闵行区东川路 800 号 (72)发明人 敬璞 董英 赵淑娟 孙向军 沈珊齐 (74)专利代理机构 上海旭诚知识产权代理有限 公司 31220 代理人 郑立 (54) 发明名称 一种从茄子皮中分离制备高纯度酰化的飞燕 草素衍生物。
2、的方法 (57) 摘要 本 发 明 涉 及 一 种 从 茄 子 皮 中 分 离 制 备 3-4-p- 香豆酰 -L- 鼠李糖基 -(1 2)-D- 吡喃 葡萄糖苷 -5-D- 吡喃葡糖苷飞燕草素的方法， 所述方法以茄子为原料， 通过将其削皮， 浸提浓 缩、 除杂、 大孔树脂纯化、 凝胶纯化、 结合半制备 色谱的步骤， 得到 3-4-p- 香豆酰 -L- 鼠李糖 基 -(1 2)-D- 吡喃葡萄糖苷 -5-D- 吡喃葡 糖苷飞燕草素 ； 所述方法操作简单， 能有效从茄 子皮中分离得到高纯度的花色苷单体， 得到的 3-4-p- 香豆酰 -L- 鼠李糖基 -(1 2)-D- 吡喃 葡萄糖苷 -5-D。
3、- 吡喃葡糖苷飞燕草素的纯度为 99.79以上， 并且可实现大规模制备。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种从茄子皮中分离制备 3-4-p- 香豆酰 -L- 鼠李糖基 -(1 2)-D- 吡喃葡萄糖 苷 -5-D- 吡喃葡糖苷飞燕草素的方法， 包括以下步骤 ： (1) 原料预处理 ： 将新鲜茄子进行洗净、 剥皮， 并将茄子皮切碎 ； (2) 茄子皮花色苷粗提浓缩液 ： 将得到的茄子皮， 按照料液比 1g 2mL 的比例加。
4、入 0.01 (v/v) 盐酸的甲醇溶液中， 常温下， 浸提， 过滤， 反复三次， 然后合并滤液， 在 40-45 下真空旋转蒸发除去甲醇得到花色苷粗提液， 按所述粗提液乙酸乙酯的体积比为 1 2 的比例加入乙酸乙酯萃取， 静置分层， 萃取三次， 收集合并水相， 在 40-50下真空旋转充分 蒸发除去乙酸乙酯， 得到花色苷浸膏 ； 将浸膏用少量的 0.01 (v/v) 盐酸的水溶液溶解， 得 到花色苷上样液 ； (3) 大孔树脂吸附 ： 将大孔吸附树脂装入层析柱中， 用 0.01 (v/v) 盐酸的水溶液冲 洗 ； 将所述花色苷上样液以0.5BV/h的流速注入大孔树脂柱中， 先用含0.01的盐。
5、酸(v/v) 的去离子水以 1BV/h 冲洗树脂， 再用 0.01 (v/v) 的盐酸的甲醇溶液以 1BV/h 的流速将花 色苷成分从树脂上解析下来， 将得到的解析液在 40-45下真空旋转蒸发除去甲醇， 得到花 色苷粗品 ； (4) 凝胶纯化 ： 将从大孔树脂纯化得到的花色苷粗品注入凝胶柱， 用 50的甲醇水 (v/ v)洗脱， 按照每15分钟接取一次， 收集洗脱液， 将收集到的洗脱液在40-45下真空旋转蒸 发除去甲醇， 得到初步纯化的花色苷提取物 ； (5) 单体制备 ： 利用半制备色谱分离所述花色苷提取物， 流动相分别为 A 相 ： 0.5 (v/ v) 甲酸的纯水， B 相 ： 0.。
6、5 (v/v) 甲酸的甲醇， 色谱纯， ； 采用梯度洗脱条件， 采用常规的 C18 制备色谱柱， 柱温 20-40； DAD 检测器 ： 检测波长为 520nm ； 根据出峰时间， 收集到的花 色苷单体吸收峰组分， 进一步浓缩， 在 40-45下， 真空旋转蒸发浓缩， 得到所述 3-4-p- 香 豆酰 -L- 鼠李糖基 -(1 2)-D- 吡喃葡萄糖苷 -5-D- 吡喃葡糖苷飞燕草素 ； 所述盐酸的浓度为 12M， 所述甲醇、 所述乙酸乙酯和所述甲酸均为色谱纯。 2. 如权利要求 1 所述的方法， 其中， 所述大孔吸附树脂为 XAD-7HP， 比表面积为 500m2/ g， 平均孔径为平均粒径。
7、为 560m， 偶极距为 1.8， 均一系数 D90/D40 为 1.7。 3. 如权利要求 1 所述的方法， 其中， 所述层析柱的直径为 50mm， 长度为 600mm。 4.如权利要求1所述的方法， 其中， 所述凝胶柱为Sephadex LH-20， 所述凝胶柱直径为 15mm， 长度为 300mm。 5. 如权利要求 1 所述的方法， 其中， 所述梯度洗脱条件为 0-3min ： 40 (v/v)B 相 ； 3-10min ： 40 -50 (v/v)B 相 ； 10-12min ： 50 -70 (v/v)B 相 ； 12-15min ： 70 (v/v)B 相 ； 15-17min 。
8、： 70 -30 (v/v)B 相 ； 流速 3mL/min。 权 利 要 求 书 CN 102796154 A 2 1/4 页 3 一种从茄子皮中分离制备高纯度酰化的飞燕草素衍生物的 方法 技术领域 0001 本发明涉及一种飞燕草素衍生物的制备方法， 具体涉及一种从茄子皮中分离制备 高纯度 3-4-p- 香豆酰 -L- 鼠李糖基 -(1 2)-D- 吡喃葡萄糖苷 -5-D- 吡喃葡糖苷飞燕 草素的方法。 背景技术 0002 花色苷 (Anthocyanidin) 是一种天然的水溶性色素， 在自然界中广泛存在， 属于 类黄酮化合物。花色苷是由花色苷苷元与糖通过糖苷键结合而成的多酚类物质， 而且。
9、在糖 苷基或是羟基上还可以与有机酸通过酯键形成酰基化的花色苷。 研究表明花色苷具有多种 对人体有益的生理活性， 如抗氧化活性、 抗炎和预防心血管等慢性疾病。 因此可以作为天然 色素、 天然抗氧化剂及功能食品添加因子应用。 0003 茄子是一种常见的蔬菜， 主要用作食用。 在茄子中， 其紫色或是黑色种皮中富含丰 富的花色苷。目前报道的不同茄子品种中花色苷的种类主要有非酰化及酰化的 3-L- 鼠 李糖基 -(1 2)-D- 吡喃葡萄糖苷 -5-D- 吡喃葡糖苷飞燕草素。其中酰化的花色苷， 即 3-4-p-香豆酰-L-鼠李糖基-(12)-D-吡喃葡萄糖苷-5-D-吡喃葡糖苷飞燕草素相对 较稳定， 而。
10、且在茄子皮中含量丰富， 其分子结构如下所示。 0004 0005 对花色苷粗品的提取最常用的是溶剂提取法， 常用溶剂有甲醇、 乙醇、 丙酮等。对 于花色苷类物质的纯化常用的是大孔树脂吸附法， 其效率高， 操作简单， 适合大规模制备。 0006 高纯度花色苷不仅在食品、 医药、 化妆品领域有着广阔的应用潜力， 而且对于单一 花色苷的颜色稳定性和生理功能等方面的深入研究有很重要的价值。 现在市售的花色苷标 品种类少， 并且价格昂贵。尤其是酰基化花色苷标准品少之又少。因此以茄子皮为原料分 离制备高纯度的酰基化花色苷单体有着重大的意义。 发明内容 说 明 书 CN 102796154 A 3 2/4 。
11、页 4 0007 本发明的目的在于提供一种从茄子皮中分离制备 3-4-p- 香豆酰 -L- 鼠李糖 基 -(1 2)-D- 吡喃葡萄糖苷 -5-D- 吡喃葡糖苷飞燕草素的方法， 所述方法以茄子为原 料， 通过将其削皮， 浸提浓缩、 除杂、 大孔树脂纯化、 凝胶纯化、 结合半制备色谱的步骤， 得到 3-4-p- 香豆酰 -L- 鼠李糖基 -(1 2)-D- 吡喃葡萄糖苷 -5-D- 吡喃葡糖苷飞燕草素。该 方法操作简单， 能有效从茄子皮中分离得到高纯度的花色苷单体， 并且可实现大规模制备。 0008 为实现上述目的， 本发明所采用以下方案 ： 0009 一种从茄子皮中分离制备 3-4-p- 香豆。
12、酰 -L- 鼠李糖基 -(1 2)-D- 吡喃葡萄糖 苷 -5-D- 吡喃葡糖苷飞燕草素的方法， 包括以下步骤 ： 0010 (1) 原料预处理 ： 将新鲜茄子进行洗净、 剥皮， 并将茄子皮切碎 ； 0011 (2) 茄子皮花色苷粗提浓缩液 ： 将得到的茄子皮， 按照料液比 1 2(w/v， g/mL) 的 比例加入 0.01盐酸甲醇溶液 (v/v) 中， 常温下， 浸提， 过滤， 反复三次， 然后合并滤液， 在 40-45下真空旋转蒸发除去甲醇得到花色苷粗提液， 按所述粗提液乙酸乙酯的体积比 为 1 2 的比例加入乙酸乙酯萃取， 静置分层， 萃取三次， 收集合并水相， 在 40-50下真空 。
13、旋转充分蒸发去除乙酸乙酯， 得到花色苷浸膏 ； 将浸膏用少量的 0.01 (v/v) 盐酸的水溶 液溶解， 得到花色苷上样液 ； 0012 (3) 大孔树脂吸附 ： 将大孔吸附树脂装入层析柱中， 用 0.01 (v/v) 盐酸的水溶液冲洗 ； 将花色苷上样液以 0.5BV/h 的流速注入大孔树脂柱中， 先用含 0.01的盐酸 (v/v) 的去离子水以 1BV/h 冲洗树脂， 再用 0.01的盐酸甲醇溶液 (v/v) 以 1BV/h 的流速将花色苷成分从树脂上解析下来， 将得到的解析液在 40-45下真空旋转蒸 发除去甲醇， 得到花色苷粗品 ； 0013 (4) 凝胶纯化 ： 将从大孔树脂纯化得。
14、到的花色苷粗品注入凝胶柱 用 50的甲醇水 (v/v) 洗脱， 按照每 15 分钟接取一次， 收集洗脱液， 将收集到的洗脱液， 在 40-45下真空旋转蒸发除去甲醇， 得到初步纯化的花色苷提取物 ； 所述大孔吸附树脂 为 XAD-7HP( 比表面积为 500m2/g ； 平均孔径为平均粒径为 560m ； 偶极距为 1.8 ； 均 一系数 D90/D40 为 1.7) ； 所述凝胶柱为 Sephadex LH-20( 分离范围 100-4000 ； 颗粒大小为 20-150m) ； 0014 (5) 单体制备 ： 利用半制备色谱分离花色苷单体， 将从凝胶柱中纯化得到的花 色苷提取样， 用半制备。
15、色谱分离， 使用程序 1 制备分离 ； 所述程序 l 中的流动相分别为 A 相 ： 0.5甲酸纯水， B 相 ： 0.5甲酸的甲醇， 色谱纯， V/V ； 采用的梯度洗脱条件 (v/v) ： 0-3min ： 40 B 相 ； 3-10min ： 40 -50 B 相 ； 10-12min ： 50 -70 B 相 ； 12-15min ： 70 B 相 ； 15-17min ： 70 -30 B 相 ； 流速 3mL/min， 采用常规的 C18 制备色谱柱 ； 柱温 20-40； DAD 检测器 ： 检测波长为 520nm ； 根据出峰时间， 收集到的花色苷单体吸收峰组分， 进一步浓缩， 。
16、在 40-45下， 真空旋转蒸发浓缩， 得到高纯度的 3-4-p- 香豆酰 -L- 鼠李糖 基 -(1 2)-D- 吡喃葡萄糖苷 -5-D- 吡喃葡糖苷飞燕草素单体制品， 该单体结构由质谱分 析并根据参考文献报道而确定。 0015 本发明所述盐酸浓度为 12M， 本发明所述甲醇、 所述乙酸乙酯和所述甲酸均为色谱 纯。 0016 本发明的优点是 ： 0017 l、 本发明采用大孔树脂， 结合凝胶， 分离纯化花色秆单体， 最后采用半制备色谱制 说 明 书 CN 102796154 A 4 3/4 页 5 备， 其操作简单， 易实施。 0018 2、 制备的花色秆为高纯度单体， 可以选作标样， 用于。
17、生理活性、 花色秆稳定 性和颜色机理等的研究， 采用本发明的制备方法得到的 3-4-p- 香豆酰 -L- 鼠李糖 基 -(1 2)-D- 吡喃葡萄糖苷 -5-D- 吡喃葡糖苷飞燕草素的纯度为 99.79以上。 附图说明 0019 图 l 为 3-4-p- 香豆酰 -L- 鼠李糖基 -(1 2)-D- 吡喃葡萄糖苷 -5-D- 吡喃葡 糖苷飞燕草素的方法制备流程图。 0020 图 2 为实施例 1 中 3-4-p- 香豆酰 -L- 鼠李糖基 -(1 2)-D- 吡喃葡萄糖 秆 -5-D- 吡喃葡糖苷飞燕草素制品的高效液相色谱图 (520nm)。 具体实施方式 0021 下面通过实施例对木发明进行。
18、具体描述， 但是本发明技术方案不局限于以下所列 举的实施方式。 0022 以下实施例的制备流程如图 1 所示。 0023 实施例 1 ： 0024 新鲜茄子 5kg， 清洗， 整理， 将皮肉分离， 得到茄子皮 750g， 切碎 ； 与 1.5L， 0.01 盐酸甲醇溶液 (v/v) 混合， 在室温下浸提 2h ； 浸提后经布氏漏斗抽滤， 滤液在 43下旋转 蒸发除去甲醇， 得到花色苷提取液 50mL ； 加入 100mL 乙酸乙酯萃取， 萃取三次， 每次用量为 100mL， 得到的萃取液在42下旋转蒸发浓缩得到花色苷浸膏 ； 将浸膏用10-15mL的0.01 (v/v) 盐酸的水溶液溶解， 得。
19、到花色苷上样液 ； 0025 用 0.01 (v/v) 盐酸的水溶液冲洗 XAD-7HP 大孔树脂柱进行预 先酸化， 以流速为 0.5BV/h 注入花色苷上样液， 待吸附结束后， 用含 0.01 (v/v) 的盐酸的 去离子水以 1BV/h 冲洗树脂除杂 ； 用 0.01 (v/v) 的盐酸甲醇溶液以 1BV/h 的流速将花色 苷成分从树脂上解析下来 ； 收集洗脱液于 45下旋转蒸发至无甲醇得到花色苷浓缩液 ； 经 过预先用 50甲醇 - 水溶液 (v/v) 处理的 Sephadex LH-20 凝胶柱， 用 50的甲醇水溶液 (v/v)洗脱， 按照每15分钟接取一次， 收集洗脱液， 将收集到。
20、的洗脱液， 在40-45下旋转蒸 发， 得到初步纯化的花色苷提取物 ； 使用半制备色谱分离单体， 色谱柱为 Agilent Eclipse XDB-C18(9.4250mmi.d.， 5m) ； 流动相分别为 A 相 ： 0.5甲酸纯水 (v/v)， B 相 ： 0.5 甲酸的甲醇， ( 色谱纯， v/v) ； 采用的梯度洗脱条件 (v/v) ： 0-3min ： 40 B 相 ； 3-10min ： 40 -50 B 相 ； 10-12min ： 50 -70 B 相 ； 12-15min ： 70 B 相 ； 15-17min ： 70 -30 B 相 ； 流速 3mL/min ； 柱温 。
21、20-40 ； DAD 检测器 ： 检测波长为 520nm ； 收集相应保留时间 7.976min 的吸收峰， 得到 58mg 的 3-4-p- 香豆酰 -L- 鼠李糖基 -(1 2)-D- 吡喃葡萄糖 苷 -5-D- 吡喃葡糖苷飞燕草素 ( 如图 2 所示 )， 即得率为 7.7mg/100g 鲜重茄子皮。根据飞 燕草素在520nm的最大吸收峰面积与全部物质在280-600nm范围内最大吸收峰面积总和的 比值， 可计算获得纯度为 99.90。 0026 实施例 2 ： 0027 新鲜茄子 10kg， 清洗， 整理， 将皮肉分离， 得到茄子皮 1500g， 切碎 ； 与 3L， 0.01盐 酸。
22、甲醇溶液 (v/v) 混合， 在室温下浸提 2h ； 浸提后经布氏漏斗抽滤， 滤液在 43下旋转蒸 说 明 书 CN 102796154 A 5 4/4 页 6 发除去甲醇， 得到花色苷提取液 150mL ； 加入 300mL 乙酸乙酯萃取， 萃取三次， 每次用量为 300mL， 得到的萃取液在42下旋转蒸发浓缩得到花色苷浸膏 ； 将浸膏用30-50mL的0.01 (v/v) 盐酸的水溶液溶解， 得到花色苷上样液 ； 用 0.01 (v/v) 盐酸的水溶液冲洗 XAD-7HP 大孔树脂柱 ( 比表面积为 500m2/g ； 平均孔径为平均粒径为 560m ； 偶极距为 1.8 ； 均一系数 D。
23、90/D40 为 1.7 ；) 进行预先酸化， 以流速为 0.5BV/h 注入花色苷上 样液， 待吸附结束后， 用含 0.01 (v/v) 的盐酸的去离子水 1L， 以 1BV/h 冲洗树脂除杂 ； 用 0.01 (v/v) 的盐酸甲醇溶液以 1BV/h 的流速将花色苷成分从树脂上解析下来 ； 收集洗脱 液于45下旋转蒸发至无甲醇得到花色苷浓缩液 ； 经过预先用50(v/v)甲醇-水溶液处 理的 Sephadex LH-20 凝胶柱用 50 (v/v) 的甲醇水洗脱， 按照每 15 分钟 接取一次， 收集洗脱液， 将收集到的洗脱液， 在 40-45下旋转蒸发， 得到初步纯化的花色苷 提取物 ；。
24、 使用半制备色谱分离单体， 步骤同实施例 1。得到 113mg 的 3-4-p- 香豆酰 -L- 鼠 李糖基 -(1 2)-D- 吡喃葡萄糖苷 -5-D- 吡喃葡糖苷飞燕草素， 即得率为 7.5mg/100g 鲜 重茄子皮。利用 HPLC 最大吸收峰面积比值可获得纯度为 99.79。 0028 本 发 明 的 一 种 从 茄 子 皮 中 分 离 制 备 高 纯 度 3-4-p- 香 豆 酰 -L- 鼠 李 糖 基 -(1 2)-D- 吡喃葡萄糖苷 -5-D- 吡喃葡糖苷飞燕草素的方法已经通过具体的实例进 行了描述， 本领域技术人员可借鉴本发明内容， 适当改变原料、 工艺条件等环节来实现相应 的其它目的， 其相关改变都没有脱离本发明的内容， 所有类似的替换和改动对于本领域技 术人员来说是显而易见的， 都被视为包括在本发明的范围之内。 说 明 书 CN 102796154 A 6 1/2 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 102796154 A 7 2/2 页 8 图 2 说 明 书 附 图 CN 102796154 A 8 。