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1、(10)申请公布号 CN 103025888 A (43)申请公布日 2013.04.03 CN 103025888 A *CN103025888A* (21)申请号 201180026768.0 (22)申请日 2011.04.06 10/01406 2010.04.06 FR C12Q 1/04(2006.01) C12Q 1/06(2006.01) C12M 1/34(2006.01) G01B 11/24(2006.01) G01N 33/487(2006.01) (71)申请人 原子能与替代能源委员会 地址 法国巴黎 申请人 生物梅里埃公司 (72)发明人 让 - 皮埃尔莫亚 马蒂厄。
2、杜波伊 奥利维尔费伽德瑞 弗莱德瑞克皮恩斯顿 吉娜维芙波斯塞 劳伦德拉泽克 玛丽丝吉谢尔 法宾罗曼恩斯 弗莱德瑞克马勒拉瑞德 (74)专利代理机构 北京同达信恒知识产权代理 有限公司 11291 代理人 杨黎峰 (54) 发明名称 用于检测生物颗粒群的方法 (57) 摘要 本发明涉及一种用于检测表面 (11)上的生 物颗粒群 (12) 的方法, 所述方法包括以下步骤 : a. 确定 (E1)所述表面的地貌表示 (20) ; 以及 b. 在所述地貌表示中检测 (E3、 E4) 至少一个限定 可能对应于所述生物颗粒群的区域的轮廓。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2012.1。
3、1.29 (86)PCT申请的申请数据 PCT/IB2011/051481 2011.04.06 (87)PCT申请的公布数据 WO2011/125033 FR 2011.10.13 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 8 页 1/1 页 2 1. 一种检测表面 (11) 上的生物颗粒群 (12) 的方法, 所述方法包括以下步骤 : a) 确定 (E1) 所述表面的地貌表示 (20) ; 以及 b) 在所述地貌表示中, 检测 (E3、 E4) 至少一个限定。
4、可能对应于所述生物颗粒群的区域 的轮廓 ; 所述步骤是在电子数据处理器装置的帮助下实现的。 2. 根据权利要求 1 所述的方法, 其中, 所述生物颗粒选自微生物以及植物细胞或动物 细胞, 所述微生物诸如细菌、 酵母菌或真菌。 3. 根据前述任一项权利要求所述的方法, 其中, 所述生物颗粒的直径或主尺寸小于或 等于 100m。 4. 根据前述任一项权利要求所述的方法, 其中, 所述表面 (11) 选自培养基和周围介质 如空气之间的界面、 功能化基底的表面和微孔膜的表面。 5. 根据前述任一项权利要求所述的方法, 其中, 所述步骤 a) 在于, 通过无接触以及无 需准备样品而进行的光学方法来实现确。
5、定所述表面的地貌表示。 6.根据权利要求5所述的方法, 其中, 所述步骤a) 在于, 通过彩色共焦微地貌来实现确 定所述表面的地貌表示。 7.根据权利要求5所述的方法, 其中, 所述步骤a) 在于, 通过纹影摄影术或阴影摄影术 来实现确定所述结构的地貌表示。 8. 根据前述任一项权利要求所述的方法, 其中, 所述步骤 b) 在于, 通过测量所述表面 的所述地貌表示的局部坡度以及定阈值来实现检测至少一个轮廓。 9. 根据前述任一项权利要求所述的方法, 还包括所述地貌表示的预处理操作 (E2) , 所 述预处理操作包括检测参考表面和减去所述参考表面。 10. 根据前述任一项权利要求所述的方法, 包。
6、括在连续的时间重复步骤 a) 和步骤 b) , 以及仅选择步骤 b) 中确定的形状或尺寸随时间变化的区域。 11. 根据前述任一项权利要求所述的方法, 包括另一步骤 c) , 所述步骤 c) 在于评估生 物颗粒的群中存在的生物颗粒的量。 12. 根据权利要求 2 至 11 中任一项所述的方法, 包括原位识别或非原位识别排列在群 中的所述微生物的另一步骤。 权 利 要 求 书 CN 103025888 A 2 1/7 页 3 用于检测生物颗粒群的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种检测表面上的生物颗粒群的方法, 所述生物颗粒例如为微生物 ( 细菌、 酵母菌、 真菌等) 或植物细胞或动物细胞,。
7、 所述表面例如为培养基的表面或功能化基 底的表面。这些颗粒呈微观尺寸, 通常约为 0.5m 至 3mm, 更特定地在 0.5m 至 10m 的 范围内。 0002 本发明特别适用于检测微生物的群落。 背景技术 0003 在众多应用中, 期望尽可能快地检测培养基 (通常是营养凝胶表面) 上的微生物 (如细菌或酵母菌) 的生长。一般情况下, 由于琼脂培养基的表面常常在遍布几毫米 (mm) 的 距离中呈现几微米 (m) 的局部深度缺陷, 因此该琼脂培养基的表面与精确地呈平面有着 显著偏离。与样本一起输送的灰尘或碎片也可以引起呈高空间频率的局部表面变形。 0004 细菌和酵母菌在生长的初期是难以识别的。
8、, 这是由于它们吸收很少的可见光、 近 紫外光或近红外光, 并且它们的折射率非常接近周围介质的折射率。因此, 通常情况下, 只 有直径大于 100m 的菌落才可以通过肉眼检测到, 菌落生长到这样的尺寸所需要的时间 通常约为 6 小时 (h) 至 24h。 0005 用高倍显微镜检查, 优选地以黑色为背景, 是一种可行的方法, 但很难实现。 0006 通常使用其他技术。 0007 例如, 可以通过由微生物的新陈代谢转化为荧光物质的各种非荧光添加剂来使微 生物发荧光 , 选择在微生物内保留长时间的荧光物质。在细菌发荧光前, 该方法需要大量 的时间 ( 大于 5 小时 ), 并且该方法还需要形成产生。
9、荧光的代谢产物。 0008 类似地, 颜色生成介质使得能够以选择性的方式观察微生物 , 但存在同样的问 题 : 在肉眼可见之前 , 染色需要相当长的时间 ( 几小时 )。 0009 此外 , 所有这些方法有着导致微生物的代谢严重紊乱的危险 , 而随后的测试 ( 例 如 , 测量对抗生素的敏感度 ) 需要使微生物在最有利的可能条件下生长。 发明内容 0010 本发明的目的是通过提供一种尽可能少侵入性地检测生物颗粒群以及可以实现 小尺寸群 (如生长初期的微生物群落) 的早期检测的方法来减轻上述的缺点。 0011 根据本发明, 通过一种检测表面上的生物颗粒群的方法来实现这样的目的, 所述 方法包括以。
10、下步骤 : 0012 a) 确定所述表面的地貌表示 ; 以及 0013 b) 在所述地貌表示中检测至少一个限定可能对应于生物颗粒群的区域的轮廓。 0014 使用适当编程的计算机或其它电子数据处理器装置, 结合适当的测量装置 (特别 用于进行步骤 a) ) , 来实施这些步骤。 0015 在本发明的有利的实现方式中 : 说 明 书 CN 103025888 A 3 2/7 页 4 0016 所述生物颗粒可以选自微生物 (如细菌、 酵母菌或真菌) 以及植物细胞或动物细 胞。 0017 所述生物颗粒的直径或主尺寸可在 10m 至 3mm 范围内, 或优选地小于或等于 几百微米, 如小于或等于 100。
11、m。 0018 所述表面可以选自培养基和周围介质 (如空气) 之间的界面、 功能化基底的表面 以及微孔膜的表面。 0019 可通过无接触以及无需准备样品进行的光学方法来实施确定所述表面的地貌 表示的所述步骤a) , 以保证最小的侵扰。 具体地, 其可以由彩色共焦微地貌或纹影摄影术或 阴影摄影术 (strioscopie) 组成。 0020 所述步骤 b) 可在于, 通过测量所述表面的地貌表示的局部坡度以及定阈值来实 施检测至少一个轮廓。 0021 该方法还可以包括预处理所述地貌表示的操作, 该预处理操作包括检测参考表 面并减去该参考表面。 0022 该方法可以包括在连续的时间重复步骤 a) 和。
12、步骤 b) , 以及仅选择步骤 b) 中确 定的形状或尺寸随时间变化的区域。 0023 在本发明的有利的变型中, 该方法可以包括另一步骤 c) , 所述步骤 c) 在于量化与 检测到的群的尺寸 (例如, 其体积) 有关的指标。当已知所考虑的生物颗粒的平均尺寸时, 这特别地有利。在这样的情况下, 该步骤 c) 可以评估该群中存在的生物颗粒的量。单独来 看, 知道所关注的生物颗粒的平均尺寸, 一旦群的尺寸被确定, 则量化所述群中存在的生物 颗粒的数量是容易的。当生物颗粒是微生物且设想对所述微生物进行随后处理 (在这种情 况下, 有必要从群落中采取样品) 时, 本发明的这种变型是特别有利的。因此, 。
13、这种变型可以 确保存在的微生物的数量是足够的, 例如在抽样前。 0024 在本发明的有利的变型中, 所述方法可以包括原位识别或非原位识别排列在群中 的微生物的另一步骤。 附图说明 0025 参照附图阅读通过示例给出的以下描述后, 本发明的其它特征、 细节和优点变得 明显, 其中 : 0026 图 1 示出其上存在有细菌群落的培养基的表面 ; 0027 图 2 是示出实施本发明的方法的各个步骤的图 ; 0028 图 3 示出在本发明的方法的第一变型中使用的彩色共焦微地貌的原理 ; 0029 图 4A 和图 4B 以及图 5A、 图 5B、 图 5C、 图 5D 和图 5E 示出通过对接 0030。
14、 种细菌的培养基应用彩色共焦微地貌技术而获得的实验结果 ; 0031 图 6A 至图 6D 示出基于纹影摄影技术的本发明的方法的第二变型 ; 以及 0032 - 图 7A 至 7C 示出基于阴影摄影技术的本发明的方法的第三变型。 具体实施方式 0033 图 1 示出培养皿 10 的俯视图, 该培养皿包括营养培养基 (琼脂) , 营养培养基的表 面11上生长有细菌群落12。 本发明的方法致力于在这些群落的生长初期阶段, 当群落的直 说 明 书 CN 103025888 A 4 3/7 页 5 径过小 (几十微米, 如 30m 或小于 30m) 而对肉眼不可见时, 检测所述群落。所述培养基 的表面。
15、 11(即, 琼脂 - 空气界面) 呈现出与琼脂的表面状态相关的不平顺部 13。在图 1 的 示例中, 琼脂直接暴露在空气中, 因此趋于干燥, 从而导致其表面变形, 特别是导致琼脂的 平均高度发生变化。有利的是, 检测琼脂表面上的生物颗粒群的方法考虑到这些表面不平 顺部以及表面所受的变形。 0034 本发明的方法利用已知的事实, 即, 营养培养基的表面处的细菌繁殖形成突起。 所 述突起的高度在群落生长初期约为几百纳米或几微米。本发明的观点在于, 利用已知的表 面形貌学技术, 结合适当的图像处理, 检测与所述生物颗粒群相关的突起。 0035 如图2所示, 本发明的方法的第一步骤E1在于确定其上正。
16、生长有用于检测的群12 的表面 11 的地貌表示 20。该图中所示的示例中, 所述地貌表示是三维的, 且特别以 “三维 板” 的形式。该表面的每一个点具有在 Oxy 平面中的坐标 (x, y) , 且在三维地貌表示中与沿 着轴线 Oz 的 z 坐标相关, 所述轴线 Oz 优选地与 Oxy 平面垂直。该表示可以是在 Ox、 Oy 和 Oz 参考系中的三维表面的形式, 或者是矩阵的形式, 在该矩阵中, 元素 ai, j对应于具有 Oxy 平面中的坐标 (i, j) 的点的沿 z 轴线的高度。 0036 第二步骤 E2 是预处理地貌表示 20 的操作, 该操作包括检测和减去基础表面。如 上所述, 所。
17、述表面 11 可能不好界定, 甚至可能会随着时间而变化。为了确保良好地检测颗 粒群, 需要确定基础表面, 该基础表面通过适当的数据处理得出, 例如通过低通空间滤波, 其截止频率通常约为0.001/微米(m-1), 例如, 在1/2000m-1至1/500m-1的范围内。 因 准备培养基造成的划痕、 厚度变化、 甚至非均匀变化和偏离平面化全部消失。 0037 在较简单的变型中, 为了确定平坦的且倾斜的基础表面, 计算表面区域附近的平 均坡度。 0038 附图标记 21 表示滤波后的三维板 (更通常地 : 地貌表示) , 其中, 低空间频率的不 平顺部 201( 例如, 由于培养基 13 的不平顺。
18、部引起 ) 已经通过上述处理操作消除。板 21 上 剩下的都是尺寸足够小和 / 或空间频率足够高的不平顺部和高低不平部 202。术语 “高” 用 在空间频率中是指频率大于1/500m-1。 可以排除甚高频率的部分, 即, 对应于大于几m-1 的空间频率的部分, 其中, 这样的部分对应于构成培养基的凝胶的高低不平部。 0039 第三步骤 E3 在于从所述三维板 21 提取轮廓 22。在已知的方式中, 可以由本领域 技术人员公知的轮廓探测滤波器, 通过测量所述板的局部坡度, 之后通过定阈值, 或通过带 通空间滤波 (例如具有位于 1/500m-1的几倍至 1/10m-1的几倍的范围内的通带的滤波 。
19、器) , 来检测轮廓。所述轮廓 22 中的至少一些轮廓限定封闭区域 23, 在第四步骤 E4 中, 封闭 区域 23 被确定为可能对应于生物颗粒群。所述步骤 E4 可以包括选择予以考虑的封闭区域 的操作。例如, 可以利用选择标准, 由此仅有足够小尺寸 (约数十微米的对角线或直径) 的区 域被保留为可能表示生物颗粒群。在变型或其组合中, 可以连续地重复步骤 E1 至步骤 E4, 且仅选择形状或尺寸随着时间变化的区域 22。生物颗粒群是随着时间变化的 “活” 结构, 然 而, 在两个连续的测量之间, 非生物结构即使发生变化, 变化也非常小。这也可以测量所述 群的生长速率。 0040 可以通过应用其。
20、本身已知的各种不同的微地貌技术来实现所述方法的第一步骤 E1, 该第一步骤在于确定其上生长有用于检测的群的表面的地貌表示。为了避免干扰待检 测的群的生长, 特别优选的是使用不涉及接触的技术, 尤其是不涉及制备样品的光学技术 说 明 书 CN 103025888 A 5 4/7 页 6 (即, 不依赖于使用染料、 荧光团或其前体) 。 0041 在通常情况下, 光学微地貌技术包括 : 0042 使用光源照射一表面, 待获得关于该表面的三维表示 ; 0043 - 使用光传感器检测由所述表面反射或透射的光所对应的信号 ; 以及 0044 根据检测到的信号确定所述表面的三维地貌表示。 0045 对表面。
21、的照射可以自周围介质直接导向所述表面。当未使照射准直时, 照射可以 集中在待被测量的区域。光源可以在空间和 / 或时间上是相干的, 或者其可以是不相干的。 光源可以是多色的或单色的。检测可以通过互补金属氧化硅 (CMOS) 、 电荷耦合器件 (CCD)、 光电倍增管、 光电二极管等类型的一维图像传感器 ( 带 ) 或二维图像传感器 ( 矩阵 ) 来进 行。所述传感器可以具有光谱测定功能, 使得能够分析检测到的光的频谱。该传感器还可 以与光圈或 “小孔” 连接, 以构成共焦检测器设备。 0046 下面详细描述构成本发明的优选实现方式的两种技术。然而, 其它光学技术也可 以应用至本发明的方法, 例。
22、如 : 通过自准直或图像处理而自动聚焦在所述表面上 ; 干涉测 量法和 / 或全息方法 ; 分析反射波前锋等。 0047 已经成功地应用于表面上的生物颗粒群的早期检测的第一微地貌光学技术是彩 色共焦微地貌。彩色共焦微地貌已由供应商 Stil S.A. 开发出且在文献 FR 2738343 中予 以详细描述。 0048 图 3 示出了彩色共焦微地貌技术或彩色共焦成像。 0049 白光 (或在任何情况下的多色光) 的点源 300(例如, 以与小孔关联的广延性源的 形式实现) 发射出光束 301, 该光束通过物镜 310 聚焦。该物镜 310 呈现出扩展的轴向色 差 : 因此, 光束 301 的各个。
23、频谱分量被聚焦在沿着所述物镜的光轴分隔开的相应焦点 321、 322、 323. 处。以这种方式聚焦的垂直入射的光束被导向至样品的表面 330 上。由所述表 面 330 反射的光再次穿过所述物镜 310, 这次朝向光源 300 传播 ; 反射光的一部分由分光镜 340 获取, 分光镜 340 指向可轴向移动的小孔 350, 小孔 350 排列在分光光度计 360 的前面。 这进行空间滤波 : 仅仅来自与小孔 350 共轭的点的光线可以到达分光光度计 360。由于物 镜 310 的轴向色度, 因此这些光线呈现出相应的良好限定的波长 i, 波长 i取决于物镜 310 和反射表面 330 之间的距离。
24、 H。因此, 可以根据由分光光度计 360 所测定的波长 i来 确定 H。 0050 因此, 可以通过扫描来获得所述表面 330 的地貌表示。 0051 已经通过利用接种的琼脂培养基和光学系统实验性地证明了用于实现本发明方 法的技术的用途, 该光学系统的特征在于 : 0052 1 千赫 (kHz) 的采样频率 ; 0053 约 300m 的距离动态范围 ; 0054 分光光度计使用1000像素的CCD带作为其检测器, 每个像素编码300纳米 (nm) 的高度。 0055 信号处理方法 (例如, 超像素化) 使得可以获得小于 300nm 的垂直分辨率。这种已 知的方法有助于通过组合相邻像素的内容。
25、来提高分辨率。 0056 作为示例说明, 可以使用来自供应商 Altimet 的装置 Altisurf 500。 0057 图 4A 和图 4B 以及图 5A 至图 5E 示出了实验结果。在这些图中, 三维板被完全等 说 明 书 CN 103025888 A 6 5/7 页 7 效的且使用灰阶 (深灰色代表低高度, 浅灰色或白色代表较高的高度) 的表示所取代。 0058 图 4A 是由表皮葡萄球菌接种的琼脂培养基的表面的地貌表示。可以观察到, 表面 在数十微米中以带的形式变形。 图4B示出预处理以减去基础表面后的相同表示。 表面变形 已消失, 但观察到高度约 2m 且直径范围为 10m 至几百。
26、 m 的细菌群落是没有困难的。 此后, 通过计算局部坡度和定阈值, 自动识别群落。 在该示例中所研究的琼脂表面的尺寸为 1.2mm 5mm。 0059 图 5A 是接种大肠杆菌的另一琼脂培养基的表面的减去背景之前的地貌表示。图 5B 示出背景表面, 显示出以带的形式的表面不平顺部, 且图 5C 示出已减去背景后的表面, 其中细菌群落是清晰可见的。 0060 图 5D 和图 5E 示出那些群落中的两个群落的一维轮廓随时间 (在时间 0 小时、 1.3 小时、 2.2 小时、 3 小时、 3.9 小时) 而变化。可以看出, 约 2 小时后群落为可检测的, 且可以 跟踪它们的生长速率。 0061 在。
27、该方法中, 培养基表面的地貌表示是三维表示。所检测的轮廓对应于限定体积 的封闭环。根据使用的轮廓检测方法, 封闭环使对应于相同的坡度的像素或者对应于相同 的高度的像素相互连接。 0062 由轮廓限定的每个体积可以被一指标量化, 该指标可以包括所述体积中包含的像 素的重量的积分 (即, 高度) 。当计算该积分时, 可以对像素的重量定阈值。换言之, 仅考虑 超过一定阈值的重量值。 可以基于组成该轮廓的一个或多个像素的重量或分布在所述轮廓 所限定的表面区域中的一个或多个像素的重量, 来建立该阈值。 0063 当已知构成该体积的微生物的类型时, 该指标可以估计其生物量。 0064 在另一实现方式中, 。
28、通过纹影摄影法检测生物颗粒群。 0065 纹影摄影是一种已知的光学方法, 且基于傅里叶光学原理。图 6A 示出了用于执行 本发明的第二实现方式的纹影设置。 0066 点源 600 发射出基本上是单色光的辐散光束 601, 辐散光束 601 随后通过物镜 620 聚焦。包含接种的培养基的透明培养皿 610 直接位于物镜 620 的下游, 以便使聚焦光束穿 过培养皿 610, 接种的培养基的表面 611 上生长有用于检测的微生物群落 612。遮罩 630 置 于物镜 620 的焦平面中。遮罩遮挡来自光源的且穿过物镜和培养皿而不发生偏转的所有光 线。如果表面 611 是完全平面的和均匀的 (以及在几。
29、何光学近似内) , 则光束 601 中的所有 的光将都被遮罩拦截。实际中, 表面不平顺部 611(包括由于群落 612 引起的不平顺部) 使 一些光线偏转, 使得这些光线绕过该遮罩。从傅里叶光学的观点看, 了解到, 在物镜的焦平 面中, 形成对应于表面 611 的空间频谱的光分布, 因此遮罩进行高通空间滤波。 0067 成像系统 (摄像机 640) 位于遮罩的下游, 且聚焦于培养基的表面。通过成像系统 获得的图像包含与表面 611 的局部坡度相关的信息, 因此可以重构所述表面 (更好地, 该表 面已经部分经受高通滤波, 而不需任何预处理) 的三维板。 0068 考虑到遮罩具有有限的尺寸, 仅检。
30、测那些偏转角度大于或等于阈值的光线。当遮 罩尺寸与物镜的衍射图案的尺寸相同时, 该阈值被最小化。如果假定光源 600 通常是点源 (始终近似) , 则可以检测到的局部坡度仅仅是大于 /(n-1)d 的坡度, 其中, 是所用光 的波长, d 是物镜的直径, 以及 n 是培养基的折射率。角度 的局部坡度使光线偏转角度 (n-1) , 且仅可观察到大于衍射的偏差。 在实际中, 培养基具有约几毫弧度的表面缺陷, 为 说 明 书 CN 103025888 A 7 6/7 页 8 了可以不需要任何预处理, 这需要远远大于该理论限度的遮罩。 遮罩的直径需要为约(n-1) l*pmax, 其中, pmax 是。
31、表面缺陷的最大局部坡度, l 是物镜和遮罩之间的距离。厚度为 1m 且直径为30m的微群落向波形表面赋予(1.35-1)/15=23毫弧度的平均局部坡度, 其远远 大于凝胶的表面缺陷, 且因此很容易看到。 群落边缘处的局部坡度甚至更大, 通常不小于几 百微弧度 (或十分之几弧度) 。 0069 纹影摄影术与几何映射技术 (例如彩色共焦成像) 相比的优点是, 不必要有优于微 群落的大小的横向分辨率 : 因为使用黑色的背景, 因此检测和定位小于分辨率极限的项目 (虽然本质上不可能将两个相互靠近程度大于所述分辨率极限的项目分离开) 不存在困难。 0070 另一个优点是, 在单次采集中, 相比于使用上。
32、述的共焦微地貌技术, 所观察到的区 域可以覆盖更广的区域。因此, 通过纹影法获取的图像使得可以观察到培养皿广泛的部分 或甚至培养皿所有部分。 0071 在该方法中, 所述培养基的表面的地貌表示是二维表示, 即, 图像, 其中, 两个相邻 像素之间的强度变化代表所照射的表面的高度变化和 / 或所述表面的折射率的局部变化。 所检测到的轮廓对应于限定区域的封闭环。 这些环将对应于灰度级的相同变化的像素连接 在一起。 0072 当两个相邻像素之间的高度变化是通过细菌群落而产生时, 该细菌群落的边缘相 对于培养基的表面形成通常大于十分之几弧度的角度。 这样的坡度大于培养基的高度变化 所形成的坡度, 在培。
33、养基的高度所形成的坡度中, 所涉及的角度通常小于 10 毫弧度。 0073 图 6B 示出能够通过纹影摄影术实现本发明的方法的另一种设置。不同于图 6A 中 的设置, 当照射光束 301 穿过透明的培养皿 610 时, 使照射光束 301 准直, 且该照射光束 被位于培养皿下游的第一物镜 620 (物镜焦距 : 200mm ; 直径 : 50mm- 仅仅以示例的方式给出 这些值) 聚焦。第二物镜 621 (焦距 : 10mm ; 数值孔径 NA : f/3- 也仅仅以示例的方式给出这些 值) 形成培养皿的图像。位于物镜 620 的焦平面中的遮罩 630 拦截非因所观察的表面 611 中的局部坡。
34、度的变化或非因所述表面中的折射率的局部变化而被反射的光线 (以及向下偏 转的光线, 即使这不是必须的) 。 当细菌群落在培养基的表面611上生长时, 其使入射在其上 的光辐射偏转, 使得光不集中于遮罩 630 上, 但由检测器 640(例如, 具有 140010003m 像素的摄像机) 检测到。因此, 因为细菌群落 612 引起表面 611 中的局部坡度波动, 因此可 以由检测器 640 检测到以黑色背景上的光点的形式的细菌群落。 0074 使用平行的照射光束, 而不是如图 6A 的设置中的发散光束 / 会聚光束, 具有使信 号的强度与所观察的表面的部分的位置无关的作用。 换言之, 在整个观察。
35、区域中, 所观察到 的表面中的相同的局部坡度在检测器上产生具有相同强度的信号, 而与该局部坡度在培养 基 610 的表面 611 上的位置无关。 0075 图 6C 对应于在大肠杆菌型细菌已被接种在大豆酪蛋白琼脂培养基 (TSA) 型琼脂 的表面上8小时后来利用图6B的设置观察大肠杆菌型细菌群落。 白点对应于细菌群落。 在 图像的右下部分中形成明亮的直角的连续线对应于构成视觉参考的玻璃载片。 0076 图 6D 是相同的培养基在接种 24 小时后的照片。可以看出, 在图 6D 中拍摄的细菌 群落与在图 6C 中示出的通过透射纹影摄影术检测的细菌群落之间具有良好的匹配。 0077 纹影摄影术也可。
36、以在反射布局中实施, 光源被布置成面向培养基, 检测器也被布 置成面向培养基。这适用于观察不透明的介质。 说 明 书 CN 103025888 A 8 7/7 页 9 0078 在另一实现方式中, 通过实施阴影摄影技术的设置观察细菌群落。所述设置如图 7A 中所示。平行光束穿过含有培养基的培养皿 710, 然后通过第一物镜 720(物镜焦距 : 200mm ; 直径 : 50mm- 仅仅以示例的方式给出这些值) 聚焦在检测器 740 上。当细菌群落 712 在培养基的表面711上生长时, 因为高度变化, 以及因此形成在表面711上的局部坡度的变 化, 细菌群落使光辐射偏转。不同于纹影方法, 通。
37、过高度变化和 / 或所观察的表面上的折射 率变化而偏转的光辐射没有被检测器 740 (具有 140010003m 的像素、 物镜焦距 f=10mm、 数值孔径 NA=f/3 的摄像机, 仅仅以示例的方式给出这些值) 获得。此装置用于借助由检测 器 740 形成的图像上出现的暗区域来检测用于分析的平面型表面上的局部坡度。因此, 在 该方法中, 细菌群落 712 以暗点的形式出现在浅背景中, 该背景对应于培养基的表面 711。 0079 如以上关于纹影摄影的主题所述的, 当实施阴影摄影术时, 培养基表面的地貌表 示是二维表示, 即, 图像, 其中, 两个相邻像素之间的强度变化表示所照射的物体表面的。
38、高 度变化。该强度变化也可以表示所述表面的折射率的局部变化。 0080 图 7B 示出了大肠杆菌型细菌群落被接种在 TSA 型琼脂的表面上 8 小时后使用图 7A 的设置观察大肠杆菌型细菌群落的结果。暗点对应于细菌群落。可以观察到, 这些群落 位于与图 6D 的结果 (照片) 和通过透射纹影摄影得到的图 6C 中所示的观察相匹配的位置 中。 0081 同纹影技术一样, 可以通过阴影摄影术在反射布局中实施观察细菌群落, 光源 700 被放置成面向含有待观察的培养基的培养皿 710, 检测器 740 也面向该培养皿。图 7C 示出 了这样的设置, 分光镜750偏转光源产生的光, 然后物镜720使光。
39、平行。 当培养基不透明时, 这样的设置是优选的。 0082 关于纹影摄影术和表面映射, 有利的是, 使用图像处理的任何方法和使连续图像 相减从而适于显示因生长而发生的变化的任何方法。 0083 一旦群的位置被确定, 则可使用已知的测量方法识别细菌本身, 例如, 通过原位分 析 (衍射法、 拉曼光谱法) 或者通过其他分析方法 (如质谱分析法) 。在这种情况下, 进行非原 位分析, 因此需要移除细菌群落。 0084 例如, 通过地貌的测位可以选择体积超过一定阈值的群, 随后, 对所选择的群进行 定性分析。 0085 本发明并不限定于检测培养基的表面上的微生物群落。 其上放置有用于检测的生 物群且更。
40、一般地生物颗粒的表面同样可呈固态, 如玻璃基底或功能化硅基底或用于回收过 滤液中获得的细菌的微孔过滤器 (可以但并不必须适于在培养基上放置) 。在所述方法的第 二步骤 E2 中实施的预处理操作优选地适合于所考虑的表面类型。 0086 位于所述表面上的周围介质可以是真空或流体, 如气体或液体, 气体尤其是空气 是优选的。周围介质可以被封闭, 以避免受污染的风险以及在适当的情况下避免琼脂蒸发 的风险。 说 明 书 CN 103025888 A 9 1/8 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103025888 A 10 2/8 页 11 图 3 说 明 书 附 图 CN 103025888 A 11 3/8 页 12 图 4A 图 4B 图 6A 说 明 书 附 图 CN 103025888 A 12 4/8 页 13 图 5A 图 5B 说 明 书 附 图 CN 103025888 A 13 5/8 页 14 图 6B 说 明 书 附 图 CN 103025888 A 14 6/8 页 15 图 6C 图 6D 说 明 书 附 图 CN 103025888 A 15 7/8 页 16 图 7A 图 7B 说 明 书 附 图 CN 103025888 A 16 8/8 页 17 图 7C 说 明 书 附 图 CN 103025888 A 17 。