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1、(10)申请公布号 CN 103113594 A (43)申请公布日 2013.05.22 CN 103113594 A *CN103113594A* (21)申请号 201310030896.3 (22)申请日 2013.01.25 C08G 81/00(2006.01) C08B 37/12(2006.01) C08B 37/08(2006.01) A61K 47/36(2006.01) A61L 27/20(2006.01) (71)申请人 暨南大学 地址 510632 广东省广州市天河区黄埔大道 西 601 号 (72)发明人 汤顺清 张灵敏 王小莺 陈鹏 吴朝西 (74)专利代理机构。
2、 广州市华学知识产权代理有 限公司 44245 代理人 裘晖 陈燕娴 (54) 发明名称 琼脂糖 - 聚乙烯亚胺 - 透明质酸接枝物及其 制备方法与应用 (57) 摘要 本发明公开了一种琼脂糖 - 聚乙烯亚胺 - 透 明质酸接枝物及其制备方法与应用。本发明利用 可溶性碳二亚胺和羰基二咪唑将胺羧及胺羟基以 酰胺键化学连接， 将透明质酸， 聚乙烯亚胺和琼脂 糖接枝， 保留了透明质酸的生物活性和靶向性、 聚 乙烯亚胺的捕获基因和细胞相互作用特性， 并且 具有了琼脂糖的成凝胶特性， 改善了生物降解性 能， 得到的微颗粒具有靶向性， 在体内循环稳定性 好， 适用于靶向药物控释载体材料和组织工程支 架材料。
3、。 由于三种聚合物之间以酰胺键连接， 容易 在细胞以及生理环境下分解， 为药物载体在细胞 内充分释放所载药物创造条件。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书5页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103113594 A CN 103113594 A *CN103113594A* 1/2 页 2 1. 一种琼脂糖 - 聚乙烯亚胺 - 透明质酸接枝物的制备方法， 其特征在于包括如下步 骤 ： （1） 将琼脂糖按质量比 0.5 ： 99.5 5 ： 95 溶于 90 95热水中，。
4、 降温至 45 60， 加入1030wt%过氧化氢， 使琼脂糖的体积浓度为0.33%， 4560恒温反应315h， 得到混合液 ； （2） 将步骤 （1） 的混合液于 50 70减压浓缩， 得到浓缩液 ； 往浓缩液中加入乙醇， 离心， 取沉淀 ； 将沉淀按质量百分比 5 10% 溶于水中， 得到溶液， 用无水乙醇沉淀 2 3 次， 离心， 得到降解琼脂糖沉淀 ； 将降解琼脂糖沉淀按质量百分比 5 10% 溶于水中， 于 -20 -65冷冻干燥 10 17h， 得降解琼脂糖粉末 ； （3） 将步骤 （2） 的降解琼脂糖粉末按210%质量百分比溶于二甲亚砜， 加入N,N-羰 基二咪唑， N,N -。
5、 羰基二咪唑在二甲亚砜中的浓度为 1 3mM， 室温反应 1 5 小时， 得到 反应液 ； 用冷乙醇沉淀反应液， 取沉淀， 得到 AG-CDI ； 将 AG-CDI 按质量百分比 3 10% 溶于 二甲亚砜中， 得到 AG-CDI 溶液， 4储存备用 ； 将聚乙烯亚胺按质量百分比 3 10% 溶于二 甲亚砜， 加入 AG-CDI 溶液， 降解琼脂糖 / 聚乙烯亚胺质量比为 1 ： 1 1 ： 5， 冰水浴中混合后 于 1.5 小时内加入三乙胺， 于 40 70反应 5h 后室温透析 5 10 天， -20 -65冷冻 干燥 10 17 小时， 得到琼脂糖接枝聚乙烯亚胺 ； 降解琼脂糖与 N,N。
6、 - 羰基二咪唑的质量 比为 2 ： 1 1 ： 5 ； 降解琼脂糖与聚乙烯亚胺的质量比为 1 ： 1 1 ： 15 ； 三乙胺的质量为降解 琼脂糖的质量的 1 5% ； （4） 将步骤 （3） 的琼脂糖接枝聚乙烯亚胺溶于水中， 配制成310wt%溶液， 调节酸度至 pH 4 6， 加入透明质酸和碳二亚胺 -N- 羟基琥珀酰亚胺， 于室温、 氮气保护下反应 3 5h 后透析 5 10 天， -20 -65冷冻干燥 10 17 小时， 得到琼脂糖 - 聚乙烯亚胺 - 透明质 酸接枝物 ； 降解琼脂糖与透明质酸的质量比为 1 ： 1 1 ： 10 ； 降解琼脂糖与碳二亚胺 -N- 羟 基琥珀酰亚胺。
7、的质量比为 3 ： 1 1 ： 5。 2. 根据权利要求 1 所述的琼脂糖 - 聚乙烯亚胺 - 透明质酸接枝物的制备方法， 其特征 在于 ： 步骤 （1） 中所述的琼脂糖的分子量为 100 300kDa。 3. 根据权利要求 1 所述的琼脂糖 - 聚乙烯亚胺 - 透明质酸接枝物的制备方法， 其特征 在于 ： 步骤 （2） 中所述的浓缩液的体积为混合液体积的 10 15% ； 所述的乙醇的体积为浓 缩液体积的 2 5 倍。 4. 根据权利要求 1 所述的琼脂糖 - 聚乙烯亚胺 - 透明质酸接枝物的制备方法， 其特征 在于 ： 步骤 （2） 中所述的离心的条件为于室温、 1500 4000 转 /。
8、 分离心 2 5 分钟 ； 所述 的无水乙醇的体积为溶液体积的 2 3 倍。 5. 根据权利要求 1 所述的琼脂糖 - 聚乙烯亚胺 - 透明质酸接枝物的制备方法， 其特征 在于 ： 步骤 （3） 中所述的聚乙烯亚胺的分子量为 1 10kDa。 6. 根据权利要求 1 所述的琼脂糖 - 聚乙烯亚胺 - 透明质酸接枝物的制备方法， 其特征 在于 ： 步骤 （3） 中所述的冷乙醇的体积为反应液体积的 1 3 倍 ； 所述的透析在双蒸水中、 用截留 2 5kDa 分子量的透析袋进行透析。 7. 根据权利要求 1 所述的琼脂糖 - 聚乙烯亚胺 - 透明质酸接枝物的制备方法， 其特征 在于 ： 步骤 （4。
9、） 中所述的透明质酸的分子量为 1 50kDa。 8. 根据权利要求 1 所述的琼脂糖 - 聚乙烯亚胺 - 透明质酸接枝物的制备方法， 其特征 权 利 要 求 书 CN 103113594 A 2 2/2 页 3 在于 ： 步骤 （4） 中所述的酸度的调节采用 0.01 0.05wt% 盐酸进行调节 ； 所述的透析在双 蒸水中、 用截留 2 5kDa 分子量的透析袋进行透析。 9. 一种琼脂糖 - 聚乙烯亚胺 - 透明质酸接枝物， 由权利要求 1 8 任一项所述的制备 方法得到。 10. 权利要求 9 所述的琼脂糖 - 聚乙烯亚胺 - 透明质酸接枝物在制备靶向药物控释载 体或组织工程支架中进行。
10、应用。 权 利 要 求 书 CN 103113594 A 3 1/5 页 4 琼脂糖 - 聚乙烯亚胺 - 透明质酸接枝物及其制备方法与应 用 技术领域 0001 本发明高分子材料技术领域， 特别涉及一种琼脂糖 - 聚乙烯亚胺 - 透明质酸接枝 物及其制备方法与应用。 背景技术 0002 生物材料在临床医学技术水平的提高中扮演了极其重要的角色， 用其制成的各种 组织工程支架、 人工器官、 药物释放系统、 医用敷料等应用几乎涉及临床的各个领域。伴随 着医疗技术水平的提高， 结构与性能单一的生物医学材料已不能满足医学发展的需要， 设 计开发新型多功能生物医学材料是当前的迫切需要。 其中降解性活性组织。
11、工程支架材料和 靶向药物 / 基因控释载体材料， 是未来生物医学材料研究的重要方向。 0003 目前作为可降解支架和控制释放体系的药物载体大多是高分子聚合物材料。 可降 解聚合物在一定时间内能被水解或酶解成小分子， 通过生理途径代谢排出体外， 因此比非 降解材料更安全、 更可靠， 有更好的生物相容性， 成为支架以及药物载体的首选材料。可降 解高分子聚合物主要有天然可生物降解高分子和人工合成可降解高分子， 或通过特殊的键 结构结合非降解性小分子， 使降解产物容易清除掉， 达到降解的目的。而且通过多组分组 和， 可得到新型多功能材料用于生物医学 , 它有着单一材料无法比拟的优势。 0004 透明质。
12、酸和琼脂糖是被广泛用于药物控释载体和组织工程支架的两种天然大分 子物质， 聚乙烯亚胺 （PEI） 广泛应用于负载基因的合成高分子。透明质酸作为生物大分子 具有靶向特定细胞核组织作用， 以及对细胞的刺激作用， 但它的某些性质， 如极易溶于水， 稳定性差， 容易发生降解等， 大大限制了透明质酸在生物医学上的应用。因此， 需要对透明 质酸进行化学改性以降低水溶性， 减缓在人体中的吸收速度。PEI 作为阳离子聚合物， 能有 效捕获基因和与细胞相互作用， 但它不降解以及分子量大的 PEI 有细胞毒性， 有必要采用 分子链上连接多个小分子 PEI 的方法达到大分子 PEI 的功能。 发明内容 0005 本。
13、发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足， 提供一种琼脂糖 - 聚乙烯亚 胺 - 透明质酸接枝物的制备方法。 0006 本发明的另一目的在于提供由上述制备方法得到的琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质 酸接枝物。 0007 本发明的再一目的在于提供所述的琼脂糖 - 聚乙烯亚胺 - 透明质酸接枝物的应 用。 0008 本发明的目的通过下述技术方案实现 ： 一种琼脂糖 - 聚乙烯亚胺 - 透明质酸接枝 物的制备方法， 包括如下步骤 ： 0009 （1）将琼脂糖按质量比 0.5 ： 99.5 5 ： 95 溶于 90 95热水中， 降温至 45 60， 加入1030wt%过氧化氢， 使琼脂糖的体积浓度为0.。
14、33%， 4560恒温反应3 说 明 书 CN 103113594 A 4 2/5 页 5 15h， 得到混合液 ； 0010 （2） 将步骤 （1） 的混合液于 50 70减压浓缩， 得到浓缩液 ； 往浓缩液中加入 乙醇， 离心， 取沉淀 ； 将沉淀按质量百分比 5 10% 溶于水中， 得到溶液， 用无水乙醇沉淀 2 3 次， 离心， 得到降解琼脂糖沉淀 ； 将降解琼脂糖沉淀按质量百分比 5 10% 溶于水中， 于 -20 -65冷冻干燥 10 17h， 得降解琼脂糖 （AG） 粉末 ； 0011 （3）将步骤 （2）的降解琼脂糖 （AG）粉末按 2 10% 质量百分比溶于二甲亚砜 （DMS。
15、O） ， 加入 N,N - 羰基二咪唑 （CDI） ， N,N - 羰基二咪唑在二甲亚砜中的浓度为 1 3mM， 室温反应 1 5 小时， 得到反应液 ； 用冷乙醇沉淀反应液， 取沉淀， 得到 AG-CDI ； 将 AG-CDI 按质量百分比 3 10% 溶于二甲亚砜中， 得到 AG-CDI 溶液， 4储存备用 ； 将聚乙烯 亚胺 （PEI） 按质量百分比 3 10% 溶于二甲亚砜， 加入 AG-CDI 溶液， 降解琼脂糖 / 聚乙烯 亚胺质量比为 1 ： 1 1 ： 5， 冰水浴中混合后于 1.5 小时内加入三乙胺， 于 40 70反应 5h 后室温透析 5 10 天， -20 -65冷冻干。
16、燥 10 17 小时， 得到琼脂糖接枝聚乙烯亚胺 （AG-PEI） ； 降解琼脂糖与 N,N - 羰基二咪唑的质量比为 2 ： 1 1 ： 5 ； 降解琼脂糖与聚乙烯 亚胺的质量比为 1 ： 1 1 ： 15 ； 三乙胺的质量为降解琼脂糖的质量的 1 5% ； 0012 （4） 将步骤 （3） 的琼脂糖接枝聚乙烯亚胺溶于水中， 配制成 3 10wt% 溶液， 调节 酸度至 pH4 6， 加入透明质酸 （HA） 和碳二亚胺 -N- 羟基琥珀酰亚胺 （EDC-NHS） ， 于室温、 氮气保护下反应 3 5h 后透析 5 10 天， -20 -65冷冻干燥 10 17 小时， 得到琼脂 糖-聚乙烯亚。
17、胺-透明质酸接枝物 （AG-PEI-HA） ； 所述的降解琼脂糖与透明质酸的质量比为 1 ： 1 1 ： 10， 降解琼脂糖与碳二亚胺 -N- 羟基琥珀酰亚胺的质量比为 3 ： 1 1 ： 5 ； 0013 步骤 （1） 中 ： 0014 所述的琼脂糖的分子量为 100 300kDa， 优选为 200kDa ； 0015 所述的琼脂糖优选按质量比 3 ： 97 溶于 90 95热水中 ； 0016 所述的琼脂糖的体积浓度优选为 2% ； 0017 步骤 （2） 中 ： 0018 所述的浓缩液的体积为混合液体积的 10 15%， 优选为 13.4% ； 0019 所述的乙醇的体积为浓缩液体积的 。
18、2 5 倍， 优选为 2 倍 ； 0020 所述的离心的条件为于室温、 1500 4000 转 / 分离心 2 5 分钟 ； 0021 所述的无水乙醇的体积为溶液体积的 2 3 倍， 优选为 2 倍 ； 0022 步骤 （3） 中 ： 0023 所述的冷乙醇的体积优选为反应液体积的 1 3 倍 ； 0024 所述的聚乙烯亚胺 （PEI） 的分子量优选为 1 10kDa ； 0025 所述的透析优选在双蒸水中、 用截留 2 5kDa 分子量的透析袋进行透析 ； 0026 所述的 N,N - 羰基二咪唑在二甲亚砜中的浓度优选为 3mM ； 0027 所述的降解琼脂糖 / 聚乙烯亚胺质量比优选为 1。
19、 ： 3.6 ； 0028 所述的三乙胺的质量优选为降解琼脂糖的质量的 4% ； 0029 所述的降解琼脂糖与 N,N - 羰基二咪唑的质量比优选为 1 ： 1 ； 0030 所述的降解琼脂糖与聚乙烯亚胺的质量比优选为 5 ： 18 ； 0031 步骤 （4） 中 ： 0032 所述的酸度的调节采用 0.01 0.05wt% 盐酸进行调节， 优选采用 0.05wt% 盐酸进 说 明 书 CN 103113594 A 5 3/5 页 6 行调节 ； 0033 所述的透明质酸的分子量为 1 50kDa， 优选为 5kDa ； 0034 所述的降解琼脂糖与透明质酸的质量比优选为 1 ： 1， 降解琼。
20、脂糖与碳二亚 胺 -N- 羟基琥珀酰亚胺的质量比优选为 1 ： 1 ； 0035 所述的透析优选在双蒸水中、 用截留 2 5kDa 分子量的透析袋进行透析 ； 0036 可以根据使用要求， 选择不同分子量的材料进行接枝， 得到颗粒、 凝胶或多孔支架 灯形状的接枝物 ； 如可选用分子量为 5kDa AG、 1.2kDa PEI 和 5kDa HA 制备转基因载体， 可 选用 20kDa AG、 1.2kDa PEI 和 20kDa HA 制备支架 ； 0037 一种琼脂糖 - 聚乙烯亚胺 - 透明质酸接枝物， 由上述制备方法得到 ； 0038 所述的琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物可应用于制备。
21、靶向药物控释载体或 组织工程支架。 0039 本发明的发明机理 ： 本发明利用可溶性碳二亚胺和羰基二咪唑将胺羧及胺羟基以 酰胺键化学连接， 使三个功能高分子接枝共聚， 并在共聚物中保持它们自身的功能， 最终这 种新型共聚高分子用于靶向载体和组织再生支架。 0040 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果 ： 0041 （1） 将透明质酸， PEI 和琼脂糖接枝， 获得一种新型的生物医学材料， 保留了透明质 酸的生物活性和靶向性， PEI 的捕获基因和细胞相互作用特性， 并且具有了琼脂糖的成凝胶 特性， 改善了生物降解性能， 同时具有一定的稳定性， 适用于靶向药物控释载体材料和组织 工程支架材。
22、料。 由于三种聚合物之间以酰胺键连接， 容易在细胞以及生理环境下分解， 这位 药物载体在细胞内充分释放所载药物创造条件。同时由于显著提高海藻多糖 - 琼脂的附加 价值， 使大型海藻养殖的吸引力进一步提高， 可望在近海生态修复中发挥积极作用。 可望得 到新型医学产品带来广泛的经济效益和社会效益， 环境效益。 0042 （2） 本发明方法得到的微颗粒具有靶向性， 在体内循环稳定性好， 在胞内可快速降 解， 适于作为靶向药物控释、 基因转染载体、 支架或薄膜。 附图说明 0043 图 1 是实施例 2 的纳米粒子的 TEM 图。 0044 图 2 是实施例 3 的 AG-PEI-HA 三元共聚物多孔。
23、支架的 SEM 图。 0045 图 3 是实施例 1 的产物的红外谱图 ； 其中 ： a 为琼脂糖的红外谱图 ； b 为聚乙烯亚 胺的红外谱图 ； c 为琼脂糖接枝聚乙烯亚胺的的红外谱图 ； d 为琼脂糖 - 聚乙烯亚胺 - 透明 质酸接枝物的红外谱图 ； e 为透明质酸的的红外谱图。 具体实施方式 0046 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述， 但本发明的实施方式不限 于此。 0047 实施例 1 0048 （1） 将 3g 200kDa 琼脂糖溶于 90 97g 热水中， 降温至 45， 加入 30wt% 过氧化 氢 50ml， 使琼脂糖的体积浓度为 2%， 45恒温反应 4h。
24、， 得到混合液 ； 0049 （2） 将步骤 （1） 的混合液 70减压浓缩 0.5h 至 20ml， 得到浓缩液 ； 往浓缩液中加 说 明 书 CN 103113594 A 6 4/5 页 7 入40ml乙醇， 4000转/分、 室温离心3分钟， 取沉淀 ； 将1g沉淀溶于20ml水中， 重复用40ml 无水乙醇沉淀， 得到降解琼脂糖沉淀 ； 将 1g 降解琼脂糖沉淀溶于 20ml 水中， 于 -65冷冻 干燥 17h， 得降解琼脂糖 （AG） 粉末 ； 降解琼脂糖粉末为 20kDa ； 0050 （3）将 0.5g 步骤 （2）的降解琼脂糖 （AG）粉末溶于 20ml 二甲亚砜， 加入 0。
25、.5g N,N - 羰基二咪唑 （CDI， CDI 在 DMSO 中浓度为 3mM） ， 室温反应 5h， 60ml 冷乙醇沉淀， 得到 AG-CDI， 将 AG-CDI 溶于 20ml DMSO 中， 4储存备用 ； 将 1.8g 1.2kDa 聚乙烯亚胺 （PEI） 溶 于20ml DMSO， 与0.8g AG-CDI在冰水浴中混合， 1.5小时内加入0.02g三乙胺， 然后45反 应 5h， 产物透析 （截留分子量 3kDa） 10 天， 于 -65冷冻干燥 10h， 得到琼脂糖接枝聚乙烯亚 胺 （AG-PEI） ； 0051 （4）将 1g 步骤 （3）的 AG-PEI 溶于 19ml。
26、 水中， 配制成 5wt% 溶液， 用 0.05% 盐酸 调节酸度至 pH 6， 加入 0.5g 5kDa 透明质酸 （HA）及 0.5g 碳二亚胺 -N- 羟基琥珀酰亚 胺 （EDC-NHS） ， 在室温、 氮气保护下反应 5h， 双蒸水中用截留 2kDa 的透析袋透析 10 天， 于 -65冷冻干燥 15h， 得到琼脂糖 - 聚乙烯亚胺 - 透明质酸接枝物 （AG-PEI-HA） 。 0052 实施例 2 ： 靶向控释药物 / 基因转染载体 0053 （1） 将 3g 200kDa 琼脂糖溶于 92 97g 热水中， 降温至 55， 加入 20wt% 过氧化 氢 50ml， 使琼脂糖的体积。
27、浓度为 2%， 55恒温反应 15h， 得到混合液 ； 0054 （2） 将步骤 （1） 的混合液 60减压浓缩 0.5h 至 20ml， 得到浓缩液 ； 往浓缩液中 加入 40ml 乙醇， 3500 转 / 分、 室温离心 4 分钟， 取沉淀 ； 将 1.5g 沉淀溶于 20ml 水中， 重 复用 40ml 无水乙醇沉淀， 得到降解琼脂糖沉淀 ； 将 1.5g 降解琼脂糖沉淀溶于 20ml 水中， 于 -20冷冻干燥 10h， 得降解琼脂糖 （AG） 粉末 ； 降解琼脂糖粉末为 5kDa ； 0055 （3）将 0.5g 步骤 （2）的降解琼脂糖 （AG）粉末溶于 20ml 二甲亚砜， 加入。
28、 0.5g N,N - 羰基二咪唑 （CDI， CDI 在 DMSO 中浓度为 3mM） ， 室温反应 3h， 60ml 冷乙醇沉淀， 得到 AG-CDI， 将 AG-CDI 溶于 20ml DMSO 中， 4储存备用 ； 将 1.8g1.2kDa 聚乙烯亚胺 （PEI） 溶于 20ml DMSO， 与 0.8g AG-CDI 在冰水浴中混合， 1.5 小时内加入 0.02g 三乙胺， 然后 40反应 5h， 产物透析 （截留分子量 2kDa） 5 天， 于 -20冷冻干燥 15h， 得到琼脂糖接枝聚乙烯亚胺 （AG-PEI） ； 0056 （4）将 1g 步骤 （3）的 AG-PEI 溶于 。
29、19ml 水中， 配制成 5wt% 溶液， 用 0.05% 盐酸 调节酸度至 pH 5， 加入 0.5g 5kDa 透明质酸 （HA） 及 0.5g 碳二亚胺 -N- 羟基琥珀酰亚胺 （EDC-NHS） ， 在室温、 氮气保护下反应 4h， 双蒸水中用截留 2kDa 的透析袋透析 8 天， 于 -45 冷冻干燥 15h， 得到琼脂糖 - 聚乙烯亚胺 - 透明质酸接枝物 （AG-PEI-HA） ； 0057 上述制备 AG-PEI-HA 三元共聚物， 将抗癌 siRNA 药物与载体在 PBS 溶液中复合形 成纳米粒子 （琼脂糖 /siRNA=10:1-100:1） ， 粒径 200-300nm。。
30、体外对肿瘤细胞的抑制率超过 90% ； 通过静脉周期性注射入裸鼠， 一个月后皮下肿瘤组织增殖受到明显抑制作用。 0058 实施例 3 ： 多孔复合支架制备及皮肤敷料 0059 （1） 将 3g 200kDa 琼脂糖溶于 95 97g 热水中， 降温至 60， 加入 10wt% 过氧化 氢 50ml， 使琼脂糖的体积浓度为 2%， 60恒温反应 3h， 得到混合液 ； 0060 （2） 将步骤 （1） 的混合液 50减压浓缩 0.5h 至 20ml， 得到浓缩液 ； 往浓缩液中加 入40ml乙醇， 1500转/分、 室温离心5分钟， 取沉淀 ； 将2g沉淀溶于20ml水中， 重复用40ml 无水。
31、乙醇沉淀， 得到降解琼脂糖沉淀 ； 将 2g 降解琼脂糖沉淀溶于 20ml 水中， 于 -45冷冻 说 明 书 CN 103113594 A 7 5/5 页 8 干燥 17h， 得降解琼脂糖 （AG） 粉末 ； 降解琼脂糖粉末为 30kDa ； 0061 （3）将 0.5g 步骤 （2）的降解琼脂糖 （AG）粉末溶于 20ml 二甲亚砜， 加入 0.5g N,N - 羰基二咪唑 （CDI， CDI 在 DMSO 中浓度为 3mM） ， 室温反应 1h， 60ml 冷乙醇沉淀， 得到 AG-CDI， 将 AG-CDI 溶于 20ml DMSO 中， 4储存备用 ； 将 1.8g1.2kDa 聚乙。
32、烯亚胺 （PEI） 溶于 20ml DMSO， 与 0.8g AG-CDI 在冰水浴中混合， 1.5 小时内加入 0.02g 三乙胺， 然后 70反应 5h， 产物透析 （截留分子量 3kDa） 8 天， 于 -45冷冻干燥 17h， 得到琼脂糖接枝聚乙烯亚胺 （AG-PEI） ； 0062 （4）将 1g 步骤 （3）的 AG-PEI 溶于 19ml 水中， 配制成 5wt% 溶液， 用 0.05% 盐酸 调节酸度至 pH 4， 加入 0.5g20kDa 透明质酸 （HA） 及 0.5g 碳二亚胺 -N- 羟基琥珀酰亚胺 （EDC-NHS） ， 在室温、 氮气保护下反应 3h， 双蒸水中用截。
33、留 5kDa 的透析袋透析 5 天， 于 -20 冷冻干燥 17h， 得到琼脂糖 - 聚乙烯亚胺 - 透明质酸接枝物 （AG-PEI-HA） ； 0063 选用上述制备的 AG-PEI-HA 三元共聚物制备多孔支架直径 1.5 厘米， 厚 3-4 毫米， 环氧乙烷消毒备用。以兔皮肤创面为模型， 造 1.5 厘米直径缺损 , 缝合固定 , 植入两 - 三 周后皮肤修复完成， 支架降解。或制备复合膜材料直径 1.5 厘米， 厚 3 毫米， 环氧乙烷消毒 备用。以兔皮肤创面为模型， 造 1.5 厘米直径缺损 , 缝合固定， 植入三周后皮肤修复完成， 支架降解。 0064 实施例 4 ： 脂肪组织工程。
34、支架 0065 （1） 将 3g 200kDa 琼脂糖溶于 90 97g 热水中， 降温至 45， 加入 30wt% 过氧化 氢 50ml， 使琼脂糖的体积浓度为 2%， 45恒温反应 3h， 得到混合液 ； 0066 （2） 将步骤 （1） 的混合液 70减压浓缩 0.5h 至 20ml， 得到浓缩液 ； 往浓缩液中加 入40ml乙醇， 4000转/分、 室温离心2分钟， 取沉淀 ； 将1g沉淀溶于20ml水中， 重复用40ml 无水乙醇沉淀， 得到降解琼脂糖沉淀 ； 将 1g 降解琼脂糖沉淀溶于 20ml 水中， 于 -65冷冻 干燥 15h， 得降解琼脂糖 （AG） 粉末 ； 降解琼脂糖。
35、粉末为 30kDa ； 0067 （3）将 0.5g 步骤 （2）的降解琼脂糖 （AG）粉末溶于 20ml 二甲亚砜， 加入 0.5g N,N - 羰基二咪唑 （CDI， CDI 在 DMSO 中浓度为 3mM） ， 室温反应 5h， 60ml 冷乙醇沉淀， 得到 AG-CDI， 将 AG-CDI 溶于 20ml DMSO 中， 4储存备用 ； 将 1.8g 1.2kDa 聚乙烯亚胺 （PEI） 溶 于20ml DMSO， 与0.8g AG-CDI在冰水浴中混合， 1.5小时内加入0.02g三乙胺， 然后45反 应 5h， 产物透析 （截留分子量 5kDa） 10 天， 于 -65冷冻干燥 1。
36、0h， 得到琼脂糖接枝聚乙烯亚 胺 （AG-PEI） ； 0068 （4）将 1g 步骤 （3）的 AG-PEI 溶于 19ml 水中， 配制成 5wt% 溶液， 用 0.05% 盐酸 调节酸度至 pH 6， 加入 0.5g 30kDa 透明质酸 （HA）及 0.5g 碳二亚胺 -N- 羟基琥珀酰亚 胺 （EDC-NHS） ， 在室温、 氮气保护下反应 5h， 双蒸水中用截留 5kDa 的透析袋透析 10 天， 于 -65冷冻干燥 10h， 得到琼脂糖 - 聚乙烯亚胺 - 透明质酸接枝物 （AG-PEI-HA） ； 0069 选用上述聚合物材料制备水凝胶支架直径 0.8 厘米， 厚 3-4 毫。
37、米。扩增成体脂肪 干细胞 800 万， 种于支架中、 风干三小时细胞贴附后加常规培养液 （补充 10ng/ml bFGF） ， 三 周后成脂肪样软组织， 支架降解。 0070 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 103113594 A 8 1/2 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103113594 A 9 2/2 页 10 图 3 说 明 书 附 图 CN 103113594 A 10 。