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1、10申请公布号CN104087614A43申请公布日20141008CN104087614A21申请号201410314721X22申请日20140703C12N15/85200601C12N7/01200601C12R1/9320060171申请人湖南农业大学地址410128湖南省长沙市芙蓉区东湖湖南农业大学72发明人黄国华李顺姬成小文胡珏刘双清74专利代理机构长沙正奇专利事务所有限责任公司43113代理人何为袁颖华54发明名称一种降低棉铃虫单包埋衣壳核型多角体病毒G4毒株突变率病毒的构建方法57摘要一种降低棉铃虫单包埋衣壳核型多角体病毒G4毒株突变率病毒的构建方法,该方法是以FP25K基因。
2、未发生突变的野生型HASNPVG4毒株的病毒粒子为实验材料;通过构建含FP25K基因的质粒,进行两次定点沉默突变;再通过构建含荧光蛋白的质粒,进行共转染、荧光筛选和空斑纯化后得到突变后的G4病毒。本方法得到的病毒消除了野生型病毒传代时导致高突变率产生的遗传因子,稳定性强。51INTCL权利要求书1页说明书5页序列表62页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页序列表62页附图1页10申请公布号CN104087614ACN104087614A1/1页21一种降低棉铃虫单包埋衣壳核型多角体病毒G4毒株突变率病毒的构建方法,其特征在于,该方法步骤如下A纯化野生。
3、型毒株检测野生型HASNPVG4毒株的FP25K基因是否存在突变,若存在突变,则使用HZAM1细胞进行空斑纯化筛选FP25K基因未突变的病毒粒子作为实验材料;若未发现突变,则直接作为实验材料使用;B构建HAGFP基于FP25K基因两侧的同源两翼片段HAFPA和HAFPB设计引物,分别扩增出HAFPA和HAFPB片段,然后与绿色荧光蛋白基因片段一起构建至PBLUESCRIPTSK载体上得到PAGFPB质粒;该PAGFPB质粒再与步骤A中得到的FP25K基因未突变的野生型G4毒株病毒粒子进行共转染,再通过空斑纯化筛选出同源交换后的带荧光基因的病毒粒子HAGFP;C构建PHAFP25K质粒基于FP2。
4、5K基因两侧的同源两翼片段HAFPA和HAFPB,以HAFPA的F端引物与HAFPB的R端引物扩增出包含HAFPA、FP25K基因和HAFPB的片段,再将其构建到PBLUESCRIPTSK质粒载体上;D定点沉默突变FP25K基因以PHAFP25K质粒为模板,使用定点诱变试剂盒对FP25K基因进行定点沉默突变,分步骤诱变FP25K基因的两个A7MNRS高突变热点;第一次突变将A71TGAAAAAAATCA诱变成TGAGAAAAATCA,得到突变体PFPA71;第二次突变,将A72TTGAAAAAAACT诱变成TTGAAGAAAACT,从而获得不再含有MNRS高突变序列的突变体PFPA72;E构建。
5、HAFP25KA7病毒粒子采用同源重组法,将PFPA72质粒与HAGFPDNA在HZAM1细胞中进行共转染实验,空斑纯化构建HAFP25KA7病毒粒子。2如权利要求1所述的一种降低棉铃虫单包埋衣壳核型多角体病毒G4毒株突变率病毒的构建方法,其特征在于,所述步骤B中,HAFPA片段的两端引物为F5GCGAAGCTTGAGCCACGTGTTTTCGAC3,R5GCGGATATCCCGTAAATTTCTACCGTGTCG3;HAFPB片段两端引物为F5GCGCTCGAGCTACAAGTACGTGTCGCTG3,R5GCGGGATCCTTCGTCGCGGTACGTTTC3。3如权利要求1所述的一种降低。
6、棉铃虫单包埋衣壳核型多角体病毒G4毒株突变率病毒的构建方法,其特征在于,所述步骤D中的第一次突变用的诱变引物为F5GACTCGTGGCAGAAACTGATTTTGAGAAAAATCAC3,R5TTGGACAGTTTCACGCAAATGTGATTTTTCTCAAA3;第二次突变用的诱变引物为F5ACTGCTGAACACAAACAATTATTGAAGAAAACTCG3;R5AGAACGGTAATAGGGCGTCACGAGTTTTCTTCAAT3。4如权利要求1所述的一种降低棉铃虫单包埋衣壳核型多角体病毒G4毒株突变率病毒的构建方法,其特征在于,所述步骤E中最终得到的病毒粒子的FP25K基因中不含有。
7、A7的MNR结构。权利要求书CN104087614A1/5页3一种降低棉铃虫单包埋衣壳核型多角体病毒G4毒株突变率病毒的构建方法技术领域0001本发明属于生物技术领域,涉及一种重组病毒的构建方法,具体涉及一种通过重组病毒的构建来降低棉铃虫单包埋衣壳核型多角体病毒G4毒株突变率的方法。背景技术0002棉铃虫HELICOVERPAARMIGERA是我国主要经济作物上的重要害虫,可造成棉花、烟草、玉米等作物的重大经济损失,甚至绝产。目前,对于棉铃虫的防治主要还是以化学防治为主,也有利用生物防治的方法如微生物杀虫剂和天敌。BT生物农药在刚推广时能够产生很好的防效,但近几年随着棉铃虫抗性的增加,BT的作。
8、用已经逐渐不明显。另外,种植抗虫棉也为棉铃虫的防治提供了一条更好的渠道,但随之而来的转基因、抗性问题也不断凸显。000370年代,我国自主研发的第一个昆虫病毒制剂棉铃虫核型多角体病毒投入生产,并在过去的几十年中取得了很好的防效。昆虫病毒由于其宿主特异性、环境安全与人畜无害等特点,在害虫综合治理中是一条理想的生物防治途径。棉铃虫病毒包括单包埋多角体病毒SNPV、多包埋多角体病毒MNPV和质型多角体病毒CPV,其中,棉铃虫单包埋核型多角体病毒HASNPV的防控作用最为明显。0004核型多角体病毒隶属于杆状病毒,是一类专性感染节肢动物的病毒。杆状病毒具有两种不同的病毒粒子形态一种为出芽型病毒粒子BU。
9、DDEDVIRUS,BV,主要介导细胞之间的系统感染,通过受体介导的内吞作用入侵细胞;另一种为包埋型病毒粒子OCCLUSIONDERIVEDVIRUS,ODV,在病毒的口服感染过程中,节肢动物肠道碱性环境能够溶解包埋型病毒粒子的外壳,萌发成具有侵染能力的病毒,并感染肠道细胞达到病毒传播。0005HASNPV为中科院武汉病毒研究所1975年从湖北省棉田中分离得到。其病毒多角体形状为不规则的多边形、近圆形的颗粒,直径为0692141M,一般包含3558个病毒粒子。其病毒粒子为杆状,单个随机包埋于多角体中。2000年,人们测定了HASNPVG4毒株的全基因组序列。其基因组大小为131,403BP,编。
10、码135个开放阅读框OPENREADINGREGION,ORF,含有5个同源区HOMOLOGOUSREGIONS,HRS。在135个ORF中,有20个ORF被认为是HASNPV特有的基因。0006全基因组的发表使得HASNPV的研究在分子水平上逐渐深入。人们发现,杆状病毒中一个编码25KDA蛋白的基因FP25K能够使病毒在产生ODV时包埋变小。如ACMNPV一般在感染昆虫细胞时能够产生大量多角体,一般5080个/细胞,但FP25K突变的ACMNPV感染昆虫细胞后,每个细胞所产生的多角体少于10个,多角体中包埋的ODV粒子也比野生型明显减少;但是,BV的产量却比野生型病毒提高。0007根据过去的。
11、研究基础人们发现,HASNPV的FP25K基因的突变主要是由该基因内单核苷酸重复序列MONONUCLEOTIDEREPEATS,MNRSA7的碱基插入导致,即在杆状病毒复制增殖过程中该区域的错误碱基插入,原本连续的7个A变成8个A。并且,在HASNPV连续传说明书CN104087614A2/5页4代的过程中,这种突变连续几代就趋于稳定。可见,FP25K基因突变不利于病毒在虫体内的增殖,不利于病毒的传播。发明内容0008本发明所要解决的技术问题是针对野生型棉铃虫单包埋核型多角体病毒HASNPVG4毒株进行连续传代后多角体产量降低、病毒粒子被包埋效率降低及毒性活力降低等情况,提供一种降低棉铃虫单包。
12、埋衣壳核型多角体病毒G4毒株突变率病毒的构建方法,该方法通过分子生物学理论及手段,获得HAFP25KA7毒株,较FP25K基因未突变的野生型HASNPV而言,具有更强稳定性持续维持多角体的产量和病毒粒子的被包埋效率以及低的LD50值。0009为了解决上述技术问题,本发明所采用的技术方案是一种降低棉铃虫单包埋衣壳核型多角体病毒G4毒株突变率病毒的构建方法,该方法步骤如下00101纯化野生型毒株包括野生型HASNPVG4病毒的扩繁、基因扩增及测序、病毒纯化,其中,0011病毒的扩繁将野生型HASNPVG4中科院武汉病毒研究所提供,以下简称G4于棉铃虫体内进行扩繁,收集病虫尸体进行提纯,得到大量病毒。
13、多角体该过程为现有技术。0012基因扩增及测序提取病毒DNA,以FP25K基因侧翼设计引物、G4DNA作为模板PCR扩增FP25K基因并测序,若显示A7、A8两种单核苷酸重复序列MNRS同时存在则证明FP25K已突变,若只有A7一种MNR则证明FP25K没有突变。0013病毒纯化根据测序结果,若发现有突变,使用HZAM1细胞进行空斑纯化筛选FP25K基因未突变的病毒粒子作为实验材料;若未发现突变,则直接作为实验材料使用。00142构建HAGFP包括构建PAGFPB质粒与筛选HAGFP,其中,0015构建PAGFPB质粒基于FP25K基因两侧的同源两翼片段HAFPA和HAFPB设计引物,分别扩增。
14、出HAFPA和HAFPB片段。然后以限制性内切酶消化HAFPA、HAFPB片段、绿色荧光蛋白基因片段以及PBLUESCRIPTSK载体,使这四者之间具有相应的黏性末端,然后一起构建至载体上得到PAGFPB质粒。0016筛选HAGFPPAGFPB质粒与步骤1中得到的FP25K基因未突变的野生型G4毒株病毒粒子进行共转染,再通过空斑纯化筛选出同源交换后的带荧光基因的病毒粒子HAGFP。00173构建PHAFP25K质粒基于FP25K基因两侧的同源两翼片段HAFPA和HAFPB,以HAFPA的F端引物与HAFPB的R端引物扩增出包含HAFPA、FP25K基因和HAFPB的片段,再将其构建到PBLUE。
15、SCRIPTSK质粒载体上;00184定点沉默突变PHAFP25K质粒上的FP25K基因以PHAFP25K质粒为模板,使用定点诱变试剂盒QUICKCHANGE,STRATAGENE对FP25K基因进行定点沉默突变,分步骤诱变FP25K基因的两个A7MNRS高突变“热点”。第一次突变将A71TGAAAAAAATCA诱变成TGAGAAAAATCA,得到突变体PFPA71;第二次突变,将A72TTGAAAAAAACT诱变成TTGAAGAAAACT,从而获得不再含有MNRS高突变序列的突变体PFPA72。00195构建HAFP25KA7病毒粒子采用同源重组法,将PFPA72质粒与HAGFPDNA在HZ。
16、AM1细胞中进行共转染实验,空斑纯化构建HAFP25KA7病毒粒子,该HAFP25KA7病说明书CN104087614A3/5页5毒的全基因组DNA序列如SEQIDNO1所示其FP25K基因中不再含有A7的MNR结构。0020如此,本方法通过构建含FP25K基因的质粒进行两次定点沉默突变,构建含荧光蛋白的质粒共转染、荧光筛选和空斑纯化得到FP25K基因中不再含有A7的MNR结构的G4病毒。本方法得到的病毒消除了野生型病毒传代时导致高突变率的遗传因子,稳定性强。附图说明0021图1是本发明PHAFP25K质粒上的FP25K基因在沉默定点突变后两个突变位点的测序结果。0022其中A1、B1分别为A。
17、71、A72突变前的测序结果,带下划线碱基为待突变位点。A2、B2分别为A71、A72突变后的测序结果,可见A1、B1下划线碱基在A2、B2中都已被突变为G,证明突变成功。0023图2是HAGFP病毒和PFPA72质粒共转染HZAM1细胞后的荧光筛选,0024其中A为共转染时相差显微镜下的宿主细胞形态;B为调整至荧光显示状态下的宿主细胞形态,箭头指示显绿色荧光信号的细胞,即HAGFP;C为两种视图结合后的宿主细胞形态,箭头指示位置不变,不显示荧光信号的细胞则含有HAFP25KA7,即本发明最终得到的病毒。具体实施方式0025本方法适用于含有FP25K基因中显示有单核苷酸重复序列MNR的杆状病毒。
18、,只需在FP25K基因两边的同源两翼根据病毒序列设计合适的引物即可。下面以棉铃虫单包埋核型多角体病毒G4毒株为例,对本方法做具体说明。00261纯化野生型G4毒株0027野生型HASNPVG4毒株由中科院武汉病毒研究所提供。先经棉铃虫幼虫体内扩繁,收集病虫尸体进行提纯,得到大量病毒多角体,然后对病毒多角体做一个简单的血球计数板计数,得到初步浓度。0028按OREILLY1992年的方法提取病毒DNA,然后取1L病毒DNA作为模板,以FP25K基因两端设计的引物F5GCGAAGCTTGAGCCACGTGTTTTCGAC3如SEQIDNO2所示;R5GCGGGATCCTTCGTCGCGGTACGT。
19、TTC3如SEQIDNO3所示对其进行PCR扩增,反应体系为5LPFUBUFFER10、4LDNTP25NMOL、125LF端引物20M、125LR端引物20M、05LPFU酶、1L模板DNA及37LDDH2O;反应程序为94预变性5MIN,94变性1MIN,55退火1MIN,68延伸1MIN,共35个循环。PCR结束以后,以70酒精溶液沉淀DNA,4保存备用。0029得到的PCR产物经电泳鉴定后胶回收,并以电击法转化大肠杆菌,得到的阳性菌落提取质粒,直接用于测序。测序结果显示90的为A7MNRS,但有少量A8MNRS,采用空斑纯化法进行纯化。空斑纯化步骤如下0030将已准备好的HZAM1细胞。
20、消化均匀铺于24孔板中,每个孔中分别接种1105个细胞。0031待细胞汇合度达到90后,弃掉孔中的培养液,根据最初的病毒浓度,用TC100培养基将病毒做一系列的10倍稀释,在每个孔中加入100L稀释液,置37吸附说明书CN104087614A4/5页62小时后弃残液。0032制备2的琼脂糖,置4050水浴待用。0033将上述琼脂糖和双倍维持液11混合后,加入培养板各孔,每孔2ML,使冷却凝固成覆盖层。0034把培养板倒置,在37含5CO2培养箱培养48H。0035制备含0002中性红的2琼脂糖双倍维持液11,置4050水浴待用。0036吸取上述琼脂加入培养板各孔,每孔2ML,使冷却凝固成第二覆。
21、盖层。0037把培养板倒置,在37二氧化碳培养箱继续培养,48小时内观察结果。0038随机挑出蚀斑下的细胞,保存于4备用。0039取空斑纯化后保存的细胞,提取DNA作为模板,以上述同样方法对FP25K基因进行PCR扩增,得到的扩增产物经电泳、胶回收、克隆转化,得到的阳性质粒用于测序。选取仅含有A7MNRS的6号空斑对应的病毒,该病毒命名为HAP6。00402构建HAGFP0041该步骤又细分为两个步骤,第一步先构建PAGFPB质粒,第二步将构建好的PAGFPB质粒与HAP6共转染细胞,筛选出重组的HAGFP。0042构建PAGFPB0043AHAFPA与HAFPB的扩增对FP25K两翼同源片段。
22、HAFPA与HAFPB分别进行PCR扩增。HAFPA片段的两端引物为F5GCGAAGCTTGAGCCACGTGTTTTCGAC3如SEQIDNO4所示;R5GCGGATATCCCGTAAATTTCTACCGTGTCG3如SEQIDNO5所示;HAFPB片段两端引物为F5GCGCTCGAGCTACAAGTACGTGTCGCTG3如SEQIDNO6所示;R5GCGGGATCCTTCGTCGCGGTACGTTTC3如SEQIDNO7所示。引物序列下划线部分分别代表限制性内切酶的酶切位点,按顺序依次是HINDIII、ECORV、XHOI和BAMHI。A片段和B片段的PCR反应体系为5LPFUBUFFE。
23、R10、4LDNTP25NMOL、125LF端引物20M、125LR端引物20M、05LPFU酶、1L模板DNA及37LDDH2O。反应程序为94预变性5MIN,94变性1MIN,55退火1MIN,68延伸1MIN,共35个循环。0044所得到的产物经电泳检测确认片段大小,然后将胶块切下,按照GLASSMILK试剂盒说明进行胶回收,分别连接至PBLUESCRIPTSK载体上,克隆转化确认产物,将阳性质粒提取后保存备用。0045BPAGFPB的构建由于HAFPA,HAFPB片段两端分别有HINDIII、ECORV、XHOI以及BAMHI位点,因此分别用以上酶消化上述得到的含两片段阳性质粒;以EC。
24、ORV和XHOI消化保存GFP基因片段的质粒;再以HINDIII与BAMHI消化载体,载体得到与HAFPA左端、HAFPB右端相同的缺口,而HAFPA的右端、HAFPB的左端分别与GFP基因片段具有相同的黏性末端。对所有消化产物进行电泳,按照GLASSMILK试剂盒的说明进行DNA回收。回收产物添加连接酶构成连接体系,连接过夜后以电击法转化大肠杆菌,以氨苄青霉素平板进行筛选,得到的阳性菌落再经HAFPA左端、HAFPB右端的引物进行菌落PCR的鉴定,提取正确阳性菌落的质粒,命名为PAGFPB。0046PAGFPB与HAP6的共转染按照LIPOFECTINE试剂说明,将1104个HZAM1细胞接。
25、种于35MM培养皿中,培养1620H,待细胞生长至50丰度,用无血清TC100培养说明书CN104087614A5/5页7基洗细胞2次待用。准备质粒DNA/脂质体复合物,即溶液A质粒PAGFPB2G,野生病毒HAP61G加入无血清TC100培养基补充体积至100L与溶液B脂质体5L,加入95L无血清TC100培养基。将溶液A和溶液B混匀,室温静置15MIN后,加入800L的无血清TC100培养基轻轻混匀。吸尽35MM培养皿中的培养基,然后逐滴加入质粒DNA/脂质体复合物。37培养12H。加含有20胎牛血清1MLTC100培养基1ML,继续培养48H后,采用倒置荧光显微镜观察细胞。经空斑纯化筛选。
26、后得到纯的重组病毒,命名为HAGFP。00473构建PHAFP25K质粒0048以HAP6DNA为模板,用FP25K基因两端引物HAFPA的F端引物与HAFPB的R端引物进行PCR扩增,得到的PCR产物经电泳验证,切胶回收,然后构建连接体系将PCR产物连接于PBLUESCRIPTSK载体上,经电击法转化大肠杆菌,挑取阳性质粒,用FP25K两端引物进行菌落PCR验证阳性,经验证正确的菌落用来提取质粒,从而将其命名为PHAFP25K质粒。00494定点沉默突变FP25K基因0050本步骤包含两个具体步骤,第一步先将A71TGAAAAAAATCA诱变成TGAGAAAAATCA,得到突变体PFPA71。
27、;第二次突变,将A72TTGAAAAAAACT诱变成TTGAAGAAAACT,从而获得不再含有MNRS高突变序列的突变体PFPA72。0051A71的诱变以PHAFP25K质粒为模板,以诱变引物A71F5GACTCGTGGCAGAAACTGATTTTGAGAAAAATCAC3如SEQIDNO8所示;R5TTGGACAGTTTCACGCAAATGTGATTTTTCTCAAA3如SEQIDNO9所示进行第一次的定点沉默突变,PCR反应体系为5LPFUBUFFER10、4LDNTP25NMOL、125LF端引物20M、125LR端引物20M、1LPFU酶、1L模板DNA、365LDDH2O。反应程序。
28、为95预变性30S,95变性30S,55退火1MIN,68延伸5MIN,18个循环。0052得到的PCR产物经克隆转化后测序,得到如图1A2所示结果,在下划线碱基出显示诱变成功,由A诱变成G,该质粒命名为PFPA71。0053A72的诱变以PFPA71质粒为模板,以诱变引物A72F5ACTGCTGAACACAAACAATTATTGAAGAAAACTCG3如SEQIDNO10所示;R5AGAACGGTAATAGGGCGTCACGAGTTTTCTTCAAT3如SEQIDNO11所示进行第一次的定点沉默突变,PCR反应体系与程序同上。0054为去除产物中原有质粒,在PCR结束之后,在PCR管中添加1。
29、LDPNI混匀,于37下保存1H,然后沉淀DNA,测序,得到如图1B2所示结果,在下划线碱基出显示诱变成功,由A诱变成G,该质粒命名为PFPA72。00555构建HAFP25KA7病毒粒子0056利用杆状病毒同源重组的原理,以带荧光标记基因HAGFP病毒和PFPA72共转染HZAM1细胞,步骤同2中的,结合参见图2,最终空斑纯化而来的病毒命名为HAFP25KA7,即为所需病毒其全基因组的FP25K基因中不再含有A7的MNR结构,病毒的全基因组DNA序列如SEQIDNO1所示。说明书CN104087614A1/62页800010002序列表CN104087614A2/62页90003序列表CN1。
30、04087614A3/62页100004序列表CN104087614A104/62页110005序列表CN104087614A115/62页120006序列表CN104087614A126/62页130007序列表CN104087614A137/62页140008序列表CN104087614A148/62页150009序列表CN104087614A159/62页160010序列表CN104087614A1610/62页170011序列表CN104087614A1711/62页180012序列表CN104087614A1812/62页190013序列表CN104087614A1913/62页20。
31、0014序列表CN104087614A2014/62页210015序列表CN104087614A2115/62页220016序列表CN104087614A2216/62页230017序列表CN104087614A2317/62页240018序列表CN104087614A2418/62页250019序列表CN104087614A2519/62页260020序列表CN104087614A2620/62页270021序列表CN104087614A2721/62页280022序列表CN104087614A2822/62页290023序列表CN104087614A2923/62页300024序列表CN1。
32、04087614A3024/62页310025序列表CN104087614A3125/62页320026序列表CN104087614A3226/62页330027序列表CN104087614A3327/62页340028序列表CN104087614A3428/62页350029序列表CN104087614A3529/62页360030序列表CN104087614A3630/62页370031序列表CN104087614A3731/62页380032序列表CN104087614A3832/62页390033序列表CN104087614A3933/62页400034序列表CN104087614A4。
33、034/62页410035序列表CN104087614A4135/62页420036序列表CN104087614A4236/62页430037序列表CN104087614A4337/62页440038序列表CN104087614A4438/62页450039序列表CN104087614A4539/62页460040序列表CN104087614A4640/62页470041序列表CN104087614A4741/62页480042序列表CN104087614A4842/62页490043序列表CN104087614A4943/62页500044序列表CN104087614A5044/62页510。
34、045序列表CN104087614A5145/62页520046序列表CN104087614A5246/62页530047序列表CN104087614A5347/62页540048序列表CN104087614A5448/62页550049序列表CN104087614A5549/62页560050序列表CN104087614A5650/62页570051序列表CN104087614A5751/62页580052序列表CN104087614A5852/62页590053序列表CN104087614A5953/62页600054序列表CN104087614A6054/62页610055序列表CN104087614A6155/62页620056序列表CN104087614A6256/62页630057序列表CN104087614A6357/62页640058序列表CN104087614A6458/62页650059序列表CN104087614A6559/62页660060序列表CN104087614A6660/62页670061序列表CN104087614A6761/62页680062序列表CN104087614A6862/62页69序列表CN104087614A691/1页70图1图2说明书附图CN104087614A70。