抗焦虑作用的林蛙卵油及其制备方法 技术领域：
本发明涉及医药技术领域，确切的说它是一种具有抗焦虑作用的林蛙卵油及其制备方法。
背景技术：林蛙(Rana Temporaria Chensinensis David)也称哈士蟆，为脊索动物门，两牺纲，无尾目，蛙科，蛙亚科，林蛙属，中国林蛙种等十几个种。林蛙是我国传统名贵补品和滋补性中药材，史料记载林蛙及其输卵管(蛤蟆油)补而不燥，润肺生津，入肾，清肺润喉。历代医书均作为补品将其著录，其产品为哈士蟆油(林蛙输卵管)及哈士蟆即林蛙的干燥全体。
近年，我国学者李成义对林蛙卵进行溶剂提取并分析证明林蛙卵中含有丰富的氨基酸，三十多种微量元素，多种不饱和脂肪酸，维生素D、E，雌激素和孕激素等多种生物活性物质(中药及天然药物1994；29：712)。本课题组的研究证明林蛙卵中含有脂肪酸、脂肪酰胺等多类别组分(中国药物化学杂志，2001，11(4)：224 225)。
中国林蛙的开发和综合利用近年越来越受到人们的重视，因此，中国林蛙专利逐年增多。以林蛙、哈士蟆、哈什蚂、蛤士蟆、雪蛤为关键词，检索国内、外专利，结果未查到其他国家专利，中国专利74篇，其中涉及林蛙卵的发明专利15篇。在这15篇专利中：有一项专利授权(ZL 97116918.7)，十四项专利申请。中国专利99119379.2“林蛙卵及其应用”保护的是林蛙卵在免疫调节、延缓衰老、壮阳、明目、调节血脂和预防妇女更年期综合症方面的作用。中国专利01106213.4“利用CO2超临界萃取林蛙卵油的方法”，01106211.8“降血脂营养保健软胶囊及其制法”，01106212.6“一种具有降血脂作用的林蛙卵油营养保健胶囊及其制法”，01106209.6“抗衰老、降血脂营养保健软胶囊及其制法”，01106210.X“益智、降血脂营养保健软胶囊及其制法”是同一天，同一个代理机构申请的5项专利，均涉及中国林蛙卵的超临界提取工艺。01112272.2雪蛤舒脂软胶囊公开了林蛙卵油的降血脂作用。中国专利01113910.2“林蛙卵油的超临界提取工艺”，01106240.1“林蛙卵油软胶囊及其生产工艺”，01114070.4“林蛙卵油注射液及其制备工艺”是本课题组自己申请的三项专利，对该产品的提取工艺和制剂工艺进行了保护，使该产品生产的关键工艺具有独占的知识产权。这些方法揭示：林蛙卵含有丰富的营养物质，对机体具有多方面的调节作用。
本课题组采用压榨、CO2超临界萃取和溶剂提取等方法制备林蛙卵油，并将得到地产品制成不同途径应用的制剂用于机体，这些途径使林蛙卵油进入体内后，发现其具有抗焦虑作用。因此，本发明将不同方式提取出的林蛙卵油制成多种制剂，以不同途径将林蛙卵油导入机体，发挥其抗焦虑作用。
发明内容：
本发明的目的提供一种抗焦虑作用的林蛙卵油及其制备方法，使林蛙卵油它可用于制备抗焦虑作用的药物制剂。制剂可制成口服和注射途径的制剂，口服制剂可制成软胶囊、片剂、胶囊、纳米干乳、口服液等剂型，注射剂可制成注射油剂，
脂质体注射液等。该林蛙卵油的获得方法可以通过压榨的方法制备，将挑选干净的林蛙卵用油浸泡过夜后，用压榨机挤压，得到林蛙卵油溶液。所述的浸泡用油为豆油、色拉油、花生油、麻油、月见草油、苏子油、橄榄油等植物油，鱼油、角鲨烯等动物油。获得方法还可以通过CO2超临界萃取的方法制备，将挑选干净的林蛙卵粉碎成粗粉，用CO2超临界萃取装置，在压力为5-50MPa、温度17-75℃，以0-50％乙醇为夹带剂条件下萃取30-360分钟，CO2流量13.7-68升/小时，然后在分离罐中分离并分离卵油，将卵油静置后过滤并减压回收乙醇，即得成品。获得方法也可以通过溶剂提取的方法制备，将挑选干净的林蛙卵用乙醚、丙酮、氯仿、石油醚、乙醇等溶剂提取后，减压回收溶剂，得到林蛙卵油。
本发明和以往的发明相比，具有以下改进：
一.采用压榨、CO2超临界萃取、乙醚、丙酮、氯仿、石油醚、乙醇等溶剂提取，多种方法制备林蛙卵油。
二.将林蛙卵提取物制成软胶囊、片剂、胶囊、纳米干乳、口服液等口服剂型，及注射油剂，脂质体注射液等注射液。
三.林蛙卵油原料和制剂具有显著抗焦虑作用。可制备抗焦虑作用的药物，为林蛙卵油提供了新的应用途径。
本发明的创造性可通过如下内容体现：
1.林蛙卵的提取
1.1 仪器设备 HA121-50-05型超临界萃取装置由南通华安超临界萃取有限公司提供。TTC525×2直冷式CO2超临界萃取装置由铁岭天元生物股份有限公司提供。压榨机、立式离心机 由辽阳制药机械厂提供。
1.2 试剂
无水乙醇 由沈阳试剂一厂提供，批号：991203。无水乙醚 由沈阳试剂一厂提供，批号：991219。色拉油，来源于营口渤海油脂有限公司。安定注射液，天津市氨基酸公司人民制药厂产品，批号010424。佳静安定注射液，河南天方药业有限公司产品，批号010101260。
1.3 提取方法
1.3.1 中国林蛙卵的乙醚提取
取去掉中国林蛙输卵管后的中国林蛙卵自然干燥，拣除杂质，用粉碎机粉碎成40目粗粉后，用1∶2(W/V)乙醚冷浸24小时，尔后倾出上清液，再加同样量的乙醚同法浸三次，收集并过滤浸液，用减压装置，在水浴上减压回收乙醚，待无乙醚蒸出后，将蒸馏瓶内的黄色油状液体倒入烧杯中于室温放置一周，将乙醚挥散净后即得浅黄棕色卵油，得率为20％。
1.3.2 中国林蛙卵的乙醇提取
取去掉中国林蛙输卵管后的中国林蛙卵自然干燥，拣除杂质，用粉碎机粉碎成粗粉后用1∶2(W/V)乙醇冷浸24小时，尔后倾出上清液，再加同样量的乙醇同法浸三次，收集并过滤浸液，连通减压装置，在水浴上减压回收乙醇，待无乙醇蒸出后，将蒸馏瓶内的黄色油状液体倒入烧杯中于室温放置一周，将乙醇挥散净后即得浅黄棕色卵油，收率为18％。
1.3.3 中国林蛙卵的丙酮提取
取去掉中国林蛙输卵管后的中国林蛙卵自然干燥，拣除杂质，用粉碎机粉碎成粗粉后用1∶2(W/V)丙酮冷浸24小时，尔后倾出上清液，再加同样量的丙酮同法浸三次，收集并过滤浸液，连通减压装置，在水浴上减压回收丙酮，待无丙酮蒸出后，将蒸馏瓶内的黄色油状液体倒入烧杯中于室温放置一周，将丙酮挥散净后即得浅黄棕色卵油，收率为17％。
1.3.4 中国林蛙卵的氯仿提取
取去掉中国林蛙输卵管后的中国林蛙卵自然干燥，拣除杂质，用粉碎机粉碎成粗粉后用1∶2(W/V)氯仿冷浸24小时，尔后倾出上清液，再加同样量的氯仿同法浸三次，收集并过滤浸液，连通减压装置，在水浴上减压回收氯仿，待无氯仿蒸出后，将蒸馏瓶内的黄色油状液体倒入烧杯中于室温放置一周，将氯仿挥散净后即得浅黄棕色卵油，收率为20％。
1.3.5 中国林蛙卵的石油醚提取
取去掉中国林蛙输卵管后的中国林蛙卵自然干燥，拣除杂质，用粉碎机粉碎成粗粉后用1∶2(W/V)石油醚冷浸24小时，尔后倾出上清液，再加同样量的石油醚同法浸三次，收集并过滤浸液，连通减压装置，在水浴上减压回收石油醚，待无石油醚蒸出后，将蒸馏瓶内的黄色油状液体倒入烧杯中于室温放置一周，将石油醚挥散净后即得浅黄棕色卵油，收率为18％。
1.3.6 中国林蛙卵的CO2超临界提取
取去掉中国林蛙输卵管后的中国林蛙，令其充分阴干，将干燥的卵小心剥出，收集在一起，拣净杂质，将卵粉碎成粗粉，用CO2超临界萃取装置进行萃取。中国林蛙卵粉碎成粗粉，在温度31-33℃，压力35Mpa以上，时间180分钟，以5％乙醇为夹带剂进行提取为最适条件。收率为12％
1.3.5 中国林蛙卵的压榨提取
取去掉中国林蛙输卵管后的中国林蛙卵自然干燥，拣除杂质，将挑选干净的林蛙卵用油(分别用豆油、色拉油、花生油、麻油、月见草油、苏子油、橄榄油等植物油，鱼油、角鲨烯等动物油)浸泡过夜后，用压榨机挤压，得到林蛙卵油溶液。收率为15％。
2 林蛙卵油的制剂方法
2.1 林蛙卵油软胶囊的制备
取林蛙卵油25kg。将原料静置，过滤，滤液与抗氧剂维生素E混合，充氮气后用干热灭菌法灭菌，取原料及明胶溶液经压制法制成软胶囊，每粒软胶囊容量约0.4ml，囊心重约400mg。
2.2 林蛙卵油注射液的制备
林蛙卵油注射液采用林蛙卵油及其他成分和制剂辅料，如稀释剂、乳化剂、助溶剂、抗氧剂等，其他有助于制剂成型和稳定的注射剂辅料也可应用。林蛙卵油注射液配方中各成分的配比为：林蛙卵油5-70％，豆油0-80％，磷脂0-90％，司盘80 0-1％，吐温80 0-1％，甘油0-30％，维生素E 0-5％，注射用水40-70％。
2.3 林蛙卵油胶囊的制备
取林蛙卵油20kg。过滤，滤液用100kg食用碳酸钙吸收，混合均匀，制成1号胶囊，每粒胶囊重300mg。
2.4 林蛙卵油片剂的制备
称取碳酸钙300g，林蛙卵油50g混合均匀。另取淀粉加水制成希糊，加入混合粉末中制成米粒大颗粒，60℃干燥2小时后加入适量滑石粉调整流动性，用压片机10mm冲模(平面直角)压片。片重550mg。
2.5 林蛙卵油纳米干乳的制备、
取林蛙卵油20kg，色拉油20kg，混合均匀，另取磷脂4kg用适量乙醇溶解，吐温80 1kg，波洛沙姆2kg和蒸馏水400kg混合，将油相缓换缓加入水相中制备乳剂。尔后喷雾干燥法制备干乳。用蔗糖10kg、甘露醇10kg、羧甲基纤维素钠10kg的混合物作辅料与林蛙卵油喷雾干粉混合形成干乳。
2.6 林蛙卵油口服液的制备
取磷脂10kg用乙醇溶解制成饱和溶液，加入林蛙卵油10kg，混合均匀，另取吐温80 1kg，蔗糖2kg，溶于蒸馏水40kg中，将林蛙卵油、磷脂乙醇溶液缓慢倒入水相中即得。
3 林蛙卵油的药理研究
3.1 实验材料
3.1.1 动物
昆明种小鼠，鼠龄5-6周，体重18-22g；Wistar大鼠，鼠龄6-7周，体重120～130g，雌雄兼用。均由沈阳药科大学动物室提供，动物合格证为辽实动质字[2000]042号。动物环境设施合格证为辽实动环字[1999]062号。发证机关是辽宁省实验动物管理委员会。动物饲养于温度24±2℃，50-60％相对湿度，12h光照(08:00--20:00h)，12h黑暗，隔音的动物室内，动物自由摄食，饮水。适应上述环境一周后用于实验。
3.1.2 仪器
小动物自发活动记录仪由北京药物所提供。小鼠爬梯，大鼠抬高十字迷宫装置参照《现代药理实验方法》描述的模型要求自制。大鼠高架十字迷路：十字迷宫为木质结构，并漆成黑色。它包括两个50cm×10cm2的相对开臂(openarms)和两个50×10×40cm3的相对闭臂(close arms)，闭臂上部是敞开的。迷宫中央有一10cm×10cm2的开阔部。迷宫离地面50cm。小鼠楼梯：一个封闭的玻璃箱，内有5级2.5cm高的相同楼梯。楼梯侧壁高度保持恒定，以使动物在楼梯的所有水平都有相同的站立分布。
3.2 实验方法和结果
3.2.1 林蛙卵油对小鼠爬梯的影响
小鼠100只，雌雄各半，按体重、性别均衡随机分为5组，灌胃给药。空白对照组(等容量色拉油)、阳性对照组(氯硝安定2mg·kg-1)、林蛙卵油组(1.4、2.8、5.6g·kg-1)，给药30min后将小鼠置于箱的底部，背朝楼梯，用数码摄像机拍摄小鼠行为，实验者离开以减少干扰。记录3min内小鼠爬梯数(以四肢都爬上楼梯为准)和站立数。每天18:00～21:00点红灯下进行实验，每只动物实验结束后迅速清洁实验箱，以排除嗅觉暗示对下一只动物的干扰。
当小鼠被引入一个新环境时会出现焦虑反应，如警觉性行为增加。爬梯行为评价探究行为或活动性的指标，直立则作为焦虑状态的参数，抗焦虑剂在不减少爬梯数的剂量下使站立数减少。从表1可见：服用林蛙卵油组的小鼠与空白对照组比较，爬梯数虽然减少但无显著差异，而站立数却均显著减少。提示林蛙卵油具有抗焦虑作用，且呈一定剂量依赖性关系。
表1 林蛙卵油对小鼠爬梯的影响( x±s)n＝20
组别 剂量(g/kg) 爬梯数 站立数
对照组 - 11.6±3.3 9.9±2.7
氯硝安定 0.002 10.9±2.7 5.5±1.5**
林蛙卵油 1.4 11.1±3.0 8.6±2.9
林蛙卵油 2.8 10.1±3.0 7.0±2.9*
林蛙卵油 5.6 10.4±2.4 5.9±1.9**
与对照组比较，**p＜0.01，*p＜0.05
3.2.2 林蛙卵油不同溶剂提取物抗焦虑活性比较
取小鼠112只，按体重随机分8组，分别为空白对照组ip色拉油10ml/kg，阳性对照组ip.氯硝安定2mg/kg，6组给药组(乙醇提取物、乙醚提取物、丙酮提取物、氯仿提取物、石油醚提取物、CO2超临界萃取物，i.p.400mg/kg)，依照爬梯实验方法确定不同溶剂提取中国林蛙卵所得提取物的抗焦虑活性，
结果表明，各组小鼠爬梯数、梯上站立数均明显减少，提示每种提取物均具有抑制小鼠爬梯活动作用，说明各提取物均具有抗焦虑活性。各组数据比较，动物的爬梯数、梯上站立数没有明显差异，各组提取物对小鼠梯上站立行为的抑制作用普遍强于对爬梯行为的抑制作用。这正是抗焦虑剂的作用特点。在抗焦虑作用的基点上，不同提取物间作用无明显差异。
表2 林蛙卵油不同溶剂提取物抗焦虑活性比较
组别 剂量(mg/kg) 爬梯数 站立数
对照组 - 15.9±5.3 11.6±4.0
氯硝安定 2 8.7±6.3** 3.1±3.1**
CO2超临界 400 10.4±5.4* 5.0±3.7**
乙醇提取物 400 10.8±3.3** 5.6±3.1**
乙醚提取物 400 11.5±5.1* 5.7±4.2**
丙酮提取物 400 11.1±5.0* 5.1±3.8**
氯仿提取物 400 11.3±4.1* 6.3±3.9**
石油醚提取物 400 12.1±3.9* 6.8±2.6**
与对照组比较，**p＜0.01，*p＜0.05
3.2.3 林蛙卵油软胶囊对小鼠爬梯的影响
取小鼠100只，雌雄各半，按体重随机分为5组，分别灌胃(ig)给药。空白对照组(ig色拉油10ml/kg)、阳性对照组(ig氯硝安定2mg/kg)、林蛙卵油组(ig林蛙卵油5.6，2.8，1.4g/kg)，给药30min后记录3min内小鼠爬梯数和站立数。
结果表明服用林蛙卵油软胶囊组的小鼠与空白组小鼠相比较，爬梯数无显著差异，而站立数却均明显减少。提示林蛙卵油软胶囊不减少爬梯数的剂量能使小鼠站立数减少，提示其具有抗焦虑作用(表3)。
表3 林蛙卵油软胶囊对小鼠爬梯的影响
组别 剂量(g/kg) 爬梯数 站立数
对照组 - 11.60±3.35 10.30±3.87
氯硝安定 0.002 11.20±1.45 5.45±2.19**
林蛙卵油软胶囊 5.6 10.15±7.46 5.95±4.45**
林蛙卵油软胶囊 2.8 10.90±6.36 7.25±5.35*
林蛙卵油软胶囊 1.4 14.20±4.68 7.50±4.08*
与对照组比较，**p＜0.01，*p＜0.05
3.2.4 林蛙卵油抗焦虑时效实验
小鼠70只，雌雄各半，按体重、性别均衡随机分为7组，腹腔给药。给林蛙卵油组小鼠剂量均为1.2g·kg-1。分别在给药0min(等容量色拉油)、15、30、60、120、180、240min后将小鼠置于箱的底部，记录3min内小鼠爬梯数和站立数。
结果如表4所示，不同时间给药的受试小鼠的爬梯数无显著差异。腹腔给药15min，小鼠站立数无明显差异，给药30min和60min，小鼠站立数均显著降低，且30min作用较强；120min以后直到240min小鼠站立数随给药时间的延长逐渐增加，提示抗焦虑作用逐渐减弱。
表4 林蛙卵油抗焦虑时效实验( x±s)n＝10
组别 剂量(g/kg) 测定时间(分) 爬梯数 站立数
对照组 - 0 20.4±1.3 15.9±2.8
林蛙卵油 1.2 15 20.0±2.2 14.3±3.5
林蛙卵油 1.2 30 20.0±0.5 11.9±3.1**
林蛙卵油 1.2 60 20.0±1.9 12.6±2.0**
林蛙卵油 1.2 120 20.4±2.2 13.8±3.9
林蛙卵油 1.2 180 21.3±3.0 14.3±4.7
林蛙卵油 1.2 240 20.6±3.1 14.4±4.4
与对照组比较，**p＜0.01，*p＜0.05
3.2.5 林蛙卵油对高架十字迷宫焦虑模型大鼠的影响
大鼠60只，雌雄各半，按体重随机分成5组：空白对照组(灌胃(ig)等容量色拉油)、阳性对照组(ig安定2mg/kg)、林蛙卵油组(ig林蛙卵油4.8，2.4，1.2g/kg)，所有实验在18:00-21:00进行。ig给药30min后，将大鼠置于高架十字迷路中央，头朝闭臂，观察者距离迷宫中心1.2米。记录实验期(5min)内，大鼠分别进入开臂及闭臂的次数和滞留时间(以四肢全部入臂或出臂为准)。观测指标：中央出发室潜伏时和停留时，开放通路和封闭通路连续停留时，开放通路和封闭通路进入次数
大鼠高架十字迷宫实验是利用动物对新异环境的探究特性和对高悬敞开臂的恐惧形成动物的矛盾冲突状态。用于评价动物的焦虑行为，十字迷路离地面50cm相当于人站在峭壁上，大鼠会产生恐惧和不安心理。对照组大鼠进入迷宫后主要停留在闭臂，进入开臂的次数和在开臂的停留时间均短。高、中剂量林蛙卵油能显著延长大鼠在开放通路连续停留时间，各组大鼠在迷宫中央室停留的出发潜伏期无显著性差异；安定组和林蛙卵油组大鼠进入开臂的次数和在开臂的停留时间显著增加；安定组和林蛙卵油组大鼠在闭臂停留的时间与空白对照组比较显著缩短；林蛙卵油组大鼠在中央室停留的时间较空白组显著增加。受试动物在开臂停留时间延长，提示林蛙卵油具有一定的抗焦虑作用，安定也能增加大鼠进入开放通路次数和停留时间(表5)。
表5 高架十字迷宫模型上EORTCD抗焦虑作用
进入开臂次
剂量 动物数 出发潜伏期 开臂停留时 闭臂停留 中央室停留 进入闭臂次数
组别
数(次
(g/kg) (只) (min) (min) ((min) (min) (次/5min)
/5min)
对照组 - 12 1.42±1.61 2.17±4.20 288.75±19.11 3.75±4.88 0.25±0.45 2.67±2.90
安定 0.002 12 1.92±1.98 13.58±12.83 254.08±33.89* 32.33±28.47** 2.00±1.55** 4.42±1.30*
林蛙卵油 4.8 12 1.92±1.98 25.25±27.89** 238.67±44.03* 36.33±28.83** 1.91±1.00** 4.00±1.95*
林蛙卵油 2.4 12 1.92±1.83 19.83±33.02 251.00±51.83* 29.50±28.93** 1.58±2.54 5.00±2.52*
林蛙卵油 1.2 12 1.33±0.49 16.17±21.44 267.00±34.51 16.83±12.04** 1.00±1.13* 3.33±1.44
与对照组相比*P＜0.05，**P＜0.01
具体实施方式：
下述实施例是为了更好的阐述本发明，并不是用来限制发明的范围。
实施例1：
林蛙卵油软胶囊
配方
林蛙卵油 25kg
维生素E 5kg
按一定工艺配成林蛙卵油软胶囊75000粒
制备方法：取林蛙卵油25kg。将原料静置，过滤，滤液与抗氧剂维生素E混合，充氮气后用干热灭菌法灭菌，取原料及明胶溶液经压制法制成软胶囊，每粒软胶囊容量约0.4ml，囊心重约400mg。
实施例2
林蛙卵油注射液
配方
林蛙卵油 50kg
注射用豆油 100kg
磷脂 20kg
司盘80 10kg
吐温80 5kg
维生素E 20kg
甘油 50kg
注射用水 500kg
按一定工艺配成林蛙卵油注射液60万支
制法：按配方量取林蛙卵油、注射用豆油混合后得到油相备用；另将磷脂与甘油分散在注射用水中，制得水相。将油相、司盘80、吐温80和维生素E加入水相中，进行乳化，并用均质机进行均质化，过滤，用1ml安瓶罐装，灭菌，检查，印字，包装。
实施例3
林蛙卵油胶囊
配方
林蛙卵油 20kg
碳酸钙 100kg
按一定工艺配成林蛙卵油胶囊400000粒
制法：取林蛙卵油20kg。过滤，滤液用100kg食用碳酸钙吸收，混合均匀，制成1号胶囊，每粒胶囊重300mg。
实施例4
林蛙卵油片
配方
林蛙卵油 50kg
碳酸钙 300kg
淀粉 20kg
滑石粉 3kg
蒸馏水 50kg
按一定工艺配成林蛙卵油片600000片
制法：称取碳酸钙300g，林蛙卵油50g混合均匀。另取淀粉加水制成希糊，加入混合粉末中制成米粒大颗粒，60℃干燥2小时后加入适量滑石粉调整流动性，用压片机10mm冲模(平面直角)压片。片重550mg。
实施例5
林蛙卵油纳米干乳
配方
林蛙卵油 20kg
色拉油 20kg
磷脂 4kg
吐温80 1kg
波洛沙姆 2kg
蒸馏水 400kg
蔗糖 10kg
甘露醇 10kg
羧甲基纤维素钠 10kg
按一定工艺配成林蛙卵油片600000片
制法：取林蛙卵油20kg，色拉油20kg，混合均匀，另取磷脂4kg用适量乙醇溶解，吐温80 1kg，波洛沙姆2kg和蒸馏水400kg混合，将油相缓换缓加入水相中制备乳剂。尔后喷雾干燥法制备干乳。用蔗糖10kg、甘露醇10kg、羧甲基纤维素钠10kg的混合物作辅料与林蛙卵油喷雾干粉混合形成干乳80kg。
实施例5
林蛙卵油口服液
配方
林蛙卵油 10kg
磷脂 10kg
吐温80 1kg，
乙醇 40kg
蒸馏水 40kg
蔗糖 2kg
按一定工艺配成林蛙卵油片600000片
制法：取磷脂10kg用乙醇溶解制成饱和溶液，加入林蛙卵油10kg，混合均匀，另取吐温80 1kg，蔗糖2kg，溶于蒸馏水40kg中，将林蛙卵油、磷脂乙醇溶液缓慢倒入水相中即得。