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1、10申请公布号CN104099364A43申请公布日20141015CN104099364A21申请号201410334944222申请日20140715C12N15/74200601C12Q1/68200601C12Q1/04200601C12R1/0120060171申请人遵义医学院地址563003贵州省遵义市大连路201号72发明人周必英74专利代理机构贵阳中新专利商标事务所52100代理人吴无惧54发明名称猪带绦虫重组双歧杆菌疫苗稳定性的研究方法57摘要本发明公开了一种猪带绦虫重组双歧杆菌疫苗稳定性的研究方法，其特征在于包括以下步骤（1）分别将猪带绦虫重组质粒PGEXTSO45W4B、。
2、PGEXTSOL18和PGEXTSO45W4BTSOL18与BLONGUM感受态细菌混匀，冰浴后转移至电击杯中，电击完毕后立即将混合液转入到MRS液体培养基的EP管中厌氧培养；将菌液涂布于含氨苄青霉素的MRS琼脂平板上，厌氧培养；（2）挑取上述平板中单个菌落至含氨苄青霉素的MRS液体培养基的EP管中，厌氧培养；将菌液离心，弃上清，沉淀中加入蔗糖溶液重溶菌体沉淀，温浴；抽提质粒为模板，进行PCR鉴定；（3）阳性菌株传代培养的稳定性或阳性菌株不同保存条件的稳定性取上述鉴定的阳性菌株在MRS培养基中传代，每次传代抽提质粒为模板，进行PCR鉴定；或将上述鉴定的阳性菌株分别放置不同温度不同时间后，取出保。
3、存的菌液，抽提质粒，进行电泳鉴定。51INTCL权利要求书1页说明书3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页10申请公布号CN104099364ACN104099364A1/1页21猪带绦虫重组双歧杆菌疫苗稳定性的研究方法，其特征在于包括以下步骤（1）重组质粒电转化长双歧杆菌分别将猪带绦虫重组质粒PGEXTSO45W4B、PGEXTSOL18和PGEXTSO45W4BTSOL18与BLONGUM感受态细菌混匀，冰浴后转移至电击杯中，电击完毕后立即将混合液转入到MRS液体培养基的EP管中厌氧培养；将菌液涂布于含氨苄青霉素的MRS琼脂平板上，厌氧培养；（2）阳性。
4、菌株的PCR鉴定挑取上述平板中单个菌落至含氨苄青霉素的MRS液体培养基的EP管中，厌氧培养；将菌液离心，弃上清，沉淀中加入蔗糖溶液重溶菌体沉淀，温浴；抽提质粒为模板，进行PCR鉴定；（3）阳性菌株传代培养的稳定性或阳性菌株不同保存条件的稳定性取上述鉴定的阳性菌株在MRS培养基中传代，每次传代抽提质粒为模板，进行PCR鉴定；或将上述鉴定的阳性菌株分别放置不同温度不同时间后，取出保存的菌液，抽提质粒，进行电泳鉴定。2根据权利要求1所述的一种猪带绦虫重组双歧杆菌疫苗稳定性的研究方法，其特征在于所述的电击参数设置为电压125KV、场强125KV/CM、电容25F、电阻200、转化时间5MS。3根据权利。
5、要求1所述的一种猪带绦虫重组双歧杆菌疫苗稳定性的研究方法，其特征在于PGEXTSO45W4B、PGEXTSOL18和PGEXTSO45W4BTSOL18分别能在宿主菌BLONGUM中稳定遗传7代、6代和9代。4根据权利要求1所述的一种猪带绦虫重组双歧杆菌疫苗稳定性的研究方法，其特征在于阳性菌株PGEXTSO45W4B/BLONGUM、PGEXTSOL18/BLONGUM和PGEXTSO45W4BTSOL18/BLONGUM在20、80、液氮中保存稳定，保存期限2个月。权利要求书CN104099364A1/3页3猪带绦虫重组双歧杆菌疫苗稳定性的研究方法技术领域0001本发明涉及猪带绦虫重组双歧杆。
6、菌疫苗人工传代后和不同保存条件下的稳定性。背景技术0002猪囊尾蚴病是由猪带绦虫TAENIASOLIUM的中绦期幼虫猪囊尾蚴寄生于人或猪等引起的一种严重危害人类健康和畜牧业生产的人兽共患寄生虫病。我国是高发国家之一，猪囊尾蚴可寄生于人体皮下、肌肉、脑、眼等不同部位，其中脑囊虫病致残率、致死率均较高。该病防治存在化学药物的残留和抗药性问题，随着分子生物学技术的发展，研制疫苗防治该病已成为当前研究的热点。0003TSO45W4B和TSOL18是猪带绦虫六钩蚴阶段特异性表达抗原，具有良好的免疫原性和免疫保护性，是理想的猪带绦虫疫苗候选抗原。重组活载体疫苗是指将编码外源性抗原的基因引入特定的疫苗载体，。
7、构建成能表达相应抗原而且传递至宿主免疫系统引起相应免疫应答的疫苗。双歧杆菌BIDOBACTERIUM,BB是人和哺乳动物肠道重要的益生菌，具有抗菌、抑瘤、免疫调节和营养等多种生理作用。近年来，随着基因工程技术的发展，选择具有益生功能的BB作为载体传递系统，已在细菌、病毒、寄生虫、肿瘤等领域构建了一系列重组双歧杆菌。0004然而，疫苗的稳定性是考核疫苗质量的关键，直接关系到疫苗的质量及生产成本，其研究目的是为证明疫苗产品在某种保存条件下，保存某一段时间后仍然具备可接受的质量、有效性和安全性提供科学依据。同时，传代培养后BB所携带的外源重组质粒稳定存在有助于在体内表达足够的抗原蛋白,经抗原提呈后产。
8、生免疫应答。而在猪带绦虫重组双歧杆菌疫苗稳定性研究方面，尚未见相关报道，因此，本研究拟分别使用猪带绦虫重组质粒PGEXTSO45W4B、PGEXTSOL18和PGEXTSO45W4BTSOL18电穿孔转化长双歧杆菌BLONGUM），获得阳性菌株，进一步研究其人工传代后和不同保存条件下的稳定性，为猪囊尾蚴病疫苗的研发奠定基础。发明内容0005本发明要解决的技术问题是分别使用重组质粒PGEXTSO45W4B、PGEXTSOL18和PGEXTSO45W4BTSOL18转化长双歧杆菌BLONGUM，将获得的阳性菌株传代培养，抽提质粒，使用PCR扩增TSO45W4BTSOL18TSO45W4BTSOL1。
9、8片段，检测其转化后目的基因质粒的稳定性。同时，将获得的阳性菌株分别分别放置不同温度不同时间后，取出保存的菌液，抽提质粒，电泳鉴定，检测菌株质粒是否丢失，从而判断其稳定性。0006本发明的技术方案是猪带绦虫重组双歧杆菌疫苗稳定性的研究方法，包括以下步骤（1）重组质粒电转化BLONGUM分别将猪带绦虫重组质粒PGEXTSO45W4B、PGEXTSOL18和PGEXTSO45W4BTSOL18与BLONGUM感受态细菌混匀，冰浴后转移至电击杯中，电击完毕后立即将混合液转入到MRS液体培养基的EP管中厌氧培养；将菌液涂布于说明书CN104099364A2/3页4含氨苄青霉素的MRS琼脂平板上，厌氧培。
10、养；（2）阳性菌株的PCR鉴定挑取上述平板中单个菌落至含氨苄青霉素的MRS液体培养基的EP管中，厌氧培养；将菌液离心，弃上清，沉淀中加入蔗糖溶液重溶菌体沉淀，温浴；抽提质粒为模板，进行PCR鉴定；（3）阳性菌株传代培养的稳定性或阳性菌株不同保存条件的稳定性取上述鉴定的阳性菌株在MRS培养基中传代，每次传代抽提质粒为模板，进行PCR鉴定；或将上述鉴定的阳性菌株分别放置不同温度不同时间后，取出保存的菌液，抽提质粒，进行电泳鉴定。0007所述的电击参数设置为电压125KV、场强125KV/CM、电容25F、电阻200、转化时间5MS。0008PGEXTSO45W4B、PGEXTSOL18和PGEXT。
11、SO45W4BTSOL18分别能在宿主菌BLONGUM中稳定遗传7代、6代和9代。0009阳性菌株PGEXTSO45W4B/BLONGUM、PGEXTSOL18/BLONGUM和PGEXTSO45W4BTSOL18/BLONGUM在20、80、液氮中保存稳定，保存期限2个月。0010本发明达到的有益效果（1）分别将猪带绦虫重组质粒PGEXTSO45W4B、PGEXTSOL18和PGEXTSO45W4BTSOL18电穿孔转化BLONGUM，获得阳性菌株PGEXTSO45W4B/BLONGUM、PGEXTSOL18/BLONGUM和PGEXTSO45W4BTSOL18/BLONGUM，分别经人工传。
12、代10次，抽提质粒，PCR鉴定，对菌株进行遗传稳定性试验。结果表明，阳性菌株PGEXTSO45W4B/BLONGUM、PGEXTSOL18/BLONGUM和PGEXTSO45W4BTSOL18/BLONGUM在体外传代10次，分别从第8代、第7代和第10代开始出现质粒丢失现象，表明重组质粒分别能在宿主菌BLONGUM中稳定遗传7代、6代和9代，在体外具有不同程度的遗传稳定性。0011（2）分别将猪带绦虫重组质粒PGEXTSO45W4B、PGEXTSOL18和PGEXTSO45W4BTSOL18电穿孔转化BLONGUM，获得阳性菌株PGEXTSO45W4B/BLONGUM、PGEXTSOL18/。
13、BLONGUM和PGEXTSO45W4BTSOL18/BLONGUM，分别放置不同温度不同时间后，取出保存的菌液，抽提质粒，电泳鉴定，对菌株稳定性进行试验研究。结果表明，阳性菌株PGEXTSO45W4B/BLONGUM、PGEXTSOL18/BLONGUM和PGEXTSO45W4BTSOL18/BLONGUM在常温下、4、20、80、196（液氮中）保存48小时、1周、1月、2月，菌株稳定性不一致，在液氮中、80、20中比较稳定，保存2个月也未发现质粒丢失，而在普通的室温环境下，在保存1个月后就开始出现质粒丢失现象，表明本研究构建的猪带绦虫重组BB疫苗低温保存能较好保留其遗传稳定性。具体实施方。
14、式0012本发明的猪带绦虫重组双歧杆菌疫苗稳定性的研究方法，包括以下步骤（1）重组质粒电转化长双歧杆菌BLONGUM）分别将猪带绦虫重组质粒PGEXTSO45W4B、PGEXTSOL18和PGEXTSO45W4BTSOL181G与BLONGUM感受态细菌100L混匀，冰浴1015MIN后转移至至1MM的电击杯中，电击参数设置为电压125KV、场强125KV/CM、电容25F、电阻200、转化时间5MS；电击完毕后立即将混合液转入到900LMRS液体培养基的EP管中，37厌氧培养2H；将菌液涂布于含100G/ML氨苄青霉素的MRS琼脂平板上，37厌氧培养2472H；说明书CN104099364A。
15、3/3页5（2）阳性菌株的PCR鉴定挑取上述平板中单个菌落至1ML含100G/ML氨苄青霉素的MRS液体培养基的EP管中，37厌氧培养2472H；将菌液410000R/MIN离心5MIN，弃上清，沉淀中加入250L25蔗糖溶液重溶菌体沉淀，37温浴30MIN，期间每隔5MIN振荡1次，使其充分反应；抽提质粒为模板，进行PCR鉴定；依据插入基因两端载体上的序列设计引物如下上游引物为P1（5TGGCGACCATCCTCCAAAATC3），下游引物为P2（5TTCACCGTCATCACCGAAACG3）；PCR反应体系上、下游引物各1L，抽提的质粒为模板5L，10PCRBUFFER5L，DNTPMIXTURE4L，MGCL24L，TAQDNAPOLYMERASE05L，DDH2O295L；PCR反应条件94预变性1MIN，94变性30S，50退火35S，72延伸40S，循环扩增30次，最后72延伸5MIN；PCR产物用1琼脂糖凝胶电泳鉴定；（3）阳性菌株传代培养的稳定性取上述鉴定的阳性菌株在MRS培养基中传代10次，每次抽提质粒为模板，进行PCR鉴定，方法同步骤（2）；（4）阳性菌株不同保存条件的稳定性将上述鉴定的阳性菌株分别放置不同温度不同时间后，取出保存的菌液，抽提质粒，进行电泳鉴定。说明书CN104099364A。