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1、10申请公布号CN104086645A43申请公布日20141008CN104086645A21申请号201410314633X22申请日20140703C07K14/765200601C07K14/47200601C07K1/3420060171申请人成都蓉生药业有限责任公司地址610041四川省成都市高新区起步园科园南路7号72发明人杨宇杨汇川余鼎吕家成兰学渊74专利代理机构成都高远知识产权代理事务所普通合伙51222代理人李高峡杜朗宇54发明名称人血白蛋白和球蛋白的制备方法57摘要本发明提供了人血白蛋白和球蛋白的制备方法,其中,在制备FIIIIII沉淀或FIIIIII上清的压滤过程中,使。
2、用PALL50P滤板,滤板的用量为1013M2/1000L血浆;采用硅藻土为助滤剂,硅藻土的用量为4555G血浆蛋白/1G硅藻土;所述硅藻土中,SIO2含量为960987,AL2O3含量为0612、FE2O3含量为0304,酸溶物质含量为005012,水溶物质含量为015020。本发明研究表明,采用本发明方法制备FIIIIII沉淀或上清过程中,所得产品中球蛋白和白蛋白的含量大幅提高,并且,过滤过程中流量、压力以及滤液浊度均优于使用C503型硅藻土助滤的现有制备方法。51INTCL权利要求书1页说明书9页附图5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书9页附图5页10。
3、申请公布号CN104086645ACN104086645A1/1页21人血白蛋白和球蛋白的制备方法,它是以血浆为原料,经低温乙醇法分别依次制备得到FIIIIII上清和FIIIIII沉淀、FIV上清和FIIII上清、FV沉淀和FII沉淀,取FV沉淀和FII沉淀,精制,分别得到白蛋白和球蛋白;其特征在于在制备FIIIIII沉淀或FIIIIII上清的压滤过程中,使用PALL50P滤板,滤板的用量为1013M2/1000L血浆;采用硅藻土A为助滤剂与待滤液混匀,硅藻土A的用量为4555G血浆蛋白/1G硅藻土A;所述硅藻土A中,SIO2含量为960987,AL2O3含量为0612、FE2O3含量为030。
4、4,酸溶物质含量为005012,水溶物质含量为015020。2根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于所述硅藻土A中,SIO2含量为960962,AL2O3含量为1012、FE2O3含量为0304,酸溶物质含量为005012,水溶物质含量为015020。3根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于所述硅藻土A的比表面积为2223M2/G,优选为2228M2/G。4根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于所述硅藻土A的离心湿密度为023024G/CM2,优选为0237G/CM2。5根据权利要求14任意一项所述的制备方法,其特征在于所述硅藻土A的型号为CELPURE1000。6根据权利要求1。
5、5任意一项所述的制备方法,其特征在于制备白蛋白过程中,FIV上清和FV沉淀的制备方法如下FIV上清的制备以FIIIIII上清为原料,经过低温乙醇法分离FIV,压滤,取上清即得;所述压滤过程中,使用PALL50P滤板,滤板的用量为1013M2/1000L血浆;采用硅藻土A和珍珠岩为助滤剂与待滤液混匀,硅藻土A的用量为3035GFIIIIII上清液蛋白/1G硅藻土;珍珠岩的用量为2030GFIIIIII上清蛋白/1G珍珠岩;FV沉淀的制备取FIV上清经过低温乙醇法分离FV,压滤,取沉淀即得;分离FV后的压滤过程中,使用PALL50P滤板,滤板的用量为1013M2/1000L血浆;采用硅藻土A为助滤。
6、剂,其中,预涂层所用硅藻土A为4060G/平方米滤板,待滤液中硅藻土A的用量为1015G/L血浆;制备球蛋白过程中,FIIII上清和FII沉淀的制备方法如下FIIII上清的制备取FIIIIII沉淀,经过低温乙醇法分离提取FIIII,压滤,取上清即得;所述压滤过程中,采用BECOSTERILPR40滤板,滤板用量为1013M2/1000L血浆;以硅藻土A为助滤剂与待滤液混匀,硅藻土A用量为89G/L血浆;FII沉淀的制备取FIIII上清经过低温乙醇法分离FII,压滤,取沉淀即得;分离FII后的压滤过程中,使用PALL50滤板,滤板的用量为510M2/1000L;采用硅藻土A为助滤剂,预涂层所用硅。
7、藻土A为8095G/M2滤板,待滤液中硅藻土A的用量为0203G/L血浆。7权利要求16任意一项所述方法制备的白蛋白和球蛋白。8血液制品中FIIIIII沉淀或FIIIIII上清的制备方法,它是以血浆为原料,经过低温乙醇法分离提取FIIIIII,压滤,分取沉淀或上清即得,其特征在于所述压滤过程中,使用PALL50P滤板,滤板的用量为1013M2/1000L血浆;采用硅藻土A为助滤剂与待滤液混匀,硅藻土A的用量为4555G血浆蛋白/1G硅藻土A。权利要求书CN104086645A1/9页3人血白蛋白和球蛋白的制备方法技术领域0001本发明涉及人血白蛋白和球蛋白的制备方法。背景技术0002人血白蛋白。
8、是目前产量最大、用量最大的蛋白质药物。其具有维持人体内血液渗透压和携带血液中多种配基包括脂肪酸、氨基酸、类固醇、金属离子及药物与组织交换等生理功能,临床用于手术输血、危重病人补液、创伤休克、低蛋白血症、红细胞过多症、发烧和水肿等,并且可增强人体抵抗力,是重要的临床药物。目前,国内人血白蛋白的规模化生产主要使用低温乙醇法从健康人血浆中分离纯化白蛋白,例如医学生物制品学第二版,人民卫生出版社、血液制品学第二版,人民卫生出版社、CN2011100307783、CN2011102237605、CN2012100132270、CN2011100307764等,通常使用的分离流程见图1,其中,组分I又称F。
9、I主要含有纤维蛋白原,组分IIII又称FIIIII主要含有丙球、凝血酶原和纤溶酶原,组分II又称FII主要含有球蛋白,组分V又称FV主要含有白蛋白,低温乙醇法过程相对简单,产量较高,可以进行大规模的生产,在世界范围内得到了广泛的应用。0003使用压滤技术进行固液相分离是目前多数国内外血液制品厂家用于低温乙醇分离工艺组分分离的方法。压滤通常会使用助滤剂,其粒间隙也构成复杂的迷宫结构,当制品溶液冲击滤板时,主要通过静电吸附和机械阻挡的方式来捕捉固体成分,由助滤剂形成的滤饼层和深层滤板成为捕捉固体沉淀颗粒的重要场所。滤板应有适当的孔径,以便能在截留助滤剂颗粒以形成结实的滤饼层的同时给制品溶液的流动带。
10、来最小的阻力。0004压滤工艺的主要控制参数包括滤板过滤介质类型、助滤剂类型和用量的选择、过滤温度、过滤前洗缓冲液和过滤回洗缓冲液的成分和理化条件等。0005其中,助滤剂种类繁多,其主要功能是吸附沉淀颗粒、帮助过滤,还可提升最终产品的安全性和质量。助滤剂的选择通常可以考虑滤过液的浊度要求、生产能力、产品的回收率、产品的稳定性和纯度等方面的要求,以及去除产品溶液中特别成份的需要。目前血液制品生产常用的助滤剂有硅藻土和珍珠岩等。硅藻土是古代单细胞硅藻遗骸沉积物,具有质轻、多孔、高强、耐磨、绝缘、绝热、吸附及填充等一列优良性能,具有良好的化学稳定性。硅藻土助滤剂的主要优点是具有良好的微孔结构、吸附性。
11、能和抗压缩性能,不仅能使被滤液体获得较好的流速比,并且能滤除微细的悬浮物,保证了澄清度。0006血液制品中添加助滤剂的主要目的是提高过滤性能、提高滤液澄清度、降低滤液浊度、吸附热原质、脂类、蛋白酶和变性蛋白,从而保证制品质量。助滤剂通过以下方式达到助滤和吸附的作用00071机械截留作用助滤剂形成的滤饼产生众多的孔隙以及形成孔隙与孔隙之间的间隔层,液体流经滤饼时能够截留其中的悬浮粒子,包括0008A表面过滤作用固液相分离发生在过滤介质的表面,当液体中悬浮固体颗粒的粒径大于硅藻土/珍珠岩的孔径时被截留在助滤剂表面。说明书CN104086645A2/9页40009B深层过滤效应固液相分离发生在过滤介。
12、质的内部当液体中悬浮固体颗粒的粒径小于硅藻土/珍珠岩的孔径时,比较小的固体颗粒穿过滤饼表面进入介质内部,介质内部曲折的微孔沟道和更细小的孔隙能够截留这些颗粒。2吸附作用产生吸附作用的主要原因包括范德华力、ZETA电位和离子交换作用,包括0010A液体中的悬浮粒子形成的链团粘附于硅藻土/珍珠岩而被截留;0011B比硅藻土/珍珠岩内部孔径小的悬浮粒子进入到硅藻土/珍珠岩内部表面因相反电荷吸附而被截留。0012虽然硅藻土是血液制品中常用的助滤剂之一,然而,硅藻土品种繁多,由于不同硅藻土的原料、加工方式等差异,使得不同硅藻土产品在成分含量和性能上产生了较大区别。发明内容0013本发明的目的在于提供一种。
13、人血白蛋白和球蛋白的制备方法。本发明的另一目的在于提供血液制品中FIIIIII沉淀或FIIIIII上清的制备方法。0014具体地,本发明提供了人血白蛋白和球蛋白的制备方法,它是以血浆为原料,经低温乙醇法分别依次制备得到FIIIIII上清和FIIIIII沉淀、FIV上清和FIIII上清、FV沉淀和FII沉淀,取FV沉淀和FII沉淀,精制,分别得到白蛋白和球蛋白;与现有技术不同的是,在制备FIIIIII沉淀或FIIIIII上清的压滤过程中,使用PALL50P滤板,滤板的用量为1013M2/1000L血浆;采用硅藻土A为助滤剂与待滤液混匀,硅藻土A的用量为4555G血浆蛋白/1G硅藻土;所述硅藻土A。
14、中,SIO2含量为960987,AL2O3含量为0612、FE2O3含量为0304,酸溶物质含量为005012,水溶物质含量为015020。0015在目前的血浆制品领域中,FIIIIII沉淀主要用于免疫球蛋白的生产,FIIIIII上清主要用于生产蛋白酶抑制剂和白蛋白等。因此,FIIIIII上清和沉淀的制备式生产白蛋白、球蛋白等血浆制品的重要中间步骤。0016进一步地,所述硅藻土A中,SIO2含量为960962,AL2O3含量为1012、FE2O3含量为0304,酸溶物质含量为005012,水溶物质含量为015020。0017其中,所述硅藻土A的比表面积为2223M2/G,优选地,所述硅藻土A的。
15、比表面积为2228M2/G。0018其中,所述硅藻土A的离心湿密度为023024G/CM2,优选为0237G/CM2。0019优选地,所述硅藻土A的型号为CELPURE1000。0020进一步地,制备白蛋白过程中,FIV上清和FV沉淀的制备方法如下0021FIV上清的制备以FIIIIII上清为原料,经过低温乙醇法分离FIV,压滤,取上清即得;所述压滤过程中,使用PALL50P滤板,滤板的用量为1013M2/1000L血浆;采用硅藻土A和珍珠岩为助滤剂与待滤液混匀,硅藻土A的用量为3035GFIIIIII上清液蛋白/1G硅藻土A;珍珠岩的用量为2030GFIIIIII上清蛋白/1G珍珠岩;002。
16、2FV沉淀的制备取FIV上清经过低温乙醇法分离FV,压滤,取沉淀即得;分离FV后的压滤过程中,使用PALL50P滤板,滤板的用量为1013M2/1000L血浆;采用硅藻土A为助滤剂,其中,预涂层所用硅藻土A为4060G/平方米滤板,待滤液中硅藻土A的用量为10说明书CN104086645A3/9页515G/L血浆;0023制备球蛋白过程中,FIIII上清和FII沉淀的制备方法如下0024FIIII上清的制备取FIIIIII沉淀,经过低温乙醇法分离提取FIIII,压滤,取上清即得;所述压滤过程中,采用BECOSTERILPR40滤板,滤板用量为1013M2/1000L血浆;以硅藻土A为助滤剂与待。
17、滤液混匀,硅藻土A用量为89G/L血浆;0025FII沉淀的制备取FIIII上清经过低温乙醇法分离FII,压滤,取沉淀即得;分离FII后的压滤过程中,使用PALL50滤板,滤板的用量为510M2/1000L;采用硅藻土A为助滤剂,预涂层所用硅藻土A为8095G/平方米滤板,待滤液中硅藻土A的用量为0203G/L血浆。0026其中,本发明制备方法中,各个步骤中的压滤流速和滤板压力为00270028本发明还提供了上述方法制备的白蛋白和球蛋白。0029本发明还提供了血液制品中FIIIIII沉淀或FIIIIII上清的制备方法,它是以血浆为原料,经过低温乙醇法分离提取FIIIIII,压滤,分取沉淀或上清。
18、即得,所述压滤过程中,使用PALL50P滤板,滤板的用量为1013M2/1000L血浆;采用硅藻土A为助滤剂与待滤液混匀,硅藻土A的用量为4555G血浆蛋白/1G硅藻土A。0030本发明方法采用特定的硅藻土、滤板种类和用量制备FIIIIII沉淀或上清,所得产品中球蛋白和白蛋白的含量大幅提高,并且,过滤过程中流量、压力以及滤液浊度均优于使用C503型硅藻土助滤的现有制备方法。0031本发明采用特定的硅藻土、滤板种类和用量对白蛋白和球蛋白制备过程进行改良后,有效提高了白蛋白和球蛋白收率,显著增加了商品利润,为企业带来的商业价值不可估量。0032另外,本发明方法所得球蛋白成品中,IGA含量明显降低,。
19、可降低患者发生IGA抗原抗体不良反应的几率,从而提高产品安全性。0033显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。0034以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明说明书CN104086645A4/9页60035图1血浆制品的常规生产流程图0036图2本发明生产流程图0037图3使用C503型硅藻土助滤的现有技术生产流程图0038图4FIIIIII上。
20、清液电泳图谱,其中,A为本发明方法所得到的FIIIIII上清液电泳图谱,B为使用C503硅藻土助滤的现有方法得到的FIIIIII上清液电泳图谱。0039图5FIIIIII沉淀电泳图谱,其中,A为本发明方法所得到的FIIIIII沉淀电泳图谱,B为使用C503硅藻土助滤的现有方法得到的FIIIIII沉淀电泳图谱。具体实施方式0040本发明所用硅藻土均购自于IMERYSPERLITECHINA,INC。0041实施例1本发明FIIIIII上清或沉淀的制备方法0042取血浆,经过低温乙醇法对FIIIIII进行分离,再使用PALL50P滤板,同时以CELPURE1000硅藻土为助滤剂与待滤液混匀,进行压。
21、滤,分取上清液即得FIIIIII上清,所得沉淀即为FIIIIII沉淀。其中,硅藻土和滤板的用量为0043硅藻土4555G血浆蛋白/1G硅藻土滤板1013M2/1000L血浆0044本发明所用硅藻土的检测结果如下00451金属氧化范围使用XRF测定的百分比004600472助熔煅烧品酸溶物质20上限004800493助熔煅烧品水溶物质20上限0050说明书CN104086645A5/9页700514比表面积005200535离心湿密度00540055实施例2本发明FIIIIII上清或沉淀的制备方法对产品的影响0056通过电泳技术检测FIIIIII上清液和沉淀中白蛋白或球白蛋纯度,对本发明与使用C。
22、503型硅藻土的现有制备方法进行比较,结果见图4、5。其中,两种方法除了助滤方法不同外,其他操作均相同,在此条件下更能说明两种助滤方法带来的效果差异。0057由图可知00581本发明方法所得FIIIIII上清液电泳图谱图4A中,白蛋白峰面积约占86,而使用C503硅藻土助滤得到的FIIIIII上清液白蛋白峰面积仅约占73图4B。对比两者可以看出,本发明方法制备的FIIIIII上清中白蛋白纯度明显增高了13个百分点。00592本发明方法所得FIIIIII沉淀中球蛋白含量约为81图5A,而使用C503硅藻土助滤得到的FIIIIII沉淀中球蛋白含量约为76图5B。对比可知,本发明方法制备的FIIII。
23、II沉淀中球蛋白纯度明显增高了约5个百分点。0060上述结果表明,本发明方法对FIIIIII的提取分离效果明显优于现有技术。0061实施例3本发明球蛋白和白蛋白的制备方法00621按实施例1的方法制备FIIIIII上清和FIIIIII沉淀。00632取FIIIIII上清,经过低温乙醇法对FIV进行分离,再使用PALL50P滤板,同时以CELPURE1000硅藻土和900珍珠岩为助滤剂与待滤液混匀,进行压滤,取上清液即得FIV上清。其中,硅藻土和滤板的用量为0064硅藻土3035GFIIIIII上清液蛋白/1G硅藻土珍珠岩2030GFIIIIII上清液蛋白/1G珍珠岩说明书CN104086645。
24、A6/9页8滤板1013M2/1000L血浆0065取FIV上清,经过低温乙醇法对FV进行分离,再使用PALL50P滤板,同时以CELPURE1000硅藻土为助滤剂,进行压滤,取沉淀即得FV沉淀。其中,硅藻土和滤板的用量为00660067取FV沉淀,精制,即得白蛋白。00683取FIIIIII沉淀,经过低温乙醇法对FIIII进行分离,再使用BECOSTERILPR40滤板,同时以CELPURE1000硅藻土为助滤剂与待滤液混匀,进行压滤,取上清液即得FIIII上清。其中,硅藻土和滤板的用量为0069硅藻土89G/L血浆滤板1013/1000L血浆0070取FIIII上清,经过低温乙醇法对FII。
25、进行分离,再使用PALL50滤板,同时以CELPURE1000硅藻土为助滤剂进行压滤,取沉淀即得FII沉淀。其中,硅藻土和滤板的用量为0071待滤液所用硅藻土0203G/L血浆预涂层中所用硅藻土8095G/M2滤板滤板510M2/1000L0072取FII沉淀,精制,即得球蛋白。0073以下通过压滤过程和产品的对比说明本发明的有益效果0074一、本发明制备方法中各步骤对压滤过程的影响0075以下试验通过过滤流量、压力以及滤液浊度等指标,对本发明与使用C503型硅藻土的现有制备方法进行比较FIIIIII阶段C503硅藻土用量为3040G血浆蛋白/1G硅藻土,3M60SP滤板用量为1013M2/1。
26、000L血浆;FIV阶段C503硅藻土用量为2030GFIIIIII上清液蛋白/1G硅藻土,900珍珠岩的用量为2030GFIIIIII上清液蛋白/1G珍珠岩,PALL50P滤板用量1013M2/1000L血浆;FV阶段待滤液中C503硅藻土的用量为2030G/L血浆,预涂层中硅藻土用量7585G/M2滤板,PALLECO1000滤板用量1013M2/1000L血浆;FIIII阶段C503硅藻土用量1113G/L血浆,3M60SP滤板用量1013M2/1000L血浆;FII阶段PALLECO1000滤板用量510M2/1000L血浆,预涂层中C503硅藻土用量110130G/M2滤板,待滤液中。
27、C503硅藻土用量0305G/L血说明书CN104086645A7/9页9浆。,其结果如下00761、过滤流量0077通过常规手段检测滤过速率,其结果如下0078表1过滤速率对比00790080由表1可知,与现有使用C503硅藻土的制备方法相比,除制备FII外,其他压滤过程中,单位时间内过滤流量明显增加,明显缩短了过滤时长,有助于整个生产工时的节省。00812、过滤压力0082通过常规手段检测滤过压力,其结果如下0083表2过滤压力对比00840085由表2可知,与现有使用C503硅藻土的制备方法相比,除FII外,其他压滤过程中单位面积滤板承受的压力负荷明显降低。压力的降低,一方面降低了过滤过。
28、程中因过滤压力过高带来的安全隐患;另一方面,每种滤材均有其最大承受压力负荷,超过此负荷,其过滤效果将会下降,影响产品质量。过滤压力的下降也从一定程度上保证了产品质量。0086从上述检测结果可以看出,在生产过程中,本发明制备方法过滤流量、压力均优于使用C503型硅藻土助滤的现有制备方法。0087二、产品比较00881、终产品收率和纯度比较0089取同批次的原料,按本发明方法制备的白蛋白、球蛋白与使用C503硅藻土传统工艺精制方法相同制备的白蛋白、球蛋白产品进行比较,其结果如下0090表3白蛋白、球蛋白收率及纯度说明书CN104086645A8/9页1000910092由上表可知,相对于使用C50。
29、3硅藻土的传统工艺而言,利用本发明方法制备的白蛋白终产品,其白蛋白、球蛋白的收率和纯度均有一定提高。00931本发明方法所得白蛋白平均收率约为2856G/L,较使用C503硅藻土传统工艺收率增加约05G/L,目前白蛋白市场价约为3540元/G,如本发明所述,其收率提高05G/L,以企业平均每次生产量约1000L血浆计算,每次生产可增收500G白蛋白,按照市场价值预估,每次生产可提高利润约1752万元。00942本发明方法所得球蛋白收率提高约05G/L,目前球蛋白市场价约为200元/G,以企业平均每次生产量约1000L血浆计算,每次生产可增收500G球蛋白,按照市场价值预估,每次生产可提高利润约。
30、10万元。0095综合上述数据可知,本发明方法可以有效提高白蛋白和球蛋白产品的收率和纯度,尤其是收率的提高,明显提高了产品利润,其商业价值极其显著。00962、球蛋白中IGA含量比较0097另外,对本发明方法和使用C503硅藻土传统工艺制备的球蛋白成品中的IGA含量进行测定,结果如下0098表4球蛋白中IGA含量0099传统工艺球蛋白成品IGA含量G/ML本发明方法球蛋白成品IGA含量G/ML10579575192361068591674588755881656118946651说明书CN104086645A109/9页1197279372平均值918平均值6170100由上表可知,本发明方法所得球蛋白成品中,IGA含量明显降低,可降低患者发生IGA抗原抗体不良反应的几率,从而提高产品安全性。说明书CN104086645A111/5页12图1说明书附图CN104086645A122/5页13图2说明书附图CN104086645A133/5页14图3说明书附图CN104086645A144/5页15图4说明书附图CN104086645A155/5页16图5说明书附图CN104086645A16。