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埃坡霉素、与之相关的中间体、类似物的合成及其用途.pdf

上传人：00****42 文档编号：474825 上传时间：2018-02-18 格式：PDF 页数：210 大小：7.61MB
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摘要
申请专利号：

CN200580013480.4

 申请日：

2005.02.28
公开号：

CN1976699A

 公开日：

2007.06.06
当前法律状态：

撤回

 有效性：

无权
法律详情：

发明专利申请公布后的视为撤回|||实质审查的生效|||公开
IPC分类号：

A61K31/426(2006.01); C07D277/20(2006.01)

 主分类号：

A61K31/426
申请人：

斯隆－凯特灵癌症研究所;
发明人：

塞缪尔·J·丹尼斯海弗斯凯; 亚历克谢·芮弗金; 吉村文彦; 周廷潮; 安娜·埃斯特·加巴尔答欧特佳; 董华进; 吴开达; 马尔科姆·A·S·摩尔; 大卫·杜恩
地址：

美国纽约
优先权：

2004.02.27 US 60/548,402; 2004.08.18 US 10/921,109
专利代理机构：

中原信达知识产权代理有限责任公司

 代理人：

杨青;樊卫民
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内容摘要

本发明提供式(I)的化合物：如本发明中一般性描述的及以类和亚类描述的那样。本发明另外还提供包含式(I)的化合物的药物组合物，并提供治疗癌症的方法，该方法包括给药式(I)的化合物。

权利要求书

1.  下式的化合物及其药学可接受的衍生物：

其中R1为氢或低级烷基；
R2为取代或未取代的芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基部分；
R5和R6各自独立地为氢或保护基团；
X为O、S、C(R7)2或NR7，其中每种情况下的R7独立地为氢或低级烷基；
A-B代表CRA＝CRB-、C(RA)2-C(RB)2-或-C≡C-；
C-D代表-CRC＝CRD-、-C(RC)2-C(RD)2-或-C≡C-；
其中每种情况下的RA独立地为氢；卤素；-ORA’；-SRA’；-N(RA’)2；-C(O)ORA’；-C(O)RA’；-CONHRA’；-O(C＝O)RA’；-O(C＝O)ORA’；-NRA’(C＝O)RA’；N3；N2RA’；环状缩醛；或环状或无环、直链或支链的脂肪族、杂脂肪族、芳基或杂芳基，任选取代以一个或多个如下基团：氢；卤素；-ORA’；-SRA’；-N(RA’)2；-C(O)ORA’；-C(O)RA’；-CONHRA’；-O(C＝O)RA’；-O(C＝O)ORA’；-NRA’(C＝O)RA’；N3；N2RA’；环状缩醛；或环状或无环、直链或支链的取代或未取代的脂肪族、杂脂肪族、芳基或杂芳基部分；
对于每种情况，RB独立地为氢；卤素；-ORB’；-SRB’；-N(RB’)2；-C(O)ORB’；-C(O)RB’；-CONHRB’；-O(C＝O)RB’；-O(C＝O)ORB’；-NRB’(C＝O)RB’；N3；N2RB’；环状缩醛；或环状或无环、直链或支链的脂肪族、杂脂肪族、芳基或杂芳基、任选取代以一个或多个如下基团：氢；卤素；-ORB’；-SRB’；-N(RB’)2；-C(O)ORB’；-C(O)RB’；-CONHRB’；-O(C＝O)RB’；-O(C＝O)ORB’；-NRB’(C＝O)RB’；N3；N2RB’；环状缩醛；或环状或无环、直链或支链的取代或未取代的脂肪族、杂脂肪族、芳基或杂芳基部分；
对于每种情况，RC独立地为氢；卤素；-ORC’；-SRC’；-N(RC’)2；-C(O)ORC’；-C(O)RC’；-CONHRC’；-O(C＝O)RC’；-O(C＝O)ORC’；-NRC’(C＝O)RC’；N3；N2RC’；环状缩醛；或环状或无环、直链或支链的脂肪族、杂脂肪族、芳基或杂芳基，任选取代以一个或多个如下基团：氢；卤素；-ORC’；-SRC’；-N(RC’)2；-C(O)ORC’；-C(O)RC’；-CONHRC’；-O(C＝O)RC’；-O(C＝O)ORC’；-NRC’(C＝O)RC’；N3；N2RC’；环状缩醛；或环状或无环、直链或支链的取代或未取代的脂肪族、杂脂肪族、芳基或杂芳基部分；
对于每种情况，RD独立地为氢；卤素；-ORD’；-SRD’；-N(RD’)2；-C(O)ORD’；-C(O)RD’；-CONHRD’；-O(C＝O)RD’；-O(C＝O)ORD’；-NRD’(C＝O)RD’；N3；N2RD’；环状缩醛；或环状或无环、直链或支链的脂肪族、杂脂肪族、芳基或杂芳基，任选取代以一个或多个如下基团：氢；卤素；-ORD’；-SRD’；-N(RD’)2；-C(O)ORD’；-C(O)RD’；-CONHRD’；-O(C＝O)RD’；-O(C＝O)ORD’；-NRD’(C＝O)RD’；N3；N2RD’；环状缩醛；或环状或无环、直链或支链的取代或未取代的脂肪族、杂脂肪族、芳基或杂芳基部分；或者
其中RA，RB，RC或RD中任意两个合在一起可以形成环状部分并可以通过氧、硫、碳或氮原子连接，或者任意两个相邻的RA，RB，RC或RD基团合在一起，可以形成3-6元取代或未取代的脂肪族、杂脂肪族、芳基或杂芳基环；
其中每种情况下的RA’，RB’，RC’或RD’独立地为氢；保护基团；直链或支链、取代或未取代、环状或无环的、脂肪族、杂脂肪族、芳基、杂芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、芳烯基、芳炔基或杂芳烷基、杂芳烯基或杂芳炔基部分。

2.  下式的化合物和其药学可接受的衍生物：

其中X为O、S、C(R7)2或NR7，其中每种情况下的R7独立地为氢或低级烷基；
Y为O或S；
R5和R6各自独立地为氢或保护基团；
R8独立地为氢、卤素、-OR9、-SR9、-N(R9)2、-CZ3、-CHZ2、-CH2Z，其中Z为F、Br、Cl、I、ORB’、NHRB’、N(RB’)2或SRB’；-(CV2)nOR9、-(CV2)nN(R9)2、-(CV2)nSR9、-(C＝O)R9、-O(C＝O)R9、-(C＝O)OR9、-O(C＝O)OR9；-NH(C＝O)R9、-NH(C＝O)OR9、-(C＝O)NHR9，或环状或无环、直链或支链的脂肪族、杂脂肪族、芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基部分，任选取代以一个或多个出现的如下基团：卤素、-OR9、-SR9、-N(R9)2、-(CV2)nOR9、-(CV2)nN(R9)2、-(CV2)nSR9、-(C＝O)R9、-O(C＝O)R9、-(C＝O)OR9、-O(C＝O)OR9；-NH(C＝O)R9、-NH(C＝O)OR9、-(C＝O)NHR9，或环状或无环、直链或支链、取代或未取代的脂肪族、杂脂肪族、芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基部分，
其中每种情况下的R9独立地为氢；保护基团；环状或无环、直链或支链、取代或未取代的脂肪族、杂脂肪族、芳基或杂芳基部分；或者是埃坡霉素、脱氧埃坡霉素或其类似物；聚合物；糖类；光亲和性标记物；或放射性标记物；
其中每种情况下的V独立地为氢、卤素、羟基、硫代、氨基、烷氨基或被保护的羟基、硫代或氨基；每种情况下的t独立地为0、1或2；每种情况下的n独立地为0-10；
A-B代表CRA＝CRB-、C(RA)2-C(RB)2-或-C≡C-；
C-D代表-CRC＝CRD-、C(RC)2-C(RD)2-或-C≡C-；
其中每种情况下的RA独立地为氢；卤素；-ORA’；-SRA’；-N(RA’)2；-C(O)ORA’；-C(O)RA’；-CONHRA’；-O(C＝O)RA’；-O(C＝O)ORA’；-NRA’(C＝O)RA’；N3；N2RA’；环状缩醛；或环状或无环、直链或支链的脂肪族、杂脂肪族、芳基或杂芳基，任选取代以一个或多个如下基团：氢；卤素；-ORA’；-SRA’；-N(RA’)2；-C(O)ORA’；-C(O)RA’；-CONHRA’；-O(C＝O)RA’；-O(C＝O)ORA’；-NRA’(C＝O)RA’；N3；N2RA’；环状缩醛；或环状或无环、直链或支链的取代或未取代的脂肪族、杂脂肪族、芳基或杂芳基部分；
对于每种情况，RB独立地为氢；卤素；-ORB’；-SRB’；-N(RB’)2；-C(O)ORB’；-C(O)RB’；-CONHRB’；-O(C＝O)RB’；-O(C＝O)ORB’；-NRB’(C＝O)RB’；N3；N2RB’；环状缩醛；或环状或无环、直链或支链的脂肪族、杂脂肪族、芳基或杂芳基、任选取代以一个或多个如下基团：氢；卤素；-ORB’；-SRB’；-N(RB’)2；-C(O)ORB’；-C(O)RB’；-CONHRB’；-O(C＝O)RB’；-O(C＝O)ORB’；-NRB’(C＝O)RB’；N3；N2RB’；环状缩醛；或环状或无环、直链或支链的取代或未取代的脂肪族、杂脂肪族、芳基，或杂芳基部分；
对于每种情况，RC独立地为氢；卤素；-ORC’；-SRC’；-N(RC’)2；-C(O)ORC’；-C(O)RC’；-CONHRC’；-O(C＝O)RC’；-O(C＝O)ORC’；-NRC’(C＝O)RC’；N3；N2RC’；环状缩醛；或环状或无环、直链或支链的脂肪族、杂脂肪族、芳基或杂芳基，任选取代以一个或多个如下基团：氢；卤素；-ORC’；-SRC’；-N(RC’)2；-C(O)ORC’；-C(O)RC’；-CONHRC’；-O(C＝O)RC’；-O(C＝O)ORC’；-NRC’(C＝O)RC’；N3；N2RC’；环状缩醛；或环状或无环、直链或支链的取代或未取代的脂肪族、杂脂肪族、芳基或杂芳基部分；
对于每种情况，RD独立地为氢；卤素；-ORD’；-SRD’；-N(RD’)2；-C(O)ORD’；-C(O)RD’；-CONHRD’；-O(C＝O)RD’；-O(C＝O)ORD’；-NRD’(C＝O)RD’；N3；N2RD’；环状缩醛；或环状或无环、直链或支链的脂肪族、杂脂肪族、芳基或杂芳基，任选取代以一个或多个如下基团：氢；卤素；-ORD’；-SRD’；-N(RD’)2；-C(O)ORD’；-C(O)RD’；-CONHRD’；-O(C＝O)RD’；-O(C＝O)ORD’；-NRD’(C＝O)RD’；N3；N2RD’；环状缩醛；或环状或无环、直链或支链的取代或未取代的脂肪族、杂脂肪族、芳基，或杂芳基部分；或者
其中RA，RB，RC或RD中任意两个合在一起可以形成环状部分并可以通过氧、硫、碳或氮原子连接，或者任意两个相邻的RA，RB，RC或RD基团合在一起，可以形成3-6元取代或未取代的脂肪族、杂脂肪族、芳基或杂芳基环；
其中每种情况下的RA’，RB’，RC’或RD’独立地为氢；保护基团；直链或支链、取代或未取代、环状或无环的、脂肪族、杂脂肪族、芳基、杂芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、芳烯基、芳炔基或杂芳烷基、杂芳烯基或杂芳炔基部分。

3.  权利要求2的化合物，其中A-B为-CH＝C(RB)-。

4.  权利要求2的化合物，其中A-B为

5.  权利要求2的化合物，其中RB为甲基。

6.  权利要求2的化合物，其中RB为-CF3。

7.  权利要求2、3或4的化合物，其中R8为甲基。

8.  权利要求2、3或4的化合物，其中R8为-CH2OH。

9.  权利要求2、3或4的化合物，其中R8为-CH2NH2。

10.  权利要求2、3或4的化合物，其中C-D为其中Z为O、S、NRZ或C(RZ)2，其中RZ为氢、卤素、低级酰基或低级烷基。

11.  权利要求10的化合物，其中Z为NH。

12.  权利要求10的化合物，其中Z为CH2。

13.  权利要求10的化合物，其中Z为O。

14.  权利要求10的化合物，其中Z为S。

15.  权利要求2、3或4的化合物，其中C-D为或其中Z为O、S、NRZ或C(RZ)2，其中RZ为氢、卤素、低级酰基或低级烷基。

16.  权利要求15的化合物，其中Z为NH。

17.  权利要求15的化合物，其中Z为CH2。

18.  权利要求2的化合物，其中Y为S。

19.  权利要求2的化合物，其中Y为O。

20.  权利要求2、3或4的化合物，其中C-D为-C(RC)2-C(RD)2-。

21.  权利要求20的化合物，其中每种情况下的RC和RD选自氢、低级烷基、羟基、卤素和低级烷氧基。

22.  权利要求20的化合物，其中每种情况下的RC和RD选自氢和甲基。

23.  权利要求20的化合物，其中每个RC为甲基和每个RD为氢。

24.  权利要求20的化合物，其中每个RC为氢和每个RD为甲基。

25.  权利要求20的化合物，其中一个RC为氢和另一个RC为甲基。

26.  权利要求20的化合物，其中一个RD为氢和另一个RD为甲基。

27.  权利要求1的化合物，选自下式的化合物：


28.  权利要求1的化合物，选自下式的化合物：


29.  权利要求1的化合物，选自下式的化合物：


30.  权利要求1的化合物，选自下式的化合物：


31.  权利要求1的化合物，选自下式的化合物：


32.  权利要求1的化合物，选自下式的化合物：






33.  用于治疗癌症的药物组合物，其包含权利要求1的化合物和药学可接受的赋形剂。

34.  权利要求33的药物组合物，进一步包含可利摩福。

35.  权利要求33的药物组合物，进一步包含可利摩福和乙醇。

36.  权利要求33的药物组合物，其中所述化合物悬浮于1∶1的可利摩福/乙醇。

37.  权利要求33的药物组合物，进一步包含另外的细胞毒性剂。

38.  用于治疗癌症的药物组合物，其包含：治疗有效量的权利要求1化合物或其药学可接受的盐；和药学可接受的载体或稀释剂，其中所述化合物的治疗有效量为这样的量：其足以递送约0.001至约40mg的化合物每kg对象体重。

39.  用于治疗癌症的药物组合物，其包含权利要求1化合物；和药学可接受的赋形剂；其中所述药物组合物适合于对对象口服给药。

40.  用于治疗癌症的药物组合物，其包含权利要求2化合物；和药学可接受的赋形剂；其中所述药物组合物适合于对对象口服给药。

41.  权利要求40的药物组合物，其中R8为-CH2OH。

42.  权利要求40的药物组合物，其中RB为-CHF2、-CH2F或-CF3。

43.  权利要求40的药物组合物，其中C-D为-CH＝CH-，其中该双键为反式构型。

44.  权利要求40的药物组合物，其中所述化合物如下式：


45.  权利要求40的药物组合物，其中所述组合物为固体形式。

46.  权利要求40的药物组合物，其中所述组合物为液体形式。

47.  治疗癌症的方法，其包括将治疗有效量的权利要求1的化合物向需要其的对象给药。

48.  权利要求47的方法，其中化合物的治疗有效量为这样的量，其足以递送约0.001mg至约40mg的化合物每kg体重。

49.  权利要求47的方法，其中化合物的治疗有效量为这样的量，其足以递送约0.1mg至约25mg的化合物每kg体重。

50.  治疗癌症的方法，其包括将治疗有效量的下式化合物向需要其的对象口服给药：


51.  制备下式化合物的方法：

其中R1为氢或低级烷基；
R2为取代或未取代的芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基部分；
R5和R6各自独立地为氢或保护基团；
X为O、S、C(R7)2或NR7，其中每种情况下的R7独立地为氢或低级烷基；和
对于每种情况，RB独立地为氢；卤素；-ORB’；-SRB’；-N(RB’)2；-CY3、-CHY2、-CH2Y，其中Y为F、Br、Cl、I、ORB’、NHRB’、N(RB’)2或SRB’；-C(O)ORB’；-C(O)RB’；-CONHRB’；-O(C＝O)RB’；-O(C＝O)ORB’；-NRB’(C＝O)RB’；N3；N2RB’；环状缩醛；或环状或无环、直链或支链的脂肪族、杂脂肪族、芳基或杂芳基，任选取代以一个或多个如下基团：氢；卤素；-ORB’；-SRB’；-N(RB’)2；-C(O)ORB’；-C(O)RB’；-CONHRB’；-O(C＝O)RB’；-O(C＝O)ORB’；-NRB’(C＝O)RB’；N3；N2RB’；环状缩醛；或环状或无环、直链或支链的取代或未取代的脂肪族、杂脂肪族、芳基或杂芳基部分；或为埃坡霉素、脱氧埃坡霉素或其类似物；或为聚合物；糖类；光亲和性标记物或放射性标记物；其中每种情况下的RB’独立地为氢；保护基团；直链或支链、取代或未取代、环状或无环的脂肪族、杂脂肪族、芳基，杂芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、杂芳烷基、杂芳烯基或杂芳炔基部分；
其为在金属和还原剂的存在下将下式化合物异构化：


52.  权利要求51的方法，其中所述金属为过渡金属。

53.  权利要求51的方法，其中所述金属为钯。

54.  权利要求51的方法，其中所述还原剂选自LiAlH4、NaBH4和NaBH3CN。

55.  制备下式化合物的方法：

其中R1为氢或低级烷基；
R2为取代或未取代的芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基部分；
R5和R6各自独立地为氢或保护基团；
X为O、S、C(R7)2或NR7，其中每种情况下的R7独立地为氢或低级烷基；和
对于每种情况，RB独立地为氢；卤素；-ORB’；-SRB’；-N(RB’)2；-CY3、-CHY2、-CH2Y，其中Y为F、Br、Cl、I、ORB’、NHRB’、N(RB’)2或SRB’；-C(O)ORB’；-C(O)RB’；-CONHRB’；-O(C＝O)RB’；-O(C＝O)ORB’；-NRB’(C＝O)RB’；N3；N2RB’；环状缩醛；或环状或无环、直链或支链的脂肪族、杂脂肪族、芳基或杂芳基，任选取代以一个或多个如下基团：氢；卤素；-ORB’；-SRB’；-N(RB’)2；-C(O)ORB’；-C(O)RB’；-CONHRB’；-O(C＝O)RB’；-O(C＝O)ORB’；-NRB’(C＝O)RB’；N3；N2RB’；环状缩醛；或环状或无环、直链或支链的取代或未取代的脂肪族、杂脂肪族、芳基，或杂芳基部分；或为埃坡霉素、脱氧埃坡霉素或其类似物；或为聚合物；糖类、光亲和性标记物或放射性标记物；其中每种情况下的RB’独立地为氢；保护基团；直链或支链、取代或未取代、环状或无环的脂肪族、杂脂肪族、芳基，杂芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、杂芳烷基、杂芳烯基或杂芳炔基部分；
其为将下式化合物与卡宾或卡宾体试剂反应：


56.  权利要求55的方法，其中卡宾为CH2N2。

说明书

埃坡霉素、与之相关的中间体、类似物的合成及其用途
发明背景
埃坡霉素(Epothilone)A和B(2a和2b，示意图1)为从纤维素降解分支杆菌，纤维堆囊菌(sorangium cellulosum)中分离出来的天然细胞毒素大环内酯物(Hfle等人Angew.Chem.，Int.Ed.Engl.1996，35，1567和J.Antibiot.1996，49，560；每篇文献通过引用并入本发明)。尽管它们的结构大不相同，埃坡霉素A和B却都具有如紫杉醇(他克唑(Taxol))的作用机理，该机理包括通过微管蛋白聚合和微管装配(microtubuleassemblies)的稳定而抑制癌细胞的生长(Bollag等人Cancer Res.1995，55，2325；通过引用并入本发明)。尽管其作为前线化学治疗剂具有毫无疑问的临床价值，但他克唑远不是理想药物。其微溶于水的溶解性使其必须借助制剂媒介物例如可利摩福(Cremophor)，这造成其自身的危险和管理问题(Essayan等人J.Allergy Clin.Immunol.1996，97，42；通过引用并入本发明)。此外，他克唑通过多重耐药性(MDR)而易于失活(Giannakakou等人J.Biol.Chem.1997，272，17118；通过引用并入本发明)。然而，这也说明了埃坡霉素A和B保持了抗MDR肿瘤细胞的显著效力(Kowalski等人Mol.Biol.Cell 1995，6，2137；通过引用并入本发明)。此外，对于埃坡霉素的配方能力(formulability)，增加的水溶解性与紫杉醇相比可能是有用的。虽然天然化合物，埃坡霉素B(2b，EpoB，示意图1中)，是天然产物的有效的埃坡霉素家族成员，但至少在异种移植小鼠中，却不幸具有麻烦地狭窄的治疗指数(Su等人Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1997，36，1093；Harris等人J.Org.Chem.1999，64，8434；每篇文献通过引用并入本发明)。

                                                                                                              2a R1＝H，R2＝CH3，埃坡霉素
                                                                                                              A(EpoA)
                                                                                                              2b R1＝CH3，R2＝CH3，埃坡霉素
1a R＝Ph，紫杉醇(他克唑)                                                             B(EpoB)
1b R＝t-Bu，多西紫杉醇(Taxotere)                                               2c R1＝H，R2＝CH2OH，埃坡霉素
                                                                                                              E(EpoE)
                                                                                                              2d R1＝CH3，R2＝CH2OH，埃坡霉
                                                                                                              素F(EpoF)
示意图1：紫杉烷类(Taxoids)和埃坡霉素
鉴于EpoB具有有限的治疗指数，人们研究其它的埃坡霉素类似物，特别是12，13-脱氧埃坡霉素，提供改进的治疗特性(therapeuticprofile)的能力(参见美国专利6,242,469、6,284,781、6,300,355、6,369,234、6,204,388、6,316,630；每篇文献通过引用并入本发明)。在各种小鼠模型上实施的体内实验证明12，13-脱氧埃坡霉素B(示意图2中3b，dEpoB)在小鼠异种移植物中具有抗各种敏感和耐药的人肿瘤的治疗效力(Chou等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998，95，9642和15798；通过引用并入本发明)。最近，这些脱氧埃坡霉素相比其它抗癌剂的治疗优势通过对比研究已经被最终证明(Chou等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2001，98，8113；通过引用并入本发明)。由于其令人印象深刻的体内特性，dEpoB已经提前通过狗体内的毒理评价，并且作为抗癌药物现正在进行人体试验。

3a R1＝H，R2＝CH3，脱氧埃               4a R1＝H，R2＝CH3，脱氢                    5a R1＝H，R2＝CH3，异
坡霉素A(dEpoA)                                              dEpoA(ddEpoA)                                                 -dEpoA
3b R1＝CH3，R2＝CH3，脱氧               4b R1＝CH3，R2＝CH3，脱氢                5b R1＝CH3，R2＝CH3，异
埃坡霉素B(dEpoB)                                            dEpoB(ddEpoB)                                                  -dEpoB
3c R1＝H，R2＝CH2OH，脱氧             4c R1＝H，R2＝CH2OH，脱氢              5c R1＝H，R2＝CH2OH，异
埃坡霉素E(dEpoE)                                            dEpoE(ddEpoE)                                                  dEpoE
3d R1＝CH3，R2＝CH2OH，                 4d R1＝CH3，R2＝CH2OH，脱              5d R1＝CH3，R2＝CH2OH，
脱氧埃坡霉素F(dEpoF)                                   氢dEpoF(ddEpoF)                                               异dEpoF(ddEpoF)
3e R1＝H，R2＝NH2，脱甲基              4e R1＝H，R2＝NH2，脱甲基氨             5e R1＝H，R2＝NH2，脱甲基
氨基-dEpoA(dadEpoA)                                   基-ddEpoA                                                            氨基-异-dEpoA
3f R1＝CH3，R2＝NH2，脱甲               4f R1＝CH3，R2＝NH2，脱甲                 5fR1＝CH3，R2＝NH2，脱甲
基氨基-dEpoB(dadEpoB)                                基氨基-ddEpoB                                                    基氨基-异-dEpoB
3g R1＝CH2F，R2＝CH3，26-氟          4g R1＝CH2F，R2＝CH3，26-氟
-dEpoB                                                                -ddEpoB
3h R1＝CF3，R2＝CH3，26-三             4h R1＝CF3，R2＝CH3，26-三氟
氟-dEpoB                                                           -ddEpoB
示意图2.各种脱氧埃坡霉素类似物
考虑到所述12，13-脱氧埃坡霉素的有前景的治疗效用，有必要研究另外的类似物以及另外的合成方法，用于合成现有埃坡霉素、脱氧埃坡霉素及其类似物以及其新型的类似物。特别的，鉴于在这类化合物的治疗效用上产生兴趣，有必要开发能提供大量前述的任何埃坡霉素或脱氧埃坡霉素或本发明中所述的化合物的的方法学，用于临床试验和大规模制备。
附图说明
图1表示12-三氟甲基-9，10-脱氢脱氧埃坡霉素D的合成。
图2表示由Epo A制备12-三氟甲基-9，10-脱氢脱氧埃坡霉素D的几种方法。
图3表示由Epo 490通过使C10-C11双键异构化至C9-C10位置而制备9，10-脱氢-epoD。
图4描绘了在9，10-位置上有修饰的各种埃坡霉素类似物。
图5表示采用在9，10-位置上的闭环复分解反应而进行的各种9，10-脱氢-埃坡霉素类似物的合成。
图6表示实验结果，其中超大的MX-1异种移植物植入裸鼠中。将MX-1肿瘤组织(50mg)在第0天皮下植入。在第22天(D22)当肿瘤大小达到960±132mg(约为体重的3.4％)时，6hr静脉内灌注弗迪隆(Fludelone)25mg/kg，如箭头所示于D22、D25、D28、D31和D34给药Q3D×5。随后间歇9天，于D43、D46、D49和D52进行第二周期治疗。肿瘤大小在赋形剂治疗对照组(●)和弗迪隆治疗组(□)(每组n＝5)中变化。继续观察Q3D直至D180，这时终止实验(在D52停止治疗后的128天)。图6A表示由肿瘤大小降低而表示的治疗效果。图6B表示裸鼠(各自选自对照组和治疗组的一只老鼠)在D25、D31、D37、D43和D52所拍的照片。在D180实验终止时没有观察到复发。图6C表示体重变化。
图7表示用人T-细胞淋巴母细胞性白血病(CCRF-CEM/他克唑)(对他克唑的耐药性为44倍)植入裸鼠的实验结果。在第0天将CCRF-CEM/他克唑(生物体外44倍耐药性)的肿瘤组织以50mg/小鼠皮下植入到裸鼠中。于D8开始用弗迪隆15mg/kg(□)(n＝3)和30mg/kg(△)(n＝4)进行6hr-静脉内灌注治疗，或D16开始，Q2D×3和然后将剂量提高到40mg/kg，Q2D×3(D22-26)和然后60mg/kg，Q2D×3(D28-40)。图10A表示由肿瘤大小降低而表示的治疗效果。图10B表示体重变化。
图11表示采用26-三氟-9，10-脱氢-dEpoB和他克唑对具有人肺癌(A549/他克唑)(对他克唑耐药性为44倍)的裸鼠的治疗(6小时静脉内灌注，Q3D×11)。图11A表示由肿瘤大小降低而表示的治疗效果。图11B表示体重变化。
图12表示采用9，10-脱氢-dEpoB对具有人类肺癌A549/他克唑(对他克唑耐药性为44倍)的裸鼠的治疗(6小时静脉内灌注，Q4D×5，×3)。图12A表示由肿瘤大小降低而表示的治疗效果。图12B表示治疗前后的体重变化。
图13表示采用26-三氟-9，10-脱氢-dEpoB、dEpoB和他克唑在采用口服制剂(PO，Q2D×7，×5)治疗具有人乳腺癌MX-1异种移植物裸鼠中的比较。图13A表示由肿瘤大小降低而表示的治疗效果。图13B表示体重变化。
图14为总结埃坡霉素衍生物的各种治疗和药物动力学参数的表。
图15表示采用26-三氟-9，10-脱氢-dEpoB和dEpoB治疗具有人类肺癌(A549)异种移植的裸鼠(6小时静脉内灌注，(Q2D×6)×2，×2)。图15A表示由肿瘤大小降低而表示的治疗效果。图15B表示在治疗中和治疗后的体重变化。
图16表示在10μM药物下的微管形成的稳定性。将在10μM他克唑存在下形成的微管定义为100％。得自牛脑的微管蛋白是Sigma的产品。微管蛋白装配试验根据制造商的说明书来实施。微管蛋白(200μl中1mg)用790μ的缓冲剂(0.1M MES，1mM EGTA，0.5mM MgCl2，0.1mM EDTA和2.5M甘油，pH6.5)和用10μl的药物(最终浓度10μM)培养。对于装配，在35℃下实施培养40分钟，和对于相同样品的拆卸，在4℃下实施培养40分钟。对于微管稳定，在350nm处测量吸光度值。溶剂空白(DMSO)从吸光度值中减去。
图17表示埃坡霉素体外抗癌细胞生长的效力和相对治疗指数。
图18为由碘化丙啶DNA染色而确定的细胞周期分析。对于OPM-2骨髓瘤细胞在用dEpoB(上图)和弗迪隆(下图)治疗后，细胞周期在开始后6小时的G2M阶段中止并且在24小时完全阻断。两种药物导致相同细胞周期中止的模式。
图19表示Annexin V在RPMI8226骨髓瘤细胞系上染色。在初期凋亡细胞中，膜磷脂磷脂酰丝氨酸(PS)由细胞膜内小叶易位到细胞膜外小页，因此将PS暴露于外部细胞环境。Annexin V为具有对PS高度亲和的35-36kD Ca+依附的磷脂结合蛋白，并利用暴露的PS结合到细胞上。结合活体染料，例如7-氨基-放线菌素(7-AAD)，染色死亡细胞，这项试验用于鉴定早期凋亡细胞。所示的数据显示在用dEpoB或弗迪隆治疗24小时后多数细胞或者凋亡或者死亡。
图20表示用弗迪隆(125nM)治疗24小时的骨髓瘤和淋巴瘤细胞系的显微照片。可以看见中止于G2/M的细胞的特征环状结构。
图21表示用弗迪隆和dEpoB(125nM)治疗的RPMI8226骨髓瘤细胞的细胞计数。在不同的时间点(1、2、4、8、24小时)，将药物洗除，并将该细胞继续培养直至48小时。注意到暴露于弗迪隆短至1小时时，肿瘤细胞数即逐步降低，同时在24小时时多数细胞经历凋亡，而用dEpoB，细胞则仍继续增殖。
图22表示RPMI8226骨髓瘤细胞的α-微管蛋白染色。弗迪隆明显稳定了微管并在治疗早期(治疗RPMI8226骨髓瘤细胞12小时)即大大增加了微管聚合物质量。药物治疗24小时后，微管质量降低并被破坏，同时细胞经历凋亡。
图23为由碘化丙啶DNA染色确定的细胞周期分析。实线表示G1和G2的值，灰色阴影区表示在S阶段中的细胞，虚线描绘出二重细胞数的总曲线，采用他克唑尤其明显(左上图)。上排说明卵巢癌细胞系IGROV用弗迪隆(10nM)、dEpoB(100nM)和他克唑(100nM)培养24小时后在G2M阶段停止。下排说明增加弗迪隆浓度增加了HT-29细胞周期的停止。用弗迪隆的100nM培养导致在24小时后大量凋亡，在包括IGROV和HT-29的几种细胞系中，阻碍了细胞周期分析。
图24表示用100nM弗迪隆、他克唑或dEpoB培养24小时后Ovcar3卵巢癌细胞系的Annexin V染色。在左下象限给出的百分比为AnnexinV+/P1-阴性细胞的百分比，这与在早期凋亡阶段的细胞类似。
图25为用HEMA3染色的治疗24小时后的HT-29结肠癌细胞的cytospin(200×放大)。(a)用溶剂(DMSO)治疗的对照细胞。(b)-(d)表示增加弗迪隆的浓度1、10和100nM。(e)在应用100nM的dEpoB后的HT-29细胞和(f)在应用100nM的他克唑后的HT-29细胞。所有三种药物都在24小时后产生同样的表型，明显呈导致凋亡的核的类环结构。
图26表示在弥漫性人肿瘤异种移植和转移人肿瘤异种移植模型中，评价弗迪隆和dEpoB的作用的体系的实验设计。
图27表示细胞增殖和IC50(50％细胞抑制的浓度)试验。细胞增殖采用3’-[1-(苯氨基-羰基)-3，4-四唑]-双(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠水合物(XTT)而测定，其通过活细胞中的线粒体脱氢酶测量四唑化合物向甲的转化。甲的量与存在于试验混合物中活细胞的数量成比例。每个数据均为四次独立测量的平均值。对于骨髓瘤细胞系(RPMI8226，CAG)，弗迪隆的IC50为约7.6～36.67nM，并且dEpoB的IC50为36.67～61.34nM。对于淋巴瘤系(SKIDLBCL和RL)，弗迪隆的IC50为约60～80nM。
图28表示在正常基质细胞上的细胞增殖和IC50试验。采用如在图104中所描述的相同的方法。人骨髓间质细胞系，HS-27A和HS-5通过E6/E7基因而不灭，具有正常的骨髓基质的功能，其支持了干细胞的自我更新和增殖。对于这些基质系，弗迪隆和dEpoB的IC50约为90～100nM，这与肿瘤系具有对等的群体倍增时间。
图29表示弗迪隆和dEpoB的浓度对细胞周期停滞的滴定。采用CAG骨髓瘤细胞系。在浓度为31.25nM时，两种药物均完全阻断细胞周期于G2M阶段(低于31.25nM的数据未示出)。
图30表示弗迪隆和dEpoB的浓度对细胞周期停滞的滴定。采用RPMI8226骨髓瘤细胞系。在浓度为31.25nM时，两种药物均完全阻断细胞周期于G2M阶段(低于31.25nM的数据未示出)。
图31表示Annexin V在CAG骨髓瘤细胞系上的染色。在初期凋亡细胞中，膜磷脂磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜的内小叶易位到细胞膜外小叶，因此将PS暴露于外部细胞环境。Annexin V为具有对PS高度亲和的35-36kD Ca+依附的磷脂结合蛋白，并利用暴露的PS结合到细胞上。结合于活体染料，例如7-氨基-放线菌素(7-AAD)，染色死亡的细胞，这项试验用于鉴定早期凋亡细胞。所示的数据显示用弗迪隆或dEpoB治疗24小时后大多数细胞或者进入凋亡或者死亡。注意X-轴为Annexin染色和Y-轴为7-ADD染色。
图32为DNA片段化试验。凋亡的主要生物化学特点为从染色质中核小体的移除。核小体移除由在染色质中核小体之间暴露的DNA连接区域的核酸内切酶介导的消化而导致。由于围绕组蛋白核的DNA的180-200个碱基在构象上免遭消化，该核酸内切酶介导的核小体移除在琼脂糖凝胶中可观察为DNA梯。所示数据说明在用弗迪隆或dEpoB治疗RPMI8226和CAG骨髓瘤细胞24hr后检测到了典型的DNA梯。该数据说明由埃坡霉素通过胱冬肽酶(caspase)途径引起细胞凋亡。
图33表示体重的交替变化和在埃坡霉素(20mg/kg)治疗弥漫性CAG异种移植骨髓瘤小鼠后的结果。所示数据显示对照小鼠在约30天时死亡并且在治疗20天后观察到体重显著降低。在用dEpoB治疗的小鼠和对照之间在寿命内没有显著性不同；然而用弗迪隆治疗的小鼠显示出比对照组和dEpoB组均显著延长的存活时间。每组中所用小鼠的数量均为四只，并且在注射CAG细胞之前辐射300Rad。
图34表示弥漫性CAG异种移植骨髓瘤小鼠在第4周的治疗。将10×106个用Luc-eGFP-TK融合基因改造的CAG骨髓瘤细胞静脉内注射入小鼠尾静脉，并且在通过生物发光图像检测到相宜骨髓瘤细胞植入的第7天时开始治疗。本图显示分别用对照或dEpoB或弗迪隆治疗的小鼠的生物发光图像。
图35表示在CAG异种移植小鼠中(N＝4)平均肿瘤光子发射的定量。该图显示用弗迪隆治疗的小鼠比用赋形剂或单独用dEpoB治疗的小鼠具有显著降低的肿瘤光子发射。肿瘤光子发射与肿瘤负荷正相关。
图36表示体重的交替变化和在埃坡霉素(20mg/kg)治疗弥漫性CAG异种移植骨髓瘤小鼠后的结果。本图在第一个30天显示如图33相似的特征；但是弗迪隆治疗小鼠的唯一存活组接受另外5剂量的Velcade(6.25μg/小鼠，静脉内灌注)加强。
图37表示在第18天弥漫性CAG异种移植骨髓瘤小鼠的治疗。该图显示出各组间图像的显著不同，这反映出其所在组中的肿瘤负荷。
图38表示在第18天在弥漫性CAG异种移植骨髓瘤小鼠的治疗中平均肿瘤光子发射的定量。该图显示出各组间图像的显著不同，这反映出其所在组中的肿瘤负荷。
图39表示在第40天弥漫性CAG异种移植骨髓瘤小鼠的治疗。该图显示出图像的不同，反映出三组小鼠中的肿瘤负荷。
图40表示在第40天在弥漫性CAG异种移植骨髓瘤小鼠的治疗中平均肿瘤光子发射的定量。该图显示出图像的不同，反映出三组小鼠中的肿瘤负荷。
图41表示用弗迪隆与Velcade结合治疗CAG异种移植骨髓瘤小鼠。用弗迪隆从第0天至28天(20mg/kg，Q2d)和用Velcade从第35天至45天(6.25μg/小鼠，静脉内，3/w)治疗小鼠。在第10天开始治疗，并且在第59天弗迪隆12剂量和Velcade 5剂量后拍摄图像。与在第40天的图像相比，三只小鼠中的两只在股骨和在无脊椎柱中均具有显著降低的肿瘤负荷。
图42为用CAG骨髓瘤细胞异种移植的七只NOD/SCID小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。对照小鼠在移植CAG细胞后40天内死亡，和用dEpoB治疗的小鼠在50天内死亡。除了一只小鼠在70天内死亡，所有用弗迪隆治疗的小鼠存活超过80天。
图43表示细胞凋亡的途径。
图44表示在CAG骨髓瘤细胞中埃坡霉素诱导的时间依赖的胱冬肽酶3过程，其显示随着药物治疗的时间延长增加了17kD的胱冬肽酶3的切割形式。
图45表示用切割的胱冬肽酶-3抗体进行的CAG骨髓瘤细胞的免疫组织化学的染色，其显示出在凋亡细胞中细胞质和核周的定位(示出了低和高的放大率)。
图46表示用切割的胱冬肽酶-3抗体进行的CAG骨髓瘤细胞的免疫组织化学的染色，其显示出在凋亡细胞中细胞质和核周的定位(示出了低和高的放大率)。
图47表明胱冬肽酶8的活性在埃坡霉素治疗后增加了，并且这种增加可通过胱冬肽酶8的特异抑制剂抑制。
图48表明胱冬肽酶8的活性在埃坡霉素治疗后增加了，并且这种增加可通过胱冬肽酶8的特异抑制剂抑制。
图49表明胱冬肽酶9的活性在埃坡霉素治疗后增加了。
图50表示在KL不存在或存在下，用dEpoB或弗迪隆培养24h的CB CD34+细胞的Annexin V染色。然后将药物洗除并实施Annexin V染色。实心区域代表赋形剂对照组并且空心区域代表药物治疗组。短时间暴露于埃坡霉素没有明显增加非循环人CD34+细胞的凋亡。
图51表示在集落形成中，埃坡霉素对非循环人CD34+细胞的影响。通过2星期集落形成而评价的先祖细胞，在对照组和药物治疗组之间没有显著不同。
图52表示在集落形成中，埃坡霉素对非循环人CD34+细胞的影响。通过2星期集落形成而评价的先祖细胞，在对照组和药物治疗组之间没有显著不同。
图53表示由弗迪隆和紫杉醇抗药物耐药性的人T细胞淋巴母细胞性白血病(CCRT-CEM/紫杉醇)异种移植物的治疗效果(体重降低)。尽管显著地降低体重，但对于所有治疗没有毒性死亡。
定义
本发明的一些化合物，和特定官能团的定义还更详细地描述于下。为了本发明的目的，化学元素根照元素周期表(CAS版本，Handbook ofChemistry and Physics(化学物理手册)，第75版，封二)而确定，并且特定官能团为在其中所述的一般定义。另外，有机化学的一般性原则，以及特定官能团部分和反应性描述于“Organic Chemistry(有机化学)”，Thomas Sorrell，University Science Books，Sausalito：1999，其全部内容通过引用而并入本发明。另外，本领域普通技术人员将认识到的是，如本发明中所述的合成方法利用了多种保护基团。如本发明中所用的术语“保护基团”，意思是指特别的官能部分，例如O、S或N，被临时封闭以使得可以在多官能化合物中另一个反应位置上选择性地进行反应。在优选的实施方案中，保护基团以良好产率选择性地反应以给出被保护了的底物，该底物对所计划进行的反应是稳定的；保护基团应当能以良好产率选择性地除去，其通过容易获得的优选无毒的不进攻其它官能团的试剂而进行；保护基团形成可易于分离的衍生物(更优选不形成新的手性中心)；并且保护基团具有最小的附加功能性以避免其它位置的反应。如在本发明中详述的，氧、硫、氮和碳保护基团可被利用。虽然典型的保护基团在本发明中详述，但是将认识到的是，本发明不意于受这些保护基团限制；更确切地，各种另外的同等保护基团可用上述标准容易地确定并应用于本发明的方法中。另外，在“Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基团)”第三版，Greene，T.W.和Wuts，P.G.编，John Wiley & Sons，New York：1999中描述了多种保护基团，其全部内容通过引用并入本发明。
将认识到的是，本发明中所描述的化合物，可以用任何数量的取代基或功能部分取代。通常，术语“取代”，无论是否在前面加上术语“任选地”，以及包含于本发明分子式中的取代基，是指用指定取代基的基团取代给定结构中的氢基团。当在任何给定结构中多于一个位置可以取代以多于一个选自指定基团的取代基时，在每个位置上的取代基可以是相同的或不同的。如本发明中所用的，术语“取代”被设想包括所有有机化合物的可允许的取代基。在广义的方面，可允许的取代基包括有机化合物的无环的和环状的、支链的和无支链的、碳环的和杂环的、芳香族的和非芳香族的取代基。为了本发明的目的，杂原子如氮可以具有氢取代基和/或本发明中所述的任何可允许的有机化合物的取代基，只要其满足该杂原子的化合价。另外，本发明不意于以任何方式被有机化合物的可允许取代基限制。由本发明设想的取代基和变体的组合优选导致形成稳定的化合物的那些，所述化合物用于治疗，例如增殖性疾病，包括但不限于癌症。术语“稳定的”，如本发明中所用，优选指这样的化合物，其具有足以允许被制备的稳定性，和其保持该化合物的完整性以被检测的足够长的时间并优选用于详述于本发明中的目的的足够长的时间。
术语“脂肪族”，如本发明中所用，包括饱和的和不饱和的、直链的(即无支链的)、支链的、环状的或多环的脂肪族烃，其任选地取代以一个或多个官能团。本领域普通技术人员将认识到的是，本发明中“脂肪族”意于包括但不限于：烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基和环炔基部分。因此，如本发明中所用的，术语“烷基”包括直链、支链和环状烷基。类似的惯例应用于其它一般术语，例如“烯基”、“炔基”等等。另外，如本发明中所用的，术语“烷基”、“烯基”、“炔基”等包括取代的和未取代的基团。在一些实施方案中，如本发明中所用的，“低级烷基”指那些具有1-6个碳原子的烷基(环状的、无环的、取代的、未取代的、支链的或无支链的)。
在一些实施方案中，本发明中所用的烷基、烯基和炔基包含1-20个脂肪族碳原子。在另一些实施方案中，本发明中所用的烷基、烯基和炔基包含1-10个脂肪族碳原子。在再一些实施方案中，本发明中所用的烷基、烯基和炔基包含1-8个脂肪族碳原子。在又一些实施方案中，本发明中所用的烷基、烯基和炔基包含1-6个脂肪族碳原子。在再一些实施方案中，本发明中所用的烷基、烯基和炔基包含1-4个脂肪族碳原子。因此例举的脂肪族基团包括但不限于，例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、-CH2-环丙基、烯丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、环丁基、-CH2-环丁基、正戊基、仲戊基、异戊基、叔戊基、环戊基、-CH2-环戊基、正己基、仲己基、环己基、CH2-环己基部分等等，其同样可具有一个或多个取代基。烯基包括但不限于，例如，乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基等。典型的炔基包括但不限于，乙炔基、2-丙炔基(炔丙基)、1-丙炔基等。
如本发明中所用的术语“烷氧基”或“硫代烷基”指如前定义的烷基，通过氧原子或通过硫原子连接到母体分子部分。在一些实施方案中，所述烷基包含1-20个脂肪族碳原子。在另一些实施方案中，所述烷基包含1-10个脂肪族碳原子。在再一些实施方案中，本发明中所用的烷基、烯基和炔基包含1-8个脂肪族碳原子。在又一些实施方案中，所述烷基包含1-6个脂肪族碳原子。在再一些实施方案中，所述烷基包含1-4个脂肪族碳原子。烷氧基的例子包括但不限于，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、新戊氧基和正己氧基。硫代烷基的例子包括但不限于，甲硫基、乙硫基、丙硫基、异丙硫基、正丁硫基等。
术语“烷氨基”指具有-NHR’结构的基团，其中R’为如本发明中所定义的烷基。在一些实施方案中，所述烷基包含1-20个脂肪族碳原子。在另一些实施方案中，所述烷基包含1-10个脂肪族碳原子。在再一些实施方案中，本发明中所用的烷基、烯基和炔基包含1-8个脂肪族碳原子。在又一些实施方案中，所述烷基包含1-6个脂肪族碳原子。在再一些实施方案中，所述烷基包含1-4个脂肪族碳原子。烷氨基的例子包括但不限于，甲氨基、乙氨基、异丙氨基等等。
本发明化合物的上述脂肪族(和其它)部分的取代基的一些例子包括但不限于，脂肪族、杂脂肪族、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、烷氧基、芳氧基、杂烷氧基、杂芳氧基、烷硫基、芳硫基、杂烷硫基、杂芳硫基、F、Cl、Br、I、-OH、-NO2、-CN、-CF3、-CH2CF3、-CHCl2、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH2NH2、-CH2SO2CH3、-C(O)Rx、-CO2(Rx)、-CON(Rx)2、-OC(O)Rx、-OCO2Rx、-OCON(Rx)2、-N(Rx)2、-S(O)2Rx、-NRx(CO)Rx，其中每次出现的Rx独立地包括但不限于，脂肪族、杂脂肪族、芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基，其中上述的和在此描述的任何脂肪族、杂脂肪族、芳烷基或杂芳烷基取代基可以是取代的或未取代的、支链的或无支链的、环状或无环的，并且其中上述的和在此描述的任何芳基或杂芳基取代基可以是取代或未取代的。另外的通常可应用的取代基的例子由在本发明实施例中所示的特定实施方案举例说明。
通常，术语“芳基”和“杂芳基”，如本发明中所用，指具有优选3-14个碳原子的稳定的单环或多环、杂环、多环和多杂环不饱和部分，其中每个均可被取代或未取代。取代基包括但不限于，任何前面提及的取代基，即如本发明中公开的对脂肪族部分列举的取代基或对其它部分列举的取代基，该取代基导致形成稳定的化合物。在本发明的一些实施方案中，“芳基”指具有一个或两个芳香环的单环或二环碳环体系，包括但不限于，苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、茚基等。在本发明的一些实施方案中，本发明中所用的术语“杂芳基”，指具有五至十个环原子的环状芳香基，其中一个环原子选自S、O和N；零个、一个或两个环原子为独立地选自S、O和N的额外杂原子；并且剩余的环原子为碳，该环状芳香基通过任何环原子连接到本发明分子的其它部分，例如吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、苯硫基、呋喃基、喹啉基、异喹啉基等等。
将认识到芳基和杂芳基(包括二环芳基)可以是未取代的或取代的，其中取代包括其上的一个、两个、三个或更多个氢原子独立地替换以任何一个或多个如下部分，包括但不限于：脂肪族、杂脂肪族、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、烷氧基、芳氧基、杂烷氧基、杂芳氧基、烷硫基、芳硫基、杂烷硫基、杂芳硫基、F、Cl、Br、I、-OH、-NO2、-CN、-CF3、-CH2CF3、-CHCl2、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH2NH2、-CH2SO2CH3、-C(O)Rx、-CO2(Rx)、-CON(Rx)2、-OC(O)Rx、-OCO2Rx、-OCON(Rx)2、-N(Rx)2、-S(O2)Rx、-NRx(CO)Rx，其中每个出现的Rx独立地包括但不限于，脂肪族、杂脂肪族、芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基，其中任何上述的和在此描述的脂肪族、杂脂肪族、芳烷基或杂芳烷基取代基可以是取代的或未取代的，支链的或无支链的、环状的或无环的，并且其中任何上述的和在此描述的芳基或杂芳基取代基可以是取代的或未取代的。另外的通常可应用的取代基的例子由在本发明实施例中所示的特定实施方案举例说明。
本发明中所用的术语“环烷基”特指具有三至七个，优选三至十个碳原子的基团。适合的环烷基包括但不限于，环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基等等，如在其它的脂肪族、杂脂肪族或杂环部分中的情况那样，其可任选的取代以如下基团，包括但不限于：脂肪族、杂脂肪族、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、烷氧基、芳氧基、杂烷氧基、杂芳氧基、烷硫基、芳硫基、杂烷硫基、杂芳硫基、F、Cl、Br、I、-OH、-NO2、-CN、-CF3、-CH2CF3、-CHCl2、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH2NH2、-CH2SO2CH3、-C(O)Rx、-CO2(Rx)、-CON(Rx)2、-OC(O)Rx、-OCO2Rx、-OCON(Rx)2、-N(Rx)2、-S(O2)Rx、-NRx(CO)Rx，其中每个出现的Rx独立地包括但不限于，脂肪族、杂脂肪族、芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基，其中任何上述的和在此描述的脂肪族、杂脂肪族、芳烷基或杂芳烷基取代基可以是取代的或未取代的，支链的或无支链的、环状的或无环的，并且其中任何上述的和在此描述的芳基或杂芳基取代基可以是取代的或未取代的。另外的通常可应用的取代基的例子由在本发明实施例中所示的特定实施方案举例说明。
本发明中所用的术语“杂脂肪族”指脂肪族部分，包含一个或多个氧、硫、氮、磷或硅原子，例如，替代碳原子。杂脂肪族部分可以是支链的、无支链的、环状的或无环的并包括饱和的和不饱和的杂环例如吗啉基、吡咯烷基等。在一些实施方案中，杂脂肪族部分其上的一个或多个氢原子独立地替代以一个或多个部分，包括但不限于，脂肪族、杂脂肪族、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、烷氧基、芳氧基、杂烷氧基、杂芳氧基、烷硫基、芳硫基、杂烷硫基、杂芳硫基、F、Cl、Br、I、-OH、-NO2、-CN、-CF3、-CH2CF3、-CHCl2、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH2NH2、-CH2SO2CH3、-C(O)Rx、-CO2(Rx)、-CON(Rx)2、-OC(O)Rx、-OCO2Rx、-OCON(Rx)2、-N(Rx)2、-S(O2)Rx、-NRx(CO)Rx，其中每个出现的Rx独立地包括但不限于，脂肪族、杂脂肪族、芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基，其中任何上述的和在此描述的脂肪族、杂脂肪族、芳烷基或杂芳烷基取代基可以是取代的或未取代的，支链的或无支链的、环状的或无环的，并且其中任何上述的和在此描述的芳基或杂芳基取代基可以是取代的或未取代的。另外的通常可应用的取代基的例子由在本发明实施例中所示的特定实施方案举例说明。
本发明中所用的术语“卤代”和“卤素”指选自氟、氯、溴和碘的原子。
术语“卤代烷基”指如上定义的烷基，其具有一个、两个或三个卤素原子连接其上并举例说明为如氯甲基、溴乙基、三氟甲基等等这样的基团。
本发明中所用的术语“杂环烷基”或“杂环”指非芳香族的5元、6元或7元环或多环基团，包括但不限于二环或三环基团，包含具有一至三个杂原子(独立地选自氧、硫、和氮)的稠合的六元环，其中(i)每个5元环具有0至1个双键和每个6元环具有0至2个双键，(ii)氮和硫杂原子可任选地被氧化，(iii)氮杂原子可任选地被季铵化，和(iv)任何上述的杂环可以稠合到苯环上。典型的杂环包括但不限于，吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基和四氢呋喃基。在一些实施方案中，“取代的杂环烷基或杂环”基团是可利用的并如本发明中使用的，其指如上所定义的杂环烷基或杂环基团，通过用如下基团独立地替代其上的一个、二个或三个氢原子而被取代，所述基团包括但不限于，脂肪族、杂脂肪族、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、烷氧基、芳氧基、杂烷氧基、杂芳氧基、烷硫基、芳硫基、杂烷硫基、杂芳硫基、F、Cl、Br、I、-OH、-NO2、-CN、-CF3、-CH2CF3、-CHCl2、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH2NH2、-CH2SO2CH3、-C(O)Rx、-CO2(Rx)、-CON(Rx)2、-OC(O)Rx、-OCO2Rx、-OCON(Rx)2、-N(Rx)2、-S(O2)Rx、-NRx(CO)Rx，其中每个出现的Rx独立地包括但不限于，脂肪族、杂脂肪族、芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基，其中任何上述的和在此描述的脂肪族、杂脂肪族、芳烷基或杂芳烷基取代基可以是取代的或未取代的，支链的或无支链的、环状的或无环的，并且其中任何上述的和在此描述的芳基或杂芳基取代基可以是取代的或未取代的。另外的通常可应用的取代基的例子由在本发明实施例中所示的特定实施方案举例说明。
“标记的”：本发明中所用的术语“标记的”意于表示化合物具有连接其上的至少一个元素、同位素或化学化合物使得该化合物可检测。通常，标记物典型地分成三类：a)同位素标记物，其可以是放射性的或者是重同位素，包括但不限于，2H、3H、32P、35S、67Ga、99mTc(Tc-99m)、111In、123I、125I、169yb和186Re；b)免疫标记物，其可以是抗体或抗原，其可以结合于酶(例如辣根过氧化物酶)上以制得可检测试剂；和c)显色的、发光的、磷光的或荧光的染料。将认识到的是，该标记物可以在任何位置上并入本发明化合物中，只要该位置不干扰被检测化合物的生物活性或特性。在本发明的一些实施方案中，利用光亲和标记直接说明在生物体系中的分子间相互作用(例如，探测微管蛋白二聚体中的埃坡霉素结合位置)。可用各种已知的发光物质，大部分依赖于重氮化合物、叠氮或重氮甲烷(diazirine)向氮宾或卡宾的光转换(参见，Bayley，H.，Photogenerated Reagents in Biochemistry and MolecularBiology(1983)，Elsevier，Amsterdam。)，其全部内容通过引用而并入本发明。在本发明的一些实施方案中，所用的光亲和标记物为用一个或多个卤素部分取代的邻-、间-和对-叠氮苯甲酰基，包括但不限于4-叠氮基-2，3，5，6-四氟苯甲酸。
“聚合物”：本发明中所用的术语“聚合物”指包含链的组合物，所述链可以是打开的、闭合的、直链的、支链的或交联的重复单元(单体)，所述重复单元可以是相同的或不同的。将认识到的是，在一些实施方案中术语聚合物指生物聚合物，在本发明中所用的生物聚合物意于指天然的聚合物材料或基于天然的那些材料，包括但不限于核酸、肽及其类似物。在另一些实施方案中，术语聚合物指合成聚合物，例如生物可降解聚合物或其它聚合物材料。将认识到的是，聚合物固相支持体也包括于本发明的聚合物中。本发明的化合物可以连接于聚合物支持体上并因此可以在固相上进行合成修饰。本发明中所用的术语“固相支持体”指包括但不限于，小颗粒、盘状物、毛细管、中空纤维、针状物、针状物、固体纤维、纤维素珠、多孔玻璃珠、硅胶、任选与二乙烯苯交联的聚苯乙烯珠、接枝共聚珠、聚丙烯酰胺珠、乳胶粒子、任选与N，N’-双-丙烯酰乙二胺交联的二甲基丙烯酰胺，和用疏水聚合物涂覆的玻璃颗粒。本领域普通技术人员将认识到的是，特定固相支持体的选择将受限于支持体与所利用的反应化学的相容性。典型的固相支持体为Tentagel氨基树脂，由1)与二乙烯基苯交联的聚苯乙烯珠和2)PEG(聚乙二醇)组成的复合物。Tentagel是特别有用的固相支持体，因为它是用于颗粒上(on-bead)或颗粒下(off-bead)试验的通用支持体，并且它还具有在从甲苯到水的溶剂中的良好的溶胀性。
本发明一些实施方案的描述
认识到开发新型和有效的癌症疗法的需要，本发明提供可获得具有广泛的生物活性和药理活性的大环的新型合成方法学，以及具有这些活性的新型化合物，新型治疗组合物，和使用这些化合物和组合物的方法。
在一些实施方案中，本发明化合物用于治疗癌症。本发明的一些化合物显示出对癌细胞系的细胞毒性或生长抑制作用，显示出聚合微管蛋白和稳定微管装配的能力，和/或导致在癌细胞异种移植物模型中肿瘤的缩小或消失。在一些实施方案中，本发明化合物可具有减少的或最小化的副作用，包括要害器官毒性、恶心、呕吐、腹泻、脱发、体重降低、体重增加、肝毒性、皮肤病等。本发明化合物还可能由于增加的水溶性、降低的毒性、增加的治疗范围、增强的功效等而易于制成制剂。
本发明化合物的一般性说明
本发明的化合物包括如下进一步定义的通式(0)的化合物，和其药学上可接受的衍生物；和其药学可接受的衍生物：

其中R0为取代或未取代的芳基、杂芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、杂芳烷基、杂芳烯基或杂芳炔基部分；在一些实施方案中，R0为芳烷基、芳烯基、杂芳烷基或杂芳烯基部分；在另一些实施方案中，R0为杂芳烯基部分；在一些实施方案中，R0为杂芳烷基部分；在另一些实施方案中，R0为5-7元的芳基或杂芳基部分；在再一些实施方案中，R0为8-12元二环芳基或杂芳基部分；在又一些实施方案中，R0为二环部分，其中苯环被稠合到杂芳基或芳基部分上；在另一些实施方案中，R0为双环部分，其中苯环被稠合到噻唑、噁唑或咪唑部分上；在再一些实施方案中，R0为取代或未取代的苯基部分；
R3和R4各自独立地为氢；或取代或未取代、直链或支链、环状或无环的脂肪族、杂脂肪族，芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基部分，任选取代以一个或多个如下基团：羟基、被保护的羟基、烷氧基、羧基、甲醛基、直链或支链的烷基或环状缩醛、氟、氨基、被保护的氨基、用一个或两个烷基或芳基部分取代的氨基、N-羟基亚氨基或N-烷氧基亚氨基；在一些实施方案中，R3和R4各自独立地为氢、氟或低级烷基；在另一些实施方案中，R3和R4各自独立地为氢或甲基；在又一些实施方案中，R3为甲基和R4为氢；
R5和R6各自独立地为氢或保护基团；在一些实施方案中，R5和R6都是氢；
X为O、S、C(R7)2或NR7，其中每种情况下的R7独立地为氢或低级烷基；在一些实施方案中，X为O；在另一些实施方案中，X为NH；
Y为O、S、NH、C(R7)2、CH2、N(R7)或NH，其中每种情况下的R7独立地为氢或低级烷基；在一些实施方案中Y为O；在另一些实施方案中，Y为NH；在再一些实施方案中，Y为CH2；
每个R8独立地为氢；卤素，羟基，烷氧基，氨基，二烷氨基，烷氨基，氟，氰基，或取代或未取代、直链或支链、环状或无环的脂肪族、杂脂肪族、芳基、杂芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基或杂芳烷基、杂芳烯基、杂芳炔基部分，任选取代以一个或多个如下基团：羟基、被保护的羟基、烷氧基、羧基、甲醛基、直链或支链的烷基或环状缩醛、氟、氨基、被保护的氨基、用一个或两个烷基或芳基部分取代的氨基、N-羟基亚氨基或N-烷氧基亚氨基；在一些实施方案中，R8为氢；在另一些实施方案中，R8为羟基；在再一些实施方案中，R8为氟；在又一些实施方案中，R8为低级烷基例如甲基；在另一些实施方案中，R8为-CF3、-CF2H或CFH2；在另一些实施方案中，R8为全氟化的或氟化的烷基；在再一些实施方案中，R8为卤化的或全卤化的烷基；
R9和R10各自独立地为氢；或取代或未取代、直链或支链、环状或无环的脂肪族、杂脂肪族、芳基、杂芳基、芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、杂芳烷基、杂芳烯基或杂芳炔基部分，任选取代以一个或多个如下基团：羟基、被保护的羟基、烷氧基、羧基、甲醛基、直链或支链的烷基或环状缩醛、氟、氨基、被保护的氨基、用一个或两个烷基或芳基部分取代的氨基、N-羟基亚氨基或N-烷氧基亚氨基；在一些实施方案中，R9和R10之一为甲基；在另一些实施方案中，R9和R10均为甲基；在再一些实施方案中，R9和R10之一为甲基，并且另一个为氢；在另一些实施方案中，R9和R10都为氢；
A-B代表CRA＝CRB-，C(RA)2-C(RB)2-或-C≡C-；
C-D代表CRC＝CRD-，-C(RC)2-C(RD)2-或-C≡C-；
其中每种情况下的RA独立地为氢；卤素；-ORA’；-SRA’；-N(RA’)2；-C(O)ORA’；-C(O)RA’；-CONHRA’；-O(C＝O)RA’；-O(C＝O)ORA’；-NRA’(C＝O)RA’；N3；N2RA’；环状缩醛；或环状或无环、直链或支链的脂肪族、杂脂肪族、芳基或杂芳基，任选取代以一个或多个如下基团：氢；卤素；-ORA’；-SRA’；-N(RA’)2；-C(O)ORA’；-C(O)RA’；-CONHRA’；-O(C＝O)RA’；-O(C＝O)ORA’；-NRA’(C＝O)RA’；N3；N2RA’；环状缩醛；或环状或无环、直链或支链的取代或未取代的脂肪族、杂脂肪族、芳基或杂芳基部分；
对于每种情况下的RB独立地为氢；卤素；-ORB’；-SRB’；-N(RB’)2；-C(O)ORB’；-C(O)RB’；-CONHRB’；-O(C＝O)RB’；-O(C＝O)ORB’；-NRB’(C＝O)RB’；N3；N2RB’；环状缩醛；或环状或无环、直链或支链的脂肪族、杂脂肪族、芳基或杂芳基，任选取代以一个或多个如下基团：氢；卤素；-ORB’；-SRB’；-N(RB’)2；-C(O)ORB’；-C(O)RB’；-CONHRB’；-O(C＝O)RB’；-O(C＝O)ORB’；-NRB’(C＝O)RB’；N3；N2RB’；环状缩醛；或环状或无环、直链或支链的取代或未取代的脂肪族、杂脂肪族、芳基，或杂芳基部分；在一些实施方案中，RB为氢、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、环丙基、环丁基、环戊基或环己基，各自未取代或任选取代以一个或多个出现的如下基团：卤素、-OH、-ORB’、NH2或N(RB’)2或其任意组合，其中每种情况下的RB’独立地为氢、烷基、芳基或保护基团，在另一些实施方案中，RB为氢、甲基或乙基，在又一些实施方案中，RB为甲基，在另一些实施方案中，-CY3、-CHY2、-CH2Y，其中Y为F、Br、Cl、I、ORB’、NHRB’、N(RB’)2或SRB’；在再一些实施方案中，RB为-CF3、-CH2F或CHF2；在另一些实施方案中，RB为全氟化或氟化的烷基；在再一些实施方案中，RB为卤化的或全卤化的烷基；
对于每种情况下的RC独立地为氢；卤素；-ORC’；-SRC’；-N(RC’)2；-C(O)ORC’；-C(O)RC’；-CONHRC’；-O(C＝O)RC’；-O(C＝O)ORC’；-NRC’(C＝O)RC’；N3；N2RC’；环状缩醛；或环状或无环、直链或支链的脂肪族、杂脂肪族、芳基或杂芳基，任选取代以一个或多个如下基团：氢；卤素；-ORC’；-SRC’；-N(RC’)2；-C(O)ORC’；-C(O)RC’；-CONHRC’；-O(C＝O)RC’；-O(C＝O)ORC’；-NRC’(C＝O)RC’；N3；N2RC’；环状缩醛；或环状或无环、直链或支链的取代或未取代的脂肪族、杂脂肪族、芳基或杂芳基部分；在一些实施方案中，RC为卤素、烷基、羟基或氨基；在另一些实施方案中，RC为氟；在再一些实施方案中，RC为羟基；
对于每种情况下的RD独立地为氢；卤素；-ORD’；-SRD’；-N(RD’)2；-C(O)ORD’；-C(O)RD’；-CONHRD’；-O(C＝O)RD’；-O(C＝O)ORD’；-NRD’(C＝O)RD’；N3；N2RD’；环状缩醛；或环状或无环、直链或支链的脂肪族、杂脂肪族、芳基或杂芳基，任选取代以一个或多个如下基团：氢；卤素；-ORD’；-SRD’；-N(RD’)2；-C(O)ORD’；-C(O)RD’；-CONHRD’；-O(C＝O)RD’；-O(C＝O)ORD’；-NRD’(C＝O)RD’；N3；N2RD’；环状缩醛；或环状或无环、直链或支链的取代或未取代的脂肪族、杂脂肪族、芳基，或杂芳基部分；或者
其中RA，RB，RC或RD中任意两个合在一起可以形成环状部分并可以通过氧、硫、碳或氮原子连接，或者任意两个相邻的RA，RB，RC或RD合在一起，可以形成3-6元取代或未取代的脂肪族、杂脂肪族、芳基或杂芳基环；在一些实施方案中，RA和RB合在一起形成通过氧、硫、碳或氮原子连接的3元环；在另一些实施方案中，RC和RD合在一起形成通过氧、硫、碳或氮原子连接的3元环；
其中每种情况下的RA’，RB’，RC’或RD’独立地为氢；保护基团；直链或支链、取代或未取代、环状或无环的、脂肪族、杂脂肪族、芳基、杂芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、芳烯基、芳炔基或杂芳烷基、杂芳烯基、杂芳炔基部分。
本发明化合物包括如下进一步定义的通式(I)的化合物：

其中R1为氢或低级烷基；在一些实施方案中，R1为甲基；在一些实施方案中，R1为-CF3、-CF2H或CH2F；在另一些实施方案中，R1为全氟化的或氟化的烷基；在再一些实施方案中，R1为卤化的或全卤化的烷基；
R2为取代的或未取代的芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基部分；在一些实施方案中，R2为取代或未取代的噁唑；在另一些实施方案中，R2为取代或未取代的噻唑；和
A、B、C、D、R3、R4、R5、R6和X如上定义。
在一些实施方案中，本发明化合物包括如下定义的具有立体化学的通式(II)的化合物：

其中A、B、C、D、R1、R2、R3、R4、R5、R6和X如上定义。
在一些实施方案中，本发明化合物包括如下所示的通式(III)的化合物：

其中Z为氧原子、硫原子、-NRZ-或-C(RZ)2-；并且A、B、R1、R2、R3、R4、R5、R6和X如上定义。在一些优选的实施方案中，Z为氧。在另一些实施方案中，Z为-NH-。在再一些实施方案中，Z为-CH2-。在另一些实施方案中，RZ为氢、烷基、卤素或酰基。在一些实施方案中，RZ为氟。
在一些实施方案中，本发明化合物包括如下定义的具有立体化学的通式(IV)的化合物：

其中A、B、R1、R2、R3、R4、R5、R6、X和Z如上定义。在一些实施方案中，RB为甲基。在另一些实施方案中，RB为-CF3。
在一些实施方案中，本发明化合物包括如下所示的通式(V)或(VI)的化合物：

其中Z为氧原子、硫原子、-NRZ-或-C(RZ)2-；并且A、B、R1、R2、R3、R4、R5、R6和X如上定义。在一些优选的实施方案中，Z为氧。在另一些实施方案中，Z为-NH-。在再一些实施方案中Z为-CH2-。在另一些实施方案中，RZ为氢、烷基、卤素或酰基。在一些实施方案中，RZ为氟。
在一些实施方案中，本发明化合物包括如下所示的通式(VII)的化合物：

其中A、B、RC、RD、R1、R2、R3、R4、R5、R6和X如上定义。在一些优选的实施方案中，每个RC独立地为氢、卤素或低级烷基。在另一些的实施方案中，每个RD独立地为氢、卤素或低级烷基。
在一些实施方案中，X为O。在另一些实施方案中，X为NH。在另一些实施方案中，X为CH2。
在一些实施方案中，R2为取代的或未取代的噻唑。在一些实施方案中，R2为2-甲基-噻唑-4-基。在另一些实施方案中，R2为2-羟甲基-噻唑-4-基。在再一些实施方案中，R2为2-氨甲基-噻唑-4-基。在另一些实施方案中，R2为2-硫羟甲基-噻唑-4-基。
在一些实施方案中，R2为取代的或未取代的噁唑。在一些实施方案中，R2为2-甲基-噁唑-4-基。在另一些实施方案中，R2为2-羟甲基-噁唑-4-基。在再一些实施方案中，R2为2-氨甲基-噁唑-4-基。在另一些实施方案中，R2为2-硫羟甲基-噁唑-4-基。
在一些实施方案中，RB为氢、甲基、乙基、-CF3、-CH2F、-CF2H。在一些实施方案中，RB为甲基。在再一些实施方案中，RB为-CF3。在一些实施方案中，RB为氢。在另一些实施方案中，RB为乙基。
一些优选的化合物包括，例如：





本发明化合物包括如上具体阐明的和在此所描述的那些化合物，并且通过在本发明中其它地方公开的各种类、属和种而部分地举例说明。不希望束缚于任何具体理论，本发明的一些化合物已经在C9和C10上修饰以与在C9-C10位置上碳碳双键相同的方式强制分子构象。电子效应、位阻效应、氢键、偶极效应或它们的结合可被用于建立这种构象强制。例如，环状环体系例如环氧乙烷、环丙基和氮杂环丙烷可用于强制这种分子的构象。在另一些实施方案中，4、5或6元环被用来达到同样的效果。这种效果还可以通过共轭的p-轨道体系，例如发现于酯、硫代酸酯或酰胺中的体系而完成。这种效果还可通过离域π体系，例如发现于芳香环体系中的那些而完成。在另一些实施方案中，利用C9和C10位置附近的取代基的位阻效应以与在C9-C10位置上碳碳双键强制分子的相同方式来强制分子构象。
本领域普通技术人员将认识到的是，不对称中心可存在于本发明化合物中。因此，本发明化合物及其药物组合物可以是单一的对映异构体、非对映异构体或几何异构体的形式，或者可以是立体异构体的混合物形式。在一些实施方案中，本发明化合物为对映体纯化合物。在另一些实施方案中，提供了立体异构体或非对映异构体的混合物。
将认识到的是，一些前述化合物的类和亚类可以以各种异构形式存在。本发明包含化合物作为基本上无其它异构体的单一异构体和替代地作为各种异构体的混合物，例如立体异构体的外消旋混合物。另外，本发明包含(Z)和(E)两者的双键异构体，除非另外明确指出。因此，通常描述于本发明结构中的本发明化合物包含那些其中双键结构为(Z)或(E)的化合物。在一些优选的实施方案中，在C12-C13位置上的双键为顺式或Z构型。在一些实施方案中，在C9-C10位置上的双键为反式或E构型。在又一些实施方案中，在C12-C13位置上的双键为顺式或Z构型，并且在C9-C10位置上的双键为反式或E构型。本发明还包含如上所述的特定化合物的互变异构体。
另外，本发明提供本发明化合物药学可接受的衍生物，和使用所述这些化合物、其药物组合物或其中之一与一种或多种另外的治疗剂组合而治疗对象的方法。本发明中所用的用语“药学上可接受的衍生物”指这种化合物的任何药学上可接受的盐、酯或这种酯的盐，或任何其它的加成物或衍生物，其在给病人用药时，能(直接地或间接地)提供如本发明中其它地方描述的化合物，或其代谢物或残留。药学上可接受的衍生物因此特别包括前体药物。前体药物为化合物的衍生物，通常具有显著降低的药理活性，其包含另外的部分，该部分在体内易于移除而生成作为药理活性物质的母体分子。前体药物的例子为酯，其可以在体内切割生成目的化合物。各种化合物的前体药物和材料以及用于衍生母体化合物形成前体药物的方法，是已知的并可适合于本发明。一些典型的药物组合物和药学可接受的衍生物将在本发明的下面详细论述。
特别感兴趣的本发明化合物包括：
●显示出对癌细胞系的细胞毒性或生长抑制作用，所述细胞系维持在体外或采用科学上可接受的癌细胞异种移植模型的动物研究中；
●显示出聚合微管蛋白和稳定微管装配的能力；
●显示出对重要器官最低的毒性水平；
●导致在科学上可接受的癌细胞异种移植模型中的肿瘤消失；
●导致在科学上可接受的癌细胞异种移植模型中的肿瘤收缩；
●导致在科学上可接受的癌细胞异种移植模型中的肿瘤消失并在停止治疗后延缓/或不导致肿瘤复发；
●在科学上可接受的癌细胞异种移植模型中显示出短时和可逆的体重降低并显示出治疗效果；
●显示出优于埃坡霉素A、B、C或D或紫杉醇的水溶性，或另外或替代地显示出足够的溶解性以配制在使用降低比例的可利摩福的含水介质中；和/或
●显示出优于埃坡霉素B、埃坡霉素D或紫杉醇的治疗特性(例如最佳的安全性和治愈的效果)
前面所描述的各种埃坡霉素的类似物已经如本发明所例证的那样而被制备、表征和测试。已经发现9，10-脱氢-埃坡霉素类似物可用于对癌症的治疗，并且特别是化合物已经被制备并发现其具有一个或多个上面列举的想要的特性。
合成方法学
一些埃坡霉素、脱氧埃坡霉素及其类似物的合成以前已经被描述了(参见，美国专利6,242,469、6,284,781、6,300,355、6,204,388、6,316,630和6,369,234；美国专利申请09/797,027、09/796,959和10/236,135；和PCT公开WO 99/01124、WO 99/43653和WO 01/64650，全部内容通过引用并入本发明)。认识到需要对大量地有效生成埃坡霉素、脱氧埃坡霉素及其类似物的合成方法学进行改进或补充，本发明提供有效的标准路线用于合成埃坡霉素、脱氧埃坡霉素及其类似物。尽管一些典型的化合物的合成描述于本文的实施例中，将认识到的是，该方法学可通用于生成如上本发明中所描述的每个类和亚类的类似物和共轭物。
具体而言，本发明的9，10-脱氢埃坡霉素化合物可用用于合成埃坡霉素的合成方法学的多种途径制备。在一些实施方案中，采用汇集合成途径制备这些化合物。例如合成埃坡霉素可通过制备两个或三个中间体并将它们结合在一起形成想要的化合物。在一个实施方案中，中间体之一为包含1-9个碳的酰基部分，而另一个中间体包含10-15个碳并可还包含噻唑侧链。这两个大致相等的埃坡霉素的中间体可以利用酯化反应而结合在一起，该酯化反应发生在C1和脱去氧的C15之间。然后可利用碳碳耦合反应，例如Suzuki耦合或闭环复分解反应，关闭成大环。在一个实施方案中，最终的闭环步骤通过闭环复分解反应形成9，10-双键并关闭成大环而完成。闭环复分解反应通过使用有机金属催化剂，例如示于下面示意图8的Grubbs催化剂而完成。在一些实施方案中，将该9，10-双键被还原或氧化，或者可以将该9，10-双键进一步官能化以制备另外的埃坡霉素衍生物。在一些实施方案中，通过以卡宾或卡宾体试剂如CH2N2处理9，10-双键而将该9，10-双键转化为环丙基部分。
在一些实施方案中，所述9，10-脱氢埃坡霉素化合物通过将双键从10，11-位置(例如，Epo490)异构化至9，10-位置而制备。这种异构化可以由存在的过渡金属如钯催化。
在另一些实施方案中，最终闭环步骤通过采用闭环复分解反应形成12，13-双键并关闭成大环而完成。在一些实施方案中，将该12，13-双键还原或氧化。在另一些实施方案中，用大环缩醛反应或大环内酯化反应形成大环。
在附图和实施例中提供本发明化合物一些典型的合成。本领域普通技术人员将认识到，采用描述于本发明中的合成方法可制备多种类似物和衍生物。例如，用不同的保护基团或不同的在16元环上的取代基可实现很多合成步骤。
药物组合物
本发明还提供药物制剂，其包含至少一种如上所述和在此描述的化合物，或其药学上可接受的衍生物，所述化合物能够抑制癌细胞的生长或杀死癌细胞，并且在一些实施方案中，特别感兴趣的是所述化合物能抑制多重耐药性癌细胞的生长或杀死它们。在一些实施方案中，本发明药物制剂还包含增溶剂或乳化剂，例如可利摩福(聚氧乙烯35蓖麻油)或Solutol(聚乙二醇660 12-羟基硬脂酸酯)。
如上所述，本发明提供具有抗癌和抗增殖活性的新型化合物，并且因此本发明化合物可用于癌症的治疗。因此在本发明的另一个方面，提供药物组合物，其中这些组合物包含本发明中所描述的化合物中的任意一个，并任选包含药物可接受的载体。在一些实施方案中，这些组合物任选地进一步包含一种或多种另外的治疗剂。在另一些实施方案中，如在本发明中进一步详述，该另外的治疗剂为抗癌剂。
还将认识到的是，本发明的一些化合物可以以游离形式存在用于治疗，或适当的地方，作为其药学上可接受的衍生物的形式。根据本发明，药学上可接受的衍生物包括但不限于，药学上可接受的盐、酯、这种酯的盐或任何其它的加成物或衍生物，其在给需要的病人用药时，能够(直接地或间接地)提供如本发明中其它地方描述的化合物，或其代谢物或残留，例如前体药物。
如在本发明中所用的，术语“药学上可接受的盐”指那些盐，其在合理的医疗判断范围内，适合用于与人和低等动物组织接触而没有不适当的毒性、刺激性、变态反应等，并具有合理的益处/风险比。药学上可接受的盐在本领域内是公知的。例如，药学可接受的盐由S.M.Berge等人详细描述于J.Pharmaceutical Sciences，66：1-19(1977)中，通过引用并入本发明。所述盐可在本发明化合物最后的分离和纯化过程中原位生成，或通过将游离碱官能团与适合的有机酸反应而分开制备。药学可接受的无毒的酸加成盐的例子为氨基与无机酸或有机酸形成的盐，其中无机酸为例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸，有机酸为例如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸，或者通过采用本领域中可用的其它方法，例如离子交换。其它药学可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基磺酸盐、乙烷磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡萄糖酸盐、hernisulfate、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙烷磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐(pamoate)、果胶酸盐(pectinate)、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等等。典型的碱金属盐或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等等。更多的药学可接受的盐包括，适当时，无毒的铵、季铵和用带反电荷的离子形成的胺阳离子，所述带反电荷的离子例如卤离子、氢氧根离子、羧酸根离子、硫酸根离子、磷酸根离子、硝酸根离子、低级烷基磺酸根离子和芳基磺酸根离子。
另外，如本发明中所用的，术语“药学上可接受的酯”指在体内水解的酯，并包括在人体内容易分解释放出母体化合物或其盐的那些酯。适合的酯基团包括，例如，那些衍生于药学可接受的脂肪族羧酸的酯，特别是链烷酸、链烯酸、环烷酸和链烷二酸，其中每个烷基或烯基部分有利地具有不多于6个碳原子。具体的酯的例子包括甲酸酯、乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯、丙烯酸酯和琥珀酸乙酯。
另外，如本发明中所用的“药学上可接受的前体药物”指本发明化合物的那些前体药物，其在合理的医疗判断范围内，适用于与人和低等动物组织接触而没有不适当的毒性、刺激性、变态反应等，并具有合理的益处/风险比，和对它们预期用途的有效性，以及只要对本发明化合物可能，指两性离子形式。术语“前体药物”指在体内快速转换以形成如上通式的母体化合物，例如通过在血液中水解。在T.Higuchi和V.Stella，Pro-drugs as Novel Delivery Systems，the A.C.S.Symposium Series第14卷中，和在Edward B.Roche编的BioreversibleCarriers in Drug Design，American Pharmaceutical Association andPergamon Press，1987中进行了彻底的讨论，两篇文献都通过引用并入本发明。
如上所述，本发明的药物组合物另外包含药学可接受的载体，其如在本发明中所用的，包括任意和所有的溶剂、稀释剂或其它液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等等，如适合于想要的具体的给药形式。Remington′s Pharmaceutical Sciences，第15版，E.W.Martin(MackPublishing Co.，Easton，Pa.，1975)公开了用于形成药物组合物的多种载体及其已知的制备技术。与本发明抗癌化合物不相容的所有常规载体介质，例如产生任何不需要的生物效果或与药物组合物中任何其它的一种或多种组分以有害的方式相互作用，除此之外，该载体介质的用途预期并入本发明的范围内。一些可用作药学可接受的载体的材料的例子，根据配方设计师的判断，包括但不限于，糖类例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉类例如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉状的西黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石粉；可利摩福；Solutol；赋形剂例如可可脂和栓剂腊(suppository waxes)；油类例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二元醇类例如丙二醇；酯类例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂例如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原水；等渗盐；林格氏溶液；乙醇和磷酸盐缓冲溶液，以及其它无毒的相容的润滑剂例如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、涂层剂、甜味剂、调味剂和加香剂(perfuming agents)、防腐剂和抗氧剂也可存在于本发明组合物中。
化合物和药物组合物的用途
本发明进一步提供用于抑制肿瘤生长和/或肿瘤转移的方法。在一些特别感兴趣的实施方案中，对于肿瘤的多重耐药癌细胞，本发明提供通过抑制肿瘤生长和/或肿瘤转移而治疗癌症的方法。该方法包括将治疗有效量的本发明化合物或其药学可接受的衍生物对需要它的对象(包括但不限于人或动物)用药。在一些实施方案中，特别用于治疗包括多重耐药癌细胞的癌症，所述治疗有效量为这样的量：其足以杀死或抑制多重耐药癌细胞系。在一些实施方案中，本发明化合物用于治疗实体瘤。
本发明化合物和药物组合物可用于治疗或预防任何疾病或症状，包括增殖性疾病(例如癌症)、自身免疫性疾病(例如类风湿性关节炎)和传染病(例如细菌、真菌等传染病)。本发明化合物和药物组合物可用药于动物，优选哺乳动物(例如家畜、猫、狗、小鼠、大鼠)，并且更优选人。可使用任何用药方法向动物递送药物组合物的化合物。在一些实施方案中，本发明化合物或药物组合物以非肠道给药。
在再一方面，如本文所描述的，根据本发明的治疗方法，通过使肿瘤细胞与本发明化合物或组合物接触而杀死肿瘤细胞或抑制它们的生长。因此在本发明的又一方面，提供用于治疗癌症的方法，其包括将治疗有效量的本发明化合物或包含本发明化合物的药物组合物以达到所想要结果的量和时间用药到需要其的对象。在本发明的一些实施方案中，本发明化合物或药物组合物的“治疗有效量”为这样的量：其有效地杀死癌细胞或抑制癌细胞生长。根据本发明的方法，本发明的化合物和组合物可以以有效杀死癌细胞或抑制癌细胞生长的任意量和任意途径给药。因此，如本发明中所用的表述“有效杀死癌细胞或抑制癌细胞生长的量”指杀死癌细胞或抑制癌细胞生长的足够量的试剂。所需的确切的量将随对象不同而变化，其依赖于对象的物种、年龄和的综合状态，感染的严重性，具体的抗癌试剂，用药方式等等。本发明的抗癌化合物优选以剂量单位形式配制以易于用药和剂量均一。本发明中所用的表述“剂量单位形式”指适合用于治疗病人的抗癌试剂的物理上分离的单位。然而这将理解为，本发明化合物和组合物的全天用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。用于任何具体病人或生物体的特定治疗有效的剂量水平将依赖于各种因素，包括所治疗的病症和该病症的严重性；所用特定化合物的活性；所用的特定组合物；病人的年龄、体重、综合健康状态、性别和日常饮食；所用特定化合物的用药的时间、用药途径和排泄速度；治疗的持续时间；与所用特定化合物相结合或同时使用的药物；以及于医学领域公知的类似因素。
另外，在与适当的药学可接受的载体以想要的剂量配制后，本发明的药物组合物可以对人和其它动物以如下方式给药：口服给药、直肠投药、非肠道用药、池内用药、阴道内用药、腹膜内用药、局部用药(如通过粉末、软膏或滴剂)、经颊用药如口腔或鼻腔喷剂等等，其依赖于所治疗的感染的严重性。在本发明的一些实施方案中，本发明中所述的化合物通过与水溶性螯合剂或水溶性聚合物结合而配制，其中所述水溶性聚合物例如：聚乙二醇如聚(1-谷氨酸)或聚(1-天冬氨酸)，如在美国专利5,977,163中所述的那样，其全部内容通过引用而并入本发明。在一些实施方案中，本发明化合物可以口服或非肠道以足够的剂量水平用药，所述剂量水平为投送的药物足以达到每日对象体重的约0.001mg/kg至约100mg/kg，约0.01mg/kg至约50mg/kg，优选约0.1mg/kg至约40mg/kg，优选约0.5mg/kg至约30mg/kg，约0.01mg/kg至约10mg/kg，约0.1mg/kg至约10mg/kg，并且更优选约1mg/kg至约25mg/kg，每日一次或多次，以获得想要的治疗效果。可以以每两天一次、每三天一次、每星期一次、每两星期一次、每三星期一次或每四星期一次提供想要的剂量。在一些实施方案中，可以用多次给药提供想要的剂量(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或十次给药)。
用于口服和非肠道给药的液体剂型包括但不限于，药学可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性化合物，液体剂型还可包含本领域中常用的惰性稀释剂例如，水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、丙三醇、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯，以及它们的混合物。除了惰性稀释剂，口服组合物还可包含佐剂例如保湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和加香剂。在一些用于非肠道给药的实施方案中，本发明化合物与增溶剂混合，例如可利摩福、醇类、油类、改性油类、二醇类、聚山梨醇酯类、环糊精类、聚合物类，以及它们的组合物。在一些实施方案中，本发明化合物与醇，例如乙醇，和可利摩福(聚乙氧基化的蓖麻油)混合。
注射剂，例如无菌注射水或油状悬浮液，可以根据本领域已知的使用适合的分散剂或保湿剂和悬浮剂而配制。无菌注射剂也可以是在无毒非肠道可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液、悬浮液或乳液，例如在1，3-丁二醇中的溶液。这些可接受的赋形剂和溶剂中可使用的有水、林格氏溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不易挥发的油常用作溶剂或悬浮介质。为此，可用任何无刺激的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，脂肪酸例如油酸被用于注射剂。
本发明注射剂可通过如下方式消毒：例如，通过细菌保留过滤器过滤，或加入消毒固体组合物形式消毒剂，所述消毒剂可以在使用前溶解或分散于无菌水或其它无菌注射介质中。
为了延长药效，希望延缓从皮下注射或肌内注射的药物的吸收。这可通过使用具有较差水溶性的结晶或无定型材料的液体悬浮液来完成。于是药物的吸收速度依赖于其溶出速度，这又可能依赖于结晶大小和晶体形态。或者，通过在油类赋形剂中将药物溶解或悬浮而达到延缓非肠道给药的药物形式吸收的目的。注射贮库剂型通过药物在生物可降解聚合物，例如聚乳酸-聚甘醇酸交酯中形成微封装胶囊基质而制备。依赖于药物对聚合物的比和所用具体聚合物的性质，可以控制药物释放速度。生物可降解聚合物的例子包括聚原酸酯和聚酐。贮库注射剂还通过与身体组织相容的脂质体或微乳捕获药物而制备。
用于直肠和阴道用药的组合物优选为栓剂，其可通过将本发明化合物与适合的非刺激性赋形剂或载体，例如可可脂、聚乙二醇或栓剂腊混合而制备，所述赋形剂或载体在室温下为固体，而在体温下为液体，并因此在直肠或阴道腔内熔化并释放出活性药物。
口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种惰性的、药学可接受的赋形剂或载体混合，例如柠檬酸钠或磷酸氢钙和/或a)填充剂或增量剂例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，b)粘合剂例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶，c)润湿剂例如甘油，d)崩解剂例如琼脂--琼脂、碳酸钙、土豆淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠，e)溶解延缓剂例如石蜡，f)吸收促进剂例如季铵盐化合物，g)保湿剂例如单硬脂酸鲸蜡醇酯和单硬脂酸甘油酯，h)吸收剂例如高岭土和膨润土和i)润滑剂例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固态聚乙二醇、十二烷基硫酸钠及其混合物。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，这些剂型还包含缓冲剂。
相似类型的固体组合物也可被用作在软填充和硬填充的明胶胶囊剂中的填充剂，所述胶囊剂所用的赋形剂为乳糖以及高分子量聚乙二醇等等。片剂、糖衣丸剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的这些固体剂型可使用在制药制剂领域公知的包衣和外壳而制备，例如肠衣和其它包衣。这些剂型可任选包含镇静剂并也可以是仅释放一种或多种活性组分的组合物，或优选地，在肠道的某些部分，任选地以延时方式释放。可用的包埋组合物的例子包括聚合物物质和蜡。相似类型的固体组合物也可被用作在软填充和硬填充的明胶胶囊剂中的填充剂，所述胶囊剂所用的赋形剂为如乳糖以及高分子量聚乙二醇等等。
活性化合物也可以与具有如上所说明的一种或多种赋形剂在微封装胶囊剂型中。片剂、糖衣丸剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的这些固体剂型可使用制药制剂领域公知的包衣和外壳而制备，例如肠衣、控释包衣和其它包衣。在这种固体剂型中活性化合物可以与至少一种惰性稀释剂例如蔗糖、乳糖或淀粉掺混。这种剂型还可包含，如正常做法，除了惰性稀释剂的另外物质，例如片剂润滑剂和其它片剂助剂如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，所述剂型还可包含缓冲剂。这些剂型可任选包含乳化剂并也可以是仅释放一种或多种活性组分的组合物，或优选地，在肠道的某些部分，任选地以延时的方式释放。可用的包埋组合物的例子包括聚合物物质和蜡。
本发明化合物的用于局部或经皮给药的剂型包括软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、粉剂、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴剂。所述的活性组分在无菌状态下与可能需要的药学可接受的载体和任何所需的防腐剂或缓冲剂掺混。眼用制剂、滴耳剂和滴眼剂也预料落入本发明范围内。另外，本发明涉及使用透皮贴剂，其具有向身体提供控释化合物的附加的优点。这种剂型可通过将本发明化合物溶解或分散于适当的介质中而制备。还可使用吸收促进剂以增加本发明化合物穿过皮肤的通量。可通过提供速度控制膜或通过在聚合物基质或凝胶中分散本发明化合物而控制透皮速度。
如上所讨论的，本发明化合物可用作抗癌剂，并因此通过使癌细胞死亡或抑制癌细胞生长而用于治疗癌症。通常，本发明抗癌剂可用于治疗的癌症和其它增殖性疾病包括但不限于，乳癌、脑癌、皮肤癌、子宫癌、结肠和直肠癌、白血病、肺癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌，仅举几个例子。在一些实施方案中，本发明的抗癌剂对白血病细胞和黑素瘤细胞是有效的，并因此可用于治疗白血病(例如，骨髓的、淋巴细胞的、早幼粒细胞的、髓细胞的和淋巴母细胞的白血病，无论急性或慢性形式)和恶性黑素瘤。在又一些实施方案中，本发明抗癌剂对实体瘤是有效的并还可以杀死多重耐药细胞(MDR细胞)和/或抑制其生长。在一些实施方案中，本发明抗癌剂对其它已知的抗肿瘤药耐药性的癌症或已经发现对其他已知的抗肿瘤药临床不反应的癌症是有效的。在另一些实施方案中，对于其它抗肿瘤微管稳定剂(例如紫杉醇)耐药性的癌症，本发明抗癌剂是有效的。
还将认识到的是，本发明化合物和药物组合物可被用于组合治疗，即本发明的化合物和药物组合物可同时、先于或随后用药于一种或多种其它所需的疗法或医学过程。用于组合方案的具体的治疗组合(治疗学或规程)应当考虑所需治疗学和/或规程与要达到的所需治疗效果的相容性。还将认识到的是，所用的疗法对于相同的病症可以达到想要的效果(例如，本发明化合物可同时与另一种抗癌剂用药)，或所用的疗法可获得不同的效果(例如，控制任何相反作用)。
例如，可与本发明抗癌剂组合应用的其它的疗法或抗癌剂包括外科手术、放射治疗(其中一些例子，γ-辐射、中子束放射治疗、电子束放射治疗、质子治疗、短距离放射治疗和全身放射性同位素，仅举几个例子)、内分泌疗法、生物反应疗法(干扰素、白细胞介素和肿瘤坏死因子(TNT)，仅举几个例子)、过热和冷冻疗法、降低任意副反应的药剂(例如止吐药)，和其它批准的化学疗法药物，包括但不限于烷基化剂(氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、苯丙酸氮芥、异环磷酰胺)、抗代谢物(甲氨喋呤)、嘌呤拮抗物和嘧啶拮抗物(6-巯基嘌呤、5-氟尿嘧啶、Cytarabile、吉西他滨(Gemcitabine))、纺锤体毒物(长春碱、长春新碱、长春花、紫杉醇、多烯紫杉醇(Docetaxel))、足叶草毒素(表鬼臼毒吡喃葡糖苷、依立替康、托泊替康)、抗生素(阿霉素、博莱霉素、丝裂霉素)、亚硝基脲(卡氮芥、罗氮芥)、无机离子(顺铂、顺羧酸铂)、酶类(天冬酰胺酶)和激素类(三苯氧胺、亮脯利特、氟他胺和甲地孕酮)，仅举几个例子。对于最新的癌症疗法的更全面的讨论参见http://www.nci.nih.gov/，FDA批准的肿瘤药物的列表在http://www.fda.gov/cder/cancer/druglistframe.htm，和The Merck Manual，第十七版1999中，其全部内容通过应用并入本发明。
在另一方面，本发明还提供药物包装或试剂盒，其包含用本发明药物组合物的一种或多种成分填充的一个或多个容器，并且在一些实施方案中，其包括另外批准的用作组合疗法的治疗剂。任选地与这样的一个或多个容器相伴的，可以是以政府机构指定形式的公告，所述政府机构规范药物产品的制造、使用或销售，其中所述公告反映了政府机构对于人用药的生产、使用或销售的批准。
同等物
下面的本发明实施例意于帮助理解本发明，并且它们不意于，也不应当将它们解释为限制本发明。事实上，从本发明的全部内容，包括下面的实施例和本发明中引用的科学和专利文献的参考文献中，对本领域技术人员而言，除了那些在本发明中说明并描述的那些，本发明的各种修改和其许多进一步实施方案将是显而易见的。将进一步认识到的是，那些被引用的文献的内容通过引用而并入本发明以帮助理解现有技术。下面的实施例包含重要的附加信息、例证和指导，其可以本发明的各种实施方案及其同等物而适合于本发明的实践。
实施例
实施例1：26-三氟-9，10-反式-脱氢-埃坡霉素D的口服和非肠道用药治疗植入裸鼠体内的人肿瘤
在本实施例中，证明了结构设计的16元大环内酯物的微管稳定剂，26-三氟-9，10-反式-脱氢-埃坡霉素D，在给予6hr静脉内灌注或口服时，使肿瘤收缩，致使肿瘤消失，并达到长时间不复发的效果。具有大尺寸肿瘤(图6)或他克唑耐药性肿瘤异种移植物(图7)的小鼠被用来说明可以用26-三氟-9，10-反式-脱氢-埃坡霉素D作为单一药剂单药治疗而治愈。治愈的治疗范围包括白血病以及乳癌、结肠癌和肺癌(图6、9和13)。这里报告的所有化学疗法体内实验均采用在免疫缺陷裸鼠中的人肿瘤异种移植物而进行。该动物模型在对癌症病人临床试验之前常用于评价抗肿瘤化合物。
MX-1和HCT-116实验分别进行5.5和6.5个月(图6和9)。在两个实验中肿瘤均没有复发，在停止治疗后肿瘤分别消除了3.8和5.2个月。对于HCT-116实验(图9)，紫杉醇和26-三氟-9，10-反式-脱氢-埃坡霉素D均以20mg/kg使用并且都实现了肿瘤消失。然而，紫杉醇治疗组在停止治疗后1.1个月后复发，而26-三氟-9，10-反式-脱氢-埃坡霉素D治疗的动物肿瘤消失超过5.2个月。假设肿瘤长大一倍的时间是4天(基于媒介物治疗对照)，HCT-116肿瘤的紫杉醇治疗导致99.7％的肿瘤抑制或2.56-log的细胞杀死，然而当实验终止时，由26-三氟-9，10-反式-脱氢-埃坡霉素D在MX-1和HCT-16实验中杀死的细胞分别是＞8.5-log和＞11.6log。基于被治疗小鼠健康的、活跃的状态，同时体重恢复到治疗前水平，如果实施延长的治疗或增加治疗周期，预计这种“治愈”可确保贯穿小鼠的2年寿命。应当可以得到这样的结果，尽管事实上这种“治愈”在免疫缺陷小鼠中比在有免疫活性的小鼠中更难于获得。就我们所知，这是在生物医学文献中在裸鼠上实施的最长的异种移植物治疗研究，也是对于单一抗肿瘤药剂用非肠胃给药或用口服给药中所报导的最长的完全康复。这与下面的表述有关：发现抑制肿瘤生长的化合物相对容易，但发现使肿瘤缩小的化合物是相对不寻常的。本发明化合物26-三氟-9，10-反式-脱氢-埃坡霉素D，其实现了在所有的小鼠中完全使肿瘤消失，并且没有复发长达5.2个月，这个发现就我们所知从未报导过，这表明26-三氟-9，10-反式-脱氢-埃坡霉素D对于治疗学进展的巨大潜力。
口服治疗的另外的显著优点是可以避免使用可利摩福配方导致的严重过敏反应。在他克唑、脱氧-EpoB和15-aza-Epo 13制剂中使用可利摩福引起棘手的过敏反应是公知的，这使得必须使用抗组胺药和/或类固醇进行预处理。
26-三氟-9，10-反式-脱氢-埃坡霉素D的口服效果与其在体外小鼠血浆内和人肝脏微粒体S9片段中显著的代谢稳定性相一致。所述代谢稳定性归因于该埃坡霉素分子中在C-26位置的三氟化(图14)。在C9-C10位置上引入双键也增加了代谢稳定性(图14)。26-三氟-9，10-反式-脱氢-埃坡霉素D用于静脉内灌注(20-30mg/kg，Q2D)和用于口服给药(20mg/kg，QD或30mg/kg Q2D)，其最佳剂量的接近说明该化合物在体内能被很好地吸收并具有良好的生物利用度。
值得注意的是，本发明实施了许多与他克唑(在临床上常用的最重要的抗癌治疗剂之一)平行进行的关于弗迪隆抗异种移植物的体内治疗研究(图13、7、9、10、11和16)。弗迪隆的重要发现，与他克唑相比，表明了该化合物用于治疗癌症的有前景的潜力。
材料和方法
化学产品：所有的埃坡霉素如本发明中所述的那样合成。紫杉醇(他克唑)和长春碱硫酸盐(VBL)购自Sigma。所有这些化合物溶解于二甲亚砜中用于体外试验，(除了VBL溶解于盐水之外)。对于体内研究，所有的埃坡霉素和紫杉醇均溶解于可利摩福/乙醇(1∶1)媒介物中并然后用盐水稀释用于通过尾静脉利用自主设计的微导管和可程控的泵进行6hr静脉内灌注(Chou等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，15798-15802；Chou等人(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，8113-8118；每篇文献通过引用并入本发明)。口服给药的药物通过如下方式制备：将化合物溶解于乙醇中并悬浮于等体积的吐温-80中，给裸鼠用药前将该悬浮液用5倍体积的盐水稀释。使用1ml注射器和标准#22球形带帽的动物给食针实施管饲法(Popper&Sons，Inc.New HydePark，NY)。
肿瘤和细胞系：CCRF-CEM人淋巴母细胞白血病细胞和其长春碱耐药性亚系(CCRF-CEM/VBL100，720倍耐药性)得自Chicago Illinois大学的William Beck博士，并且CCRF-CEM/他克唑(44倍耐药性)通过在六个月中将CCRF-CEM细胞暴露于不断增加的至致死的浓度(IC50-IC90)的紫杉醇中而制备。耐药性程度示于图14中。人乳癌(MX-1)、人肺癌细胞(A549)和人结肠癌(HCT-116)得自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)。
动物：具有nu/nu基因的无胸腺裸鼠得自NCI，Frederick，MD并用于所有的人肿瘤异种移植。使用6星期以上的和体重20-22g或更重的雄性裸鼠。通过使用自制的灌输微管和限制管通过尾静脉静脉内灌注6小时给药。具有多通道的可程控的Harvard PHD2000注射器泵被用于静脉内灌注。典型的6小时灌输体积为2.0ml盐水中含有100μl每种药物的可利摩福/乙醇(1∶1)。对于口服给药，弗迪隆和他克唑均溶解于乙醇中并用吐温-80稀释5倍。他克唑溶液应在5min内使用以避免沉淀。肿瘤体积通过用测径器测量长×宽×高(或宽)而估算。对于带有肿瘤的裸鼠，实验过程中其体重是指总重减去肿瘤的重量。所有的动物实验均根据National Institute of Health Guide for the Care and Use of Animals的指导原则和由Memorial Sloan-Kettering Cancer Center′s InstitutionalAnimal Care and Use Committee批准的协议而实施。
细胞毒性试验：为准备体外细胞毒性试验，细胞培养于初始密度为2-5×104个细胞每毫升。将它们保存于5％CO2-湿润气氛的37℃的RPMI培养基1640(GIBCO/BRL)中，所述RPMI培养基1640包含青霉素(100单位/mL)、链霉素(100μg/mL GIBCO/BRL)和5％热灭活的FBS。对于在单层中生长的实体肿瘤细胞(例如HCT-116和A549)，药物的细胞毒性通过使用丽丝胺罗丹明B方法(Skehan等人(1990)J.Natl.CancefInst.82，1107-1112，通过引用并入本发明)在96-孔微量滴定板上测定。对于生长于混悬液中的细胞(例如CCRF-CEM及其亚系)，通过使用2，3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-N羧酰苯胺)-2H-terazodium氢氧化物(XTT)微管法(Scudiero等人(1988)Cancer Res.48，4827-4833；通过引用并入本发明)在96-孔微量滴定板上一式两份进行测量。对于两种方法，每个孔的吸光度用微量板读板机(Power Wave XS，Bio-Tek，Winooski，VT)测量。剂量-效果的关系数据由每种药物的6至7个浓度，一式两份，通过使用计算机程序(Chou等人(1997)CalcuSyn for Windows(Biosoft，Cambridge，U.K.)；其中每个均通过引用并入本发明)以中效图而分析。
埃坡霉素在小鼠中和在人肝脏S9片段中的稳定性：用全自动HPLC系统进行稳定性研究，所述HPLC系统包括Prospekt-2(SparkHolland，Netherlands)样品制备系统和Agilent 1100 HPLC系统。简言之，Prospekt 2选择C8萃取柱并用乙腈和水洗涤。Agilent自动进样器，设定为37℃，吸取20μl样品，将其加载到萃取柱上，用水洗，然后Prospekt 2转向流动相流通过萃取柱到分析柱上。具有保护柱(MacMod，Chadds Ford，PA)的Reliance Stable Bond C8 4×80mm和洗脱液在250nm处监控。流动相由53或65％乙腈/0.1％甲酸组成，流速0.4ml/min，因此目的化合物的保留时间为约6分钟。样品制备包含将等体积的血浆加入到PBS中，得到总体积400μl，过滤，并加入0.5-2μl的该底物(20mM)以获得在HPLC分析中在250nm处约30-50mAU。为了合并的人肝脏微粒体S9片段(Xeno Tech，Lenex，KS)，将20μl(400μg)的S9片段用280μl的PBS混合然后进行如上所述步骤。采样周期由自动进样器控制并且采集峰面积数据以比较母体化合物的消失速率。
结果
体外抗人白血病、他克唑耐药性和长春碱耐药性白血病细胞和实体瘤细胞的结构-活性关系。依据IC50(以μM计)，对于十二种典型埃坡霉素抗如下细胞生长的效力列于图17的表中：人白血病CCRF-CEM细胞以及它们的长春碱耐药性CCRF-CEM/VBL和紫杉醇耐药性CCRF-CEM/他克唑的亚系。同时还列有两个人实性瘤细胞系的IC50值：肺癌A549和结肠癌HCT-116。这表明deH-EpoB代替了EpoB作为已知的最有效力的埃坡霉素。还表明的是：i)在dEpoB、dEpoF或F3-dEpoF上9，10-脱氢修饰总是导致效力的显著增加，然而在C-26位置上的三氟化却在一定程度上降低了所述效力，然而代谢稳定性却由三氟化大大增加了(图14)；和ii)大部分埃坡霉素对长春碱，一种对P-糖蛋白有多重抗药性的典型底物没有交叉耐药性，也没有对他克唑的交叉耐药性。他克唑是一种MDR表型良好的底物，但他克唑耐药性也可通过在微管蛋白基因中的突变而产生。15-氮杂-EpoB是个例外，15-氮杂-deH-EpoB显示出显著的对长春碱和紫杉醇的交叉耐药性。dEpoF及其衍生物显示出一些与长春碱的交叉耐药性而对紫杉醇却没有。iii)白血病CCRF-CEM细胞和实体瘤A549和HCT-116几乎同样的易受埃坡霉素的影响。iv)F3-deH-dEpoB、deH-dEpoB和deH-EpoB，它们是本发明用于进一步药理学评价的新型先导化合物，没有一点对长春碱的交叉耐药性，对紫杉醇也没有。
在早期研究中(Schiff等人(1979)Nature(London)277，665-667；Meng等人(1997)J.Am.Chem.Soc.119，2733-2734；每篇文献通过引用并入本发明)，总结了埃坡霉素分子可被分成三个部分。因此，在C-1～8的酰基部分中，根据体外细胞毒性和微管稳定化能力，不允许结构改变。这与C-9～15的O-烷基部分和C-15的侧芳基部分相反，其中后两者结构可允许显著地变化(Haar等人(1996)Biochemistry 35，243-250；Kowalski等人(1997)J.Biol.Chem.272，2534-2541；每篇文献通过引用并入本发明中)。
具有12，13-环氧基部分的埃坡霉素，例如EpoB和deH-EpoB，尽管是埃坡霉素系列中最有效力的药剂，但它们却在最大忍受剂量下只具有相当差的治疗指数。这种假说用示于图14表中的治疗数据可说明。
埃坡霉素衍生物的物理化学性质、代谢性质、药理学性质和治疗结果。相互关联的不同性质的系列埃坡霉素促进了对贡献于主导化合物的治疗归宿的因素的理解。图14中的表总结了九种埃坡霉素衍生物的特征。结构-细胞毒素的体外活性关系提供了基于效力的初始评估。例如，9，10-脱氢修饰的新类大大增加了体内和体外的效力。在这些预选的化合物中，较难于将结构-微管稳定性效力相关联，因为这个效力都非常高(即，类似于紫杉醇的效力)。水溶解性和亲脂性在治疗效果中起不同的作用并对于制剂的设计是重要的。DeH-dEpoF、F3-deH-dEpoF和deH-dEpoB相对于其它埃坡霉素具有显著增加的水溶性。F3-deH-dEpoB是口服有效的，这个发现降低了水溶性在药物制剂中的必要性并且可以避免使用引起过敏的可利摩福。
在体外，deH-EpoB、deH-dEpoF、EpoB和deH-dEpoB，以此顺序具有亚纳摩尔的IC50，然而F3-deH-dEpoF、dEpoF、F3-deH-dEpoB、dEpoB和F3-dEpoB，以此顺序，具有IC50的范围为1.3至9.3nM(图17)。DeH-EpoB和EpoB在体外和体内是已知的最有效力的埃坡霉素，但它们并不产生最好的治疗指数。显然，在EpoB和deH-EpoB的C-12～13上的环氧基部分很大地贡献于对于宿主的毒性，通过最大体重百分比降低(而不死亡)较低的值明显可见(图14)。相反，F3-deH-dEpoB和dEpoB允许体重降低最高值并且它们都表现出良好的治疗结果，例如在所有动物中完全消除肿瘤。通常，用6hr静脉内灌注治疗，体外效力和最佳的治疗剂量显示了良好的关联性。特别有兴趣的是在所列的埃坡霉素中，F3-deH-dEpoB(弗迪隆)具有最宽的治愈治疗剂量范围(10-30mg/kg)(Chou等人(2003)Angew Chem.Int.Ed.Engl.42，4762-4767，通过引用并入本发明)、极好的代谢稳定性和最佳的总体治疗结果(图14)。另外，F3-deH-dEpoB通过口服给药途径提供了治愈的治疗效果。总之，最有效力的埃坡霉素作为抗肿瘤药剂并不一定具有较好疗效，和F3-deH-dEpoB是用于治疗学发展的主导候选药物。
对于超大MX-1肿瘤异种移植物的治疗。如图6A中所示，25mg/kg，6hr静脉内灌注Q3D×5，肿瘤植入后D22开始用F3-deH-dEpoB大至体重3.4％的治疗MX-1异种移植物导致显著的肿瘤收缩(＞97.4％)。在没有治疗的9天间歇期内(D34-D43)，肿瘤大小持续收缩(＞99.3％)并且在5只被研究的小鼠中有2只小鼠肿瘤消失，然而治疗组的体重在相同的间歇期间都恢复到治疗前的水平(图6B)。在D43恢复治疗，Q3D×4，导致在剩余的3只小鼠中在D50、D50和D51肿瘤消失。D52(即最后服药日期)后，每三天观察动物一次，直到D165试验终止时。所有5只动物在D165(即停止治疗后3.7个月)均没有肿瘤复发。
从对照组和治疗组中一只小鼠在D25、D31、D37、D43和D52拍摄的本试验裸鼠的照片示于图6B中。
通过口服给药由弗迪隆对MX-1异种移植物的治愈癌症治疗。如图13A所示，每两天口服给予F3-deH-dEpoB 30mg/kg 7次，导致MX-1肿瘤收缩并且4只小鼠中2只肿瘤消失。另外两个剂量(剂量跳过后)在4只小鼠中4只均导致肿瘤消失。相反，以相同剂量和相同进度下进行的他克唑的口服治疗抑制了MX-1肿瘤的生长但并不导致肿瘤收缩。在最后一剂他克唑后两天(D36)，其导致肿瘤抑制66.9％。F3-deH-dEpoB治疗诱导中等程度的但却持久的体重降低，最大降低15％体重(图13B)。他克唑治疗诱导很小的体重变化，说明口服给药他克唑明显由于药物代谢失活或差的生物利用度而不是合适的治疗。与口服给药途径相反，本发明的发明人早期报导(Chou等人(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，8113-8118；通过引用并入本发明)，MX-1肿瘤以20mg/kg他克唑经6hr静脉内灌注治疗能导致肿瘤收缩和肿瘤消失。
弗迪隆抗他克唑耐药性的CCRF-CEM/他克唑异种移植物的治愈治疗效果。在本发明的发明人最近的报导中(Chou等人(2003)AngewClient.Int.Ed.Engl.42，4762-4767；通过引用并入本发明)，本发明的发明人说明了F3-deH-dEpoB在20mg/kg，Q2D×7，6hr静脉内灌注在抗他克唑耐药性人肺癌A549/他克唑(体外对紫杉醇44倍耐药性)时导致肿瘤生长完全抑制，但没有达到消失肿瘤。本发明的发明人在本发明中使用另一种紫杉醇耐药性异种移植物，CCRF-CEM/他克唑(体外对紫杉醇44倍耐药性)。如图7中所示，弗迪隆在30mg/kg Q2D×7，6hr静脉内灌注导致4只小鼠中有2只肿瘤消失。另外的Q2D×5(剂量翻一倍)导致在4只小鼠中有3只肿瘤消失，最终的肿瘤抑制为99.8％(图7A)。在降低的剂量为15mg/kg，在4只小鼠中只有一只在两个周期治疗后第5天发生肿瘤消失。在D34最终的肿瘤抑制为98.8％。用他克唑在20mg/kg进行的平行实验导致了肿瘤生长抑制但很少或根本没有缩小肿瘤。在D34最终的肿瘤抑制为75.6％。
F3-deH-dEpoB(在15mg/kg和30mg/kg)和他克唑(20mg/kg)两者在每两天通过6hr静脉内灌注的7次治疗的第一周期治疗过程中均持续降低体重。在D22跳过一次治疗导致在所有小鼠中立即增加体重。Q2D×5的第二周期治疗同样持续降低体重，但对所有测试小鼠均没有致死(图7B)。
由弗迪隆抗人结肠癌HCT-116异种移植物的治愈治疗。如图9A所示，F3-deH-dEpoB在20mg/kg和30mg/kg或他克唑在20mg/kg，Q2D×4，6hr静脉内灌注3个周期，在4只小鼠中4只均导致肿瘤消失。在肿瘤植入后D9开始治疗。介于第一和第二周期之间在D17跳过一个剂量，并且介于第二和第三循环之间在D27和D29跳过两个剂量。D9-D37为3周期治疗阶段并且D37-D200为随访阶段。该实验持续200天，其为超过小鼠平均寿命的四分之一。
对于在30mg/kg的F3-deH-dEpoB，肿瘤在D21、23、33和41消失，而在20mg/kg，肿瘤在D31、35、41和45消失。对于两种剂量的F3-deH-dEpoB，在D200实验结束时，4只小鼠中4只均没有肿瘤复发。对于他克唑在20mg/kg，肿瘤在D33、33、41和45消失，这与在20mg/kg的F3-deH-dEpoB中观察到的相似。然而在他克唑治疗组，在D71、75、81和81肿瘤复发。
包括间歇期间的治疗进度表由小鼠的体重降低和体格状况来表示。对于在30mg/kg的F3-deH-dEpoB治疗，最大的体重降低为30％而没有导致死亡，这发生于第二治疗周期末(即D29)(图9B)。对于20mg/kg的他克唑和20mg/kg的F3-deH-dEpoB，体重的降低和恢复在模式和量度上均相似。
实施例2：确定弗迪隆(F3-deH-dEpoB)的作用机理以及其如何不同于EpoD的作用机理；这些不同的治疗学暗示
人多重骨髓瘤(MM)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)肿瘤细胞系的药物敏感性
MM占所有癌症的1％和恶性血液疾病的10％，在2002年有15,500新增诊断病例和＞15,000例死亡。用传统化学疗法治疗MM是不能治愈的，生存年限中位值为约3年(Barlogie等人“Treatment of multiplemyeloma”Blood 2004；103：20-32；通过引用并入本发明)。尽管用造血干细胞载体的高剂量化学疗法增加了完全症状减退和无事件生存时间的比率，几乎每个病人都会复发，要求对于抢救治疗选择方案的迫切需要。紫杉醇已被用于治疗多重骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤(Miller等人“Paclitaxel as the initial treatment of multiple myeloma：an EasternCooperative Oncology Group Study(E1A93)”Am.J.Clin.Oncol.1998；21：553-556；Jazirehi等人“Resveratrol modifies the expression of apoptoticregulatory proteins and sensitizes non-Hodgkin′s lymphoma and multiplemyeloma cell lines to paclitaxel-induced apoptosis”Mol.Cancer Ther.2004；3：71-84；每篇文献通过引用并入本发明)。然而，这种应用却由于其高的毒性和多重耐药性而受限制。本发明的发明人已经评价了弗迪隆和dEpoB抗一组人MM和NHL系，它们已经在许多用于评价新型疗法的NOD/SCID异种移植模型的新近研究中使用，包括10-炔丙基-10-脱氮杂-氨喋呤(PDX)(Wang等人“Activity of a novel anti-folate(PDX，10-propargyl-10-deazaaminopterin)against human lymphoma issuperior to methotrexate and correlates with tumor RFC-1geneexpression”Leukemia & Lymphoma 2003，44：1027-1035)、抗端粒末端转移酶(Wang等人“Telomerase inhibition with an oligonucleotidetelomerase template antagonist：in vitro and in vivo studies in multiplemyeloma and lymphoma”Blood 2004；103：258-66；通过引用并入本发明)和抗VEGFR Mab(Wang等人“Targeting autocrine and paracrineVEGF receptor pathways regresses human lymphoma xenographs in vivo”Blood，印刷中；通过引用并入本发明)。弗迪隆和dEpoB均能显著地抑制骨髓瘤和淋巴瘤细胞增殖。骨髓瘤细胞系对具有超低IC50的弗迪隆和dEpoB非常敏感，同时两种NHL系在弗迪隆剂量高出MM中有效剂量5-10倍时被抑制(表2-1)。
表2-1.弗迪隆和dEpoB抗一组正常人肿瘤和正常人细胞种群的细胞增长抑制和IC50，由XTT双偶氮盐(tetrazonium)试验测定。

  IC50(nM)  IC50(nM)  肿瘤细胞系  组织学  dEpoB  弗迪隆  RPMI 8226  骨髓瘤  36.67±2.0  7.6±1.2  CAG  骨髓瘤  61.34±4.2  12.04±1.8  OPM-2  骨髓瘤  38.89±3.3  8.2±2.2  H929  骨髓瘤  42.75±4.5  9.2±1.9  MOLP-5  骨髓瘤  68.56±5.5  14.4±2.6  RL  淋巴瘤  90±11  80±11  SKI-DLBCL  淋巴瘤  72±9.8  60±4.2  HS-27A  骨髓基质  100±10  102±8  HS-5  骨髓基质  100±8  96±7  MRC-5  胚肺成纤维细胞(人)  8.2±4.3  7.4±2.7  HT-29  结肠癌  7.2±2.2  4±1.7  HCT-116  结肠癌  7.5±3.1  3.6±1.3  MDA MB435  乳癌  7.8±4.2  5.8±2.8  IGROV  卵巢癌  15±3.8  2±1.2  SKOV3  卵巢癌  13±4.7  1.6±0.5  Ovcar-3  卵巢癌  14±3.6  1.1±0.4  Ovcar-4  卵巢癌  16±2.5  1.8±0.7

正常的骨髓基质细胞(HS-27A和HS-5系)显示对这些化合物的相对耐药性，表明弗迪隆和dEpoB具有对MM的安全治疗窗(表2-1)。弗迪隆比dEpoB对MM细胞系具有约5倍大的效力，同时这两种药均对正常骨髓基质细胞具有对等的毒性。人胎儿肺成纤维细胞(MRC-5)对dEpoB和Flu是敏感的，但对于Flu，清晰的治疗窗是明显的，甚至对于这些非常敏感的正常细胞。弗迪隆和dEpoB导致骨髓瘤和淋巴瘤细胞在G2M阶段停滞(图18)并诱导肿瘤细胞凋亡(图19和20)。本发明的发明人评价了导致骨髓瘤细胞凋亡必需的体外药物暴露的持续时间。脉冲暴露1、2、4、8和24小时，随后洗除药物并继续培养长达48小时。细胞暴露于弗迪隆或dEpoB 24hr导致所有的细胞在48hr内死亡(图21)。用dEpoB培养4-8hr延缓了细胞增殖，而暴露于弗迪隆相同的持续时间则降低了最初细胞数量的约50％。暴露于dEpoB一小时在48hr内减少了但没有阻止肿瘤细胞增殖，而用Flu，肿瘤数量降低了50％(图21)。弗迪隆和dEpoB与紫杉醇一样，都具有在暴露后不久，增加微管束在癌细胞内形成而没有略微改变该细胞中的微管质量的能力(图22)。在稍后的时间(约24hr)微管被破坏并且发生细胞凋亡。在弗迪隆和dEpoB对于获自母体髓的初生CD138MM细胞的比较中，本发明的发明人说明弗迪隆诱导肿瘤在24hr内凋亡，而dEpoB却没有。
对人实体瘤细胞系的药物敏感性
弗迪隆和dEpoB的IC50在一组人实体瘤系(结肠、乳和卵巢)上测定(表2-1)。在每个例子中，弗迪隆的IC50均低于dEpoB的IC50。卵巢癌系对弗迪隆特别敏感并且4/5的卵巢系具有平均为1.6nM的IC50，相比而言dEpoB的IC50为16.5nM。这两种药物均导致肿瘤细胞在G2M阶段停滞(图23)并快速诱导凋亡(图24和25)。
RPMI-8226骨髓瘤细胞系在用dEpoB或弗迪隆在以×10各自IC50剂量治疗6和18hr后的全基因组表达
在RPMI-8226人多重骨髓瘤细胞系中全基因组表达(Affymetric芯片AU133 2.0)与差别基因表达的比较，在用dEpoB或弗迪隆治疗6或18hr(在×10的IC50剂量)后进行。在弗迪隆治疗的RPMI-08226与对照未治疗的细胞比较中，在6小时时5个基因被正调控(表2-2)并且在18hr时48个基因被正调控(表2-3)。JUN在两次均被正调控(+3.25，+2.64)。在6hr时3个基因被负调控(表2-2)并且在18hr时16个基因被负调控(表2-3)。HNRPD(异源核核蛋白D类似物)在两个时间均被负调控(-2.46，-3.25)。在dEpoB治疗的RPMI-08226与对照未治疗的细胞比较中，在6小时时21个基因被正调控(表2-2)并且在18hr时26个基因被正调控(表2-3)。JUN(+5.66，+3.73)和微管蛋白α3(+2.64，+2.30)在两个时间均被正调控。在6hr时3个基因被负调控(表2-2)并且在18hr时16个基因被负调控(表2-3)。HNRPD在两个时间均被负调控(-4.92，-2.00)。于是本发明的发明人比较了由弗迪隆对dEpoB而改变的基因表达(表2-2和2-3)。
表2-2.全基因组表达(Affymetrix芯片-AU133 2.0)与差别基因表达在RPMI-8226(人多重骨髓瘤细胞系)中的比较。对照细胞与用弗迪隆或dEpoB治疗的细胞(在10倍IC50剂量)6小时的比较。  弗迪隆6hr  倍数变化  脱氧埃坡霉素B 6hr  倍数变化 JUN  SKIL(类SKI)  BASP1(脑丰度膜连信  号) APP(淀粉样β前体蛋  白) HMGCS1(3-羟基-3-甲  基戊二酸单酰辅酶合  酶)              +3.25  +2.83  +2.83   +2.14   +200                IFI27(干扰素-α可诱导蛋白质)  JUN  G1P3*(干扰素-α可诱导蛋白质)  IFITM1*(干扰素诱导跨膜蛋白1)   APP(淀粉样β前体蛋白质)  CCL5(Rantes趋化因子)   TUBA3(微管蛋白α3)  INSIG1(胰岛素诱导基因)  TRIM22(含三分裂基序22)  HLA-DPA1*(组织相容性类别II  DPα1)  IFIT1*(具有tetratricopeptide重复  的干扰素诱导蛋白) HMGCS1(3-羟基-3-甲基戊二酸单  酰辅酶A)  MARCKS(富含meristoylated丙氨  酸PKC底物)  ABCG1(ABC输运活性)  +18.38  +5.66  +5.28  +4.92    +2.83  +2.64   +2.64  +2.46  +2.30  +2.30   +2.30   +2.30   +2.14   +2.14
  MX1*(粘液病毒耐药性，干扰素可  诱导p78)  OAS1*(2’5’-寡腺苷酸合成酶)  PLSCR1(磷脂移位酶(phospholid  scramblase))  STS(类固醇硫酸酯酶)  DUSP4(双特异磷酸酯酶)  AP1S1(接头相关蛋白复合物1)  ARHE(Ras同系物家族E)   +2.00   +2.00  +2.00   +2.00  +2.00  +2.00  +2.00  +2.00 HNRPD(异源核核蛋白  D).  SUV39 H2.  (杂色的同源染色体的  抑制因子).  HIST1(组蛋白1)  -2.46   -2.00    -2.00 RNRPD(异源核核蛋白D)   HMOX1(血红素氧合酶)  HASA1A(热休克70kDa蛋白)   MAT2A(甲硫氨酸腺苷转移酶IIα)  -4.92   -2.30  -2.14   -2.00

下划线：-基因正调控或负调控，在弗迪隆或dEpoB治疗的细胞中6hr时。
*干扰素可诱导基因。
表2-3.全基因组表达(Affymetrix芯片-AU133 2.0)与差别基因表达在RPMI-8226(人多重骨髓瘤细胞系)中的比较。对照细胞与用弗迪隆或dEpoB治疗(在×10倍IC50剂量)的细胞18小时的比较。  弗迪隆18hr  倍数变化  脱氧埃坡霉素B 18hr  倍数变化  PRKDC(双链断裂修复)   微纤维蛋白2  REPS1(RALP1相关的Eps区  域) PKD1(多囊肾疾病1)  +21.11   +12.3  +9.85   +7.46  REPS1(RALBP1相关的Eps  区域) PKD1(多囊肾疾病1) JUN  SEMA3D(Ig sema区域)  +9.85   +5.6  +3.73   +3.73
 TRIO(Triple functn区域脒基  NEF)  FLJ20241(NFkB活化蛋白) CCL3(趋化因子MIP-1α) PCNX(Pecanex同系物) KIAA1025蛋白 TRA2A(转换基因2α，mRNA  剪接)  GTF2H2(通用转录因子IIH)   SLC13A1(钠离子转运蛋白) PHC3(聚同源异型类似物) SEMA3D(Ig sema区域) JUN PRKCBP1(蛋白激酶C结合)  GA17(树突细胞蛋白)   SEC24D(SEC24相关的基因家  族D) SMA3(水解酶活性)  ETS2(v-ets致癌基因同系物)  DNAJB1(Hsp40同系物亚族B)  CCT8(含TCP1的伴侣素)  EIFA1(转译起始因子4A-1)   TCS2(结节性硬化症2)  CD72(细胞粘着)  HSPA1A(热休克蛋白70kDa  1A)  +4.29   +3.73  +3.48  +3.48  +3.25  +3.03   +3.03   +3.03  +2.83  +2.83  +2.64  +2.64  +2.64   +2.64   +2.46  +2.46  +2.30  +2.30   +2.30   +2.30  +2.30  +2.14  PRKCBP1(蛋白激酶C结合) PCNX(Pecanex同源性)  GTF2H2(通用转录因子IIH) KIAA1025蛋白 TRIO(Triple functn区域鸟  嘌呤基NEF) CCL3(趋化因子MIP-1α) VEZATIN(跨膜蛋白) TRA2A(转换基因2α，mRNA  剪接) APRIN(雄激素诱导多育曲  菌素inhi) KIAA0191蛋白  TUBA3(微管蛋白α3) THEM1(跨膜蛋白1) PHC3(聚同源异型类似物) SMA3(水解酶活性) AKAP9(PRKA激酶锚定蛋  白)  INADL(PDZ，信号级联)  EIFA1(翻译起始因子4A-1)  GAPCENA(rab6GTPase活  化)  MGC10526(糖磷酸转移酶)  ATP8B1(ATPase类别1) RPL23(核糖体蛋白L23)  RC3(rabconnectin3)    +3.03  +3.03  +2.83  +2.83  +2.83   +2.64  +2.46  +2.46   +2.46   +2.46  +2.30  +2.30  +2.30  +2.30  +2.14   +2.14   +2.14  +2.14   +2.00  +2.00  +2.00  +2.00  
  ZFY(锌指蛋白-Y-连接的)  AIP1(阿托品-1相互作用蛋白) RPL23(核糖体蛋白L23) THEM1(跨膜蛋白-1) KIAA0191蛋白  HSPA1B(热休克蛋白70kDa  1B) VEZATIN(跨膜蛋白)  SERPINH1(半胱氨酸蛋白酶抑  制剂)  MADH1(mothers against  decapentaplegic)  BAX(Bc1-2相关蛋白)  APRIN(雄激素诱导多育曲菌  素inhi)  APBB2(淀粉样β前体结合蛋  白) AKAP9(PRKA激酶锚定蛋白)  APG16L(APG16自吞噬16-类  似物)  CENPC1(着丝粒蛋白C1)  +2.14  +2.14  +2.14  +2.14  +2.14  +2.00   +2.00  +2.00   +2.00   +2.00  +2.00   +2.00   +2.00  +2.00   +2.00 ZF(HCF-结合转录因子)  Clorf29(染色体1开放阅读框)  FLJ20130(假设性的蛋白)   F11(凝血因子X1)  G1P3(干扰素-α可诱导蛋白质) HNRPD(异源核核蛋白D-类似  物)  -6.50  -6.06  -5.66   -4.00  -3.73  -3.25  ZF(HCF-结合转录因子)  细胞周期蛋白E2 MARS(蛋氨酸-tRNA合成  酶) POU4F1(Pou区转录因子) NRTN(neuturin)  PABPN1聚(A)结合蛋白，  核)  -6.06  -3.03  -2.83   -2.46  -2.14  -2.00 
 细胞周期蛋白E2   FLJ20045(假设性的蛋白)  CEB1(细胞周期蛋白E结合泛  素连接酶)  FBXO5(F盒唯一蛋白5) NRTN(neuturin)  DUSP6(双特异性磷酸酶) POU4F1(Pou区转录因子) MARS(蛋氨酸-tRNA合成酶)  HDAC9(组蛋白去乙酰酶9)  CENPC1(着丝粒蛋白C1)  -2.64   -2.46  -2.30   -2.30  -2.3  -2.14  -2.14  -2.00  -2.00  -2.00 HNRPD(异源核核蛋白D-类  似物)            -2.00           

下划线：-基因正调控或负调控，在弗迪隆或dEpoB治疗的细胞中18hr时。
*干扰素可诱导基因。
在6小时，由弗迪隆正调控5个基因，由dEpoB正调控21个，并且二者都正调控3个基因，同时由弗迪隆负调控3个基因，由dEpoB负调控4个，并且没有二者都负调控的基因。在18小时，由弗迪隆正调控48个基因，由dEpoB正调控26个，并且二者都正调控18个基因，同时由弗迪隆负调控16个基因，由dEpoB负调控7个，并且二者都负调控6个基因。指定该方案测试如下假说：弗迪隆优于dEpoB和以前的埃坡霉素的增强的抗肿瘤功效是由于除了微管稳定性外，另外一些肿瘤靶向机理。因此本发明的发明人确定了何种基因由Flu差别地正调控和负调控，同时与dEpoB-治疗的MM细胞比较(表2-4)。
表2-4.全基因组表达(Affymetrix芯片-AU133 2.0)与差别基因表达在用dEpoB或弗迪隆(在×10倍IC50剂量)治疗6或18小时的RPMI-8226(人多重骨髓瘤细胞系)中的比较。所示基因为由弗迪隆选择性改变的那些。
  6小时基因差异  倍数变化  18小时基因差异  倍数变化  BCL3  血红素加氧酶  +3.25  +2.30  HMT-1(甲基转移酶-类似物-1)   +11.3  IFI27*(可诱导的干扰素  (IFN)α) GIP3*(可诱导的IFNα)  T RIM34(含三分裂基序) IFTM1*(IFN诱导的跨膜)   HLA-II DPα*  AIM2*(在黑素瘤中缺乏)  PTPL(酪氨酸磷酸酶-类似  物)  TRIM22(含三分裂基序)   CA4(碳酸酐酶)  MX1*(粘液病毒耐药性，  IFN可诱导的)。    -7.46   -6.06  -5.66  -4.00   -3.73  -2.64  -2.46   -2.46   -2.14   -2.00    IFI27*(可诱导的干扰素(IFN)  α) GIP3*(可诱导的IFNα) IFITM1*(IFN诱导的跨膜) MX1*(粘液病毒耐药性，IFN可  诱导的)  DUSP4(双特异磷酸酶)  PPAP2C(磷脂酸磷酸酶)  PLSCR1*(磷脂移位酶)   IFIT1*(IFN诱导的蛋白  tetra-tricopeptide重复)  OAS2*(2’-5’-寡腺苷酸合成酶  -2)  TRIM22(含三分裂基序-22)   CEB1(细胞周期蛋白E结合蛋  白)  -5.28   -5.28  -3.25  -2.30   -2.14  -2.14  -2.00   -2.00   -2.00   -2.00   -2.00 

下划线：-基因负调控，在弗迪隆或dEpoB治疗的细胞中在6和18hr时。
*干扰素可诱导基因。
在6小时，正调控了两个基因，并且在18小时，正调控了一个基因。在6小时，负调控了十个基因，并且在18小时，负调控了十一个基因，并且在两个时间负调控了四个基因(IFI27，-7.46，-5.28)，GIP3(-6.06，-5.28)，IFTM1(-4.00，-3.25)，MX-1(-2.00，-2.30)。这些是所有干扰素可诱导的基因。卵巢1A9和1A9PTX22卵巢异种移植物的基因表达图已经被报导，用紫杉醇治疗24小时后显示为IFN响应基因(GIP3，IFI27，IFITM1，IFII6，ISG15)的表达减少(Bani等人“Gene expressioncorrelating with response to paclitaxel in ovarian carcinoma xenografts”Mol.Cancer Thera.2004；3：111-121；通过引用并入本发明)。这些基因中的三个(GIP3，IFI27，IFITM1)，在用dEpoB而不是用弗迪隆治疗的RPMI-8226细胞后6小时，被强烈地过度表达，并且这些也是其表达最强烈地辨别弗迪隆和dEpoB基因图的基因。IFN-响应基因的过度表达(例如，IFR9)最近已经与肿瘤细胞系中对紫杉醇的耐药性联系在一起，并且这些发现支持了这样的可能性：是INF信号的介质涉及于紫杉醇的响应，而不是INF自身(Luker等人，“Overexpression of IRF9confers resistance to antimicrotubule agents in breast cancer cells”CancerRes.2001；61：6540-7；通过引用并入本发明)。在对抗微管剂耐药性的发展中，IRF9的这种新型IFN独立作用的报导占到接近乳癌和子宫癌的一半(Luker等人，“Overexpression of IRF9confers resistance toantimicrotubule agents in breast cancer cells”Cancer Res.2001；61：6540-7；通过引用并入本发明)。eEpoA或他克唑耐药性的肿瘤系的微阵列分析表明在EpoA耐药性肿瘤中而不在他克唑耐药性肿瘤中被高度表达的多数基因编码了干扰素可诱导基因(Atadja等人“Geneexpression profiling of epothilone A-resistantcells”Novartis Found Symp.2002；243：119-32；通过引用并入本发明)。显然，本发明的发明人发现8/21(38％)的所有基因(在dEpoB治疗RPMI-8226之后被正调控，为IFN可诱导的并且这些基因中没有一个由Flu治疗而改变(表2-2至2-4)。随后的IFN可诱导基因显示出在8226MM细胞中用dEpoB治疗6小时或18小时后被正调控而用弗迪隆治疗时不改变。由dEpoB正调控的程度排序，它们是1.)干扰素(IFN)α-可诱导的IFI 27(增加+18.83)。这属于小的干扰素-α-可诱导基因的家族，其未知的功能为在发炎的皮肤病、上皮癌和伤口修复中被正调控(Suomela等人“Interferon alpha-inducibleprotein 27(IFI27)is upregulated in Psoriatic skin and certain epithelialcancers”J Invest.Dermatol.2004；122：717-721；通过引用并入本发明)。2.)IFNα-可诱导蛋白(克隆IFI-6-16)GIP3(Bani等人“Gene expressioncorrelating with response to paclitaxel in ovarian carcinoma xenografts”Mol.Cancer.Thera.2004；3：111-121；通过引用并入本发明)(增加+5.28)。3.)IFN-诱导跨膜蛋白1，IFTM1(Bani等人)(增加+4.92)。4.)粘膜病毒耐药性，IFN可诱导的，MX1(在6小时增加+2和在18小时增加+2.3)。该MX1基因赋予流感病毒选择性的先天耐药性(Staeheli，Ad.Viral Res.38：147，1990；通过引用并入本发明)。它们还可能作为GTP结合蛋白担当基本的细胞功能(Arnheiter H和Meier E.“Mx proteins：antiviral proteins by chance or necessity？”New Biol.1990；90 851；通过引用并入本发明)。5.)磷脂移位酶1基因PLSCR1。该基因的转录控制由位于第一外显子的单一IFN-刺激的响应元件而完全调控(Zhou等人“Transcriptional control of the human plasma membrane phospholipidscramplase 1 gene is mediated by interferon-alpha”Blood 2000；95：2593-2599；通过引用并入本发明)。PLSCR1涉及改建血浆膜磷脂和磷脂酰丝氨酸向细胞表面的运动。其可帮助血浆膜磷脂的快速跨膜移动，这可在暴露至升高细胞内Ca++的受伤和凋亡的细胞中观察到。研究表明其还能使核易位并可以用作转录因子(Ben-Efraim等人“PhospholipidScramblase 1 is imported into the nucleus by a receptor-mediated pathwayand interacts with DNA”Biochem.2004；43：35181；通过引用并入本发明)。6.)具有tetracopeptide重复的干扰素诱导蛋白，IFITI(增加+2.3)。其已经与全身红斑狼疮相关并且蛋白-蛋白研究表明其可以通过与Rho/Rac鸟嘌呤核苷酸交换因子相互作用而活化Rho蛋白(Ye等人“Protein interaction for an interferon-inducible syste-3526mic lupusassociated gene，IFIT1”Rheumatology 2003；42：1155-63；通过引用并入本发明)。7.)2’-5’寡腺苷酸合成酶-2，OAS2(增加+2)。这一族(OAS1，OAS2，OAS3，OAS4)的干扰素诱导基因涉及应激反应并对于干扰素的抗病毒活性是重要的(Chebath，Nature 330：587，1987；Meurs等人J.Virol.66：5804，1992；每篇文献通过引用并入本发明)。OAS2催化了腺苷低聚物(2-5A)的合成。于是这些低聚物活化了RNase L，潜伏于大多数哺乳动物细胞中的核糖核酸内切酶，其反过来又可以使病毒(picornoviruses例如门戈病毒)和细胞的RNA失活(Anderson等人Eur.J.Biochem.2004；271：628-36；通过引用并入本发明)。8.)组织相容性类II DPα1，HLA-DPA1(增加+2)。MHC-类II是已知的IFN生物学功能的介质(Tissot等人“Molecular cloning of a new Interferon-induced factorthat represses human immunodeficiency virus Type 1long terminal repeatexpression”Biol.Chem.1995；270：14891-14898；通过引用并入本发明)。
总结
CAG骨髓瘤细胞系显示了临床多重骨髓瘤的许多特征，所述多重骨髓瘤具有表型(CD38+CD138+CD45-)和体内移植物两者。通过静脉内灌注10～15百万个用融合HSV-TK-eGFP-荧光素酶基因改造的CAG细胞而建立异种移植NOD-SCID骨髓瘤小鼠模型。因此由荧光素酶生物发光形成的整个动物成像可用于实时的、非侵入性报告评价在活的小鼠中肿瘤负荷和药物功效。骨髓瘤小鼠在肿瘤注射7至20天后显示骨髓浸润和病理溶骨损害。植入肿瘤细胞后，小鼠随机地分成媒介物对照组、dEpoB治疗组和弗迪隆治疗组。dEpoB和弗迪隆的剂量均为20mg/kg，并且这些药物均通过腹膜内途径给药。给药剂量次数的平均值：在治疗的第一个30天中，对于dEpoB为10次，对于弗迪隆为12次。另外，在初始用弗迪隆治疗的7只小鼠中的3只，在35至45天之间给药五个剂量的Velcade(6.25μg/鼠，静脉内灌注)。结果表明，通过生物发光成像评价，与用dEpoB治疗的小鼠和对照小鼠相比，用弗迪隆治疗的骨髓瘤小鼠的其肿瘤负荷显著降低。所有对照组的小鼠在初始治疗后30天内死亡，然而弗迪隆治疗的小鼠的存活时间至少为对照组的两倍。对照组和用dEpoB治疗的小鼠两组间的存活时间没有差别。与蛋白酶体抑制剂Velcade组合，可显著减小位于脊椎动物脊髓灰柱和股骨中的肿瘤，这表明这种组合甚至在骨髓微环境保护下也可以攻击骨髓瘤细胞。
前面的数据表明用埃坡霉素治疗的骨髓瘤显示出典型的凋亡特征。尚不清楚胱冬肽酶是否牵涉于这个过程中。首先，本发明的发明人通过Western印迹研究了在骨髓瘤细胞中胱冬肽酶3(在胱冬肽酶途径中的一种效应物胱冬肽酶)的活性。用dEpoB或弗迪隆治疗，骨髓瘤细胞显示出增加了17kd的裂解的胱冬肽酶3，这与其活性相关。CAG骨髓瘤细胞免疫组织化学的染色采用了特异于切断的胱冬肽酶3的抗体，用于表示在凋亡细胞中细胞质和核周的局部特征。这些数据证实胱冬肽酶在埃坡霉素治疗的细胞中被激活。其次，本发明的发明人尝试通过萤光法试验了胱冬肽酶8和胱冬肽酶9(在胱冬肽酶途径中的引发剂胱冬肽酶)的活性。同样，在骨髓瘤细胞中发现胱冬肽酶8和胱冬肽酶9活性均被增加了。注意增加的胱冬肽酶9的活性比胱冬肽酶8更突出。引发胱冬肽酶8或9活化的信号正在积极研究中。
对造血干细胞的药物细胞毒性一直是人们主要关心的。从脐带血中分离出人CD34+干细胞并或用dEpoB或用弗迪隆单独培养24小时。洗除药物后，进行凋亡试验和2个星期的起源试验以评价埃坡霉素对干细胞的影响。本发明的数据显示dEpoB或弗迪隆对非循环干细胞没有显著毒性。
实施例3：(E)-9，10-脱氢埃坡霉素：在鼠科异种移植模型中具有很好前景特征的一类新型微管稳定抗肿瘤剂
包含普通16元环的26-F3-[16]dEpoB(2)的合成可通过高汇集策略完成，该策略为应用于27-F3-[17]ddEpoB(19)的合成中相关的策略。这种策略预计通过如下所示的闭环复分解反应而形成E-9，10-烯(以前的通过RCM大环化成络合物结构的例子为，参见：Sinha，S.C.；Sun，J.Angew.Chem.Int.Ed.2002，41，1381；通过引用并入本发明)。本发明的发明人预计28和29的E-9，10-烯的化学选择还原将给出dEpoB(1)和想要的26-F3-dEpoB(2)。该RCM的前体由通过酯化反应结合两个片段(21或24)和123而制备。耦合伴侣123通过消除连接于C8二级甲基的亚甲基间隔基团(见本发明的发明人早期途径中，参见化合物18)而构建。如上所说明，包含间隔双烯排列的17元环的埃坡霉素(参见18)的体外水平的发现，强调了对于在熟悉的16元环内酯结构中这样的双烯的生物学结果的相应研究的需要。鉴于本发明中dEpoB中的顺式12，13-双烯的存在，这样的间隔双烯应当必须包含9，10-双键。
9，10-脱氢埃坡霉素和26-F3-dEpoB的逆合成

用易于合成的三氟烯丙基碘和甲基烯丙基碘(分别为8和124)烷基化噁唑烷酮7(Lee等人，J.Am.Chem.Soc.2001，123，5249；通过引用并入本发明)，允许在适合的绝对构型中建立具有高的非对映体过量(参见产物9或125)的C15立体中心(Evans，D.A.；Morrissey，M.M.；Dorow，R.L.J.Am.Chem.Soc.1985，107，4346；Paterson，I.；Bower，S.；Mcleod，M.D.Tetrahedron lett.1995，36，175；每篇文献通过引用并入本发明)。将后者转换为相应的Weinreb酰胺(Nahm等人Tetrahedron Lett.1981，22，3815；Levin等人Synth.Commun.1982，12，989；每篇文献通过引用并入本发明)，并且由此转化为126和42，然后通过亲核甲基化(MeMgBr)和适合的Homer Wittig成烯化作用(Lythgoe等人，Tetrahedron lett.1975，40，3863；Lythgoe，Chem.Soc.Rev.1981，449；Toh等人Org.Chem.1983，48，1414；Baggiolini等人J.Org.Chem.1986，51，3098；每篇文献通过引用并入本发明)转化为24和21。尽管使用这种作为手性辅助物的噁唑烷酮已经由Evans及其同事(Evans等人J.Am.Chem.Soc.1985，107，4346；Paterson等人Tetrahedron Lett.1995，36，175；每篇文献通过引用并入本发明)首创，但其通过烷基化(而不是通过羟基化)合成光学定义的甘醇酸酯的应用尚未被开发。
片段21和24的合成

多丙酸酯片段25的合成可以通过两个关键的醛醇缩合反应而实现，其建立了C3、C6和C7立体中心的相对构型。第一个醇醛缩合反应涉及将Z-烯醇化的乙基酮30与Roche醛31反应(Cohen等人Org.Chem.1976，41，3505；Nagaoka等人Tetrahedron 1981，37，3873；Roush等人J.Am.Chem.Soc.1990，112，6348；每篇文献通过引用并入本发明)以提供想要的具有高度非对映体选择性的32。该合成借助于31，其显著优点是优于使用以前的醛，以前的醛需要解决光学纯起始原料的来源问题。
保护C7-醇随后通过缩醛水解提供想要的醛34并为第二次醇醛缩合反应创造条件。34与Duthaler的DAG(二酮葡萄糖)Ti-烯醇化物反应(Duthaler等人Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1989，28，495；通过引用并入本发明)提供想要的具有高度(＞95％)非对映体选择性的羟基叔丁基酯35。然后将后者直接转化为想要的酸25。
酸25的合成

烯丙基醇24、21和C1-C9的酸片段25通过EDCI酯化规程结合在一起，因此分别提供了RCM前体26和27。26和27的闭环复分解反应通过使用RCM催化剂(Scholl等人Tetrahedron Lett.1999，40，2247；Grubbs等人Acc.Chem.Res.1995，28，446；Trnka等人Acc.Chem.Res.2001，34，18；Alkene Metathesis in Organic Chemistry Ed.：Fürstner，A；Springer，Berlin，1998；Fürstner，A.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2000，39，3012；Schrock，Top.Organomet.Chem.1998，1，1；每篇文献通过引用并入本发明)在甲苯中进行。这些反应确实提供了反式异构体39a和40a。然而，主产物却是39b和40b，其由明显的另一RCM途径获得。这些不想要的RCM异构体超过想要的39a和40a的比例为约3∶1。最后，用HF-吡啶对39a和40a的甲硅烷基醚脱去保护导致形成想要的E-9，10-脱氢-埃坡霉素28(White等人J Am.Chem.Soc.2001，123，5407；White等人J；Am.Chem.Soc.(增补/修正)2003，125，3190；每篇文献通过引用并入本发明。已知化合物28的严格证明的结构，本发明的发明人惊奇地发现其光谱性质与先前地报导的以为具有相同实体的化合物的光谱并不一致。该化合物的实际结构先前认为是28，现在被重新鉴定。回顾过去，28从未被制备过并且，事实上本发明中报导的整个(E)-9，10-脱氢埃坡霉素家族都是新的种类)和29。根据计划，后者通过二酰亚胺还原E-9，10-烯而转化为dEpoB(1)和26-三氟-dEpoB(2)(Corey等人Tetrahedron Lett.1961，347；Pasto等人Org.React.1991，40，91；每篇文献通过引用并入本发明)。
通过相应的方法学，本发明的发明人合成了9，10-脱氢-dEpoF(57)，参见下文。选择性的二酰亚胺还原E-9，10-烯证实了如上所述的各种合成中间体的结构，因此促使再次评定文献中以前的分配。
9，10-脱氢-埃坡霉素的合成

合成的类似物(28、29和57)，在细胞培养装置中的检查(参见增补版)，显示出它们对各种敏感物和MDR肿瘤细胞系产生强于本发明的发明人目前的候选药物dEpoB(1)所具有的抑制作用。埃坡霉素28、29和57所具有的给人深刻印象的细胞生长抑制作用覆盖各种耐药性肿瘤的范围，这促使了对这些新型(E)-9，10同类物的血浆稳定性进行测定。本发明的发明人记得(E)-10，11-脱氢-dEpoB(Epo490)具有非常差的血浆稳定性。事实上，正是这种血浆不稳定性阻碍了Epo490(6)的进一步开发。相反，当将28、29和57暴露于鼠血浆时，本发明的发明人观察到与dEpoB(1)相比非常慢的药物降解(因子约为7)。从药物利用度方面，相对于dEpoB(1)，更不用说epo490(6)，这种稳定性构成了实质上的进步。基于初步的(E)-9，10-脱氢衍生物28和29的细胞培养和药物动力学数据，将它们进一步用于体内研究是合适的。这样的研究当然比在体外研究更强调药物的利用度(Rivkin等人J.Am.Chem.Soc.2003，125，2899；Chou等人Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2003，42，4761-4767；Yoshimura等人Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2003，42，2518-2521；每篇文献通过引用并入本发明。对于最近另外有效的埃坡霉素类似物的例子参见：Altmann等人Bioorg.Med.Chem.Lett.2000，10，2765；Nicolaou等人Chem.Biol.，2000，7，593；每篇文献通过引用并入本发明)。
这种需求，和实际上可能最后需要制备数克量的9，10-脱氢衍生物用于进一步研究，促使对本发明全合成路线进行有意义的再评价。当然，唯一最严重的问题是在26、27和54上的RCM反应产生的39b、40b和56仅为次要产物。涉及RCM反应的主要途径严格限制于26、27和54的O-烷基部分，导致主要产生不想要的39b和40b。因此，决定尝试将噻唑的引入(通过烯化作用)推迟到RCM之后(见下页)。
将最终数克量级的可处理性作为本发明的目标，因此重新构建了进入RCM反应的烷基和酰基片段。化合物86如所示的那样易于合成。将其用于烷基化高度对映体过量的噁唑烷酮7。随后进行OTES基团的去保护和亲核甲基化作用，得到化合物90。该α-羟基酮，在制备所有关键性RCM的重要的酯的形成中，用作酰基受体。令人明显关注的可能的弱点是，这样的羟基酮作为酰基受体可部分外消旋化或转化成区位异构的α-酮醇。
可处理的合成片段90

本发明的发明人以前合成的酸片段25的严重问题是，成本很高并且技术上需要Duthaler化学(Duthaler等人Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1989，28，495；通过引用并入本发明)在C3位置上产生想要的S立体化学。为了回避这个问题，不用任何手性辅助物而进行羟醛反应以提供相应β-羟基酮的1∶1混合物。控制所衍生的酮官能团(参见化合物69)不对称还原的试剂，采用Noyori条件(Noyori等人J.Am.Chem.Soc.1987，109，5856；通过引用并入本发明)在C3位置上以高对映体过量的形式产生了想要的S立体化学。现在将可得到的β-羟基酯70根据以前的方案在几步内转化为酸25(Chou等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2001，98，8113；通过应用并入本发明)。
可处理的合成酸25

显著地，将得到的羟基酮43和44用C1-C9酸片段25酯化提供了相应的RCM环化前体45和46，而没有在C15上明显外消旋，或者说丧失最初α酮醇成键的完整性。45和46的闭环复分解反应通过采用RCM催化剂(Scholl等人Tetrahedron Lett.1999，40，2247；Grubbs等人Acc.Chem.Res.1995，28，446；Trnka等人Acc.Chem.Res.2001，34，18；Alkene Metathesis in Organic Chemistry Ed.Fürstner，A；Springer，Berlin，1998；Fürstner，A.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2000，39，3012；Schrock，Top.Organomet.Chem.1998，1，1；每篇文献通过引用并入本发明)在甲苯中进行。该反应，现在由于代用的复分解途径而并不复杂，提供高产率的完全反式异构体47和48。通过Wittig反应以高的E/Z选择性和高产率引入噻唑部分，在将两个甲硅烷醚脱保护后得到28和29(Hindupur等人Tetrahedron Lett.2000，2，7341；通过引用并入本发明。尝试应用Avery的方案引入噻唑以获得想要的产物，产率低且E/Z选择性差)。这条途径符合服从大量合成的标准。
本发明的发明人考虑是否在埃坡霉素B(51，EpoB)中引入C9-C10烯将改变其生物特性，以与其12，13-脱氧对应物情况相同的方向。为此，本发明的发明人研究了采用2，2′-二甲基双环氧乙烷(DMDO)对28进行环氧化。该反应在较多取代的C12-C13烯上确实以高立体选择性而进行。获得产率为87％的比例为1∶2.6的(E)-9，10-脱氢埃坡霉素B(49)和其具有α-12，13-环氧乙烷的非对映异构体(结构未示出)。体外研究49(其在C12和C13构型已被建立，将其还原提供EpoB)，显示其比母体化合物EpoB(51)对各种细胞系的效力强大约为2-4倍。尽管化合物49在本发明的发明人进行的程序中被证明是最有效力的埃坡霉素，但其对于异种移植物狭窄的治疗指数，以及其难于获得性(见上)阻碍了其在临床前的进一步研究。有趣的是，非天然的α-环氧乙烷几乎没有活性。
可处理的合成(E)-9，10-脱氢埃坡霉素

如上所述的重新建立的(第二代)合成的另一个优势为：可通过酮中间体39a和40a将各种杂环引入。这点通过9，10-脱氢-dEpoF的合成而很好的突出。酮与合适的鏻盐叶立德进行的Wittig反应以高产率和高E/Z选择性提供了想要的9，10-脱氢-dEpoF化合物57和59。另外，本发明的发明人能够有效地将21-羟基59转化为96和97型的衍生物，包括在C21位置进行氨基官能化，几步反应如下所述。
(E)-9，10-脱氢埃坡霉素的C21的多样化

已经在抗多种细胞类型方面评价本发明全合成的埃坡霉素同系物，以确定它们的抗肿瘤效力。
本发明的发明人的发现的最突出的特征如下：通过将E-12，13双键替代C12-C13β环氧化物，可以预见大约降低一个数量级(对敏感的CCRF-CEM细胞系比较EpoB和dEpoB)。另一个可以预料的为：包括E-9，10双键，加上Z-12，13烯，其导致覆盖几种细胞系的细胞毒性显著增加。
另一个有益的趋势可见于12-三氟-E-9，10-脱氢-dEpoB(29)(弗迪隆)与相应的E-9，10-脱氢化合物28的比较中。相对于(1)，在C26上包含三个氟原子减弱了细胞毒性最高至因子4。这种12-三氟甲基官能团的减弱效应也可见于缺少9，10-不饱和键的化合物中(比较dEpoB(1)和12-三氟-dEpoB(2))。
鉴于这些数据，和鉴于这些9，10-脱氢化合物(包括12-三氟同类物)通过化学合成的可得到性，本发明的发明人开始用本发明最有前景的化合物进行体内实验。本发明人在此描述了用化合物29(弗迪隆)的一些特别惊人的和有前景的结果，化合物29已经显示出用于进一步临床评价的最令人兴奋的可能性。在免疫缺陷裸鼠中利用人肿瘤异种移植物进行体内实验。尽管有它们的缺点，这种在肿瘤学中的模型仍被广泛用于评价(Fiebig，H.H.；Berger，D.P.；Preclinical Phase II trials。在Boven，E.和Winograd，B.编辑的The Nude Mouse in Oncology Research中，CRC Press，Boca Raton(1995)，318；通过应用并入本发明)可能的抗肿瘤先导化合物以开展临床研究。
显著地，用30mg/kg剂量的弗迪隆治疗MX-1异种移植物，其导致肿瘤完全消失并且在停止治疗后2个月没有任何复发(参见图6A)。最重要的是，这些成功的治疗可或者通过6小时静脉内灌注或者通过口服给药而完成(参见图6B和10A)。另一方面，通过口服他克唑治疗MX-1异种移植物没有影响该肿瘤(参见图6B和10A)。不言而喻，如果转移到人的临床环境中，获得口服活性将是显著有益的。
他克唑耐药性肿瘤异种移植物(图7A)以及人结肠癌(HCT-116，图9A)也可以用弗迪隆通过静脉内灌注而治愈。在裸鼠中用人乳癌(MX-1)和人结肠癌(HCT-116)异种移植物进行的实验分别持续6.0和6.6个月。在停止治疗后，在两个实验中各自在4.3和5.3个月中没有肿瘤复发。对于HCT-116实验，在20mg/kg下比较他克唑和弗迪隆，两者都使肿瘤消失他克唑治疗的组在治疗中止后1.1个月复发，然而弗迪隆治疗的动物肿瘤消失超过5.3个月。
这些结果涉及特别长的并贯穿整个治疗的研究，所述研究采用异种移植物并引人注目地报告了用单一抗肿瘤剂肠胃外用药或口服用药而长期完全消退病症。
实验例：
一般性药理学方法：
肿瘤和细胞系。CCRF-CEM人淋巴母细胞性白血病细胞和其长春碱耐药性的亚系(CCRF-CEM/VBL100，720倍耐药性)得自Chicago，Illinois大学的William Beck博士，并且CCRF-CEM/他克唑(体外44倍耐药性)通过在六个月中将CCRF-CEM细胞暴露于不断增加的至致死的浓度(IC50-IC90)的紫杉醇中而制备。人乳癌(MX-1)、人肺癌细胞(A549)和人结肠癌(HCT-116)细胞得自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)。
动物。带有nu/nu基因的无胸腺裸鼠得自NCI，Frederick，MD并用于所有的人肿瘤异种移植。除了另外指出雌性裸鼠，使用6星期以上的体重20-22g或更重的雄性裸鼠。使用自制的灌输微管和限制器通过尾静脉静脉内灌注6小时给药。具有多通道的可程控的HarvardPHD2000注射泵被用于静脉内灌注。典型的6小时灌输体积对在可利福/乙醇(1∶1)中的每种药物而言为2.0ml盐水中含有100μl。对于口服给药，弗迪隆和他克唑均溶解于乙醇中并用吐温-80稀释5倍。他克唑溶液应在5min内使用以避免沉淀。肿瘤体积通过测径器测量长×宽×高(或宽)而估算。对于带有肿瘤的裸鼠，实验过程中其体重是指总重减去肿瘤的重量。所有的动物实验均根据National Institute of HealthGuide for the Care and Use of Animals的指导原则和由MemorialSloan-Kettering Cancer Center′s Institutional Animal Care and UseCommittee批准的规程而实施。
细胞毒性试验。为准备体外细胞毒性试验，细胞培养于初始密度为2-5×104个细胞每毫升。将它们保存于5％CO2-湿润气氛的37℃的RPMI介质1640(GIBCO/BRL)中，所述RPMI介质1640包含青霉素(100单位/mL)、链霉素(100μg/mL，GIBCO/BRL)和5％热灭活的FBS。对于在单层中生长的实体肿瘤细胞(例如HCT-116和A549)，药物的细胞毒性通过使用磺酰罗丹明B方法(Skehan等人J.Natl.Cancer Inst.(1990)82，1107-1112，通过引用并入本发明)在96-孔微量滴定板上测定。对于生长于混悬液中的细胞(例如CCRF-CEM及其亚系)，通过使用二甲氧唑磺(2，3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilide)-2H-terazodium hydroxide(XTT))微管法(Scudiero等人Cancer Res.(1988)48，4827；通过引用并入本发明)在96孔微量滴定板上一式两份进行测量。对于两种方法，每个孔的吸光度用微量滴定板读板机(PowerWave XS，Bio-Tek，Winooski，VT)测量。剂量-效果的关系数据由每种药物的6至7个浓度，一式两份，通过使用计算机程序(Chou，T.-C.&Talalay，P.T.Adv.Enzyme Reg.1984，22，27；Chou，T.-C.& Hayball，M.CalcuSyn for Windows(Biosoft，Cambridge，U.K.)(1997)；其中每篇文献通过引用并入本发明)以中效图而分析。
一般性化学方法：使用得自商业供货商的试剂不用进一步纯化，除非另有说明。下述溶剂由干燥溶剂系统(通过预填充的氧化铝柱)获得，并无需进一步干燥而被使用：四氢呋喃、二氯甲烷、乙醚、苯和甲苯。从氢化钙中蒸馏三乙胺、N，N-二异丙基乙胺、二异丙胺、吡啶和2，6-二甲基吡啶。所有对空气和水敏感的反应均在经火焰干燥的玻璃器皿中在超纯氮气或氩气的正压条件下而进行。NMR(1H和13C)光谱在Bruker AMX-400MHz或Bruker Advance DRX-500MHz上如分别说明的那样记录，参照CDCl3(对于1H 7.27ppm和对于13C 77.1ppm)。红外光谱(IR)在Perkin-Elmer FT-IR model 1600光谱仪上获得。旋光度在JASCO model DIP-370数字旋光计上获得。低分辨率(电喷射)质谱在PESCIEX API 100上记录。分析薄层色谱在E.Merck硅胶60F254板上进行。对紫外没有活性的化合物通过将硅胶板浸渍于乙醇的对甲氧基苯甲醛溶液、乙醇的磷钼酸或钼酸铈氨中或/和加热而显影。制备性薄层色谱在Whatman(LK6F硅胶60A)TLC板上使用指定的溶剂而进行。硅胶色谱法在Davisil(1740级，60A型，170-400目)硅胶上使用指定的溶剂进行。
化学位移以相对于氯仿(NMR对于质子δ7.24和对于碳δ77.0)的δ值报告。

在室温下向4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯(24.0mL，0.164mol)的THF-水(3∶1＝V∶V，320mL)的溶液中加入烯丙基溴(20.0mL，1.4当量)，随后加入铟(粉，-100目，25g，1.3当量)，并将所得到的混合物在48℃下搅拌15h。将该反应混合物冷却至室温，用2N的HCl水溶液(400mL)淬灭，并用CH2Cl2(400mL，2×200mL)萃取。将合并的有机相干燥(MgSO4)，过滤，并在真空下浓缩。急骤层析(己烷→己烷-乙醚10∶1→8∶1→6∶1→4∶1)给出的醇为澄清油状物(31.64g，85％产率)：IR(film)3426(br m)，2986(m)，1713(s)，1377(m)，1345(m)，1301(m)，1232(m)，1173(s)，1095(m)，1023(m)，927(m)cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.82(m，1H)，5.15(m，3H)，4.17(m，2H)，2.59(m，1H)，2.58(d，J＝3.4Hz，2H)，2.29(dd，J＝14.2，8.6Hz，1H)，1.24(t，J＝7.2Hz，3H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ172.08，130.89，125.65(q，J＝280Hz)，120.27，73.79(q，J＝28Hz)，61.55，38.97，35.65，13.82；高分辨率质谱m/z 227.0895[(M+H)+；C9H14O3F3计算值：227.0895]。
该醇为挥发性的。经柱色谱后，不将该醇彻底浓缩。产率由总重和通过NMR积分而获得的产物和溶剂间的比而确定。

将醇(16.71g，0.07386mol)和吡啶(15.0mL，2.5当量)的混合物冷却至-10℃并于11min内用亚硫酰氯(11.3mL，2.1当量)缓慢处理(黄色沉淀)。将所得的混合物温热至55℃(在75℃下加热17h得到氯化产物的复杂混合物)并搅拌12h。将反应混合物冷却至-5℃，用水(200mL)淬灭并用CH2Cl2(2×200mL，2×150mL)萃取。合并的有机相用饱和NaHCO3(2×200mL)和盐水(200mL)洗涤，干燥(MgSO4)并在真空下浓缩。急骤层析(戊烷∶乙醚15∶1)给出的酯(11.90g，77％产率)为黄色油状物：IR(film)2986(w)，1731(s)，1308(s)，1265(w)，1227(m)，1197(s)，1133(s)，1025(m)，920(w)，896(w)cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.36(s，1H)，5.79(ddt，J＝16.9，10.2，6.6Hz，1H)，5.15(dd，J＝17.1，1.5Hz，1H)，5.08(dd，J＝10.0，1.4Hz，1H)，4.22(q，J＝7.1Hz，2H)，3.44(d，J＝6.5Hz，2H)，1.29(t，J＝7.1Hz，3H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ164.22，143.37(q，J＝29Hz)，132.71，123.21(q，J＝274Hz)，122.60(q，J＝6Hz)，117.32，60.85，30.54，13.85；高分辨率质谱m/z 209.0788[(M+H)+；C9H12O2F3计算值：227.0789]。
该酯是挥发性的。经过柱色谱后，不将该酯彻底浓缩。

向冷却的(-75℃)所述酯(7.12g，0.0342mol)的CH2Cl2(120mL)溶液中，在35min内加入DIBAL-H(75mL，2.2当量)的CH2Cl2溶液(1.0M)，将所得的溶液在3h内温热至室温。将反应混合物冷却至0℃，用饱和NH4Cl(12mL)淬灭并在室温搅拌20min。将反应混合物用乙醚(200mL)稀释，干燥(MgSO4)并真空浓缩。急骤层析(戊烷∶乙醚3∶1→1∶1)给出的醇(5.68g，99％)为澄清油状物：IR(film)3331(br s)，2929(m)，1642(m)，1445(m)，1417(w)，1348(s)，1316(s)，1217(s)，1175(s)，1119(s)，1045(m)，985(s)，921(m)，831(w)cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.33(td，J＝6.1，1.6Hz，1H)，5.75(ddt，J＝17.2，10.0，6.2Hz，1H)，5.07(m，2H)，4.29(ddd，J＝6.3，4.3，2.1Hz，2H)，2.95(d，J＝6.2Hz，2H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ134.45(q，J＝6Hz)，133.38，127.97(q，J＝29Hz)，123.76(q，J＝271Hz)，116.25，57.87，29.79。
醇56是挥发性的。经过柱色谱后，不将56彻底浓缩。

将冷却的(0℃)醇(5.97g，0.0358mol)的CH2Cl2(50mL)溶液用PPh3(11.17g，1.2当量)、咪唑(3.55g，1.5当量)和I2(9.10g，1.1当量)处理(最后加入I2)，将所得的(黄色浑浊)混合物在0℃下搅拌10min。该反应混合物用饱和Na2S2O3饱和的NaHCO3(1∶1＝V∶V，200mL)溶液淬灭并用戊烷萃取(3×200mL)。合并的有机相用饱和Na2S2O3饱和的NaHCO3(1∶1＝V∶V，200mL)溶液和盐水(100mL)洗涤，干燥(MgSO4)并在真空下浓缩。急骤层析(戊烷)给出的碘化物(6.69g，68％)为淡红色油状物(贮藏于-78℃冷冻箱中)：IR(film)3083(w)，2982(w)，1636(w)，1558(w)，1456(w)，1367(w)，1317(s)，1216(m)，1181(s)，1151(s)，1120(s)，989(m)，921(m)，896(m)cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.45(td，J＝8.9，1.5Hz，1H)，5.79(ddt，J＝16.8，10.3，6.2Hz，1H)，5.12(m，2H)，3.85(ddd，J＝8.9，2.9，1.4Hz，2H)，3.00(dt，J＝6.1，1.4Hz，2H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ132.42，131.64(q，J＝6Hz)，129.63(q，J＝29Hz)，123.64(q，J＝272Hz)，117.00，29.32，-4.27；低分辨率质谱m/z 298.7[(M+Na)+；C7H8F3INa计算值：299.0]。
该烯丙基碘是挥发性的。经过柱色谱后，不将该烯丙基碘彻底浓缩。

α-羟基噁唑烷酮。向冷却的(-78℃)TES保护的4-苄基-3-羟基乙酰基-噁唑烷-2-酮(16.28g，1.92当量)的THF(160mL)溶液中，在51min内滴加LHMDS(42mL，1.73当量)的THF溶液(1.0M)，将所得到的混合物在-78℃下搅拌35min。该反应混合物于15min内用烯丙基碘(6.69g，24.2mmol)的THF(10mL)溶液处理，将所得的混合物缓慢温热至室温过夜。该反应混合物用饱和NaHCO3(200mL)淬灭并用EtOAc萃取(3×200mL)。合并的有机相用饱和NH4Cl(150mL)、盐水(150mL)洗涤，干燥(MgSO4)并在真空下浓缩。急骤层析(己烷-EtOAc 6∶1→3∶1)给出烷基化产物混合物(13.6g)，其用于下步反应而不必进一步纯化(在此阶段不分离非对映异构体)。将所述烷基化产物的HOAc-水-THF溶液(3∶1∶1＝V∶V∶V，200mL)在室温下搅拌4h。将反应混合物真空浓缩以除去HOAc，用饱和NaHCO3(400mL)淬灭并用EtOAc萃取(3×200mL)。将合并的有机相干燥(MgSO4)并在真空下浓缩。急骤层析(己烷∶EtOAc3∶1→2∶1)给出α-羟基噁唑烷酮(7.55g，两步的产率为81％)为澄清油状物：[α]D20(25℃)-48.2°(c 1.08，CHCl3)；IR(film)3486(br s)，3030(m)，2983(s)，2925(m)，1790(s)，1682(s)，1481(m)，1393(m)，1360(m)，1217(m)，1171(m)，1113(m)，992(m)，919(m)，847(w)cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.32(m，3H)，7.17(m，2H)，6.33(td，J＝7.2，1.5Hz，1H)，5.77(ddt，J＝16.6，10.1，6.2Hz，1H)，5.08(m，3H)，4.74(ddt，J＝4.8，3.7，4.4Hz，1H)，4.33(dd，J＝8.6，8.6Hz，1H)，4.26(dd，J＝9.2，3.4Hz，1H)，3.42(br d，J＝6.4Hz，1H)，3.24(dd，J＝13.5，3.4Hz，1H)，2.99(m，2H)，2.79(dd，J＝13.5，9.4Hz，1H)，2.70(m，1H)，2.50(m，1H)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ173.93，153.05，134.43，133.64，129.98(q，J＝6Hz)，129.82(q，J＝28Hz)，129.29，120.01，127.58，124.00(q，J＝272Hz)，116.34，69.60，67.31，54.95，37.78，32.29，29.84；高分辨率质谱m/z 384.1421[(M+H)+；C19H21NO4F3计算值：384.1423]。

α-羟基酰胺。(MeO)NHMe.HCl(10.1g，5.25当量)的THF(100mL)悬浮液在0℃下用AlMe3(50mL，5.1当量)的甲苯溶液(2.0M)滴加处理，并将所得到的澄清溶液在室温下搅拌34min，然后缓慢加入到冷却的(0℃)α-羟基噁唑烷酮(7.55g，19.7mmol)的THF(70mL)溶液中(混浊→澄清，淡黄色)。将所得到的混合物温热至室温并搅拌12h。将反应混合物冷却至0℃，通过缓慢加入1N的酒石酸水溶液(100mL)淬灭，室温下搅拌25min，用EtOAc萃取(3×200mL)。将合并的有机相干燥(MgSO4)并在真空下浓缩。急骤层析(己烷∶EtOAc 2∶1→1∶1)给出的α-羟基酰胺(5.12g，产率97％)为澄清油状物：[α]D20(24℃)-57.2°(c 1.03，CHCl3)；IR(film)3432(br s)，3084(w)，2980(m)，2943(m)，1652(s)，1464(m)，1373(m)，1318(m)，1214(m)，1171(m)，1112(m)，991(m)，919(m)，818(w)cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.32(td，J＝7.3，1.5Hz，1H)，5.74(ddt，J＝16.9，10.3，6.1Hz，1H)，5.05(m，2H)，4.43(dd，J＝7.6，3.5Hz，1H)，3.70(s，3H)，3.35(br s，1H)，3.24(s，3H)，2.94(d，J＝6.1Hz，2H)，2.59(m，1H)，2.36(m，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ173.43，133.68，130.59(q，J＝6Hz)，129.25(q，J＝28Hz)，124.05(q，J＝271Hz)，116.17，67.57，61.44，32.56，32.38，29.75；高分辨率质谱m/z 268.1161[(M+H)+；C11H17NO3F3计算值：268.1161]。

α-羟基酮。向冷却的(0℃)α-羟基酰胺(4.87g，18.2mmol)的THF(150mL)溶液中加入MeMgBr(75mL，12当量)的乙醚溶液(3.0M)。5min后，将该反应混合物用饱和NH4Cl(250mL)淬灭并用EtOAc萃取(5×200mL)。将合并的有机相干燥(MgSO4)并在真空下浓缩。急骤层析(己烷∶EtOAc 4∶1→2∶1→1∶2)给出的α-羟基酮(2.16g，产率53％，基于回收的原料计产率为73％)为澄清油状物，并且给出原料α-羟基酰胺(1.30g，收率为27％)：[α]D20(23℃)+58.5°(c 1.30，CHCl3)；IR(film)3460(br s)，3085(w)，2984(m)，2926(m)，1716(s)，1679(m)，1641(m)，1417(m)，1361(m)，1319(s)，1247(m)，1216(s)，1172(s)，1113(s)，1020(m)，994(m)，968(w)，919(m)cm-1；1H NMR(500MHz，CDCl3)δ6.21(t，J＝7.0Hz，1H)，5.75(ddt，J＝16.7，10.4，6.2Hz，1H)，5.07(m，2H)，4.26(dt，J＝7.1，4.5Hz，1H)，3.51(d，J＝4.7Hz，1H)，2.96(d，J＝6.1Hz，2H)，2.66(m，1H)，2.42(m，1H)，2.19(s，3H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ208.53，133.43，129.80(q，J＝28Hz)，129.76(q，J＝6Hz)，123.85(q，J＝271Hz)，116.32，75.36，31.22，29.81，25.11；高分辨率质谱m/z 223.0945[(M+H)+；C10H14NO2F3计算值：223.0946]。
这个反应即使使用过量MeMgBr也不能进行完全。

碳酸1-(2苄氧基-1-甲基乙基)-5，5-二异丙氧基-2，4，4-三甲基-3-氧代戊酯2，2，2-三氯乙基酯。向0℃下的7-苄氧基-5-羟基-1，1-二异丙氧基-2，2，4，6-四甲基-庚-3-酮(1.0g，2.4mmol)和吡啶(0.8mL，7.3mmol)的CH2Cl2(10.0mL)溶液中加入氯甲酸2，2，2-三氯乙酯(668.0μL，4.9mmol)，然后将所得的混合物温热至室温。1h后，将反应混合物用盐水淬灭并用CH2Cl2萃取。将合并的有机层经MgSO4干燥并在减压下浓缩。粗产物通过急骤层析(梯度己烷至己烷/EtOAc 93∶7)纯化给出想要的产物(1.285g，92％)为澄清油状物：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.03-1.09(m，12H)，1.15(d，J＝1.8Hz，3H)，1.17(d，J＝1.9Hz，3H)，1.19-1.21(m，6H)，1.97-2.11(m，1H)，3.2(dd，J＝6.2和9.0Hz，1H)，3.54(dd，J＝4.8和9.1Hz，1H)，3.57-3.60(m，1H)，3.82(qd，J＝3.6和5.9Hz，2H)，4.47(s，2H)，4.57(s，1H)，4.72(d，J＝11.9Hz，1H)，4.81(d，J＝11.9Hz，1H)，5.08(t，J＝6.0Hz，1H)，7.29-7.35(m，5H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ11.9，15.0，18.8，21.4，21.7，22.3，23.2，23.4，35.7，42.5，53.4，53.9，69.4，70.9，71.4，73.3，81.3，94.7，103.4，127.5，127.6，128.2，138.2，154.0，215.6；IR(film，NaCl，cm-1)2966，1760，1698，1247；LRMS(ESI)C27H41O7Cl3Na[M+Na+]计算值605.2，实验值605.2；[α]23D＝-20.4(c＝1.0，CHCl3)。

碳酸1-(2苄氧基-1-甲基乙基)-2，4，4-三甲基-3，5-二氧代戊酯2，2，2-三氯乙基酯。向原料(1.28g，2.25mmol)的4∶1的THF/H2O(25mL)溶液中加入p-TsOH(111.0mg，0.6mmol)。在70℃下加热5h后，将反应混合物倾入冷的(0℃)饱和NaHCO3水溶液中(12mL)，然后用EtOAc萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥并在减压下浓缩。粗产物经急骤层析(梯度己烷至己烷/EtOAc 84∶16)纯化给出的产物(793.2mg，76％)为澄清油状物：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ0.90(d，J＝5.8Hz，3H)，1.0(d，J＝6.9Hz，3H)，1.24(s，6H)，1.97-2.04(m，1H)，3.24(dd，J＝4.8和9.2Hz，1H)，3.34(m，1H)，3.42(dd，J＝5.8和9.2Hz，1H)，4.35(d，J＝11.9Hz，1H)，4.39(d，J＝11.9Hz，1H)，4.64(d，J＝11.9Hz，1H)，4.69(d，J＝11.9Hz，1H)，4.96(t，J＝6.0Hz，1H)，7.19-7.28(m，5H)，9.49(s，1H)；13CNMR(100MHz，CDCl3)-12.0，14.8，19.5，19.6，35.4，43.3，60.9，71.1，73.3，80.37，94.5，127.7，127.8，128.3，137.9，154.1，201.0，210.1；IR(film，NaCl，cm-1)2973，2880，1758，1701，1453，1380，1248；LRMS(ESI)C21H27O6Cl3Na[M+Na+]计算值503.0，实验值503.0；[α]23D＝-18.5(c＝0.8，CHCl3)。

9-苄氧基-4，4，6，8-四甲基-3，5-二氧代-7-(2，2，2-三氯乙氧基羰基氧基)-壬酸叔丁酯。在-78℃下向LDA(1.17mmol，在Et2O中0.3M)的溶液中加入乙酸叔丁酯(1.0mmol，135.0μl)。30min后，在15min内缓慢加入原料(464.0mg，1mmol)的Et2O(2mL)溶液。搅拌1h后，用饱和NH4Cl水溶液淬灭反应并然后用EtOAc萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥并在减压下浓缩。粗产物用急骤层析(梯度己烷至己烷/EtOAc 86∶14)纯化给出的产物(1∶1差向异构体混合物461.4mg，80％)为澄清油状物：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ0.87(d，J＝5.3Hz，3H)，0.89(d，J＝5.5Hz，3H)，1.02-1.10(m，18H)，1.38(s，18H)，1.97-2.2(m，2H)，2.27-2.31(m，2H)，3.22-3.27(m，3H)，3.39-3.48(m，5H)，4.03-4.06(m，1H)，4.11-4.14(m，1H)，4.38-4.45(m，4H)，4.58-4.73(m，4H)，4.97(t，J＝5.8Hz，1H)，5.02(t，J＝5.8Hz，1H)，7.18-7.27(m，10H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ11.9，12.7，14.9，15.2，18.7，19.3，21.4，21.6，28.0，35.6，37.4，41.7，42.0，51.8，51.9，71.3，71.3，72.5，73.0，73.3，73.3，80.6，81.2，81.3，94.6，127.5，127.7，127.8，128.3，138.0，138.1，154.0，154.1，172.3，172.4，216.0，216.3；IR(film，NaCl，cm-1)3509，2975，1759，1707，1368，1248，1152；LRMS(ESI)C27H39O8Cl3Na[M+Na+]计算值619.1，实验值619.2。

向原料(350.0mg，0.6mmol)的CH2Cl2(10mL)的0℃溶液中加入Dess-Martin过碘烷(periodinane)(398.0mg，0.9mmol)。将该混合物在室温下搅拌1h然后倾入到搅拌充分的1∶1的饱和Na2S2O3/饱和NaHCO3混合物中。30min后分层。水层用Et2O萃取三次。合并有机萃取物，用饱和NaHCO3、盐水洗涤，经MgSO4干燥并在真空下浓缩。粗产物用急骤层析(梯度己烷至己烷/EtOAc 91∶9)纯化给出的产物(258.4mg，74％)为澄清油状物：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ0.80(d，J＝6.9Hz，3H)，0.87(d，J＝6.9Hz，3H)，1.13(s，3H)，1.19(s，3H)，1.23(s，9H)，2.04-2.12(m，1H)，3.09-3.28(m，5H)，4.23(s，2H)，4.48(d，J＝11.9Hz，1H)，4.55(d，J＝11.9Hz，1H)，4.79(dd，J＝4.6和7.3Hz，1H)，7.04-7.13(m，5H)；13CNMR(100MHz，CDCl3)δ11.7，14.6，20.7，21.5，27.9，35.5，42.2，43.4，63.3，71.3，73.3，79.9，81.5，90.5，94.5，127.6，127.7，128.2，138.0，154.0，166.2，202.9，210.0；IR(film，NaCl，cm-1)2977，1758，1697，1368，1248，1154；LRMS(ESI)C27H37O8Cl3Na[M+Na+]计算值617.1，实验值617.1；[α]23D＝-49.1(c＝0.9，CHCl3)。

9-苄氧基-3-羟基-4，4，6，8-四甲基-5-氧代-7-(2，2，2-三氯乙氧基羰基氧基)-壬酸叔丁酯。用(R)-RuBINAP催化剂(16.8mg，10.0pmol)装填容器衬里(bomb liner)。加入HCl(555μL，在甲醇中0.2N)，并将该混合物超声15sec。然后将原料(59.4mg，0.1mmol)的甲醇(555μL)溶液加入并将该混合物转移到Parr装置中。将该容器用H2清洗5min，然后加压至1200psi。17h后，反应回到大气压下并将其倾入饱和NaHCO3水溶液中。水层用EtOAc萃取三次。合并的有机萃取物经MgSO4干燥并在减压下浓缩。粗产物用急骤层析(梯度己烷至己烷/EtOAc 88∶12)纯化给出的产物(47.6mg，80％)为澄清油状物：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.06(d，J＝6.9Hz，3H)，1.11(d，J＝6.8Hz，3H)，1.14(s，3H)，1.18(s，3H)，1.47(s，9H)，2.05-2.12(m，1H)，2.35-2.40(m，1H)，3.31-3.37(m，2H)，3.51-3.54(m，2H)，4.11-4.14(m，1H)，4.46(s，2H)，4.72(d，J＝11.9Hz，1H)，4.80(d，J＝11.9Hz，1H)，5.05(dd，J＝5.0和6.7Hz，1H)，7.27-7.35(m，5H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ12.0，15.0，19.3，21.7，28.0，35.6，37.5，41.7，51.8，71.3，73.0，73.3，80.6，81.3，94.7，127.5，127.7，128.3，138.2，154.1，172.4，216；IR(film，NaCl，cm-1)3849，2974，2879，1758，1701，1454，1368，1248，1152，926，734；LRMS(ESI)C27H39O8Cl3Na[M+Na+]计算值619.1，实验值619.2；[α]23D＝-13.0(c＝0.4，CHCl3)。

9-苄氧基-4，4，6，8-四甲基-5-氧代-7-(2，2，2-三氯乙氧基羰基氧基)-3-(三乙基硅烷氧基)-壬酸叔丁酯。在0℃下向原料(37.6mg，6.3μmol)和咪唑(9.4mg，13.8μmol)的DMF(0.4mL)溶液中加入TESCl(11.6μl，69.3μmol)。3h后，用饱和NaHCO3水溶液稀释该混合物。水层用己烷萃取三次。合并的有机萃取物用盐水洗涤，经MgSO4干燥并在减压下浓缩。粗产物通过急骤层析(梯度己烷至己烷/EtOAc 93∶7)纯化，以洗脱顺序得到产物(22.9mg，51％)和回收的原料(12.9mg，34％)为澄清油状物：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ0.66(q，J＝7.9Hz，6H)，0.96(t，J＝7.9Hz，9H)，1.01(s，3H)，1.05(d，J＝5.2Hz，3H)，1.07(d，J＝5.3Hz，3H)，1.35(s，3H).1.44(s，9H)，2.05-2.11(m，2H)，2.50(dd，J＝3.5和17.2Hz，1H)，3.35(dd，J＝5.9和9.0Hz，1H)，3.49(dd，J＝4.0和9.0Hz，1H)，3.53(dd，J＝3.8和6.7Hz，1H)，4.18(dd，J＝3.5和6.5Hz，1H)，4.45(s，2H)，4.65(d，J＝11.9Hz，1H)，4.79(d，J＝11.9Hz，1H)，4.97(dd，J＝3.7和8.1Hz，1H)，7.29-7.52(m，5H)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ5.3，7.3，10.9，14.9，21.3，22.6，28.4，35.9，41.1，42.7，53.7，71.9，73.7，75.7，80.1，80.9，95.1，127.9，128.0，128.7，138.6，154.3，171.7，215.7；IR(film，NaCl，cm-1)2956，2876，1732，1694，1456，1366，1257，1154，1098，988，835，774，741；LRMS(ESI)C33H53O8SiCl3Na[M+Na+]计算值733.2，实验值733.3。[α]23D＝-16.1(c＝0.1，CHCl3)。

9-苄氧基-3-(二乙基甲基硅烷氧基)-7-羟基-4，4，6，8-四甲基-5-氧代-壬酸叔丁酯。向原料(22.9mg，3.2μmol)的1∶1THF/AcOH(1.4mL)溶液中加入Zn(5.0mg，7.8μmol，纳米级)。将该混合物超声15min。加入更多的Zn(5.0mg，7.8μmol，纳米级)，随后再超声15min。该悬浮液通过C盐垫过滤，用EtOAc洗涤数次。滤出液用饱和NaHCO3、盐水洗涤，经MgSO4干燥并在真空下浓缩。将粗残余物通过硅胶短塞，用己烷/EtOAc 4∶1洗脱，给出17.1mg(99％收率)的产物为无色油状物：1HNMR(400MHz，CDCl3)δ(m，6H)，0.96(t，J＝7.9Hz，9H)，0.97(d，J＝6.8Hz，3H)，1.05(d，J＝6.8Hz，3H)，1.11(s，3H)，1.26(s，3H)，1.44(s，9H)，1.84-1.90(m，1H)，2.21(dd，J＝6.7和17.0Hz，1H)，2.36(dd，J＝6.7和17.0Hz，1H)，3.24-3.29(m，1H)，3.44-3.52(m，2H)，3.67(dd，J＝3.9和8.9Hz，1H)，4.36(dd，J＝3.5和6.5Hz，1H)，4.50(d，J＝12.0Hz，1H)，4.54(d，J＝12.0Hz，1H)，7.32-7.36(m，5H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ5.0，6.9，9.7，13.9，20.2，21.8，28.0，36.3，40.8，41.5，53.7，72.5，72.9，73.2，73.6，80.7，127.4，127.5，128.2，138.6，171.0，221.4；IR(film，NaCl，cm-1)3502，2959，2875，1731，1683，1456，1366，1154，1098，996，739；LRMS(ESI)C30H52O6SiCl3Na[M+Na+]计算值559.3，实验值559.3；[α]23D＝-41.0(c＝0.4，CHCl3)。

9-苄氧基-7-(叔丁基二甲基硅烷氧基)-3-(二乙基甲基硅烷氧基)-4，4，6，8-四甲基-5-氧代-壬酸叔丁酯。在-78℃下向原料(4.1mg，7.6μmol)和2，6-二甲基吡啶(10.0μl，43.5mmol)的CH2Cl2(0.2mL)溶液中加入TBSOTf(10.0μl，85.8mmol)。2h后，加入更多的2，6-二甲基吡啶(10.0μl，43.5mmol)和TBSOTf(10.0μl，85.8mmol)。6h后将该混合物用饱和NaHCO3水溶液稀释。水层用EtOAc萃取三次。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，经MgSO4干燥并在减压下浓缩。粗产物用急骤层析(梯度己烷至己烷/EtOAc 91∶9)纯化给出的产物(5.4mg，82％)为澄清油状物。光谱数据很好地符合于已经报导的值。

将酸和醇与无水苯(5mL×2)共沸并在反应前于高真空下干燥。在0℃下向醇(639mg，2.63mmol)的CH2Cl2(13mL)溶液中加入EDCI(576mg，3.09mmol)和DMAP(366mg，3.09mmol)。在0℃下向该混合物中滴加酸(1.11g，相当于1.88mmol)的CH2C12(5mL+2mL冲洗)溶液16min以上。在0℃下搅拌1.5h后，将该混合物在室温下搅拌3.5h。将反应混合物浓缩后，残余物通过急骤柱层析(SiO2，己烷/EtOAc＝30∶1至20∶1)纯化给出的酯(1.20g，1.61mmol，由叔丁酯计86％)为无色油状物。

[α]D24-25.1(c 1.30，CHCl3)；IR(film)ν2955，2925，2872，1732，1696，1461，1378，1290，1243，1173，1091，985，873，773cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ0.06(3H，s)，0.06(3H，s)，0.58-0.66(6H，m)，0.92(9H，s)，0.95(9H，t，J＝8.0Hz)，1.02(3H，d，J＝6.5Hz)，1.03(3H，d，J＝6.5Hz)，1.07(3H，s)，1.21(3H，s)，1.67(3H，s)，2.07(3H，s)，2.05-2.12(1H，m)，2.30(1H，dd，J＝16.9，7.5Hz)，2.39(1H，dt，J＝14.8，6.7Hz)，2.49(1H，dd，J＝17.0，3.0Hz)，2.50(1H，dt，J＝14.8，6.7Hz)，2.70(3H，s)，2.74-2.30(2H，m)，3.07(1H，dd，J＝7.0Hz)，3.83(1H，dd，J＝7.1，2.0Hz)，4.35(1H，dd，J＝7.4，2.8Hz)，4.98-5.07(4H，m)，5.16(1H，brt，J＝7.0Hz)，5.23(1H，t，J＝6.9Hz)，5.74(1H，ddt，J＝16.7，10.2，6.5Hz)，5.91(1H，ddd，J＝17.8，10.5，7.8Hz)，6.50(1H，s)，6.95(1H，s)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ-3.7，-3.3，5.3(3C)，7.2(3C)，14.8，15.2，18.7，18.9，19.4，20.3，23.6，23.7，26.4(3C)，31.7，36.7，40.1，43.8，46.4，53.3，74.2，76.5，79.6，115.5，115.6，116.5，120.5，121.3，135.8，136.1，137.4，140.2，152.9，164.7，171.5，218.4；LRMS(ESI)C41H71NO5SSi2Na[M+Na+]计算值768.5，实验值768.5；HRMSC41H72NO5SSi2[M+H+]计算值746.4670，实验值746.4680。

将二烯(26.9mg，36.1μmol)的甲苯(70mL)溶液加热至回流并用Grubbs催化剂(3.1mg，3.61μmol)的甲苯(2mL)溶液处理。将该混合物搅拌25min，冷却至0℃，通过已用己烷/EtOAc＝2/1洗涤过的硅胶垫过滤。将合并的滤液浓缩并通过急骤柱层析(SiO2，己烷/Et2O＝40∶1至5∶1)纯化给出想要的产物(9.9mg，13.8μmol，38％)和环庚二烯(14.4mg，22.3μmol，62％)均为无色油状物。

[α]D25-41.5(c 0.715，CHCl3)；IR(film)ν2955，2884，1737，1690，1467，1378，1249，1179，1102，1014，979，879，826，773cm-1；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ0.08(3H，s)，0.12(3H，s)，0.57(6H，q，J＝7.8Hz)，0.89(9H，t，J＝8.0Hz)，0.93(9H，s)，1.04(3H，s)，1.06(3H，d，J＝7.1Hz)，1.12(3H，s)，1.17(3H，d，J＝7.1Hz)，1.68(3H，s)，2.15(3H，d，J＝0.8Hz)，2.14-2.27(2H，m)，2.45(1H，dd，J＝14.0，4.8Hz)，2.50(1H，dd，J＝14.9，3.2Hz)，2.64-2.74(2H，m)，2.72(3H，s)，3.02(1H，五重峰，J＝7.0Hz)，3.10(1H，dd，J＝14.4，7.3Hz)，3.96(1H，d，J＝8.7Hz)，4.43(1H，dd，J＝8.3，2.9Hz)，5.22(1H，dd，J＝9.8，5.7Hz)，5.33-5.42(2H，m)，5.69(1H，dd，J＝15.8，8.2Hz)，6.57(1H，s)，6.96(1H，s)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ-3.3，-3.2，5.6(3C)，7.1(3C)，15.0，17.2，18.8，19.4，21.4，21.7，23.8，24.3，26.5(3C)，33.2，35.6，41.3，41.8，48.2，54.0，74.4，77.4，79.3，116.4，120.5，121.0，129.3，132.1，137.8，138.0，152.7，164.8，170.7，216.8；LRMS(ESI)C39H68NO5SSi2[M+H+]计算值718.4，实验值718.3；HRMSC39H68NO5SSi2[M+H+]718.4357，实验值718.4355。

[α]D26-38.5(c 0.400，CHCl3)；IR(film)ν2955，2878，1741，1693，1472，1458，1385，1295，1253，1169，1098，988，871，837，775cm-1；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ0.07(6H，s)，0.61-0.68(6H，m)，0.93(9H，s)，0.97(9H，t，J＝8.0Hz)，1.03(3H，d，J＝7.0Hz)，1.04(3H，d，J＝7.0Hz)，1.10(3H，s)，1.21(3H，s)，1.65(3H，s)，1.75(3H，s)，2.06-2.14(1H，m)，2.31(1H，dd，J＝17.2，7.2Hz)，2.34-2.51(2H，m)，2.49(1H，dd，J＝17.1，2.8Hz)，2.65-2.81(2H，m)，3.07(1H，五重峰，J＝7.0Hz)，3.84(1H，dd，J＝7.2，2.1Hz)，4.40(1H，dd，J＝7.2，2.8Hz)，4.98-5.09(2H，m)，5.38-5.42(1H，m)，5.65(1H，t，J＝5.9Hz)，5.93(1H，ddd，J＝17.9，10.1，7.8Hz)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ-3.6，-3.3，5.4(3C)，7.3(3C)，15.3，18.7，19.0，20.0，22.1，23.8，25.8，26.4(3C)，31.3，32.3，40.0，43.8，46.3，54.0，72.5，73.8，76.5，115.6，119.8，125.6，136.5，140.1，140.6，171.9，218.5；LRMS(ESI)C35H64O5Si2Na[M+Na+]计算值643.4，实验值643.3；HRMSC35H64O5Si2Na[M+Na+]计算值643.4190，实验值643.4219。

经过Wittig反应：在0℃下向Wittig试剂(19.1mg，54.7μmol)的THF(0.4mL)溶液中加入KHMDS(109μl 0.5M的甲苯溶液，54.7μmol)。将该混合物在0℃下搅拌0.5h然后冷却至-78℃。向该混合物中滴加酮(5.7mg，9.12μmol)的THF(0.3mL)溶液，将得到的混合物在1.5h温热至-20℃。用饱和NH4Cl水溶液(2mL)淬灭该反应并用EtOAc萃取(7mL×3)。合并的有机层经Na2SO4干燥并浓缩。残余物通过急骤柱层析(SiO2，己烷/Et2O＝10∶1)纯化给出5.6mg的不可分开的烯混合物(E/Z＝9∶1)。将该混合物通过制备TLC(己烷/Et2O＝4∶1)纯化给出纯的想要的异构体(5.0mg，6.96μmol，76％)为无色油状物。

1H NMR(400MHz，CDCl3)δ0.08(3H，s)，0.12(3H，s)，0.51(6H，q，J＝7.9Hz)，0.86(9H，t，J＝7.9Hz)，0.97(9H，s)，1.01(3H，s)，1.06(3H，d，J＝7.1Hz)，1.12(3H，s)，1.18(3H，d，J＝7.1Hz)，1.69(3H，s)，1.97(3H，s)，2.10-2.18(1H，m)，2.24-2.31(1H，m)，2.38-2.59(3H，m)，2.68-2.78(1H，m)，2.72(3H，s)，2.98-3.14(2H，m)，3.97(1H，d，J＝9.0Hz)，4.45-4.48(1H，m)，5.29-5.41(2H，m)，5.73(1H，dd，J＝15.6，8.3Hz)，6.30(1H，s)，6.73(1H，d，J＝8.7Hz)，6.56(1H，s)；LRMS(ESI)C39H68NO5SSi2[M+H+]计算值718.4，实验值718.1。

在0℃下向在塑料管中的甲硅烷基醚(298.8mg，0.416mmol)的THF(6.5mL)溶液中加入HF·吡啶(3.2mL)，将该混合物在室温下搅拌3h。在0℃下滴加TMSOMe(30mL)淬灭反应，将该混合物在室温下搅拌3h。浓缩后在高真空下干燥，残余物用急骤柱层析(SiO2，己烷/Et2O＝1∶1)纯化给出醇(196.6mg，0.402mmol，97％)为无色固体。

[α]D25-96.6(c 0.235，CHCl3)；IR(film)ν3502，2970，2927，1733，1685，1506，1456，1375，1251，1152，1040，977cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.06(3H，s)，1.11(3H，d，J＝7.0Hz)，1.22(3H，d，J＝6.8Hz)，1.28(3H，s)，1.72(3H，s)，2.10(3H，s)，2.31-2.40(2H，m)，2.43(1H，dd，J＝16.0，3.7Hz)，2.49(1H，dd，J＝16.0，9.2Hz)，2.55-2.68(2H，m)，2.71(3H，s)，2.98(1H，dd，J＝14.4，6.4Hz)，3.16(1H，五重峰，J＝6.2Hz)，3.76(1H，dd，J＝5.9，3.2Hz)，4.30(1H，dd，J＝9.2，3.7Hz)，5.18(1H，brt，J＝7.3Hz)，5.32(1H，dd，J＝8.4，2.5Hz)，5.63(1H，dd，J＝15.7，6.4Hz)，5.60(1H，ddd，J＝15.7，6.9，5.1Hz)，6.60(1H，s)，6.98(1H，s)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ15.1，16.0，17.7，19.2，19.5，22.5，23.6，32.0，35.0，39.6，40.3，44.8，53.3，71.8，75.6，78.3，116.1，119.6，120.5，129.9，131.3，137.5，138.2，152.2，165.0，170.7，218.8；LRMS(ESI)C27H40NO5S[M+H+]计算值490.3，实验值490.2；HRMS C27H40NO5S[M+H+]计算值490.2627，实验值490.2602。

在50℃下向烯(1.2mg，2.5μmol)和TrisNHNH2(29.3mg，98μmol)的ClCH2CH2Cl(0.7mL)溶液中加入Et3N(13.7μL，98μmol)。反应由HPTLC监控(己烷/EtOAc/CH2Cl2＝1/1/2)。搅拌7h后，将该混合物冷却至室温，用EtOAc稀释并通过用EtOAc冲洗过的硅胶垫过滤。浓缩后，残余物通过制备TLC(己烷/EtOAc/CH2Cl2＝1/1/2)纯化给出还原的产物(1.1mg，2.2μmol，91％)为白色固体。该化合物的光谱数据与已报导的dEpoB的光谱相同。

将酸和醇与无水苯(5mL×2)共沸并于反应前在高真空下干燥。在0℃下向醇(10∶1异构体的混合物，240mg，0.756mmol)的CH2Cl2(5mL)溶液中加入EDCI(192.7mg，1.01mmol)和DMAP(122.8mg，1.01mmol)。在0℃下于15min内向混合物中滴加酸(314.6mg，0.628mmol)的CH2Cl2(2mL+1mL冲洗)溶液。在0℃下搅拌2h后，将该混合物在室温下搅拌2h。浓缩后，小心地将残余物用急骤柱层析(SiO2，己烷/EtOAc＝20∶1至15∶1)纯化给出酯(340.1mg，0.425mmol，基于酸计68％)为无色油状物。

[α]D24-27.5(c 0.28，CHCl3)；IR(film)ν2956，2878，1740，1692，1472，1378，1317，1253，1174，1118，988，915，872，837，775cm-1；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ0.06(6H，s)，0.57-0.65(6H，m)，0.92(9H，s)，0.94(9H，t，J＝7.9Hz)，1.02(3H，d，J＝6.9Hz)，1.03(3H，d，J＝6.8Hz)，1.07(3H，s)，1.22(3H，s)，2.07-2.10(1H，m)，2.09(3H，s)，2.31(1H，dd，J＝16.9，7.3Hz)，2.51(1H，dd，J＝16.8，3.0Hz)，2.49-2.65(2H，m)，2.71(3H，s)，2.96-2.99(2H，m)，3.06(1H，五重峰，J＝7.1Hz)，3.83(1H，dd，J＝7.3，2.1Hz)，4.35(1H，dd，J＝7.2，3.0Hz)，4.98-5.12(4H，m)，5.30(1H，t，J＝6.7Hz)，5.76(1H，ddt，J＝16.7，10.2，6.2Hz)，5.92(1H，ddd，J＝17.8，9.9，7.8Hz)，6.19(1H，t，J＝7.0Hz)，6.51(1H，s)，6.97(1H，s)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ-3.7，-3.4，5.2(3C)，7.1(3C)，14.7，15.2，18.6，18.9，19.3，19.9，23.8，26.3(3C)，30.1，31.2，40.0，43.7，46.3，53.3，73.9，76.5，77.9，115.5，116.5，117.0，121.5，124.1[q，1J(C，F)＝273.4Hz]，129.6[q，2J(C，F)＝28.5Hz]，130.5[q，3J(C，F)＝6.1Hz]，133.6，136.3，140.1，152.4，164.8，171.3，218.3；LRMS(ESI)C41H68F3NO5SSi2Na[M+Na+]计算值822.4，实验值822.4；HRMS C41H69F3NO5SSi2[M+H+]计算值800.4387，实验值800.4374。

将双烯(57.6mg，72.0μmol)的甲苯(142mL)溶液加热至回流并用Grubbs催化剂(6.1mg，7.20μmol)的甲苯(2mL)溶液处理。将该混合物搅拌28min，冷却至0℃，通过用己烷/EtOAc＝2/1(300mL)冲洗过的硅胶垫过滤。将合并的滤液浓缩并通过急骤柱层析(SiO2，己烷/Et2O＝40∶1至15∶2)纯化给出想要的产物(12.0mg，15.5μmol，22％)和环庚二烯(29.2mg，43.3μmol，60％)均为无色油状物。

[α]D26-17.1(c 0.14，CHCl3)；IR(film)ν2955，2884，1743，1690，1472，1320，1173，1114，1038，1008，873，832，773cm-1；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ0.09(3H，s)，0.12(3H，s)，0.55(6H，q，J＝7.7Hz)，0.88(9H，t，J＝8.0Hz)，0.96(9H，s)，1.01(3H，s)，1.06(3H，d，J＝7.1Hz)，1.12(3H，s)，1.20(3H，d，J＝7.1Hz)，2.07-2.17(1H，m)，2.19(3H，s)，2.38(1H，dd，J＝14.3，3.5Hz)，2.39-2.49(1H，m)，2.50(1H，dd，J＝14.3，7.3Hz)，2.73(3H，s)，2.77-2.91(2H，m)，2.96-3.09(2H，m)，3.98(1H，dd，J＝8.9Hz)，4.54(1H，dd，J＝7.3，3.4Hz)，5.28-5.38(1H，m)，5.63(1H，dd，J＝9.6，2.3Hz)，5.77(1H，dd，J＝15.9，8.5Hz)，6.21-6.28(1H，m)，6.60(1H，s)，6.99(1H，s)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ-3.4，-3.3，5.5(3C)，7.0(3C)，14.6，17.1，18.7，19.4，19.9，21.3，24.8，26.4(3C)，29.6，32.8，42.0，42.1，48.2，54.1，73.4，76.9，77.8，117.0，121.6，124.3[q，1J(C，F)＝273.5Hz]，127.2，130.6[q，2J(C，F)＝28.2Hz]，130.8[q，3J(C，F)＝6.1Hz]，133.2，136.5，152.3，165.0，170.1，217.1；LRMS(ESI)C39H65F3NO5SSi2[M+H+]计算值772.4，实验值772.4；HRMS C39H65F3NO5SSi2[M+H+]计算值772.4074，实验值772.4102。

[α]D26-35.6(c 0.365，CHCl3)；IR(film)ν2956，2878，1737，1693，1472，1458，1305，1279，1252，1173，1116，988，871，775cm-1；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ0.08(6H，s)，0.64(6H，q，J＝7.8Hz)，0.93(9H，s)，0.96(9H，t，J＝7.8Hz)，1.04(6H，d，J＝7.0Hz)，1.10(3H，s)，1.22(3H，s)，1.70(3H，s)，2.05-2.14(1H，m)，2.32(1H，dd，J＝17.0，7.1Hz)，2.50(1H，dd，J＝17.0，3.0Hz)，2.51-2.63(2H，m)，2.87(1H，dd，J＝18.4，6.7Hz)，2.90-3.02(1H，m)，3.07(1H，五重峰，J＝7.1Hz)，3.85(1H，dd，J＝7.2，2.0Hz)，4.39(1H，dd，J＝7.1，2.9Hz)，4.98-5.08(2H，m)，5.51(1H，dd，J＝8.1，3.8Hz)，5.67(1H，t，J＝5.9Hz)，5.93(1H，ddd，J＝17.8，10.5，7.8Hz)，6.29(1H，t，J＝5.5Hz)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ-3.7，-3.4，5.3(3C)，7.1(3C)，15.3，18.7，18.9，19.6，21.3，23.9，24.1，26.3(3C)，30.3，40.0，43.7，46.3，53.4，70.9，73.7，76.5，115.5，123.4，123.8[q，1J(C，F)＝272.2Hz]，129.1[q，3J(C，F)＝6.1Hz]，131.5[q，2J(C，F)＝28.8Hz]，138.1，140.0，171.7，218.5；LRMS(ESI)C35H61F3O5Si2Na[M+Na+]计算值697.4，实验值697.4；HRMS C35H61F3O5Si2Na[M+Na+]计算值697.3907，实验值697.3892。

在0℃下向在塑料管中的甲硅烷基醚(1.78g，2.31mmol)的THF(25mL)溶液中缓慢加入HF·吡啶(12.5mL)，将该混合物在室温下搅拌4h。在0℃下于10min内用滴加TMSOMe(80mL)淬灭反应。在室温下剧烈搅拌该混合物2.5h。浓缩并在高真空干燥2h后，将残余物通过急骤柱层析(SiO2～50g，己烷/EtOAc＝1∶1)纯化，给出二醇(1.20g，2.21mmol，96％)为无色固体。

[α]D25-54.6(c 0.28，CHCl3)；IR(film)ν3478，2974，2929，1736，1689，1449，1381，1318，1247，1169，1113，1039，983，867，736cm-1；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ1.05(3H，s)，1.12(3H，d，J＝7.0Hz)，1.23(3H，d，J＝6.8Hz)，1.37(3H，s)，2.04(1H，brd，J＝3.8Hz，-OH)，2.12(3H，s)，2.25-2.33(1H，m)，2.38(1H，dd，J＝15.3，3.0Hz)，2.48(1H，dd，J＝15.4，9.8Hz)，2.54-2.61(1H，m)，2.66-2.76(1H，m)，2.71(3H，s)，2.96(1H，dd，J＝16.5，4.5Hz)，3.02(1H，dd，J＝16.3，6.5Hz)，3.11(1H，五重峰，J＝6.7Hz)，3.19(1H，brs，＝OH)，3.74(1H，brs)，4.35(1H，brd，J＝9.5Hz)，5.42(1H，dd，J＝6.2，4.1Hz)，5.60(1H，ddd，J＝15.8，5.6，4.5Hz)，5.66(1H，dd，J＝15.8，5.8Hz)，6.24(1H，t，J＝7.2Hz)，6.64(1H，s)，7.00(1H，s)；13CNMR(100MHz，CDCl3)δ15.1，16.1，17.7，18.5，19.3，22.5，28.8，31.1，39.6，39.7，45.0，53.7，71.4，75.3，76.8，116.7，120.2，124.3[q，1J(C，F)＝273.4Hz]，127.9，130.2[q，3J(C，F)＝6.0Hz]，130.6[q，2J(C，F)＝28.4Hz]，132.5，136.7，152.0，165.4，170.2，218.4；LRMS(ESI)C27H37F3NO5S[M+H+]计算值544.2，实验值544.1；HRMS C27H37F3NO5S[M+H+]计算值544.2345，实验值544.2346。

在50℃下向二醇(1.22mg，2.24μmol)和TrisNHNH2(26.7mg，89.6μmol)的ClCH2CH2Cl(1mL)溶液中加入Et3N(12.5μL，89.6μmol)。反应由HPTLC监控(己烷/EtOAc/CH2Cl2＝1/1/2)。搅拌6.5h后，向混合物中再加入TrisNHNH2(26.7mg，89.6μmol)和Et3N(12.5μL，89.6μmol)。搅拌14h后，将该混合物冷却至室温，用EtOAc稀释并通过用EtOAc冲洗过的硅胶垫过滤。浓缩后，残余物用制备TLC(己烷/EtOAc/CH2Cl2＝1/1/2)纯化给出还原的产物(1.16mg，2.13μmol，94％)为白色固体。

[α]D24-75.1(c 0.35，CHCl3)；IR(film)ν3483，2968，1337，1685，1466，1381，1322，1247，1168，1113，1010，833，736cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.03(3H，d，J＝7.0Hz)，1.08(3H，s)，1.19(3H，d，J＝6.8Hz)，1.25-1.35(2H，m)，1.37(3H，s)，1.42-1.55(2H，m)，1.65-1.82(2H，m)，2.10(3H，d，J＝0.8Hz)，2.21-2.47(2H，m)，2.27(1H，dd，J＝14.2，2.6Hz)，2.48(1H，dd，J＝14.3，10.8Hz)，2.70(3H，s)，2.70-2.28(1H，m)，3.02(1H，d，J＝2.0Hz，-OH)，3.19(1H，qd，J＝6.9，2.2Hz)，3.65(1H，d，J＝6.2Hz，-OH)，3.69-3.72(1H，m)，4.34(1H，ddd，J＝10.8，6.2，2.6Hz)，5.28(1H，dd，J＝10.2，2.2Hz)，6.12(1H，dd，J＝10.2，5.2Hz)，6.61(1H，s)，6.98(1H，s)；13CNMR(100MHz，CDCl3)δ13.0，15.9，16.0，17.7，19.1，23.0，25.6，26.2，31.3，32.3，37.4，39.8，41.6，53.9，72.3，73.6，77.7，116.2，119.9，124.3[q，1J(C，F)＝274.4Hz]，129.8[q，3J(C，F)＝6.1Hz]，132.6[q，2J(C，F)＝27.8Hz]，138.3，151.7，165.4，170.2，220.7；LRMS(ESI)C27H39F3NO5S[M+H+]计算值546.3，实验值546.2；HRMS C27H39F3NO5S[M+H+]计算值546.2501，实验值544.2496。

将酸和醇与无水苯(3mL×2)共沸并于反应前在高真空下干燥。在0℃下向醇(68.0mg，0.173mmol)的CH2Cl2(1.3mL)溶液中加入EDCI(37.8mg，0.197mmol)和DMAP(24.1mg，0.197mmol)。在0℃下于5min内向混合物中滴加酸(72.6mg，0.123mmol)的CH2Cl2(0.7mL)溶液。在0℃下搅拌1h后，将该混合物在室温下搅拌2.5h。浓缩后，将残余物用急骤柱层析(SiO2，己烷/EtOAc＝30∶1)纯化给出酯(99.5mg，0.114mmol，由叔丁酯计92％)为无色油状物。

[α]D25-23.4(c 0.56，CHCl3)；IR(film)ν2955，2931，2880，1735，1696，1506，1472，1386，1362，1294，1254，1174，1104，988，878，776，742cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ0.06(3H，s)，0.06(3H，s)，0.14(6H，s)，0.63(6H，q，J＝8.0Hz)，0.92(9H，s)，0.94(9H，t，J＝8.0Hz)，0.97(9H，s)，1.02(3H，d，J＝6.6Hz)，1.05(3H，d，J＝6.5Hz)，1.07(3H，s)，1.21(3H，s)，1.67(3H，s)，2.06(3H，d，J＝0.8Hz)，2.05-2.14(1H，m)，2.30(1H，dd，J＝16.9，7.5Hz)，2.33-2.53(2H，m)，2.50(1H，dd，J＝16.9，2.7Hz)，2.76-2.80(2H，m)，3.07(1H，五重峰，J＝7.0Hz)，3.83(1H，dd，J＝7.0，2.2Hz)，4.35(1H，dd，J＝7.4，2.8Hz)，4.97(2H，s)，4.97-5.07(4H，m)，5.16(1H，t，J＝7.2Hz)，5.24(1H，t，J＝6.9Hz)，5.74(1H，ddt，J＝16.6，10.0，6.5Hz)，5.91(1H，ddd，J＝17.6，9.9，7.7Hz)，6.50(1H，s)，7.06(1H，s)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ-5.2(2C)，-3.7，-3.3，5.3(3C)，7.2(3C)，14.7，15.2，18.5，18.7，18.9，20.3，23.6，23.7，26.0(3C)，26.4(3C)，31.7，36.7，40.1，43.8，46.4，53.3，63.4，74.2，76.5，79.6，115.5，115.6，116.6，120.5，121.3，135.8，136.1，137.4，140.1，153.0，171.5，172.2，218.4；LRMS(ESI)C47H86NO6SSi3[M+H+]计算值876.6，实验值876.5；HRMS C47H86NO6SSi3[M+H+]计算值876.5484，实验值876.5482。

将双烯(69.7mg，79.5μmol)的甲苯(158mL)溶液加热至回流并用Grubbs催化剂(6.7mg，7.95μmol)的甲苯(2mL)溶液处理。将该混合物搅拌11min，冷却至0℃，通过用己烷/EtOAc＝3/1(280mL)冲洗过的硅胶垫过滤。将合并的滤液浓缩并通过急骤柱层析(SiO2，己烷/Et2O＝20∶1至15∶1)纯化给出想要的产物(18.4mg，21.7μmol，27％)和环庚二烯(28.3mg，45.5μmol，57％)均为无色油状物。

[α]D24-40.4(c 0.26，CHCl3)；IR(film)ν2955，2930，2879，1740，1694，1472，1387，1362，1253，1200，1107，1007，838，776，742cm-1；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ0.08(3H，s)，0.12(3H，s)，0.15(6H，s)，0.57(6H，q，J＝7.9Hz)，0.88(9H，t，J＝8.0Hz)，0.95(9H，s)，0.97(9H，s)，1.04(3H，s)，1.06(3H，d，J＝7.1Hz)，1.12(3H，s)，1.17(3H，d，J＝7.0Hz)，1.69(3H，s)，2.06-2.30(2H，m)，2.14(3H，s)，2.45(1H，dd，J＝15.6，3.6Hz)，2.50(1H，dd，J＝14.9，3.1Hz)，2.63-2.75(2H，m)，2.97-3.06(1H，m)，3.10(1H，dd，J＝14.6，7.7Hz)，3.97(1H，d，J＝8.5Hz)，4.44(1H，dd，J＝8.4，2.9Hz)，4.97(2H，s)，5.22(1H，dd，J＝8.7，5.2Hz)，5.33-5.44(2H，m)，5.70(1H，dd，J＝15.6，8.1Hz)，6.57(1H，s)，7.07(1H，s)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ-5.2，-3.3，-3.2，5.6，7.2，7.3，15.0，17.2，18.5，18.8，21.4，23.9，24.4，26.0，26.5，33.3，35.6，41.4，41.8，48.2，54.0，63.5，74.4，78.1，79.3，116.6，120.6，121.0，129.3，132.1，137.8，137.9，153.0，170.7，172.3，216.8；LRMS(ESI)C45H82NO6SSi3[M+H+]计算值848.5，实验值848.5；HRMS(ESI)C45H82NO6SSi3[M+H+]计算值848.5171，实验值848.516l。

在0℃下向在塑料管中的甲硅烷基醚(61.8mg，72.8μmol)的THF(2mL)溶液中加入HF·吡啶(1mL)，将该混合物在室温下搅拌3.2h。在0℃下滴加TMSOMe(15mL)淬灭反应。在室温下搅拌该混合物2h。浓缩并在高真空干燥后，将残余物通过急骤柱层析(SiO2，己烷/EtOAc＝1∶3)纯化，给出三醇(32.4mg，64.1μmol，88％)为白色固体。

[α]D25-108.4(c 0.285，CHCl3)；IR(film)ν3422，2968，2919，2729，1689，1449，1377，1252，1152，1064，978cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.05(3H，s)，1.12(3H，d，J＝6.9Hz)，1.22(3H，d，J＝6.8Hz)，1.32(3H，s)，1.72(3H，s)，2.08(3H，s)，2.31-2.40(3H，m)，2.43(1H，dd，J＝15.5，3.5Hz)，2.49(1H，dd，J＝15.5，9.5Hz)，2.55-2.67(2H，m)，2.95(1H，dd，J＝14.6，6.3Hz)，3.13(1H，五重峰，J＝6.6Hz)，3.34(1H，brs，-OH)，3.75(1H，dd，J＝6.6，2.4Hz)，4.06(1H，brs，-OH)，4.33(1H，dd，J＝9.4，3.0Hz)，4.92(2H，s)，5.18(1H，t，J＝6.9Hz)，5.33(1H，dd，J＝8.0，2.5Hz)，5.52(1H，dd，J＝15.8，6.4Hz)，5.59(1H，ddd，J＝15.8，6.6，5.0Hz)，6.63(1H，s)，7.13(1H，s)；13CNMR(100MHz，CDCl3)δ15.3，16.3，17.8，19.2，22.8，23.7，31.9，35.1，39.7，40.2，45.0，53.4，61.8，71.7，75.8，78.1，116.7，119.0，120.5，130.0，131.2，137.6，138.9，152.5，170.0，170.7，218.7；LRMS(ESI)C27H39NO6SNa[M+Na+]计算值528.2，实验值528.0；HRMS C27H40NO6S[M+H+]计算值506.2576，实验值506.2552。

将粗酸(4.65g，相当于7.27mmol)和醇(2.18g，9.84mmol)与无水苯共沸，然后在反应前高真空下干燥20min。在0℃下向醇(2.18g，9.84mmol)的CH2Cl2(65mL)溶液中加入EDCI(2.09g，10.9mmol)和DMAP(1.33g，10.9mmol)。在0℃下于20min内向混合物中滴加粗酸(4.65g，相当于7.27mmol)的CH2Cl2(20mL+5mL冲洗)溶液。在0℃下搅拌40min后，将该混合物在室温下搅拌4h。浓缩后，将残余物用急骤柱层析(SiO2～160g，己烷/EtOAc＝20∶1)纯化给出酯(4.85mg，6.87mmol，从叔丁酯计94％)为无色油状物。

[α]D25-22.7(c 0.26，CHCl3)；IR(film)ν2958，2936，2800，1748，1732，1693，1473，1416，1360，1317，1296，1254，1174，1119，989，916，872，838，776cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ0.08(3H，s)，0.08(3H，s)，0.60(6H，q，J＝7.8Hz)，0.93(9H，s)，0.94(9H，t，J＝8.0Hz)，1.04(3H，d，J＝7.0Hz)，1.04(3H，d，J＝7.0Hz)，1.11(3H，s)，1.23(3H，s)，2.05-2.14(1H，m)，2.17(3H，s)，2.40(1H，dd，J＝16.9，7.0Hz)，2.59(1H，dd，J＝17.0，3.6Hz)，2.56-2.64(2H，m)，2.90-3.01(2H，m)，3.06(1H，五重峰，J＝7.0Hz)，3.85(1H，dd，J＝7.3，2.0Hz)，4.38(1H，d，J＝7.0，3.4Hz)，4.97-5.14(5H，m)，5.75(1H，ddt，J＝16.0，9.9，6.2Hz)，5.92(1H，ddd，J＝17.8，10.5，7.8Hz)，6.21(1H，td，J＝7.2，1.5Hz)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ-3.7，-3.4，5.2(3C)，7.1(3C)，15.4，18.7，18.9，19.5，23.9，26.3(3C)，26.6，28.5，30.0，39.8，43.7，46.3，53.3，73.6，76.5，77.1，115.6，117.8，124.0[q，1J(C，F)＝273.5Hz]，129.2[q，3J(C，F)＝6.1Hz]，130.6[q，2J(C，F)＝28.7Hz]，133.4，140.0，171.8，204.6，218.4；LRMS(ESI)C36H63F3O6Si2Na[M+Na+]计算值727.4，实验值727.3；HRMS C36H64F3O6Si2[M+H+]计算值705.4194，实验值705.4193。

将双烯(510.0mg，0.723mmol)的甲苯(500mL)溶液加热至回流并用Grubbs催化剂(92.1mg，0.109mmol)的甲苯(10mL)溶液处理。将该混合物在回流状态下搅拌17min并立即冷却至0℃并在通过硅胶垫过滤前保持在0℃。同时第二批双烯(510.0mg，0.723mmol)同样处理。合并的反应混合物通过用己烷/EtOAc＝3/1(1.4L)冲洗过的硅胶垫(100g)过滤。将合并的滤液浓缩并通过急骤柱层析(SiO2～65g，己烷/Et2O＝10∶1至5∶1)纯化给出大环内酯物(742.4mg，1.10mmol，76％)为无色无定形油状物。

[α]D25-7.5(c 0.12，CHCl3)；IR(film)ν2956，2979，1748，1732，1695，1472，1415，1384，1252，1170，1119，1018，986，876，835cm-1；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ0.08(3H，s)，0.10(3H，s)，0.60(6H，q，J＝7.8Hz)，0.93(9H，s)，0.94(9H，t，J＝7.8Hz)，1.03(3H，d，J＝7.1Hz)，1.08(3H，s)，1.13(3H，d，J＝7.0Hz)，1.17(3H，s)，2.26(3H，s)，2.25-2.34(1H，m)，2.64(1H，dd，J＝15.5，5.0Hz)，2.68-2.75(2H，m)，2.76(1H，dd，J＝15.6，6.4Hz)，2.85(1H，dd，J＝15.6，5.7Hz)，2.97(1H，dq，J＝8.3，6.9Hz)，3.04(1H，dd，J＝15.6，6.3Hz)，3.92(1H，dd，J＝8.3，1.2Hz)，4.36(1H，t，J＝5.3Hz)，5.30-5.39(2H，m)，5.58(1H，dd，J＝15.5，8.0Hz)，6.13(1H，brt，J＝7.2Hz)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ-3.6，-3.6，5.4(3C)，7.0(3C)，17.5，18.5，19.0，21.6，23.5，26.3(3C)，26.5，28.6，29.1，41.0，42.3，47.3，54.1，74.2，76.8，77.7，124.0[q，1J(C，F)＝273.7Hz]，126.0，128.7[q，3J(C，F)＝5.9Hz]，132.2[q，2J(C，F)＝28.1Hz]，133.8，170.5，204.1，216.1；LRMS(ESI)C34H59F3O6Si2Na[M+Na+]计算值699.4，实验值699.4；HRMS C34H60F3O6Si2[M+H+]计算值677.3881，实验值677.3892。

经过Wittig反应：将酮与苯(5mL×2)共沸然后在高真空下干燥0.5h。在0℃下于5min内向Wittig盐(907mg，2.59mmol)的THF(19mL)溶液中滴加t-BuOK(2.4mL的1.0M的THF溶液，2.43mmol)。在0℃下将该混合物搅拌0.5h然后冷却至-78℃。于10min内向该混合物中滴加酮(1.10g，1.62mmol)的THF(13mL)溶液，将得到的混合物于2h内温热至-20℃。用饱和NH4Cl水溶液(15mL)淬灭该反应并用EtOAc萃取(50mL×3)。合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。残余物用急骤柱层析(SiO2，己烷/Et2O＝20∶1至10∶1)纯化给出想要的16(E)-异构体(940mg，1.22mmol，75％)和不想要的16(Z)-异构体(140.9mg，0.182mmol，11％)均为无色无定形油状物。

[α]D2562.7(c 0.33，CHCl3)；IR(film)ν2955，2878，1743，1692，1472，1379，1320，1253，1169，1114，1007，956，877，835，775cm-1；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ0.09(3H，s)，0.13(3H，s)，0.49(6H，q，J＝7.8Hz)，0.85(9H，t，J＝7.8Hz)，0.97(9H，s)，0.99(3H，s)，1.06(3H，d，J＝7.1Hz)，1.11(3H，s)，1.20(3H，d，J＝7.1Hz)，2.00(3H，s)，2.03-2.13(1H，m)，2.35(1H，dd，J＝14.3，3.0Hz)，2.46(1H，dd，J＝14.3，7.8Hz)，2.41-2.50(1H，m)，2.73(3H，s)，2.71-2.90(2H，m)，2.98-3.12(2H，m)，3.99(1H，d，J＝9.2Hz)，4.56(1H，dd，J＝7.7，2.8Hz)，5.33(1H，ddd，J＝15.6，8.9，4.1Hz)，5.82(1H，dd，J＝15.6，8.4Hz)，6.29(1H，s)，6.33-6.40(1H，m)，6.94(1H，m)，7.09(1H，brd，J＝8.4Hz)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ-3.2，-3.2，5.5(3C)，7.0(3C)，17.2，18.7，19.3，19.6，20.0，22.3，24.9，26.4(3C)，29.7，32.9，41.9，42.0，48.6，54.0，72.2，73.3，77.0，116.7，120.7，124.5[q，1J(C，F)＝273.3Hz]，127.9，129.7[q，2J(C，F)＝28.0Hz]，131.9[q，3J(C，F)＝6.1Hz]，132.9，136.6，152.1，165.4，170.2，217.4；LRMS(ESI)C39H65F3NO5SSi2[M+H+]计算值772.4，实验值772.4；HRMS C39H65F3NO5SSi2[M+H+]计算值772.4074，实验值772.4044。

将deH-dEpoB(12.2mg，24.9μmol)的CH2Cl2(1.25mL)溶液冷却至-78℃并用冷却的DMDO溶液(-78℃，丙酮中0.06M，914μl，54.8μmol)处理。将该混合物温热至-50℃并在-50℃下搅拌2.7h。过量的DMDO通过在-50℃下加入二甲硫(117μl)而淬灭，并且将该混合物在此温度下搅拌0.5h。真空下除去溶剂。用制备薄层色谱(己烷/EtOAc＝1/2)纯化给出β-环氧化物(3.0mg，5.93μmol，24％)和α-环氧化物(7.9mg，15.6μmol，63％)，均为无色固体。

[α]D25-78.5(c 0.33，CHCl3)；IR(film)ν3454，2974，2928，1734，1689，1450，1379，1250，1152，1061，978，735cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.03(3H，s)，1.11(3H，d，J＝7.0Hz)，1.14(3H，d，J＝6.9Hz)，1.34(3H，s)，1.36(3H，s)，2.00(1H，ddd，J＝15.1，7.3，4.0Hz)，2.14(1H，dt，J＝15.1，5.2Hz)，2.14(3H，s)，2.21(1H，dd，J＝14.6，8.0Hz)，2.33(1H，dd，J＝14.7，4.8Hz)，2.47(1H，dd，J＝13.8，3.3Hz)，2.59(1H，dd，J＝13.8，9.4Hz)，2.73(3H，s)，2.77(1H，brs，OH)，2.93(1H，dd，J＝7.3，4.8Hz)，3.34(1H，qd，J＝6.9，3.8Hz)，3.75-3.82(1H，m)，4.12-4.24(2H，m，包含OH)，5.54(1H，ddd，J＝15.7，7.4，5.0Hz)，5.54-5.60(1H，m)，5.64(1H，dd，J＝15.7，5.6Hz)，6.94(1H，s)，7.01(1H，s)；1H NMR(500MHz，CD2Cl2)δ0.91(3H，s)，1.01(3H，d，J＝6.9Hz)，1.03(3H，d，J＝6.9Hz)，1.22(3H，s)，1.27(3H，s)，1.96-2.02(1H，m)，2.04(3H，d，J＝0.7Hz)，2.16-2.23(2H，m)，2.33(1H，dd，J＝14.2，3.1Hz)，2.30-2.35(1H，m)，2.44(1H，dd，J＝14.4，10.3Hz)，2.69(3H，s)，2.77(1H，t，J＝5.9Hz)，3.24(1H，qd，J＝6.9，4.5Hz)，3.63(1H，t，J＝4.1Hz)，4.18-4.26(1H，m)，5.37(1H，t，J＝4.5Hz)，5.48(1H，dtd，J＝15.7，6.7，0.5Hz)，5.58(1H，dd，J＝15.7，6.2Hz)，6.58(1H，s)，7.00(1H，s)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ14.4，16.3(2C)，19.3，19.7，21.6，22.6，31.8，35.9，38.7，39.6，44.1，52.8，60.8，61.8，74.0，75.7，75.9，116.5，119.6，124.3，135.8，136.2，152.1，165.2，170.8，221.5；LRMS C27H40NO6S[M+H+]计算值506.3，实验值506.3；HRMS(ESI)C27H40NO6S[M+H+]计算值506.2576，实验值506.2566。

[α]D25-53.9(c 0.700，CHCl3)；IR(film)ν3460，2976，2928，1735，1688，1506，1451，1378，1252，1186，1151，1087，1042，976，879，735cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.00(3H，s)，1.04(3H，d，J＝6.9Hz)，1.12(3H，d，J＝7.0Hz)，1.35(3H，s)，1.35(3H，s)，1.87(1H，dt，J＝15.0，9.2Hz)，2.03(1H，dd，J＝13.9，9.2Hz)，2.13(3H，s)，2.13-2.19(1H，m)，2.36(1H，dd，J＝13.9，3.4Hz)，2.39(1H，dd，J＝12.2，2.1Hz)，2.42-2.51(1H，m)，2.49(1H，dd，J＝12.4，10.9Hz)，2.69(1H，d，J＝2.7Hz)，2.72(3H，s)，3.06(1H，dd，J＝9.7，3.1Hz)，3.54(1H，q d，J＝7.0，1.8Hz)，3.76-3.80(1H，m)，4.07-4.14(1H，m)，4.31(1H，d，J＝4.1Hz)，5.52(1H，dd，J＝15.5，8.7Hz)，5.60(1H，ddd，J＝15.1，9.4，3.4Hz)，5.71(1H，d，J＝8.4Hz)，6.63(1H，s)，6.99(1H，s)；13CNMR(100MHz，CDCl3)δ13.7，15.3，15.7，18.5，19.4，21.2，22.4，32.5，35.5，39.1，43.4，43.8，51.9，61.3，64.8，73.5，75.9，76.4，116.7，120.1，124.3，137.5，137.7，152.3，165.2，171.0，222.3；LRMS(ESI)C27H39NO6SNa[M+Na+]计算值528.2，实验值528.2；HRMS C27H40NO6S[M+H+]计算值506.2576，实验值506.2583。

在50℃下向环氧化物(0.7mg，1.38μmol)和TrisNHNH2(20.6mg，69μmol)的ClCH2CH2Cl(0.4mL)溶液中加入Et3N(9.6μL，69μmol)。反应由HPTLC监控(己烷/EtOAc＝1/2)。搅拌6h后，将该混合物冷却至室温，用EtOAc稀释并通过用EtOAc冲洗过的硅胶垫过滤。浓缩后，残余物用制备TLC(己烷/EtOAc＝1/2)纯化给出还原的产物(0.5mg，0.985μmol，71％)为白色固体。
该化合物的光谱数据与已报导的dEpoB的光谱相同。

在50℃下向环氧化物(14.0mg，27.7μmol)和TrisNHNH2(165mg，0.554mmol)的ClCH2CH2Cl(3.3mL)溶液中加入Et3N(77.0μL，0.554mmol)。反应由HPTLC监控(己烷/EtOAc＝1/2)。搅拌6h后，将该混合物冷却至室温，用EtOAc稀释并通过用EtOAc冲洗过的硅胶垫过滤。浓缩后，残余物用制备TLC(己烷/EtOAc＝1/2)纯化给出还原的产物(12.3mg，24.2μmol，87％)为无色固体。

[α]D24-13.8(c 0.61，CHCl3)；IR(film)ν3475，2971，2875，1735，1689，1456，1382，1253，1181，1151，1056，980，884，735cm-1；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ0.95(3H，d，J＝7.1Hz)，1.04(3H，s)，1.11(3H，d，J＝7.0Hz)，1.28(3H，s)，1.37(3H，s)，1.25-1.44(2H，m)，1.45-1.59(2H，m)，1.71-1.82(3H，m)，1.86(1H，dt，J＝15.3，9.5Hz)，2.10(1H，dd，J＝15.3，3.6Hz)，2.13(3H，s)，2.40(1H，dd，J＝12.5，2.5Hz)，2.49(1H，dd，J＝12.5，11.0Hz)，2.74(3H，s)，2.80(1H，brs，OH)，3.07(1H，dd，J＝10.3，3.3Hz)，3.34(1H，qd，J＝7.0，0.5Hz)，3.89(1H，brs，OH)，4.03-4.09(1H，m)，4.12-4.17(1H，m)，5.69(1H，d，J＝9.1Hz)，6.63(1H，s)，7.00(1H，s)；13CNMR(100MHz，CDCl3)δ12.9，15.4，16.3，18.8，19.3，21.6，22.0，23.0，31.5，32.1，33.6，38.6，38.9，42.6，51.7，62.6，65.5，71.2，74.5，76.3，116.6，119.9，138.0，152.2，165.2，170.6，222.7；LRMS(ESI)C27H41NO6SNa[M+Na+]计算值530.3，实验值530.2；HRMS C27H42NO6S[M+H+]计算值508.2733，实验值508.2754。

将酮与苯(5mL×2)共沸然后在高真空下干燥0.5h。在0℃下于5min内向Wittig盐(1.19g，2.27mmol)的THF(18mL)溶液中滴加t-BuOK(2.2□L的1.0M的THF溶液，2.20mmol)。在0℃下将该混合物搅拌20min并然后冷却至-78℃。于10min内向该混合物中滴加酮(1.06g，1.51mmol)的THF(10mL+2mL冲洗)溶液，将得到的混合物在2h内温热至-20℃。用饱和NH4Cl水溶液(15mL)淬灭该反应并用EtOAc萃取(50mL×3)。合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。残余物用急骤柱层析(SiO2～65g，己烷/Et2O＝30∶1至20∶1)纯化给出想要的16(E)-异构体(1.01g，1.11mmol，74％)和不想要的16(Z)-异构体(154.5mg，0.182mmol，11％)均为无色无定形油状物。

[α]D24-19.0(c 0.10，CHCl3)；IR(film)ν2954，2930，2880，1744，1692，1472，1381，1321，1252，1171，1114，1038，1006，837，776cm-1；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ0.09(3H，s)，0.12(3H，s)，0.15(6H，s)，0.55(6H，q，J＝7.8Hz)，0.87(9H，t，J＝8.0Hz)，0.96(9H，s)，0.97(9H，s)，1.01(3H，s)，1.06(3H，d，J＝7.1Hz)，1.12(3H，s)，1.20(3H，d，J＝7.1Hz)，2.07-2.16(1H，m)，2.18(3H，d，J＝1.0Hz)，2.38(1H，dd，J＝14.4，3.3Hz)，2.34-2.46(1H，m)，2.49(1H，dd，J＝14.4，7.4Hz)，2.78-2.90(2H，m)，2.97-3.09(2H，m)，3.98(1H，d，J＝8.9Hz)，4.54(1H，dd，J＝7.3，3.3Hz)，4.97(2H，s)，5.33(1H，ddd，J＝15.8，8.6，4.9Hz)，5.63(1H，dd，J＝9.6，2.4Hz)，5.78(1H，dd，J＝15.8，8.2Hz)，6.22-6.27(1H，m)，6.60(1H，s)，7.09(1H，s)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ-5.3(2C)，-3.4，-3.3，5.5(3C)，7.0(3C)，14.6，17.1，18.4，18.7，19.8，21.3，24.8，25.9(3C)，26.4(3C)，29.6，32.9，42.0，42.1，48.2，54.1，63.4，73.4，76.9，77.8，117.2，121.7，124.3[q，1J(C，F)＝273.6Hz]，127.2，130.7[q，2J(C，F)＝27.5Hz]，130.8[q，3J(C，F)＝6.2Hz]，133.2，136.4，152.6，170.1，172.4，217.1；LRMS(ESI)C45H78F3NO6SSi3Na[M+Na+]计算值924.5，实验值924.5；HRMS C45H79F3NO6SSi3[M+H+]计算值902.4888，实验值902.4887。

[α]D2665.7(c 1.76，CHCl3)；IR(film)ν2955，2931，2879，1743，1692，1472，1380，1321，1253，1170，1113，1007，836，776cm-1；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ0.07(3H，s)，0.13(3H，s)，0.16(6H，s)，0.48(6H，q，J＝7.8Hz)，0.84(9H，t，J＝7.9Hz)，0.97(18H，s)，0.98(3H，s)，1.06(3H，d，J＝7.1Hz)，1.11(3H，s)，1.20(3H，d，J＝7.2Hz)，2.00(3H，s)，2.03-2.11(1H，m)，2.33(1H，dd，J＝14.1，2.8Hz)，2.43(1H，dd，J＝14.0，7.8Hz)，2.40-2.48(1H，m)，2.76-2.89(2H，m)，2.97-3.10(2H，m)，3.99(1H，d，J＝9.3Hz)，4.57(1H，dd，J＝7.8，2.6Hz)，4.95(1H，d，J＝14.6Hz)，5.00(1H，d，J＝14.6Hz)，5.33(1H，ddd，J＝15.6，9.1，3.8Hz)，5.82(1H，dd，J＝15.6，8.3Hz)，6.30(1H，s)，6.32-6.38(1H，m)，7.04(1H，s)，7.11(1H，dd，J＝11.0，2.3Hz)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ-5.3(2C)，-3.2，-3.2，5.5(3C)，7.0(3C)，17.2，18.4，18.8，19.3，19.8，22.4，25.1，25.9(3C)，26.5(3C)，29.7，33.0，41.9，42.1，48.6，54.0，63.5，72.1，73.3，76.9，117.0，120.8，124.5[q，1J(C，F)＝273.5Hz]，127.9，129.7[q，2J(C，F)＝27.6Hz]，131.9[q，3J(C，F)＝6.1Hz]，132.9，136.4，152.4，170.1，172.9，217.5；LRMS(ESI)C45H78F3NO6SNa[M+Na+]计算值924.5，实验值924.5。

在0℃下向在塑料管中的甲硅烷基醚(1.04g，2.25mmol)的THF(22mL)溶液中缓慢加入HF·吡啶(11mL)，将该混合物在室温下搅拌4.3h。在0℃下于10min内滴加TMSOMe(75mL)淬灭反应。在室温下剧烈搅拌该混合物4.2h。浓缩并在高真空干燥1h后，将残余物通过急骤柱层析(SiO2～25g，己烷/EtOAc＝3∶4至1∶2)纯化，给出三醇(615.7mg，1.00mmol，96％)为无色粉末。

[α]D25-57.7(c 1.20，CHCl3)；IR(film)ν3441，2974，2932，1734，1685，1507，1456，1374，1318，1248，1169，1112，1054，982，888，737cm-1；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ1.04(3H，s)，1.12(3H，d，J＝6.9Hz)，1.25(3H，d，J＝6.8Hz)，1.36(3H，s)，1.90(1H，d，J＝6.6Hz，OH)，2.08(3H，s)，2.23-2.32(1H，m)，2.34(1H，dd，J＝15.7，2.4Hz)，2.49(1H，d d，J＝15.7，10.1Hz)，2.59-2.69(2H，m)，2.95-3.01(2H，m)，3.04(1H，五重峰，J＝6.8Hz)，3.72(1H，td，J＝7.0，3.0Hz)，3.78(1H，d，J＝5.7Hz，OH)，4.38(1H，ddd，J＝10.1，5.7，2.4Hz)，4.90(2H，d，J＝6.1Hz)，5.10(1H，t，J＝6.1Hz，OH)，5.44(1H，t，J＝4.7Hz)，5.60(1H，dd，J＝15.9，4.4Hz)，5.66(1H，dd，J＝15.9，5.0Hz)，6.28(1H，t，J＝6.7Hz)，6.73(1H，s)，7.16(1H，s)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ16.0，16.5，17.4，17.5，22.9，28.5，30.3，39.0，39.6，45.6，54.0，60.9，70.6，75.6，75.7，116.8，119.2，124.2[q，1J(C，F)＝273.6Hz]，127.9，129.8[q，2J(C，F)＝28.4Hz]，130.3[q，3J(C，F)＝5.9Hz]，131.2，137.0，152.2，169.8，170.0，218.3；LRMS(ESI)C27H37F3NO6SNa[M+H+]计算值560.2，实验值560.1；HRMS C27H37F3NO6S[M+H+]计算值560.2294，实验值560.2299。

在0℃下向在塑料管中的甲硅烷基醚(42.8mg，55.4μmol)的THF(1mL)溶液中缓慢加入HF·吡啶(0.5mL)，并将该混合物在室温下搅拌4.3h。在0℃下于10min内滴加TMSOMe(3.2mL)淬灭反应。在室温下剧烈搅拌该混合物1.5h。浓缩并在高真空干燥1h后，将残余物通过急骤柱层析(SiO2，己烷/EtOAc＝1∶1)纯化，给出二醇(23.6mg，43.4μmol，78％)为无色油状物。

[α]D25 31.6(c 1.00，CHCl3)；IR(film)ν2955，2878，1743，1692，1471，1379，1320，1253，1169，1114，1007，877，835，741cm-1；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ1.04(3H，s)，1.11(3H，d，J＝6.9Hz)，1.20(3H，d，J＝6.9Hz)，1.30(3H，s)，1.93(3H，brs)，2.22(1H，d，J＝4.3Hz，OH)，2.25-2.33(1H，m)，2.38-2.41(2H，m)，2.51-2.59(2H，m)，2.70(3H，s)，2.80-2.90(1H，m)，2.94(1H，dd，J＝15.6，4.7Hz)，3.06(1H，dd，J＝15.6，7.4Hz)，3.19(1H，五重峰，J＝6.6Hz)，3.71-3.76(1H，m)，4.26-4.32(1H，m)，5.57(1H，ddd，J＝15.8，7.2，5.0Hz)，5.67(1H，dd，J＝15.8，6.8Hz)，6.27(1H，s)，6.33(1H，dd，J＝7.6，6.3Hz)，6.76(1H，dd，J＝8.3，2.9Hz)，6.94(1H，s)；13CNMR(100MHz，CDCl3)δ14.5，17.9，19.2，19.5，19.8，22.2，28.7，32.4，39.8(2C)，44.7，53.3，71.9，74.1，75.1，117.0，120.4，124.4[q，1J(C，F)＝272.7Hz]，128.4，130.1[q，2J(C，F)＝28.9Hz]，131.5[q，3J(C，F)＝5.9Hz]，133.0，136.9，152.2，165.5，170.7，218.5；LRMS(ESI)C27H36F3NO5SNa[M+Na+]计算值566.2，实验值566.3。

在0℃下向醇(18.9mg，33.8μmol)和Et3N(18.8μL，0.135mmol)的CH2Cl2(1mL)溶液中加入TsCl(12.9mg，67.5μmol)，随后加入DMAP(2.1mg，16.9μmol)。室温下搅拌1.5h后，将该混合物通过硅胶垫(EtOAc冲洗)过滤。浓缩后，残余物用制备TLC(己烷/EtOAc＝1/1)纯化给出甲苯磺酸酯(8.5mg，11.9μmol，35％)和氯化物(4.3mg，7.44μmol，22％)均为无色粉末。

1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.06(3H，s)，1.12(3H，d，J＝7.0Hz)，1.23(3H，d，J＝6.7Hz)，1.33(3H，s)，1.99(1H，d，J＝5.5Hz)，2.10(3H，s)，2.25-2.34(1H，m)，2.41(1H，dd，J＝15.5，3.3Hz)，2.47(3H，s)，2.48(1H，dd，J＝15.7，9.4Hz)，2.51-2.63(1H，m)，2.63(1H，d，J＝6.1Hz，OH)，2.64-2.75(1H，m)，2.91-3.05(2H，m)，3.10(1H，五重峰，J＝6.8Hz)，3.70-3.75(1H，m)，4.30(1H，ddd，J＝9.3，6.1，3.2Hz)，5.32(2H，s)，5.41(1H，dd，J＝5.8，4.5Hz)，5.57(1H，ddd，J＝15.8，6.4，4.6Hz)，5.65(1H，dd，J＝15.8，6.0Hz)，6.21(1H，t，J＝7.1Hz)，6.59(1H，s)，7.18(1H，s)，7.37(2H，d，J＝8.1Hz)，7.84(2H，d，J＝8.3Hz)；LRMS(ESI)C34H42F3NO8S2Na[M+Na+]计算值736.2，实验值736.3。

IR(film)ν3494，2975，2935，1734，1689，1319，1248，1170，1113，1040，979，738cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.06(3H，s)，1.12(3H，d，J＝6.9Hz)，1.23(3H，d，J＝6.7Hz)，1.34(3H，s)，2.00(1H，d，J＝5.6Hz，OH)，2.15(3H，s)，2.25-2.35(1H，m)，2.41(1H，dd，J＝15.5，3.2Hz)，2.49(1H，dd，J＝15.5，9.4Hz)，2.53-2.62(1H，m)，2.69(1H，d，J＝6.1Hz，OH)，2.66-2.76(1H，m)，2.92-3.05(2H，m)，3.11(1H，五重峰，J＝6.4Hz)，3.70-3.76(1H，m)，4.32(1H，ddd，J＝9.2，5.9，3.1Hz)，4.85(2H，s)，5.43(1H，dd，J＝6.0，4.4Hz)，5.59(1H，ddd，J＝15.9，6.4，4.5Hz)，5.66(1H，dd，J＝15.9，6.1Hz)，6.23(1H，t，J＝6.8Hz)，6.63(1H，s)，7.20(1H，s)；LRMS(ESI)C27H35ClF3NO5SNa[M+Na+]计算值600.2，实验值600.2。

在0℃下向三醇(50.4mg，90.1μmol)的THF(1mL)溶液中加入(PhO)2PON3(27.2μl，0.126mmol)。5min后，加入DBU(16.2μl，0.108mmol)，将该混合物在0℃下搅拌2h，然后在室温下搅拌20.5h。该混合物用EtOAc稀释并用水(2mL)淬灭，用EtOAc萃取(三次)，合并的有机层经Na2SO4干燥。浓缩后，将残余物通过急骤柱层析(SiO2，己烷/EtOAc＝3∶2)纯化，给出叠氮化物(45.6mg，78μmol，87％)为无色粉末。

[α]D24-60.3(c 0.345，CHCl3)；IR(film)ν3492，2975，2931，2105，1732，1688，1319，1248，1169，1113，982，733cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.05(3H，s)，1.12(3H，d，J＝7.0Hz)，1.23(3H，d，J＝6.8Hz)，1.33(3H，s)，2.01(1H，d，J＝5.5Hz，OH)，2.17(3H，s)，2.25-2.35(1H，m)，2.41(1H，dd，J＝15.5，3.2Hz)，2.49(1H，dd，J＝15.5，9.5Hz)，2.54-2.60(1H，m)，2.66(1H，d，J＝6.0Hz)，2.65-2.76(1H，m)，2.96(1H，dd，J＝16.0，4.2Hz)，3.03(1H，dd，J＝16.1，6.7Hz)，3.11(1H，五重峰，J＝6.8Hz)，3.71-3.76(1H，m)，4.31(1H，ddd，J＝9.2，5.9，3.2Hz)，4.65(2H，s)，5.43(1H，dd，J＝6.0，4.3Hz)，5.58(1H，ddd，J＝15.8，6.4，4.6Hz)，5.66(1H，dd，J＝15.8，6.1Hz)，6.23(1H，t，J＝7.3Hz)，6.63(1H，s)，7.18(1H，s)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ15.4，15.9，17.8，18.6，22.8，28.7，30.9，39.5，39.7，45.1，51.3，53.5，71.5，75.4，76.8，118.2，119.6，122.7[q，1J(C，F)＝273.6Hz]，127.9，130.0[q，3J(C，F)＝6.1Hz]， 130.6[q，2J(C，F)＝27.9Hz]，132.3，137.2，153.1，163.9，170.0，218.3；LRMS(ESI)C27H35F3N4O5SNa[M+Na+]计算值607.2，实验值607.2；HRMS C27H36F3N4O5S[M+H+]计算值585.2359，实验值585.2344。

向甲苯磺酸酯(8.9mg，12.5μmol)的DMF(0.4mL)溶液中加入NaN3(12.2mg，0.188mmol)。在室温下搅拌21h，该混合物用饱和NH4Cl(水溶液)淬灭，用EtOAc萃取(三次)。浓缩后，残余物用制备TLC(己烷/EtOAc＝1∶1)纯化给出叠氮化物(6.9mg，11.8μmol，94％)为无色粉末。

向叠氮化物(21.0mg，35.9μmol)的THF(0.6mL)溶液中加入PMe3(在THF中1.0M，43.1μL，43.1μmol)。2min后，加入水(0.1mL)并将混合物在室温下搅拌3h。加入更多的PMe3(在THF中1.0M，7.2μL，7.2μmol)，并在室温下将混合物搅拌1.5h。加入28％的NH4OH水溶液(54.5μL)。室温下搅拌1h后，将混合物直接用制备TLC(CH2Cl2/MeOH＝100∶7.5)纯化给出胺(15.9mg，28.5μmol，79％)为无色粉末。

[α]D26-64.2(c 0.815，CHCl3)；IR(film)ν3504，3363，2975，2931，1733，1688，1450，1383，1318，1248，1169，1113，1054，984，736cm-1；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ1.05(3H，s)，1.12(3H，d，J＝7.0Hz)，1.23(3H，d，J＝6.8Hz)，1.34(3H，s)，2.12(3H，d，J＝0.7Hz)，2.24-2.35(1H，m)，2.39(1H，dd，J＝15.4，3.0Hz)，2.49(1H，dd，J＝15.4，9.8Hz)，2.54-2.63(1H，m)，2.66-2.76(1H，m)，2.97(1H，dd，J＝16.2，4.2Hz)，3.03(1H，dd，J＝16.3，6.5Hz)，3.10(1H，五重峰，J＝6.8Hz)，3.74(1H，dd，J＝6.7，3.5Hz)，4.18(2H，s)，4.34(1H，dd，J＝9.8，2.9Hz)，5.43(1H，dd，J＝6.0，4.3Hz)，5.55-5.64(1H，m)，5.67(1H，dd，J＝15.9，5.8Hz)，6.24(1H，brt，J＝7.3Hz)，6.66(1H，s)，7.10(1H，s)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ15.3，16.1，17.7，18.2，22.6，28.7，30.9，39.4，39.7，43.9，45.1，53.8，71.2，75.3，76.6，116.8，120.1，124.2[q，1J(C，F)＝273.5Hz]，127.8，130.2[q，3J(C，F)＝6.1Hz]，130.4[q，2J(C，F)＝28.6Hz]，132.2，136.6，152.3，170.1，172.7，218.4；LRMS(ESI)C27H38F3N2O5S [M+H+]计算值559.2，实验值559.2；HRMSC27H38F3N2O5S[M+H+]计算值559.2454，实验值559.2440。

向搅拌过的胺(15.9mg，28.5μmol)的CH3CN(0.78mL)溶液中加入HCHO(37％水溶液，31.4μL，0.143mmol)，随后加入NaBH3CN(在THF中1.0M，85.5μL。85.5μmol)。在室温下搅拌混合物20min。加入AcOH(1滴)，室温下搅拌混合物40min。将混合物直接用制备TLC(CH2Cl2/MeOH＝100∶8)纯化给出二甲胺(15.6mg，26.6μmol，93％)为无色粉末。

[α]D24-49.9(c 0.74，CHCl3)；IR(film)ν3424，2974，1729，1689，1468，1318，1247，1169，1112，754cm-1；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.05(3H，s)，1.12(3H，d，J＝6.9Hz)，1.23(3H，d，J＝6.8Hz)，1.33(3H，s)，2.17(3H，s)，2.24-2.35(1H，m)，2.43(1H，dd，J＝15.7，3.6Hz)，2.49(1H，dd，J＝15.6，9.1Hz)，2.55-2.64(2H，m，包含OH)，2.68-2.77(1H，m)，2.80(3H，s)，2.81(3H，s)，2.92-3.06(2H，m)，3.10(1H，五重峰，J＝6.8Hz)，3.69-3.76(1H，m)，4.25-4.34(1H，m)，4.33(2H，s)，5.42(1H，t，J＝5.5Hz)，5.57(1H，dt，J＝15.8，6.3Hz)，5.66(1H，dd，J＝15.7，6.4Hz)，6.22(1H，brt，J＝7.2Hz)，6.64(1H，s)，7.30(1H，s)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ15.3，15.8，17.8，18.8，22.3，28.8，30.9，39.6，39.6，45.2，49.7，49.7，53.4，61.5，71.7，75.4，77.4，119.2，120.2，124.2[q，1J(C，F)＝273.5Hz]，127.8，129.9[q，3J(C，F)＝6.2Hz]，130.7[q，2J(C，F)＝28.4Hz]，132.4，137.6，154.2，157.2，170.0，218.3；LRMS(ESI)C29H42F3N2O5S[M+H+]计算值580.2，实验值580.2。
熔点；两个样品均未重结晶，但通过SiO2纯化。

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本发明提供式(I)的化合物：如本发明中一般性描述的及以类和亚类描述的那样。本发明另外还提供包含式(I)的化合物的药物组合物，并提供治疗癌症的方法，该方法包括给药式(I)的化合物。 。

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