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1、10申请公布号CN104152393A43申请公布日20141119CN104152393A21申请号201410374669722申请日20140731CGMCCNO570620120109C12N1/21200601C12N15/70200601C12N9/06200601C12R1/19200601C12R1/46520060171申请人上海交通大学地址200240上海市闵行区东川路800号72发明人周培冯海玮支月娥唐冬孙玉静毛亮罗艳青卫星74专利代理机构上海交达专利事务所31201代理人王毓理王锡麟54发明名称基于亚硝酸盐还原酶的工程菌及其实现方法57摘要本发明涉及基因工程技术领域的亚。
2、硝酸盐还原酶的工程菌及其实现方法，以灰略红链霉菌基因组DNA为模板，与含有酶切位点的引物进行PCR扩增依次得到编码亚硝酸盐还原酶大亚基及亚硝酸盐还原酶小亚基的核苷酸序列；然后将扩增得到的基因序列依次连接到共表达载体PETDUET1，最终获得重组共表达载体PETDUETNCND；之后将该亚硝酸盐还原酶表达载体转化到大肠杆菌表达菌株。本发明针对现有技术存在的由于亚硝酸盐还原酶在生物体内多为胞内酶且表达量较低导致的应用范围和效果严重受限等不足，能够应用基因工程手段实现亚硝酸盐还原酶体外的大量表达合成，对于次生盐渍化土壤的快速修复乃至实现精准农业具有重大意义。83生物保藏信息51INTCL权利要求书1。
3、页说明书5页序列表8页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页序列表8页附图1页10申请公布号CN104152393ACN104152393A1/1页21一种亚硝酸盐还原酶的工程菌，其特征在于，该工程菌为外源表达亚硝酸盐还原酶的大肠杆菌；所述的胞内亚硝酸盐还原酶具体为灰略红链霉菌STREPTOMYCESGRISEORUBENSJSD1亚硝酸盐还原酶编码基因，由亚硝酸盐还原酶大亚基SGNC和亚硝酸盐还原酶小亚基SGND构成，其核苷酸序列分别为2601BP和354BP，分别编码866和117个氨基酸，其中亚硝酸盐还原酶大亚基SGNC的核苷酸序列如SEQIDN。
4、O1所示，氨基酸序列如SEQIDNO3所示；亚硝酸盐还原酶小亚基SGND的核苷酸序列如SEQIDNO2所示，氨基酸序列如SEQIDNO4所示。2根据权利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的灰略红链霉菌STREPTOMYCESGRISEORUBENSJSD1，现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC，保藏编号为CGMCCNO5706，保藏日期为2012年1月9日。3一种根据权利要求1或2中所述的工程菌的实现方法，其特征在于，以灰略红链霉菌基因组DNA为模板，与含有酶切位点的引物进行PCR扩增依次得到编码亚硝酸盐还原酶大亚基及亚硝酸盐还原酶小亚基的核苷酸序列；然后将扩增得到的基因序列依次连。
5、接到共表达载体PETDUET1，最终获得重组共表达载体PETDUETNCND；之后将该亚硝酸盐还原酶表达载体转化到大肠杆菌表达菌株内，获得亚硝酸盐还原酶过表达重组菌株。4根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的含有酶切位点的引物包括NCNCOIFACCATGGTGCCCACGGACACCTCGACCATCGTNCECORIRGGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGTCGCTGTGCGCTTCCTTNDNDEIFGTACATATGACCCTGGCACTCGAGACGACCACCNDECORVRCGATATCTCAATGATGATGATGATGATGCGCCGCCTTCACCTC。
6、GT。5根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的PCR扩增的条件为98预变性3MIN；98变性10S，68延伸1MIN；30个循环后68终延伸5MIN。6根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的大肠杆菌表达菌株为TRANSETTADE3大肠杆菌。7一种根据上述任一权利要求所述的亚硝酸盐还原酶的工程菌的应用，其特征在于，将其用于亚硝酸盐还原酶的体外高效表达，最终实现亚硝酸盐还原酶的工业发酵生产。权利要求书CN104152393A1/5页3基于亚硝酸盐还原酶的工程菌及其实现方法技术领域0001本发明涉及的是一种生物基因工程技术领域的基因及其工程菌株，具体是一种灰略红链霉菌的基于亚硝酸盐还原酶的。
7、工程菌及其实现方法。背景技术0002从环境角度来讲，N元素的积累，可造成肥料的浪费而且影响作物生长及土壤利用，同时可通过农田的地表径流和农田渗漏，导致农业面源污染；从食品安全角度来讲，当人体摄入过量的硝酸盐，在体内硝酸盐NO3容易还原成亚硝酸盐NO2，亚硝酸盐能使细胞中携氧的低铁血红蛋白氧化成无携氧能力的高铁蛋白而造成组织缺氧，不仅如此，被氧化成的高铁蛋白还会降低已携有氧的氧合血红蛋白向身体组织释放氧的功能，使人体缺氧，严重时有使人窒息死亡的危险。更可怕的是亚硝酸盐和二甲胺、三甲胺作用后会生成亚硝胺。亚硝胺是一种具有强烈致癌性的化合物，在已发现的120种亚硝胺类化合物中，75被确认有致癌性，亚。
8、硝胺还有引起遗传变异和怪胎的潜在危险，一旦这种物质进入蔬菜，对人的影响是非常可怕的。因此，如何快速消除环境中残存的亚硝酸盐，便成为接下工作的重中之重。0003生物修复法尤其是生物酶法的出现，为快速降解环境如土壤和水体中的亚硝酸盐提供了一个新的方法。一般而言，亚硝酸盐还原酶在生物体内多为胞内表达且表达量很低，不能满足环境修复的需求。于是构建一种高效亚硝酸盐还原酶转基因过表达菌株，实现亚硝酸盐还原酶的高效表达就显得尤为关键。发明内容0004本发明针对现有技术存在的由于亚硝酸盐还原酶在生物体内多为胞内酶且表达量较低导致的应用范围和效果严重受限等不足，提出一种基于亚硝酸盐还原酶的工程菌及其实现方法，能。
9、够应用基因工程手段实现其体外的大量表达合成，对于次生盐渍化土壤的快速修复乃至实现精准农业具有重大意义。0005本发明是通过以下技术方案实现的0006本发明涉及一种亚硝酸盐还原酶的工程菌，该工程菌为外源表达亚硝酸盐还原酶的大肠杆菌。0007所述的亚硝酸盐还原酶具体为灰略红链霉菌STREPTOMYCESGRISEORUBENSJSD1亚硝酸盐还原酶编码基因，由亚硝酸盐还原酶大亚基和亚硝酸盐还原酶小亚基构成，其核苷酸序列分别为2601BP和354BP，分别编码866和117个氨基酸。0008所述的亚硝酸盐还原酶大亚基SGNC的核苷酸序列如SEQIDNO1所示，氨基酸序列如SEQIDNO3所示；亚硝酸。
10、盐还原酶小亚基SGND的核苷酸序列如SEQIDNO2所示，氨基酸序列如SEQIDNO4所示。0009所述的亚硝酸盐还原酶编码基因通过全基因组测序和PCR扩增的方式克隆获得。0010所述的灰略红链霉菌STREPTOMYCESGRISEORUBENSJSD1，现保藏于中国普通说明书CN104152393A2/5页4微生物菌种保藏管理中心CGMCC，保藏编号为CGMCCNO5706，保藏日期为2012年1月9日，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101。0011本发明涉及上述工程菌的实现方法，以灰略红链霉菌基因组DNA为模板，与含有酶切位点的引物进行PCR扩增依次。
11、得到编码亚硝酸盐还原酶大亚基及小亚基的核苷酸序列；然后将扩增得到的基因序列依次连接到共表达载体PETDUET1，最终重组共表达载体PETDUETNCND；之后将该亚硝酸盐还原酶表达载体转化到大肠杆菌表达菌株内，获得亚硝酸盐还原酶过表达重组菌株。0012所述的含有酶切位点的引物包括0013NCNCOIFACCATGGTGCCCACGGACACCTCGACCATCGT0014NCECORIRGGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGTCGCTGTGCGCTTCCTT0015NDNDEIFGTACATATGACCCTGGCACTCGAGACGACCACC0016NDECORVRCGAT。
12、ATCTCAATGATGATGATGATGATGCGCCGCCTTCACCTCGT0017所述的PCR扩增的条件为98预变性3MIN；98变性10S，68延伸1MIN；30个循环后68终延伸5MIN。0018所述的大肠杆菌表达菌株为TRANSETTADE3大肠杆菌。0019本发明涉及一种亚硝酸盐还原酶的工程菌的应用，将其用于亚硝酸盐还原酶的体外高效表达，并最终实现亚硝酸盐还原酶的工业发酵生产。技术效果0020现有亚硝酸盐还原酶在灰略红链霉菌内为胞内酶且表达量很低，因此严重限制了其使用范围和效果；与现有技术相比，本发明提供了一种全新的亚硝酸盐还原酶基因序列；在特殊条件下如高温以及碱性具有更稳定的。
13、生物学活性；本发明通过构建外源表达载体，实现了亚硝酸盐还原酶的体外过表达，并通过在表达重组蛋白C端添加聚组氨酸标签的方法，维持蛋白活性的同时也最大程度的保证了蛋白纯度。附图说明0021图1为不同浓度硝酸盐培养下亚硝酸盐还原酶表达量变化图；0022图2为亚硝酸盐还原酶大亚基C及小亚基D信号肽预测图；具体实施方式0023下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例10024本实施例中灰略红链霉菌STREPTOMYCESGRISEORUBENS分离自上海市浦江镇收集的腐烂秸秆，保藏编号为。
14、CGMCCNO5706。将该菌种接种于LB液体培养基，32培养48H。0025上述LB液体培养基组分为蛋白胨100G/L，酵母提取物50G/L，NACL100G/L，PH6872。在液体培养基中加入150200G/L琼脂即得LB固体培养基。00261灰略红链霉菌STREPTOMYCESGRISEORUBENS基因组DNA提取收集20ML菌液，12000RPM离心2MIN。弃上清，收集菌体沉淀，加入180L溶菌酶20MG/ML和20L说明书CN104152393A3/5页5EDTA溶液05M,PH80，37处理45MIN，加入4LRNASEA100MG/ML，震荡混匀15S，室温放置5MIN，随。
15、后按照细菌DNA提取试剂盒TIANGEN操作说明完成剩余操作，得到高纯度基因组DNA。通过08琼脂糖凝胶电泳确定基因组DNA质量，确保无明显RNA条带，基因组条带清洗、完整、无降解、无污染。00272灰略红链霉菌STREPTOMYCESGRISEORUBENS基因组测序确定全基因组鸟枪法WGS策略，采用第二代测序技术，构建不同插入片段长度的文库，采用ILLUMINAMISEQ2250BP平台进行测序。收集测序的原始数据，对带接头、低质量的数据进行过滤，随后采用NEWBLERV28对去除接头的测序数据进行从头拼接，构建CONTIG及SCAFFOLD，最后使用GAPCLOSER程序进行缺口填补得到。
16、链霉菌基因组草图。00283蛋白编码基因功能预测采用GLIMMER30软件对全基因组序列进行基因预测。基因预测模型选取自我训练基因预测模型，即提取拼装序列中最长的序列，以该序列作为基因预测模型训练的序列。然后以该序列构建的基因预测模型，对所有序列进行基因预测，设定开放阅读框的长度为110BP，其余参数为GLIMMER30的默认设置。00294序列验证根据全基因组测序结果，设计PCR引物如下0030NCFATGCCCACGGACACCTCGACCAT0031NCRTCATCGCTGTGCGCTTCCTTCCA0032NDFATGACCCTGGCACTCGAGACGAC0033NDRTCACGCC。
17、GCCTTCACCTCGTACG0034以灰略红链霉菌JSD1基因组DNA为模板，进行PCR扩增并通过琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明片段约为26KB及350BP，将PCR产物切胶回收，使用DNAATAILINGKITTAKARA加A后连接到TVECTORPMDTM19TTAKARA，并将连接产物转入DH5大肠杆菌，在氨苄50G/ML抗性平板上挑选阳性克隆，摇菌提取质粒测序。测序结果证实插入片段与基因组测序结果完全吻合，即为本发明序列表中的SEQIDNO1和SEQIDNO2。0035上述PCR反应使用的DNA聚合酶为GXLPOLYMERASETAKARA；NC基因扩增条件为98预变性3MIN；98。
18、变性10S，55退火15S，68延伸1MIN；30个循环后68终延伸5MIN。ND基因扩增条件则为98预变性3MIN；98变性10S，55退火15S，68延伸15S；30个循环后68终延伸3MIN。00365灰略红链霉菌总RNA的提取将链霉菌接种于以KNO3为唯一碳源的无机盐培养基，32、150RPM条件下培养72H。每12H取样，离心收集菌体沉淀，并按细菌总RNA提取试剂盒要求TIANGEN提取高纯度的链霉菌总RNA。0037上述无机盐培养基组分为葡萄糖20G/L,KH2PO410G/L,NACL05G/L,MGSO4025G/L,CACL22H2O01G/L,FESO47H2O001G/L。
19、及KNO310MM,30MM,50MM,100MM。00386灰略红链霉菌亚硝酸盐还原酶表达水平测定0039根据亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列，通过DNAMAN60软件设计特异性PCR引物，引物序列如下0040NCFGCGTGGTCGTGCTGTGCGA0041NCRCGCCAGGTCCGTCAGCGACA0042同样的，根据16SRRNA的特异性序列设计引物，并作为内参基因，引物序列如下004316SRRNAFCGTATTCACCGCAGCAATGC说明书CN104152393A4/5页6004416SRRNARGCGAGGTGGAGCGAATCTCA0045以链霉菌总RNA模板进行反转录获得。
20、CDNA文库，并按照荧光定量PCR试剂盒TAKARA要求进行相关操作。设置三个重复，待实验完成收集处理数据，分析在不同浓度KNO3作用下，亚硝酸盐还原酶的表达量如图1。结果表明，随着时间的延长和KNO3浓度的升高，该亚硝酸盐还原酶的表达量显著上调，证明该基因参与硝酸盐的代谢过程。0046上述的荧光定量PCR反应条件为95预变性30S；95变性10S，60退火30S，72延伸15S，共40个循环。00477亚硝酸盐还原酶膜定位预测采用SIGNALP41分别对亚硝酸盐还原酶大亚基及小亚基序列进行信号肽模拟预测，如图2所示。结果表明亚硝酸盐还原酶大亚基及小亚基均不存在明显的信号肽序列，推测该酶为胞内。
21、酶。实施例20048亚硝酸盐还原酶表达载体构建00491根据亚硝酸盐还原酶序列，设计含有酶切位点的引物，序列如下0050NCNCOIFACCATGGTGCCCACGGACACCTCGACCATCGT0051NCECORIRGGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGTCGCTGTGCGCTTCCTT0052NDNDEIFGTACATATGACCCTGGCACTCGAGACGACCACC0053NDECORVRCGATATCTCAATGATGATGATGATGATGCGCCGCCTTCACCTCGT00542以灰略红链霉菌STREPTOMYCESGRISEORUBENS基因组DNA为。
22、模板，用含有NCOI和ECORI酶切位点引物进行PCR扩增获得亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列，使用DNAATAILINGKIT加A后连接到TVECTORPMDTM19TTAKARA，并将连接产物转入DH5大肠杆菌内。挑选阳性克隆，摇菌提取质粒测序。若无误，NCOI和ECORI进行双酶切37，回收亚硝酸盐还原酶大亚基DNA片段NC。用相同内切酶酶切共表达载体PETDUET1并回收载体DNA片段。将NC与载体片段混合，T4DNALIGASETAKARA过夜连接16，将连接产物转入DH5大肠杆菌感受态细胞内，通过抗性平板及菌落PCR筛选含有质粒PETDUETNC的阳性克隆。挑取阳性克隆接种于含有氨苄青。
23、霉素50G/ML的LB液体培养基中，180RPM、37培养16小时后提取质粒。0055以含有NDEI和ECORV酶切位点引物进行PCR扩增获得亚硝酸盐还原酶小亚基基因序列，加A后连接到TVECTORPMDTM19T，将连接产物转入DH5大肠杆菌内。挑选阳性克隆摇菌并回收质粒测序验证。若无误，用NDEI和ECORV双酶切该质粒，回收亚硝酸盐还原酶小亚基DNA片段ND。相同内切酶处理重组表达载体PETDUETND并回收载体DNA片段。将ND与PETDUETNC载体片段混合，T4DNALIGASE过夜连接，将连接产物转入DH5大肠杆菌感受态细胞内，通过抗性平板和菌落PCR筛选含有重组共表达载体PET。
24、DUETNCND的阳性克隆。挑取阳性克隆，摇菌并提取其质粒即得亚硝酸盐还原酶表达载体。0056上述PCR扩增条件为98预变性3MIN；98变性10S，68延伸1MIN；30个循环后68终延伸5MIN。00573亚硝酸盐还原酶过表达转基因菌株的构建0058将上述亚硝酸盐还原酶表达载体PETDUETNCND转入TRANSETTADE3大肠杆菌，并在含有氨苄青霉素50G/ML和氯霉素34G/ML的LB固体培养基上筛选，获得亚硝酸盐还原酶过表达菌株。说明书CN104152393A5/5页70059上述的TRANSETTADE3具有以下特征该菌株具有氯霉素CAMR，且含有大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子AG。
25、A,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA对应的TRNA，可有效提高外源基因，尤其是真核生物及链霉菌等高GC含量生物基因在原核系统中的表达水平。说明书CN104152393A1/8页80001序列表CN104152393A2/8页900020003序列表CN104152393A3/8页100004序列表CN104152393A104/8页110005序列表CN104152393A115/8页120006序列表CN104152393A126/8页130007序列表CN104152393A137/8页140008序列表CN104152393A148/8页150009序列表CN104152393A151/1页16图1图2说明书附图CN104152393A16。