用于提取家禽DNA的细胞裂解液、试剂盒和方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201410403604.0	申请日：	2014.08.15
公开号：	CN104152438A	公开日：	2014.11.19
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/10申请日:20140815\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N15/10	主分类号：	C12N15/10
申请人：	四川农业大学
发明人：	王也; 刘显庆; 刘益平; 金洁; 卿莹; 朱庆
地址：	625014 四川省雅安市雨城区新康路46号
优先权：
专利代理机构：	北京众合诚成知识产权代理有限公司 11246	代理人：	裴娜
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内容摘要

本发明提供了一种用于提取家禽DNA的细胞裂解液，包括：0.5g/L～2.5g/L Tris-HCl；0.3g/L～1.0g/L KCl；1.5g/L～2.5g/L MgCl2；0.5g/L～1.5g/L EDTA；20mL/L～30mL/L Triton X-100；余量的水；用NaOH调节pH值为8。本发明还提供了一种含有上述技术方案所述的细胞裂解液的家禽DNA提取试剂盒。本发明还提供了一种家禽DNA提取方法。本发明提供的方法使得禽类血液DNA提取时间比传统方法显著缩短，在达到或超过试剂盒提取质量的同时，其成本远低于试剂盒方法，步骤少，操作难度低于主流试剂盒。

权利要求书

1.  一种用于提取家禽DNA的细胞裂解液，其特征在于，包括:

0.  5g/L～2.5g/L Tris-HCl；0.3g/L～1.0g/L KCl；1.5g/L～2.5g/L MgCl₂；0.5g/L～1.5g/L EDTA；20mL/L～30mL/L Triton X-100；余量的水；用NaOH调节pH值为8。

2.  根据权利要求1所述的细胞裂解液，其特征在于，包括：

1.  576g/L Tris-HCl；0.7455g/L KCl；2.033g/L MgCl₂；0.7448g/L EDTA；25mL/L Triton X-100；余量的水；用NaOH调节pH值为8。

3.  一种用于提取家禽DNA的细胞缓冲液，其特征在于，包括：

0.  5g/L～2.5g/L Tris-HCl；0.3g/L～1.0g/L KCl；1.5g/L～2.5g/L MgCl₂；0.5g/L～1.5g/L EDTA；15g/L～30g/L NaCl；0.5g/L～1.5g/L SDS；余量的水；用NaOH调节pH值为8。

4.  根据权利要求3所述的细胞缓冲液，其特征在于，包括：

1.  576g/L Tris-HCl；0.7455g/L KCl；2.033g/L MgCl₂；0.7448g/L EDTA；23.376g/L NaCl；1g/L SDS；余量的水；用NaOH调节pH值为8。

5.  一种用于提取家禽DNA的细胞裂解液，其特征在于，包括Buffer WY和Buffer YW，其中，
所述Buffer WY包括：0.5g/L～2.5g/L Tris-HCl；0.3g/L～1.0g/L KCl；1.5g/L～2.5g/L MgCl₂；0.5g/L～1.5g/L EDTA；20mL/L～30mL/L Triton X-100；余量的水；用NaOH调节pH值为8；
所述Buffer YW包括：0.5g/L～2.5g/L Tris-HCl；0.3g/L～1.0g/L KCl；1.5g/L～2.5g/L MgCl₂；0.5g/L～1.5g/L EDTA；15g/L～30g/L NaCl；0.5g/L～1.5g/L SDS；余量的水；用NaOH调节pH值为8。

6.  根据权利要求5所述的细胞裂解液，其特征在于，所述Buffer WY包括：1.576g/L Tris-HCl；0.7455g/L KCl；2.033g/L MgCl₂；0.7448g/L EDTA；25mL/L Triton X-100；余量的水；用NaOH调节pH值为8；
所述Buffer YW包括：1.576g/L Tris-HCl；0.7455g/L KCl；2.033g/L MgCl₂；0.7448g/L EDTA；23.376g/L NaCl；1g/L SDS；余量的水；用NaOH调节pH值为8。

7.  含有权利要求5或6所述的细胞裂解液的家禽DNA提取试剂盒。

8.  根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括：NaCl溶液、异丙醇、75％酒精和TE裂解液。

9.  一种家禽DNA提取方法，包括：
a)将新鲜抗凝家禽类血样与Buffer WY溶液混合，经水浴加热后离心，将弃上清后得到的物质与Buffer WY溶液混合，离心后弃上清得到沉淀；所述Buffer WY溶液包括：0.5g/L～2.5g/L Tris-HCl；0.3g/L～1.0g/L KCl；1.5g/L～2.5g/L MgCl₂；0.5g/L～1.5g/L EDTA；20mL/L～30mL/L Triton X-100；余量的水；用NaOH调节pH值为8；
b)将所述步骤a)得到的沉淀与Buffer YW溶液和蛋白酶K溶液混合，水浴加热后加入NaCl溶液，在核酸纯化柱中纯化后离心，得到滤液；所述Buffer YW溶液包括：0.5g/L～2.5g/L Tris-HCl；0.3g/L～1.0g/L KCl；1.5g/L～2.5g/L MgCl₂；0.5g/L～1.5g/L EDTA；15g/L～30g/L NaCl；0.5g/L～1.5g/L SDS；余量的水；用NaOH调节pH值为8；
c)将所述步骤b)得到的滤液与异丙醇混合，离心后弃上清，然后与75％酒精混合，离心后弃上清，加热后加入TE裂解液溶解。

10.  根据权利要求10所述的提取方法，其特征在于，所述步骤a)具体为：将10～20μL新鲜抗凝家禽类血样与1000μL Buffer WY溶液震荡混合，60～70℃水浴加热5min～8min后10000～15000rpm/min离心1～3min，将弃上清后得到的物质与1000μL BufferWY溶液震荡混合，10000～15000rpm/min离心1～3min后弃上清得到沉淀；
所述步骤b)具体为：将所述步骤a)得到的沉淀与200μL Buffer YW溶液和10μL20mg/mL的蛋白酶K溶液震荡混合，60～70℃水浴加热20min～30min后加入100μL5mol/L的NaCl溶液，在核酸纯化柱中纯化后6000～10000rpm/min离心1min，得到滤液；
所述步骤c)具体为：将所述步骤b)得到的滤液与等体积的异丙醇混合，10000～15000rpm/min离心3～5min后弃上清，然后与1000～1500μL75％酒精震荡混合，10000～15000rpm/min离心1～3min后弃上清，70～75℃烘箱加热1～3min后加入50mLTE裂解液溶解。

说明书

用于提取家禽DNA的细胞裂解液、试剂盒和方法
技术领域
本发明属于生物育种技术领域，尤其涉及一种用于提取家禽DNA的细胞裂解液、试剂盒和方法。
背景技术
家禽分子育种作为现代家禽育种工作不可或缺的技术，常需要对核心群体进行遗传背景鉴定、遗传疾病剔除、隐性遗传性状提纯，如鸡羽色性状中隐性白羽等分子检测相关工作以控制后代群体质量。而DNA提取是后续分子实验的基础，因此，大规模、快速获取家禽基因组对家禽分子育种工作的开展十分必要。
针对禽类血液红细胞具有细胞核的特点并为了减少家禽对采样的应激，目前多以翅下静脉采血为主，以达到从少量静脉血中提取足量的DNA以满足实验需要的目的。现有技术公开了多种家禽血液DNA提取技术，如申请号为201210100069.2的中国专利文献公开了一种安全快速从血液中提取基因组DNA的方法，其以SDS(十二烷基硫酸钠)与Trito X-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)相混合为红细胞裂解液，饱和氯化钠溶液为蛋白质沉淀剂并使用乙醇沉淀DNA，该方法提取时间相对较短，能够完成DNA粗提取工作，能普遍应用于血液DNA基因组提取。但是，该方法获得DNA具有较高的蛋白污染，而且使用样品量较大，会加重采样负担、动物应激，减少血样使用次数，对禽类血液DNA提取针对性不强，其耗时比本发明长。
申请号为201110030176.8的中国专利文献公开了一种动物DNA提取的细胞裂解液、试剂盒和方法，以盐酸胍缓冲液为主要裂解液，并加入蛋白酶K后水浴过夜，以饱和酚萃取DNA，该方法在传统DNA提取方法酚-氯仿抽提法上进一步改善，能得到一定质量的DNA基因组。但是，该方法耗时长，需过夜消化，提取全过程长达16小时以上，不利于快速、批量操作。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于提取家禽DNA的细胞裂解液、试剂盒和方法，本发明提供的方法提取操作简便、用时短，成本低。
本发明提供了一种用于提取家禽DNA的细胞裂解液，包括:
0.5g/L～2.5g/L Tris-HCl；0.3g/L～1.0g/L KCl；1.5g/L～2.5g/L MgCl₂；0.5g/L～1.5g/L EDTA；20mL/L～30mL/L Triton X-100；余量的水；用NaOH调节pH值为8。
作为优选，所述细胞裂解液包括：
1.576g/L Tris-HCl；0.7455g/L KCl；2.033g/L MgCl₂；0.7448g/L EDTA；25mL/L Triton X-100；余量的水；用NaOH调节pH值为8。
本发明还提供了一种用于提取家禽DNA的细胞缓冲液，包括：
0.5g/L～2.5g/L Tris-HCl；0.3g/L～1.0g/L KCl；1.5g/L～2.5g/L MgCl₂；0.5g/L～1.5g/L EDTA；15g/L～30g/L NaCl；0.5g/L～1.5g/L SDS；余量的水；用NaOH调节pH值为8。
作为优选，所述细胞缓冲液包括：
1.576g/L Tris-HCl；0.7455g/L KCl；2.033g/L MgCl₂；0.7448g/L EDTA；23.376g/L NaCl；1g/L SDS；余量的水；用NaOH调节pH值为8。
本发明提供的上述细胞裂解液和细胞缓冲液优选组合使用，即，本发明还提供了一种用于提取家禽DNA的细胞裂解液，包括Buffer WY和Buffer YW，其中，
所述Buffer WY包括：0.5g/L～2.5g/L Tris-HCl；0.3g/L～1.0g/L KCl；1.5g/L～2.5g/L MgCl₂；0.5g/L～1.5g/L EDTA；20mL/L～30mL/L Triton X-100；余量的水；用NaOH调节pH值为8；
所述Buffer YW包括：0.5g/L～2.5g/L Tris-HCl；0.3g/L～1.0g/L KCl；1.5g/L～2.5g/L MgCl₂；0.5g/L～1.5g/L EDTA；15g/L～30g/L NaCl；0.5g/L～1.5g/L SDS；余量的水；用NaOH调节pH值为8。
作为优选，所述Buffer WY包括：1.576g/L Tris-HCl；0.7455g/L KCl；2.033g/L MgCl₂；0.7448g/L EDTA；25mL/L Triton X-100；余量的水；用NaOH调节pH值为8；
所述Buffer YW包括：1.576g/L Tris-HCl；0.7455g/L KCl；2.033g/L MgCl₂；0.7448g/L EDTA；23.376g/L NaCl；1g/L SDS；余量的水；用NaOH调节pH值为8。
本发明还提供了一种含有上述技术方案所述的细胞裂解液的家禽DNA提取试剂盒，即包括Buffer WY和Buffer YW。
作为优选，所述试剂盒还包括：NaCl溶液、异丙醇、75％酒精和TE裂解液。
作为优选，所述试剂盒还包括蛋白酶K溶液，蛋白酶K溶液能够使获取的DNA纯度和收量较高。
作为优选，所述NaCl溶液的浓度为5mol/L。
作为优选，所述蛋白酶K溶液的浓度为20mg/mL。
本发明还提供了一种家禽DNA提取方法，包括：
a)将新鲜抗凝家禽类血样与Buffer WY溶液混合，经水浴加热后离心，将弃上清后得到的物质与Buffer WY溶液混合，离心后弃上清得到沉淀；所述Buffer WY溶液包括：0.5g/L～2.5g/L Tris-HCl；0.3g/L～1.0g/L KCl；1.5g/L～2.5g/L MgCl₂；0.5g/L～1.5g/L EDTA；20mL/L～30mL/L Triton X-100；余量的水；用NaOH调节pH值为8；
b)将所述步骤a)得到的沉淀与Buffer YW溶液和蛋白酶K溶液混合，水浴加热后加入NaCl溶液，在核酸纯化柱中纯化后离心，得到滤液；所述Buffer YW溶液包括：0.5g/L～2.5g/L Tris-HCl；0.3g/L～1.0g/L KCl；1.5g/L～2.5g/L MgCl₂；0.5g/L～1.5g/L EDTA；15g/L～30g/L NaCl；0.5g/L～1.5g/L SDS；余量的水；用NaOH调节pH值为8；
c)将所述步骤b)得到的滤液与异丙醇混合，离心后弃上清，然后与75％酒精混合，离心后弃上清，加热后加入TE裂解液溶解。
作为优选，所述步骤a)具体为：将10～20μL新鲜抗凝家禽类血样与1000μL Buffer WY溶液震荡混合，60～70℃水浴加热5min～8min后10000～15000rpm/min离心1～3min，将弃上清后得到的物质与1000μL Buffer WY溶液震荡混合，10000～15000rpm/min离心1～3min后弃上清得到沉淀。
作为优选，所述步骤a)更具体为：将10μL新鲜抗凝家禽类血样与1000μL Buffer WY溶液震荡混合，60℃水浴加热8min，12000rpm/min离心2min，将弃上清后得到的物质与1000μL Buffer WY溶液震荡混合，使沉淀物质分散，12000rpm/min离心2min后弃上清得到沉淀。
作为优选，所述步骤b)具体为：将所述步骤a)得到的沉淀与200μL Buffer YW溶液和10μL20mg/mL的蛋白酶K溶液震荡混合，60～70℃水浴加热20min～30min后加入100μL5mol/L的NaCl溶液，在核酸纯化柱中纯化后6000～10000rpm/min离心1min，得到滤液。
作为优选，所述步骤b)更具体为：将所述步骤a)得到的沉淀与200μL Buffer YW溶液和10μL20mg/mL的蛋白酶K溶液震荡混合，60℃水浴加热25min并摇晃两次；然后加入100μL5mol/L的NaCl溶液，混合均匀后在核酸纯化柱中纯化，8000rpm/min离心1min，得到滤液，并将滤液转移到另一1.5mlEP管中。
作为优选，所述步骤c)具体为：将所述步骤b)得到的滤液与等体积的异丙醇混合，10000～15000rpm/min离心3～5min后弃上清，然后与1000～1500μL75％酒精震荡混合，10000～15000rpm/min离心1～3min后弃上清，70～75℃烘箱加热1～3min后加入50mLTE裂解液溶解。
作为优选，所述步骤c)更具体为：将所述步骤b)得到的滤液与等体积的异丙醇充分混合均匀，12000rpm/min离心5min后弃上清，然后与1000μL75％酒精震荡混合，混匀后12000rpm/min离心3min后弃上清，72℃烘箱加热3min后加入50mLTE裂解液溶解，将样品放于-20℃冰箱保存备用。
作为优选，所述禽类血样可以为鹅血、鸡血、鸭血或者鸽子血。
另外，本发明提供的方法也可以无需加入蛋白酶K溶液，此时得到的DNA纯度和收量略低，但是能够满足普通PCR要求。
与现有技术相比，本发明提供的家禽DNA提取方法具有如下优点之一：
1、本发明解决了目前常规DNA提取方法需消化过夜或需数小时消化等耗时长的问题，显著缩短常规方法提取禽类血样DNA所需时间，将整个DNA提取过程控制在1小时内，理论时间为49min，真正实现快速获取家禽DNA基因组的目的，本方法比TaKaRa全血基因组提取试剂盒省时约30min。
2、本发明解决了常规方法提取DNA过程中操作步骤过多的问题，只需6步即可完成DNA提取工作，而TaKaRa全血基因组提取试剂盒需15步操作，操作繁琐。
3、本发明克服了试剂盒提取成本贵、无法大批量应用的问题：TaKaRa全血基因组提取试剂盒成本约10元一个样，而本方法一个样成本在0.9元左右。
4、本发明对核酸纯化柱的使用方法使得整个DNA提取过程无需吸取上清溶液，吸上清是DNA提取的限速步骤，需要谨慎操作，常常需要消耗大量时间而且容易造成蛋白质污染，人为操作因素对结果影响较大。本发明方法以核酸纯化柱滤过基因组DNA，使DNA在滤液中而蛋白质等沉淀留在滤膜上。本发明对核酸纯化柱的使用方法与试剂盒相反，试剂盒是滤过蛋白质而使DNA沉淀留在滤膜上，无需吸取上清液，使用核酸纯化柱滤过DNA液使所得DNA蛋白污染低，纯度高，省时省力。
5、本发明提取得到的DNA纯度和收量较高，能够达到甚至超过试剂盒提取质量。
总之，本发明提供的方法使得禽类血液DNA提取时间比传统方法显著缩短，比TaKaRa全血基因组提取试剂盒等主流试剂盒所需时间更短。在达到或超过试剂盒提取质量的同时，其成本远低于试剂盒方法，步骤少，操作难度低于主流试剂盒。本发明实现了在实验室快速、低廉、高质量获取禽类血液基因组DNA的目的。
附图说明
图1为本发明实施例提供的方法提取的DNA电泳结果；
图2为本发明实施例及比较例提供的方法提取的DNA电泳结果；
图3为本发明实施例1获取的DNA模板PCR扩增结果；
图4为本发明实施例6～10提供的方法提取的DNA电泳结果。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明提供的用于提取家禽DNA的细胞裂解液、试剂盒和方法进行进一步说明。
以下各实施例中所用试剂如下：Buffer WY、Buffer YW、5mol/L NaCl溶液、异丙醇、75％酒精、TE裂解液、20mg/ml蛋白酶K溶液；
Buffer WY：Tris-HCl1.576g，KCl0.7455g，MgCl₂2.033g，EDTA0.7448g，Triton X-100 25ml，定容至1000ml，NaOH调节PH至8.0。
Buffer YW：Tris-HCl1.576g，KCl0.7455g，MgCl₂2.033g，EDTA0.7448g，NaCl23.376g，SDS1g，定容至1000ml，NaOH调节PH至8.0。
实施例1
1.取10ul新鲜抗凝鹅血于1.5ml EP中，加入1000ul Buffer WY溶液，震荡混匀，于60℃水浴8min，12000rpm/min离心2min后，弃上清；沉淀中再加入1000ul BufferWY溶液，震荡使沉淀分散，12000rpm/min离心2min后，弃上清。
2.向上一步得到的沉淀中加入200ul Buffer YW溶液以及20mg/ml蛋白酶K溶液10ul，震荡混匀，于60℃水浴25min并摇晃两次。
3.向上一步所得混合液中加入5mol/L NaCl溶液100ul，混匀后将全部溶液转移至核酸纯化柱中，8000rpm/min离心1min，将所得滤液转入重新编号的1.5ml EP管中。
4.加入等体积异丙醇于上述滤液中，充分混匀后12000rpm/min离心5min，弃上清。
5.加入75％酒精1000ul，震荡混匀后12000rpm/min离心3min，弃上清。
6.放入72℃烘箱3min后，加入50ml的TE裂解液溶解，将样品放于 -20℃冰箱保存备用。
7.所得DNA液用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测，并用核酸蛋白仪NanoVue Plus检测其浓度，结果参见图1和表1，图1为本发明实施例提供的方法提取的DNA电泳结果，其中，M为Marker；表1为本发明实施例及比较例提供的DNA的核酸蛋白仪检测结果。由图1可知，本发明提供的方法提取鹅血的DNA的条带明亮单一。
实施例2
1.取10ul新鲜抗凝鸡血于1.5ml EP中，加入1000ul Buffer WY溶液，震荡混匀，于60℃水浴8min，12000rpm/min离心2min后，弃上清；沉淀中再加入1000ul Buffer WY溶液，震荡使沉淀分散，12000rpm/min离心2min后，弃上清。
2.向上一步得到的沉淀中加入200ul Buffer YW溶液以及20mg/ml蛋白酶K溶液10ul，震荡混匀，于60℃水浴25min并摇晃两次。
3.向上一步所得混合液中加入5mol/L NaCl溶液100ul，混匀后将全部溶液转移至核酸纯化柱中，8000rpm/min离心1min，将所得滤液转入重新编号的1.5ml EP管中。
4.加入等体积异丙醇于上述滤液中，充分混匀后12000rpm/min离心5min，弃上清。
5.加入75％酒精1000ul，震荡混匀后12000rpm/min离心3min，弃上清。
6.放入72℃烘箱3min后，加入50ml的TE裂解液溶解，将样品放于-20℃冰箱保存备用。
7.所得DNA液用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测，并用核酸蛋白仪NanoVue Plus检测其浓度，结果参见图1和表1，图1为本发明实施例提供的方法提取的DNA电泳结果，其中，M为Marker；表1为本发明实施例及比较例提供的DNA的核酸蛋白仪检测结果。由图1可知，本发明提供的方法提取鸡血的DNA的条带明亮单一。
实施例3
1.取10ul新鲜抗凝鸽子血于1.5ml EP中，加入1000ul Buffer WY溶液，震荡混匀，于60℃水浴8min，12000rpm/min离心2min后，弃上清；沉淀中再加入1000ul Buffer WY溶液，震荡使沉淀分散，12000rpm/min离心2min后，弃上清。
2.向上一步得到的沉淀中加入200ul Buffer YW溶液以及20mg/ml 蛋白酶K溶液10ul，震荡混匀，于60℃水浴25min并摇晃两次。
3.向上一步所得混合液中加入5mol/L NaCl溶液100ul，混匀后将全部溶液转移至核酸纯化柱中，8000rpm/min离心1min，将所得滤液转入重新编号的1.5ml EP管中。
4.加入等体积异丙醇于上述滤液中，充分混匀后12000rpm/min离心5min，弃上清。
5.加入75％酒精1000ul，震荡混匀后12000rpm/min离心3min，弃上清。
6.放入72℃烘箱3min后，加入50ml的TE裂解液溶解，将样品放于-20℃冰箱保存备用。
7.所得DNA液用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测，并用核酸蛋白仪NanoVue Plus检测其浓度，结果参见图1和表1，图1为本发明实施例提供的方法提取的DNA电泳结果，其中，M为Marker；表1为本发明实施例及比较例提供的DNA的核酸蛋白仪检测结果。由图1可知，本发明提供的方法提取鸽子血的DNA的条带明亮单一。
实施例4
1.取10ul新鲜抗凝鸭血于1.5ml EP中，加入1000ul Buffer WY溶液，震荡混匀，于60℃水浴8min，12000rpm/min离心2min后，弃上清；沉淀中再加入1000ul Buffer WY溶液，震荡使沉淀分散，12000rpm/min离心2min后，弃上清。
2.向上一步得到的沉淀中加入200ul Buffer YW溶液以及20mg/ml蛋白酶K溶液10ul，震荡混匀，于60℃水浴25min并摇晃两次。
3.向上一步所得混合液中加入5mol/L NaCl溶液100ul，混匀后将全部溶液转移至核酸纯化柱中，8000rpm/min离心1min，将所得滤液转入重新编号的1.5ml EP管中。
4.加入等体积异丙醇于上述滤液中，充分混匀后12000rpm/min离心5min，弃上清。
5.加入75％酒精1000ul，震荡混匀后12000rpm/min离心3min，弃上清。
6.放入72℃烘箱3min后，加入50ml的TE裂解液溶解，将样品放于-20℃冰箱保存备用。
7.所得DNA液用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测，并用核酸蛋白仪NanoVue Plus检测其浓度，结果参见图1和表1，图1为本发明实施例提供的方法提取的DNA电泳结果，其中，M为Marker；表1为本发明实施例及比较例提供的DNA的核酸蛋白仪检测结果。由图1可知，本发明提供的方法提取鸭血的DNA的条带明亮单一。
对比例1
于宝生物工程(大连)有限公司购买试剂盒TaKaRa MiniBEST Whole Blood Genomic DNA Extraction Kit。按照试剂盒操作说明提取新鲜抗凝鹅血样DNA，并用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测，并用核酸蛋白仪NanoVue Plus检测其浓度，结果参见图2和表1，其中，图2为本发明实施例及比较例提供的方法提取的DNA电泳结果，其中，M为Marker，E为实施例1，e为对比例1；表1为本发明实施例及比较例提供的DNA的核酸蛋白仪检测结果。由图2可知，本发明提供的方法提取鹅血的DNA的条带明亮单一，其亮度高于试剂盒提取的DNA。
对比例2
于宝生物工程(大连)有限公司购买试剂盒TaKaRa MiniBEST Whole Blood Genomic DNA Extraction Kit。按照试剂盒操作说明提取新鲜抗凝鸡血样DNA，并用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测，并用核酸蛋白仪NanoVue Plus检测其浓度，结果参见图2和表1，其中，图2为本发明实施例及比较例提供的方法提取的DNA电泳结果，其中，M为Marker，J为实施例2，j为对比例2；表1为本发明实施例及比较例提供的DNA的核酸蛋白仪检测结果。由图2可知，本发明提供的方法提取鸡血的DNA的条带明亮单一，其亮度高于试剂盒提取的DNA。
对比例3
于宝生物工程(大连)有限公司购买试剂盒TaKaRa MiniBEST Whole Blood Genomic DNA Extraction Kit。按照试剂盒操作说明提取新鲜抗凝鸽子血样DNA，并用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测，并用核酸蛋白仪NanoVue Plus检测其浓度，结果参见图2和表1，其中，图2为本发明实施例及比较例提供的方法提取的DNA电泳结果，其中，M为Marker，G为实施例3，g为对比例3；表1为本发明实施例及比较例提供的DNA的核酸蛋白仪检测结果。由图2可知，本发明提供的方法提取鸽子血的DNA的条带明亮单一，其亮度高于试剂盒提取的DNA。
对比例4
于宝生物工程(大连)有限公司购买试剂盒TaKaRa MiniBEST Whole Blood Genomic DNA Extraction Kit。按照试剂盒操作说明提取新鲜抗凝鸭血样DNA，并用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测，并用核酸蛋白仪NanoVue Plus检测其浓度，结果参见图2和表1，其中，图2为本发明实施例及比较例提供的方法提取的DNA电泳结果，其中，M为Marker，Y为实施例4，y为对比例4；表1为本发明实施例及比较例提供的DNA的核酸蛋白仪检测结果。由图2可知，本发明提供的方法提取鸭血的DNA的条带明亮单一，其亮度高于试剂盒提取的DNA。
表1 本发明实施例及比较例提供的DNA的核酸蛋白仪检测结果

由表1可知，本发明提供的方法与试剂盒方法所得DNA质量相当，甚至纯度和收量高于试剂盒方法。
实施例5
以实施例1获得的鹅基因组DNA为模板，扩增鹅内源性逆转录Ⅱ类病毒(Genbank accession number：AY820076.1)。
PCR扩增体系为25uL：DNA模板2uL，2×Taq MasterMix(购于天根生化科技有限公司)12.5uL，上下游引物各0.75ul，补余量双蒸水至25uL。
PCR反应扩增程序为：预变性95℃5min，循环34次(变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃1min)，延伸72℃5min，4℃保存。
引物为：
F：5’-GCCCTAAAGGACTGTCCCAG-3’，
R：5’-CGCAAAGCTTCTGCAACGTA-3’。
退火温度62℃。
结果参见图3，图3为本发明实施例1获取的DNA模板PCR扩增结果，其中，M为Marker，p为鹅内源性逆转录Ⅱ类病毒部分扩增片段。由图3可知，以实施例1提取得到的DNA为模板进行PCR扩增，PCR结果条带明亮，无杂带，无污染，表明本发明方法所提取DNA质量好，能用于分子检测。
实施例6
按照与实施例1相同的方法进行DNA提取，区别在于不添加蛋白酶K溶液，结果参见图4，图4为本发明实施例6～10提供的方法提取的DNA电泳结果，其中，M为Marker，E1为实施例1，E0为实施例6。由图4可知，不添加蛋白酶K溶液消化的条带较加入蛋白酶K的稍暗，但亮度高于maker，依然能用于普通PCR。
实施例7
按照与实施例2相同的方法进行DNA提取，区别在于不添加蛋白酶K溶液，结果参见图4，图4为本发明实施例6～10提供的方法提取的DNA电泳结果，其中，M为Marker，J1为实施例2，J0为实施例7。由图4可知，不添加蛋白酶K溶液消化的条带较加入蛋白酶K的稍暗，但亮度高于maker，依然能用于普通PCR。
实施例8
按照与实施例3相同的方法进行DNA提取，区别在于不添加蛋白酶K溶液，结果参见图4，图4为本发明实施例6～10提供的方法提取的DNA电泳结果，其中，M为Marker，G1为实施例3，G0为实施例8。由图4可知，不添加蛋白酶K溶液消化的条带较加入蛋白酶K的稍暗，但亮度高于maker，依然能用于普通PCR。
实施例9
按照与实施例4相同的方法进行DNA提取，区别在于不添加蛋白酶K溶液，结果参见图4，图4为本发明实施例6～10提供的方法提取的DNA电泳结果，其中，M为Marker，Y1为实施例4，Y0为实施例9。由图4可知，不添加蛋白酶K溶液消化的条带较加入蛋白酶K的稍暗，但亮度高于maker，依然能用于普通PCR。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

资源描述

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1、10申请公布号CN104152438A43申请公布日20141119CN104152438A21申请号201410403604022申请日20140815C12N15/1020060171申请人四川农业大学地址625014四川省雅安市雨城区新康路46号72发明人王也刘显庆刘益平金洁卿莹朱庆74专利代理机构北京众合诚成知识产权代理有限公司11246代理人裴娜54发明名称用于提取家禽DNA的细胞裂解液、试剂盒和方法57摘要本发明提供了一种用于提取家禽DNA的细胞裂解液，包括05G/L25G/LTRISHCL；03G/L10G/LKCL；15G/L25G/LMGCL2；05G/L15G/LEDTA；。

2、20ML/L30ML/LTRITONX100；余量的水；用NAOH调节PH值为8。本发明还提供了一种含有上述技术方案所述的细胞裂解液的家禽DNA提取试剂盒。本发明还提供了一种家禽DNA提取方法。本发明提供的方法使得禽类血液DNA提取时间比传统方法显著缩短，在达到或超过试剂盒提取质量的同时，其成本远低于试剂盒方法，步骤少，操作难度低于主流试剂盒。51INTCL权利要求书2页说明书8页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书8页附图4页10申请公布号CN104152438ACN104152438A1/2页21一种用于提取家禽DNA的细胞裂解液，其特征在于，包括0。

3、5G/L25G/LTRISHCL；03G/L10G/LKCL；15G/L25G/LMGCL2；05G/L15G/LEDTA；20ML/L30ML/LTRITONX100；余量的水；用NAOH调节PH值为8。2根据权利要求1所述的细胞裂解液，其特征在于，包括1576G/LTRISHCL；07455G/LKCL；2033G/LMGCL2；07448G/LEDTA；25ML/LTRITONX100；余量的水；用NAOH调节PH值为8。3一种用于提取家禽DNA的细胞缓冲液，其特征在于，包括05G/L25G/LTRISHCL；03G/L10G/LKCL；15G/L25G/LMGCL2；05G/L15G/。

4、LEDTA；15G/L30G/LNACL；05G/L15G/LSDS；余量的水；用NAOH调节PH值为8。4根据权利要求3所述的细胞缓冲液，其特征在于，包括1576G/LTRISHCL；07455G/LKCL；2033G/LMGCL2；07448G/LEDTA；23376G/LNACL；1G/LSDS；余量的水；用NAOH调节PH值为8。5一种用于提取家禽DNA的细胞裂解液，其特征在于，包括BUFFERWY和BUFFERYW，其中，所述BUFFERWY包括05G/L25G/LTRISHCL；03G/L10G/LKCL；15G/L25G/LMGCL2；05G/L15G/LEDTA；20ML/L3。

5、0ML/LTRITONX100；余量的水；用NAOH调节PH值为8；所述BUFFERYW包括05G/L25G/LTRISHCL；03G/L10G/LKCL；15G/L25G/LMGCL2；05G/L15G/LEDTA；15G/L30G/LNACL；05G/L15G/LSDS；余量的水；用NAOH调节PH值为8。6根据权利要求5所述的细胞裂解液，其特征在于，所述BUFFERWY包括1576G/LTRISHCL；07455G/LKCL；2033G/LMGCL2；07448G/LEDTA；25ML/LTRITONX100；余量的水；用NAOH调节PH值为8；所述BUFFERYW包括1576G/LTR。

6、ISHCL；07455G/LKCL；2033G/LMGCL2；07448G/LEDTA；23376G/LNACL；1G/LSDS；余量的水；用NAOH调节PH值为8。7含有权利要求5或6所述的细胞裂解液的家禽DNA提取试剂盒。8根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括NACL溶液、异丙醇、75酒精和TE裂解液。9一种家禽DNA提取方法，包括A将新鲜抗凝家禽类血样与BUFFERWY溶液混合，经水浴加热后离心，将弃上清后得到的物质与BUFFERWY溶液混合，离心后弃上清得到沉淀；所述BUFFERWY溶液包括05G/L25G/LTRISHCL；03G/L10G/LKCL；15G/L25G/LM。

7、GCL2；05G/L15G/LEDTA；20ML/L30ML/LTRITONX100；余量的水；用NAOH调节PH值为8；B将所述步骤A得到的沉淀与BUFFERYW溶液和蛋白酶K溶液混合，水浴加热后加入NACL溶液，在核酸纯化柱中纯化后离心，得到滤液；所述BUFFERYW溶液包括05G/L25G/LTRISHCL；03G/L10G/LKCL；15G/L25G/LMGCL2；05G/L15G/LEDTA；15G/L30G/LNACL；05G/L15G/LSDS；余量的水；用NAOH调节PH值为8；C将所述步骤B得到的滤液与异丙醇混合，离心后弃上清，然后与75酒精混合，离权利要求书CN104152。

8、438A2/2页3心后弃上清，加热后加入TE裂解液溶解。10根据权利要求10所述的提取方法，其特征在于，所述步骤A具体为将1020L新鲜抗凝家禽类血样与1000LBUFFERWY溶液震荡混合，6070水浴加热5MIN8MIN后1000015000RPM/MIN离心13MIN，将弃上清后得到的物质与1000LBUFFERWY溶液震荡混合，1000015000RPM/MIN离心13MIN后弃上清得到沉淀；所述步骤B具体为将所述步骤A得到的沉淀与200LBUFFERYW溶液和10L20MG/ML的蛋白酶K溶液震荡混合，6070水浴加热20MIN30MIN后加入100L5MOL/L的NACL溶液，在核。

9、酸纯化柱中纯化后600010000RPM/MIN离心1MIN，得到滤液；所述步骤C具体为将所述步骤B得到的滤液与等体积的异丙醇混合，1000015000RPM/MIN离心35MIN后弃上清，然后与10001500L75酒精震荡混合，1000015000RPM/MIN离心13MIN后弃上清，7075烘箱加热13MIN后加入50MLTE裂解液溶解。权利要求书CN104152438A1/8页4用于提取家禽DNA的细胞裂解液、试剂盒和方法技术领域0001本发明属于生物育种技术领域，尤其涉及一种用于提取家禽DNA的细胞裂解液、试剂盒和方法。背景技术0002家禽分子育种作为现代家禽育种工作不可或缺的技术，。

10、常需要对核心群体进行遗传背景鉴定、遗传疾病剔除、隐性遗传性状提纯，如鸡羽色性状中隐性白羽等分子检测相关工作以控制后代群体质量。而DNA提取是后续分子实验的基础，因此，大规模、快速获取家禽基因组对家禽分子育种工作的开展十分必要。0003针对禽类血液红细胞具有细胞核的特点并为了减少家禽对采样的应激，目前多以翅下静脉采血为主，以达到从少量静脉血中提取足量的DNA以满足实验需要的目的。现有技术公开了多种家禽血液DNA提取技术，如申请号为2012101000692的中国专利文献公开了一种安全快速从血液中提取基因组DNA的方法，其以SDS十二烷基硫酸钠与TRITOX100聚乙二醇对异辛基苯基醚相混合为红细。

11、胞裂解液，饱和氯化钠溶液为蛋白质沉淀剂并使用乙醇沉淀DNA，该方法提取时间相对较短，能够完成DNA粗提取工作，能普遍应用于血液DNA基因组提取。但是，该方法获得DNA具有较高的蛋白污染，而且使用样品量较大，会加重采样负担、动物应激，减少血样使用次数，对禽类血液DNA提取针对性不强，其耗时比本发明长。0004申请号为2011100301768的中国专利文献公开了一种动物DNA提取的细胞裂解液、试剂盒和方法，以盐酸胍缓冲液为主要裂解液，并加入蛋白酶K后水浴过夜，以饱和酚萃取DNA，该方法在传统DNA提取方法酚氯仿抽提法上进一步改善，能得到一定质量的DNA基因组。但是，该方法耗时长，需过夜消化，提取。

12、全过程长达16小时以上，不利于快速、批量操作。发明内容0005有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于提取家禽DNA的细胞裂解液、试剂盒和方法，本发明提供的方法提取操作简便、用时短，成本低。0006本发明提供了一种用于提取家禽DNA的细胞裂解液，包括000705G/L25G/LTRISHCL；03G/L10G/LKCL；15G/L25G/LMGCL2；05G/L15G/LEDTA；20ML/L30ML/LTRITONX100；余量的水；用NAOH调节PH值为8。0008作为优选，所述细胞裂解液包括00091576G/LTRISHCL；07455G/LKCL；2033G/LMGCL2；07448G。

13、/LEDTA；25ML/LTRITONX100；余量的水；用NAOH调节PH值为8。0010本发明还提供了一种用于提取家禽DNA的细胞缓冲液，包括001105G/L25G/LTRISHCL；03G/L10G/LKCL；15G/L25G/LMGCL2；说明书CN104152438A2/8页505G/L15G/LEDTA；15G/L30G/LNACL；05G/L15G/LSDS；余量的水；用NAOH调节PH值为8。0012作为优选，所述细胞缓冲液包括00131576G/LTRISHCL；07455G/LKCL；2033G/LMGCL2；07448G/LEDTA；23376G/LNACL；1G/LS。

14、DS；余量的水；用NAOH调节PH值为8。0014本发明提供的上述细胞裂解液和细胞缓冲液优选组合使用，即，本发明还提供了一种用于提取家禽DNA的细胞裂解液，包括BUFFERWY和BUFFERYW，其中，0015所述BUFFERWY包括05G/L25G/LTRISHCL；03G/L10G/LKCL；15G/L25G/LMGCL2；05G/L15G/LEDTA；20ML/L30ML/LTRITONX100；余量的水；用NAOH调节PH值为8；0016所述BUFFERYW包括05G/L25G/LTRISHCL；03G/L10G/LKCL；15G/L25G/LMGCL2；05G/L15G/LEDTA；。

15、15G/L30G/LNACL；05G/L15G/LSDS；余量的水；用NAOH调节PH值为8。0017作为优选，所述BUFFERWY包括1576G/LTRISHCL；07455G/LKCL；2033G/LMGCL2；07448G/LEDTA；25ML/LTRITONX100；余量的水；用NAOH调节PH值为8；0018所述BUFFERYW包括1576G/LTRISHCL；07455G/LKCL；2033G/LMGCL2；07448G/LEDTA；23376G/LNACL；1G/LSDS；余量的水；用NAOH调节PH值为8。0019本发明还提供了一种含有上述技术方案所述的细胞裂解液的家禽DNA提。

16、取试剂盒，即包括BUFFERWY和BUFFERYW。0020作为优选，所述试剂盒还包括NACL溶液、异丙醇、75酒精和TE裂解液。0021作为优选，所述试剂盒还包括蛋白酶K溶液，蛋白酶K溶液能够使获取的DNA纯度和收量较高。0022作为优选，所述NACL溶液的浓度为5MOL/L。0023作为优选，所述蛋白酶K溶液的浓度为20MG/ML。0024本发明还提供了一种家禽DNA提取方法，包括0025A将新鲜抗凝家禽类血样与BUFFERWY溶液混合，经水浴加热后离心，将弃上清后得到的物质与BUFFERWY溶液混合，离心后弃上清得到沉淀；所述BUFFERWY溶液包括05G/L25G/LTRISHCL；0。

17、3G/L10G/LKCL；15G/L25G/LMGCL2；05G/L15G/LEDTA；20ML/L30ML/LTRITONX100；余量的水；用NAOH调节PH值为8；0026B将所述步骤A得到的沉淀与BUFFERYW溶液和蛋白酶K溶液混合，水浴加热后加入NACL溶液，在核酸纯化柱中纯化后离心，得到滤液；所述BUFFERYW溶液包括05G/L25G/LTRISHCL；03G/L10G/LKCL；15G/L25G/LMGCL2；05G/L15G/LEDTA；15G/L30G/LNACL；05G/L15G/LSDS；余量的水；用NAOH调节PH值为8；0027C将所述步骤B得到的滤液与异丙醇混合。

18、，离心后弃上清，然后与75酒精混合，离心后弃上清，加热后加入TE裂解液溶解。0028作为优选，所述步骤A具体为将1020L新鲜抗凝家禽类血样与1000LBUFFERWY溶液震荡混合，6070水浴加热5MIN8MIN后1000015000RPM/MIN离心13MIN，将弃上清后得到的物质与1000LBUFFERWY溶液震荡混合，1000015000RPM/MIN离心13MIN后弃上清得到沉淀。说明书CN104152438A3/8页60029作为优选，所述步骤A更具体为将10L新鲜抗凝家禽类血样与1000LBUFFERWY溶液震荡混合，60水浴加热8MIN，12000RPM/MIN离心2MIN，将。

19、弃上清后得到的物质与1000LBUFFERWY溶液震荡混合，使沉淀物质分散，12000RPM/MIN离心2MIN后弃上清得到沉淀。0030作为优选，所述步骤B具体为将所述步骤A得到的沉淀与200LBUFFERYW溶液和10L20MG/ML的蛋白酶K溶液震荡混合，6070水浴加热20MIN30MIN后加入100L5MOL/L的NACL溶液，在核酸纯化柱中纯化后600010000RPM/MIN离心1MIN，得到滤液。0031作为优选，所述步骤B更具体为将所述步骤A得到的沉淀与200LBUFFERYW溶液和10L20MG/ML的蛋白酶K溶液震荡混合，60水浴加热25MIN并摇晃两次；然后加入100L。

20、5MOL/L的NACL溶液，混合均匀后在核酸纯化柱中纯化，8000RPM/MIN离心1MIN，得到滤液，并将滤液转移到另一15MLEP管中。0032作为优选，所述步骤C具体为将所述步骤B得到的滤液与等体积的异丙醇混合，1000015000RPM/MIN离心35MIN后弃上清，然后与10001500L75酒精震荡混合，1000015000RPM/MIN离心13MIN后弃上清，7075烘箱加热13MIN后加入50MLTE裂解液溶解。0033作为优选，所述步骤C更具体为将所述步骤B得到的滤液与等体积的异丙醇充分混合均匀，12000RPM/MIN离心5MIN后弃上清，然后与1000L75酒精震荡混合，。

21、混匀后12000RPM/MIN离心3MIN后弃上清，72烘箱加热3MIN后加入50MLTE裂解液溶解，将样品放于20冰箱保存备用。0034作为优选，所述禽类血样可以为鹅血、鸡血、鸭血或者鸽子血。0035另外，本发明提供的方法也可以无需加入蛋白酶K溶液，此时得到的DNA纯度和收量略低，但是能够满足普通PCR要求。0036与现有技术相比，本发明提供的家禽DNA提取方法具有如下优点之一00371、本发明解决了目前常规DNA提取方法需消化过夜或需数小时消化等耗时长的问题，显著缩短常规方法提取禽类血样DNA所需时间，将整个DNA提取过程控制在1小时内，理论时间为49MIN，真正实现快速获取家禽DNA基因。

22、组的目的，本方法比TAKARA全血基因组提取试剂盒省时约30MIN。00382、本发明解决了常规方法提取DNA过程中操作步骤过多的问题，只需6步即可完成DNA提取工作，而TAKARA全血基因组提取试剂盒需15步操作，操作繁琐。00393、本发明克服了试剂盒提取成本贵、无法大批量应用的问题TAKARA全血基因组提取试剂盒成本约10元一个样，而本方法一个样成本在09元左右。00404、本发明对核酸纯化柱的使用方法使得整个DNA提取过程无需吸取上清溶液，吸上清是DNA提取的限速步骤，需要谨慎操作，常常需要消耗大量时间而且容易造成蛋白质污染，人为操作因素对结果影响较大。本发明方法以核酸纯化柱滤过基因组。

23、DNA，使DNA在滤液中而蛋白质等沉淀留在滤膜上。本发明对核酸纯化柱的使用方法与试剂盒相反，试剂盒是滤过蛋白质而使DNA沉淀留在滤膜上，无需吸取上清液，使用核酸纯化柱滤过DNA液使所得DNA蛋白污染低，纯度高，省时省力。00415、本发明提取得到的DNA纯度和收量较高，能够达到甚至超过试剂盒提取质量。说明书CN104152438A4/8页70042总之，本发明提供的方法使得禽类血液DNA提取时间比传统方法显著缩短，比TAKARA全血基因组提取试剂盒等主流试剂盒所需时间更短。在达到或超过试剂盒提取质量的同时，其成本远低于试剂盒方法，步骤少，操作难度低于主流试剂盒。本发明实现了在实验室快速、低廉、。

24、高质量获取禽类血液基因组DNA的目的。附图说明0043图1为本发明实施例提供的方法提取的DNA电泳结果；0044图2为本发明实施例及比较例提供的方法提取的DNA电泳结果；0045图3为本发明实施例1获取的DNA模板PCR扩增结果；0046图4为本发明实施例610提供的方法提取的DNA电泳结果。具体实施方式0047以下结合实施例对本发明提供的用于提取家禽DNA的细胞裂解液、试剂盒和方法进行进一步说明。0048以下各实施例中所用试剂如下BUFFERWY、BUFFERYW、5MOL/LNACL溶液、异丙醇、75酒精、TE裂解液、20MG/ML蛋白酶K溶液；0049BUFFERWYTRISHCL157。

25、6G，KCL07455G，MGCL22033G，EDTA07448G，TRITONX10025ML，定容至1000ML，NAOH调节PH至80。0050BUFFERYWTRISHCL1576G，KCL07455G，MGCL22033G，EDTA07448G，NACL23376G，SDS1G，定容至1000ML，NAOH调节PH至80。0051实施例100521取10UL新鲜抗凝鹅血于15MLEP中，加入1000ULBUFFERWY溶液，震荡混匀，于60水浴8MIN，12000RPM/MIN离心2MIN后，弃上清；沉淀中再加入1000ULBUFFERWY溶液，震荡使沉淀分散，12000RPM/M。

26、IN离心2MIN后，弃上清。00532向上一步得到的沉淀中加入200ULBUFFERYW溶液以及20MG/ML蛋白酶K溶液10UL，震荡混匀，于60水浴25MIN并摇晃两次。00543向上一步所得混合液中加入5MOL/LNACL溶液100UL，混匀后将全部溶液转移至核酸纯化柱中，8000RPM/MIN离心1MIN，将所得滤液转入重新编号的15MLEP管中。00554加入等体积异丙醇于上述滤液中，充分混匀后12000RPM/MIN离心5MIN，弃上清。00565加入75酒精1000UL，震荡混匀后12000RPM/MIN离心3MIN，弃上清。00576放入72烘箱3MIN后，加入50ML的TE裂。

27、解液溶解，将样品放于20冰箱保存备用。00587所得DNA液用15琼脂糖凝胶进行电泳检测，并用核酸蛋白仪NANOVUEPLUS检测其浓度，结果参见图1和表1，图1为本发明实施例提供的方法提取的DNA电泳结果，其中，M为MARKER；表1为本发明实施例及比较例提供的DNA的核酸蛋白仪检测结果。由图1可知，本发明提供的方法提取鹅血的DNA的条带明亮单一。0059实施例200601取10UL新鲜抗凝鸡血于15MLEP中，加入1000ULBUFFERWY溶液，震荡混匀，说明书CN104152438A5/8页8于60水浴8MIN，12000RPM/MIN离心2MIN后，弃上清；沉淀中再加入1000ULB。

28、UFFERWY溶液，震荡使沉淀分散，12000RPM/MIN离心2MIN后，弃上清。00612向上一步得到的沉淀中加入200ULBUFFERYW溶液以及20MG/ML蛋白酶K溶液10UL，震荡混匀，于60水浴25MIN并摇晃两次。00623向上一步所得混合液中加入5MOL/LNACL溶液100UL，混匀后将全部溶液转移至核酸纯化柱中，8000RPM/MIN离心1MIN，将所得滤液转入重新编号的15MLEP管中。00634加入等体积异丙醇于上述滤液中，充分混匀后12000RPM/MIN离心5MIN，弃上清。00645加入75酒精1000UL，震荡混匀后12000RPM/MIN离心3MIN，弃上清。

29、。00656放入72烘箱3MIN后，加入50ML的TE裂解液溶解，将样品放于20冰箱保存备用。00667所得DNA液用15琼脂糖凝胶进行电泳检测，并用核酸蛋白仪NANOVUEPLUS检测其浓度，结果参见图1和表1，图1为本发明实施例提供的方法提取的DNA电泳结果，其中，M为MARKER；表1为本发明实施例及比较例提供的DNA的核酸蛋白仪检测结果。由图1可知，本发明提供的方法提取鸡血的DNA的条带明亮单一。0067实施例300681取10UL新鲜抗凝鸽子血于15MLEP中，加入1000ULBUFFERWY溶液，震荡混匀，于60水浴8MIN，12000RPM/MIN离心2MIN后，弃上清；沉淀中再。

30、加入1000ULBUFFERWY溶液，震荡使沉淀分散，12000RPM/MIN离心2MIN后，弃上清。00692向上一步得到的沉淀中加入200ULBUFFERYW溶液以及20MG/ML蛋白酶K溶液10UL，震荡混匀，于60水浴25MIN并摇晃两次。00703向上一步所得混合液中加入5MOL/LNACL溶液100UL，混匀后将全部溶液转移至核酸纯化柱中，8000RPM/MIN离心1MIN，将所得滤液转入重新编号的15MLEP管中。00714加入等体积异丙醇于上述滤液中，充分混匀后12000RPM/MIN离心5MIN，弃上清。00725加入75酒精1000UL，震荡混匀后12000RPM/MIN离。

31、心3MIN，弃上清。00736放入72烘箱3MIN后，加入50ML的TE裂解液溶解，将样品放于20冰箱保存备用。00747所得DNA液用15琼脂糖凝胶进行电泳检测，并用核酸蛋白仪NANOVUEPLUS检测其浓度，结果参见图1和表1，图1为本发明实施例提供的方法提取的DNA电泳结果，其中，M为MARKER；表1为本发明实施例及比较例提供的DNA的核酸蛋白仪检测结果。由图1可知，本发明提供的方法提取鸽子血的DNA的条带明亮单一。0075实施例400761取10UL新鲜抗凝鸭血于15MLEP中，加入1000ULBUFFERWY溶液，震荡混匀，于60水浴8MIN，12000RPM/MIN离心2MIN后。

32、，弃上清；沉淀中再加入1000ULBUFFERWY溶液，震荡使沉淀分散，12000RPM/MIN离心2MIN后，弃上清。00772向上一步得到的沉淀中加入200ULBUFFERYW溶液以及20MG/ML蛋白酶K溶液10UL，震荡混匀，于60水浴25MIN并摇晃两次。00783向上一步所得混合液中加入5MOL/LNACL溶液100UL，混匀后将全部溶液转移说明书CN104152438A6/8页9至核酸纯化柱中，8000RPM/MIN离心1MIN，将所得滤液转入重新编号的15MLEP管中。00794加入等体积异丙醇于上述滤液中，充分混匀后12000RPM/MIN离心5MIN，弃上清。00805加入。

33、75酒精1000UL，震荡混匀后12000RPM/MIN离心3MIN，弃上清。00816放入72烘箱3MIN后，加入50ML的TE裂解液溶解，将样品放于20冰箱保存备用。00827所得DNA液用15琼脂糖凝胶进行电泳检测，并用核酸蛋白仪NANOVUEPLUS检测其浓度，结果参见图1和表1，图1为本发明实施例提供的方法提取的DNA电泳结果，其中，M为MARKER；表1为本发明实施例及比较例提供的DNA的核酸蛋白仪检测结果。由图1可知，本发明提供的方法提取鸭血的DNA的条带明亮单一。0083对比例10084于宝生物工程大连有限公司购买试剂盒TAKARAMINIBESTWHOLEBLOODGENOM。

34、ICDNAEXTRACTIONKIT。按照试剂盒操作说明提取新鲜抗凝鹅血样DNA，并用15琼脂糖凝胶进行电泳检测，并用核酸蛋白仪NANOVUEPLUS检测其浓度，结果参见图2和表1，其中，图2为本发明实施例及比较例提供的方法提取的DNA电泳结果，其中，M为MARKER，E为实施例1，E为对比例1；表1为本发明实施例及比较例提供的DNA的核酸蛋白仪检测结果。由图2可知，本发明提供的方法提取鹅血的DNA的条带明亮单一，其亮度高于试剂盒提取的DNA。0085对比例20086于宝生物工程大连有限公司购买试剂盒TAKARAMINIBESTWHOLEBLOODGENOMICDNAEXTRACTIONKIT。

35、。按照试剂盒操作说明提取新鲜抗凝鸡血样DNA，并用15琼脂糖凝胶进行电泳检测，并用核酸蛋白仪NANOVUEPLUS检测其浓度，结果参见图2和表1，其中，图2为本发明实施例及比较例提供的方法提取的DNA电泳结果，其中，M为MARKER，J为实施例2，J为对比例2；表1为本发明实施例及比较例提供的DNA的核酸蛋白仪检测结果。由图2可知，本发明提供的方法提取鸡血的DNA的条带明亮单一，其亮度高于试剂盒提取的DNA。0087对比例30088于宝生物工程大连有限公司购买试剂盒TAKARAMINIBESTWHOLEBLOODGENOMICDNAEXTRACTIONKIT。按照试剂盒操作说明提取新鲜抗凝鸽子。

36、血样DNA，并用15琼脂糖凝胶进行电泳检测，并用核酸蛋白仪NANOVUEPLUS检测其浓度，结果参见图2和表1，其中，图2为本发明实施例及比较例提供的方法提取的DNA电泳结果，其中，M为MARKER，G为实施例3，G为对比例3；表1为本发明实施例及比较例提供的DNA的核酸蛋白仪检测结果。由图2可知，本发明提供的方法提取鸽子血的DNA的条带明亮单一，其亮度高于试剂盒提取的DNA。0089对比例40090于宝生物工程大连有限公司购买试剂盒TAKARAMINIBESTWHOLEBLOODGENOMICDNAEXTRACTIONKIT。按照试剂盒操作说明提取新鲜抗凝鸭血样DNA，并用15琼脂糖凝胶进行。

37、电泳检测，并用核酸蛋白仪NANOVUEPLUS检测其浓度，结果参见图2和表1，其中，图2为本发明实施例及比较例提供的方法提取的DNA电泳结果，其中，M为MARKER，说明书CN104152438A7/8页10Y为实施例4，Y为对比例4；表1为本发明实施例及比较例提供的DNA的核酸蛋白仪检测结果。由图2可知，本发明提供的方法提取鸭血的DNA的条带明亮单一，其亮度高于试剂盒提取的DNA。0091表1本发明实施例及比较例提供的DNA的核酸蛋白仪检测结果00920093由表1可知，本发明提供的方法与试剂盒方法所得DNA质量相当，甚至纯度和收量高于试剂盒方法。0094实施例50095以实施例1获得的鹅基。

38、因组DNA为模板，扩增鹅内源性逆转录类病毒GENBANKACCESSIONNUMBERAY8200761。0096PCR扩增体系为25ULDNA模板2UL，2TAQMASTERMIX购于天根生化科技有限公司125UL，上下游引物各075UL，补余量双蒸水至25UL。0097PCR反应扩增程序为预变性955MIN，循环34次变性9430S，退火6230S，延伸721MIN，延伸725MIN，4保存。0098引物为0099F5GCCCTAAAGGACTGTCCCAG3，0100R5CGCAAAGCTTCTGCAACGTA3。0101退火温度62。0102结果参见图3，图3为本发明实施例1获取的DN。

39、A模板PCR扩增结果，其中，M为MARKER，P为鹅内源性逆转录类病毒部分扩增片段。由图3可知，以实施例1提取得到的DNA为模板进行PCR扩增，PCR结果条带明亮，无杂带，无污染，表明本发明方法所提取DNA质量好，能用于分子检测。0103实施例60104按照与实施例1相同的方法进行DNA提取，区别在于不添加蛋白酶K溶液，结果参见图4，图4为本发明实施例610提供的方法提取的DNA电泳结果，其中，M为MARKER，E1为实施例1，E0为实施例6。由图4可知，不添加蛋白酶K溶液消化的条带较加入蛋白酶K的稍暗，但亮度高于MAKER，依然能用于普通PCR。0105实施例70106按照与实施例2相同的方。

40、法进行DNA提取，区别在于不添加蛋白酶K溶液，结果参见图4，图4为本发明实施例610提供的方法提取的DNA电泳结果，其中，M为MARKER，J1为实施例2，J0为实施例7。由图4可知，不添加蛋白酶K溶液消化的条带较加入蛋白酶说明书CN104152438A108/8页11K的稍暗，但亮度高于MAKER，依然能用于普通PCR。0107实施例80108按照与实施例3相同的方法进行DNA提取，区别在于不添加蛋白酶K溶液，结果参见图4，图4为本发明实施例610提供的方法提取的DNA电泳结果，其中，M为MARKER，G1为实施例3，G0为实施例8。由图4可知，不添加蛋白酶K溶液消化的条带较加入蛋白酶K的稍。

41、暗，但亮度高于MAKER，依然能用于普通PCR。0109实施例90110按照与实施例4相同的方法进行DNA提取，区别在于不添加蛋白酶K溶液，结果参见图4，图4为本发明实施例610提供的方法提取的DNA电泳结果，其中，M为MARKER，Y1为实施例4，Y0为实施例9。由图4可知，不添加蛋白酶K溶液消化的条带较加入蛋白酶K的稍暗，但亮度高于MAKER，依然能用于普通PCR。0111以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。说明书CN104152438A111/4页12图1说明书附图CN104152438A122/4页13图2说明书附图CN104152438A133/4页14图3说明书附图CN104152438A144/4页15图4说明书附图CN104152438A15。

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