酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201410665396.1	申请日：	2014.11.19
公开号：	CN104391021A	公开日：	2015.03.04
当前法律状态：	驳回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):G01N 27/26申请公布日:20150304\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):G01N 27/26申请日:20141119\|\|\|公开
IPC分类号：	G01N27/26; G01N27/327	主分类号：	G01N27/26
申请人：	辽宁科技大学
发明人：	王月; 张志强; 王翠苹; 崔勇; 刘飞; 贾宏敏; 孟庆涛
地址：	114044辽宁省鞍山市高新区千山路185号
优先权：
专利代理机构：	鞍山嘉讯科技专利事务所21224	代理人：	张群
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内容摘要

本发明公开了一种酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法，能够低成本、高效准确的检测水体环境中酚类化合物。该检测方法包括：制备酪氨酸酶生物传感器，在玻碳电极的检测端表面沉积有聚硫堇分子，聚硫堇分子外表面偶联一层戊二醛薄膜，在戊二醛薄膜外侧键合酪氨酸酶分子；检测溶液中酚类化合物，以酪氨酸酶生物传感器作为工作电极，银/氯化银作为参比电极，铂电极作为对电极，根据酚类化合物浓度与还原电流的线性回归方程，测定待测溶液中的酚类化合物的种类和含量。本发明与传统的高效液相色谱法相比，成本低廉、操作简单、响应速度快、检测精度高、抗干扰性强。

权利要求书

权利要求书
1.  一种酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法，其特征是该方法包括以下内容：
一.酪氨酸酶生物传感器的制备
酪氨酸酶生物传感器包括一玻碳电极，在玻碳电极的检测端表面沉积有聚硫堇分子，聚硫堇分子外表面偶联一层戊二醛薄膜，在戊二醛薄膜外侧键合酪氨酸酶分子；
二.检测溶液中酚类化合物
以酪氨酸酶生物传感器作为工作电极，银/氯化银作为参比电极，铂电极作为对电极，建立三电极系统，三电极系统与电化学工作站连接，将工作电极的检测端置于待测溶液中，通过电化学工作站检测出待测溶液中还原电流大小，然后根据酚类化合物浓度与还原电流的线性回归方程，测定待测溶液中的酚类化合物的种类和含量。

2.  根据权利要求1所述的一种酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法，其特征是所说的酪氨酸酶生物传感器的制备包括以下步骤：
a.沉积聚硫堇分子膜，在一清洗好的玻碳电极的检测端表面用电化学方法沉积硫堇分子，得到聚硫堇分子膜修饰电极，晾干备用；
b.偶联戊二醛，向步骤a中制得的硫堇修饰电极上滴加配制好的戊二醛水溶液，通过化学偶联反应使戊二醛与玻碳电极上的硫堇共价偶联，得到戊二醛-硫堇修饰电极；
c.固定酪氨酸酶，在步骤b中制得的戊二醛-硫堇修饰电极上滴加配制好的酪氨酸酶溶液，通过化学偶联反应使酪氨酸酶固定于修饰电极的戊二醛上，得到酪氨酸酶生物传感器。

3.  根据权利要求2所述的一种酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法，其特征是所述步骤a中，硫堇的浓度为0.1mmol/L-1.0mmol/L，所用溶剂为Britton-Robinson缓冲溶液，包括硼酸、醋酸、磷酸和氢氧化钠，缓冲溶液浓度为10-100mM，pH值为4.0-9.5，扫描起始电压为0.4V，终止电压为0.4V，最高电压为1.1V，最低电压为-0.4V，扫面方向负向，扫描循环为20-100次，扫描速度为100mV/s；所述步骤b中的戊二醛水溶液体积百分比浓度为5-25％，用量为5μL-10μL，反应时间为15分钟-1小时；所述步骤c中酪氨酸酶浓度范围为0.1mg/mL-1mg/mL，用量为5μL-10μL。

4.  根据权利要求1所述的一种酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法，其特征是所述的测定待测溶液中的酚类化合物为苯二酚，特别是对苯二酚或邻苯二酚，对苯二酚和邻苯二酚的浓度线性检测范围均为5×10-7～1×10-4M。

5.  根据权利要求1所述的一种酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法，其特征是所说的根据酚类化合物浓度与还原电流的线性回归方程，测定待测溶液中的酚类化合物的含量，电流信号变化公式为：P＝Ib-Ia，式中P为酚类污染物溶液处理前后电流信号变化量；Ia为修饰后玻碳电极在空白缓冲溶液中扫描的电流；Ib为酚类污染物溶液滴加到检测缓冲溶液后扫描的电流，对苯二酚浓度与还原电流变化的线性回归方程为：
PHQ＝67.582-5.4614lgCHQ    (1)
式(1)中，PHQ为对苯二酚检测时电流信号变化值，单位为μA；CHQ为待测溶液中对苯二酚的浓度值，单位为M；以底物浓度为横坐标，所对应的电流信号变化值作为纵坐标，作校正曲线，找出校正曲线的线性范围后，所得到相关系数R2，式(1)的相关系数为R2＝0.9502，检测下限为5×10-8M；邻苯二酚浓度与还原电流变化的线性回归方程为：
PCC＝86.954-7.0386lgCCC    (2)
式(2)中，PCC为邻苯二酚检测时电流信号变化值，单位为μA；CCC为待测溶液中邻苯二酚的浓度值，单位为M；式(2)的相关系数为R2＝0.9751，检测下限为1.5×10-8M。

说明书

说明书酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法
技术领域
本发明涉及检测酚类化合物的方法，特别是一种酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法。
背景技术
酚类化合物是环境中广泛存在的一类有机污染物，主要来自化工、医药、炼焦等工业排放及农药降解，威胁人类用水安全。随着人们对环境安全意识的逐步提高，迫切要求快速准确测量地表水及饮用水的安全状况。目前对于酚类有机污染物的主要测定方法有色谱法、紫外分光光度法、流动注射分析法等。但这些方法都存在着仪器昂贵、样品预处理、操作过程复杂、分析周期长以及对工作人员的操作水平要求高等缺点，难以实现产业化，无法满足环境中酚类化合物的准确快速检测的要求。
生物传感器是基于生物组分对底物进行专一的识别，通过信号传导器将产生的信号以光、电等形式传递出来，通过信号大小定量检测底物的一项新技术。运用生物传感器来检测环境中的有机污染物、重金属、病菌微生物具有专一性强、灵敏度高、样品量少、成本低廉的特点，因此成为环境保护研究中的一个热点课题。
酪氨酸酶是一种具有生物催化活性的蛋白质，在生物体外容易失去活性，在生物传感器应用中，生物酶需要被固定在一个基板上以实现直接电子传递或者增大表面积以达到效率放大作用。利用各种固定方法将生物敏感元件固定于基板表面并保持活性是生物传感器发展的重要方向。目前许多酪氨酸酶传感器普遍存在的问题是制备方法复杂、成本高、操作和存储稳定性不够高等。
查阅相关专利文献，公开(公告)号：102854233A，公开了一种“基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器及其制备方法和应用”，通过在玻碳电极表面沉积纳米金粒子，之后吸附L-赖氨酸薄膜，在L-赖氨酸薄膜上加载有序介孔碳载纳米金，最后吸附酪氨酸酶。制备过程中所使用的纳米金材料昂贵，制备过程复杂，并且酪氨酸酶的用量为0.05mg/μL-0.1mg/μL，生产成本很高。公开(公告)号：102928488A，公开了一种“酶电化学生物传感器检测水体环境中酚类化合物的方法”，利用亲水性离子液体与介孔碳制备复合材料，再将酪氨酸酶加入到复合材料中制备酪氨酸酶工作电极。介孔碳材料的制备过程复杂，需要使用浓硫酸，并且制备过程中需要升温750-950度，使用有机溶剂，易造成环境污染，酪氨酸酶的用量为2.5-20mg/mL，生产成本较高。公开(公告)号：103278541A公开了一种“用于检测双酚A的电化学生物传感器及其制备方法和应用”，使用石墨烯/金复合物以及壳聚糖来修饰固定酪氨酸酶电极，使用的石墨烯及金等材料价格昂贵，其中氧化石墨烯的制备过程复杂，需要多种有机及无机试剂，并且使用酪氨酸酶的浓度为4.5mg/mL。
发明内容
本发明提供了一种酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法，能够低成本、高效准确的检测水体环境中酚类化合物。
本发明提供的酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法包括以下内容：
一.酪氨酸酶生物传感器的制备
酪氨酸酶生物传感器包括一玻碳电极，在玻碳电极的检测端表面沉积有聚硫堇分子，聚硫堇分子外表面偶联一层戊二醛薄膜，在戊二醛薄膜外侧键合酪氨酸酶分子；
二.检测溶液中酚类化合物
以酪氨酸酶生物传感器作为工作电极，银/氯化银作为参比电极，铂电极作为对电极，建立三电极系统，三电极系统与电化学工作站连接，将工作电极的检测端置于待测溶液中，通过电化学工作站检测出待测溶液中还原电流大小，然后根据酚类化合物浓度与还原电流的线性回归方程，测定待测溶液中的酚类化合物的种类和含量。
所述酪氨酸酶生物传感器的制备包括以下步骤：
a.沉积聚硫堇分子膜，在一清洗好的玻碳电极的检测端表面用电化学方法沉积硫堇分子，得到聚硫堇分子膜修饰电极，晾干备用；
b.偶联戊二醛，向步骤a中制得的硫堇修饰电极上滴加配制好的戊二醛水溶液，通过化学偶联反应使戊二醛与玻碳电极上的硫堇共价偶联，得到戊二醛-硫堇修饰电极；
c.固定酪氨酸酶，在步骤b中制得的戊二醛-硫堇修饰电极上滴加配制好的酪氨酸酶溶液，通过化学偶联反应使酪氨酸酶固定于修饰电极的戊二醛上，得到酪氨酸酶生物传感器。
所述酪氨酸酶生物传感器的制备，步骤a中，硫堇的浓度为0.1mmol/L-1.0mmol/L，所用溶剂为Britton-Robinson缓冲溶液，包括硼酸、醋酸、磷酸和氢氧化钠，缓冲溶液浓度为10-100mM，pH值为4.0-9.5，扫描起始电压为0.4V，终止电压为0.4V，最高电压为1.1V，最低电压为-0.4V，扫面方向负向，扫描循环为20-100次，扫描速度为100mV/s；所述步骤b中的戊二醛水溶液体积百分比浓度为5-25％，用量为5μL-10μL，反应时间为15分钟-1小时；所述步骤c中酪氨酸酶浓度范围为0.1mg/mL-1mg/mL，用量为5μL-10μL。
所述的测定待测溶液中的酚类化合物为苯二酚，特别是对苯二酚或邻苯二酚，待测溶液中对苯二酚、邻苯二酚的浓度线性检测范围均为5×10-7～1×10-4M。
所述的根据酚类化合物浓度与还原电流的线性回归方程，测定待测溶液中的酚类化合物的含量，电流信号变化公式为：P＝Ib-Ia，式中P为酚类污染物溶液处理前后电流信号变化量；Ia为修饰后玻碳电极在空白缓冲溶液中扫描的电流；Ib为酚类污染物溶液滴加到检测缓冲溶液后扫描的电流，对苯二酚浓度与还原电流变化的线性回归方程为：
PHQ＝67.582-5.4614lgCHQ    (1)
式(1)中，PHQ为对苯二酚检测时电流信号变化值，单位为μA；CHQ为待测溶液中对苯二酚的浓度值，单位为M；以底物浓度为横坐标，所对应的电流信号变化量作为纵坐标，作校正曲线，找出校正曲线的线性范围后，所得到相关系数R2，式(1)的相关系数为R2＝0.9502，检测下限为5×10-8M；邻苯二酚浓度与还原电流变化的线性回归方程为：
PCC＝86.954-7.0386lgCcc     (2)
式(2)中，PCC为邻苯二酚检测时电流信号变化值，单位为μA；CCC为待测溶液中邻苯二酚的浓度值，单位为M；式(2)的相关系数为R2＝0.9751，检测下限为1.5×10-8M。
本发明与现有技术相比，其显著的有益效果体现在：
1.本发明的基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器采用了化学偶联的修饰方式，具有较好的稳定性。首先，将硫堇溶液用电化学的方法沉积在电极表面，使玻碳表面具有伯胺基团，然后通过戊二醛作为偶联试剂，通过化学反应固定到玻碳电极表面，化学键的形成能够提高酶电极的操作稳定性及储存稳定性，最后通过戊二醛的另一端醛基与酪氨酸酶的伯胺基团发生反应，将酪氨酸酶固定在玻碳电极上，因化学偶联方法提供了稳定的化学键，因此能够维持酪氨酸酶的高活性，使酪氨酸酶生物传感器使用寿命更长，酪氨酸酶活性更高。此外，本发明所使用的有机染料并不局限于吩噻嗪类染料，对于吖啶橙类染料同样适用，具有很好的生物兼容性，扩大了制备电极的物质种类，电极的修饰材料更易获得。可见，本发明的酪氨酸酶生物传感器充分集成了现有技术中的技术手段，使组合后的生物传感器实现了各技术手段的优势互补、协同增效，大大提高了生物传感器的稳定性、重复性，提高了现有生物传感器的检测水平。
2.本发明的基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器可用于检测邻苯二酚、对苯二酚等有机酚类污染物，由于生物传感器上酪氨酸酶的高活性，对于邻苯二酚、对苯二酚的氧化能够起到良好的催化效果，本发明的酪氨酸酶生物传感器具有卓越的电子传导能力，使得每次达到稳定响应电流的时间很短，因此，在可测定的浓度范围内，测定结果较理想，用于水样测定的响应值准确，与传统的高效液相色谱法相比，成本低廉、操作简单、响应速度快、检测精度高、抗干扰性强。
附图说明
图1为酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法中，酪氨酸酶生物传感器的制备过程示意图。图中编号：1.玻碳电极(GC)；2.聚硫堇分子膜(TN)；3.戊二醛分子(GA)；4.酪氨酸酶(TYR)
图2为酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法的检测反应原理图。
图3为酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法制得的(TN-GA-TYR/GC)修饰电极的扫描电镜图。
图4为酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法中检测酪氨酸酶与玻碳电极组装过程。图中a为未修饰的玻碳电极在100mmol·L-1PBS缓冲溶液中的循环伏安(CV)曲线；b为酪氨酸酶修饰的玻碳电极的CV曲线，扫描速度为100mV/s。
图5为酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法中酪氨酸酶生物传感器检测时的pH值优化图。
图6为酪氨酸酶修饰电极在PBS溶液中不同扫速下扫描曲线，自上到下为100、90、80、70、60、50、30、20、10mV/s。
图7为酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法中扫描速度与电流信号相关曲线。
图8为酪氨酸酶生物传感器组装过程，图中a为未修饰的玻碳电极在100mmol·L-1PBS缓冲溶液中的电化学阻抗谱图(EIS)；b为硫堇修饰的玻碳电极的EIS谱图；c为戊二醛/硫堇修饰的玻碳电极的EIS谱图；d为酪氨酸酶/戊二醛/硫堇修饰玻碳电极的电化学阻抗谱图。
具体实施方式
下面结合附图用实施例对本发明做进一步详细说明。
如图1所示，酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法，该方法采用基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器，酪氨酸酶生物传感器包括一玻碳电极1，在玻碳电极1的检测端表面沉积有硫堇聚合物分子膜2，硫堇聚合物分子膜2外表面吸附一层戊二醛分子3，戊二醛分子3外层偶联酪氨酸酶4。
一.酪氨酸酶生物传感器的制备步骤
1.直径为0.3cm的玻碳电极用粒径分别为1μM、0.3μM、0.05μM的三氧化二铝粉末抛光，然后在去离子水中超声清洗3次，每次2分钟；
2.在一清洗好的玻碳电极的检测端表面用电化学方法沉积硫堇(TN)分子，具体操作方法是：将该玻碳电极放入含有0.1mmol/LTN的磷酸缓冲溶液中，循环伏安法扫描，初始电位为0.4V，时间为50min，得到硫堇修饰电极，备用；
3.在步骤2中制得的硫堇修饰电极的检测端滴加配置好的5％的戊二醛水溶液，室温静置放置1小时，使硫堇与戊二醛充分反应，其扫描电镜图如图3所示。由图3可知，戊二醛已经分布在玻碳电极的表面，验证了戊二醛/硫堇修饰电极的固定化过程；
4.在步骤3)中制得的戊二醛/硫堇修饰电极的检测端滴加10μL的酪氨酸酶溶液(0.1mg/mL)，室温放置1小时，通过充分的化学偶联反应使酪氨酸酶固定于硫堇/戊二醛修饰电极表面，得到酪氨酸酶生物传感器，其扫描电镜图如图3所示。由图3可知，酪氨酸酶被固定在玻碳电极表面；
5.将修饰后的玻碳电极放入0.1mol L-1PBS溶液中搅拌清洗3次，每次5分钟，去除表面吸附弱的酶分子，将该酪氨酸酶生物传感器保存于4℃条件下备用。
二.采用酪氨酸酶生物传感器检测酚类化合物
将酪氨酸酶生物传感器作为工作电极，银/氯化银作为参比电极，铂电极作为对电极，建立三电极系统，将三电极系统与电化学工作站连接，对待测溶液中的对苯二酚、邻苯二酚浓度进行检测。
工作条件：所用的电解液为0.1mol/L的Britton-Robinson缓冲溶液(BRS)，在pH＝4.0-9.5范围内测定酪氨酸酶生物传感器对同一浓度邻苯二酚的电流响应值，优化结果如图5所示，选定pH＝6.5为最佳pH值，因此在此pH值下，其响应电流大且稳定。
酪氨酸酶生物传感器的检测原理如下：酪氨酸酶催化氧化邻苯二酚成邻醌，邻醌在电极上得到电子，又被还原成邻苯二酚，通过检测还原电流的大小来定量指示待测液中邻苯二酚的浓度；但对苯二酚不是酪氨酸酶的直接底物，在酪氨酸酶和邻醌的作用下形成对醌，对醌在电极上得到电子，又被还原成邻苯二酚，通过检测还原电流的大小来定量指示待测液中对苯二酚的浓度，由于对苯二酚不是酪氨酸酶的直接底物，因此，在后面检测下限中，邻苯二酚的检测下限更低。
本发明检测过程的主反应式如下所示：
CC+O2→o-quinone+2H2O
CC+O2→benzoquinone+2H2O
o-quinone(benzoquinone)+2e+2H+→CC(HQ)
对苯二酚浓度与还原电流变化的线性回归方程为：
PHQ＝67.582-5.4614lgCHQ     (1)
式(1)中，PHQ为对苯二酚检测时的电流变化值，单位为μA；CHQ为待测溶液中对苯二酚的浓度值，单位为M；式(1)的相关系数为R2＝9502，检测下限为5×10-8M。
邻苯二酚浓度与还原电流变化的线性回归方程为：
PCC＝86.954-7.0386lgCcc     (2)
式(2)中，PCC邻苯二酚检测时的电流变化值，单位为μA；CCC为待测溶液中邻苯二酚的浓度值，单位为M；式(1)的相关系数为R2＝0.9751，检测下限为1.5×10-8M。
本实施例中对苯二酚、邻苯二酚的线性范围均为5×10-7～1×10-4M。
本实施例检测的是水样样品，检测结果如下表1、表2所示，该表中原水取自鞍山城市饮用水，C1为原水过滤后测定的对苯二酚、邻苯二酚的浓度，经过过滤后加入确定浓度的对苯二酚、邻苯二酚，制成A、B、C、D四个水样，四个水样的配置浓度为C2栏所示，而C3栏为按照本实施例的检测方法和检测条件测定的浓度值。从加标回收率可以看出，本发明在可测定的浓度范围内，加标回收率在95.4％-103.2％之间，测定结果理想，相比传统的高效液相色谱法，本发明的检测方法操作简单，且不受其它污染物的干扰。
在上述检测方法下，对30μM浓度的邻苯二酚标准溶液连续进行10次平行测定，邻苯二酚峰电流和迁移时间的相对标准偏差分别是为3.2％和1.5％。将电极保存在4℃环境下，每5天检测一次活性，一个月后仍然保持初始活性的90％。
表1 酪氨酸酶生物传感器检测水中的对苯二酚
水样C1mol·L-1C2mol·L-1C3mol·L-1回收率A01×10-60.965×10-696.5％B01×10-51.03×10-5103％
C05×10-54.97×10-599.4％D01×10-41.02×10-4102％
表2 酪氨酸酶生物传感器检测水中的邻苯二酚
水样C1mol·L-1C2mol·L-1C3mol·L-1回收率A01×10-60.9542×10-695.4％B01×10-51.005×10-5100.5％C05×10-55.16×10-5103.2％D01×10-40.972×10-497.2％

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410665396.1 (22)申请日 2014.11.19 G01N 27/26(2006.01) G01N 27/327(2006.01) (71)申请人辽宁科技大学地址 114044 辽宁省鞍山市高新区千山路 185 号 (72)发明人王月张志强王翠苹崔勇刘飞贾宏敏孟庆涛 (74)专利代理机构鞍山嘉讯科技专利事务所 21224 代理人张群 (54) 发明名称酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法 (57) 摘要本发明公开了一种酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法，能够低成本、高效。

2、准确的检测水体环境中酚类化合物。该检测方法包括：制备酪氨酸酶生物传感器，在玻碳电极的检测端表面沉积有聚硫堇分子，聚硫堇分子外表面偶联一层戊二醛薄膜，在戊二醛薄膜外侧键合酪氨酸酶分子；检测溶液中酚类化合物，以酪氨酸酶生物传感器作为工作电极，银 / 氯化银作为参比电极，铂电极作为对电极，根据酚类化合物浓度与还原电流的线性回归方程，测定待测溶液中的酚类化合物的种类和含量。本发明与传统的高效液相色谱法相比，成本低廉、操作简单、响应速度快、检测精度高、抗干扰性强。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请。

3、权利要求书2页说明书5页附图4页 (10)申请公布号 CN 104391021 A (43)申请公布日 2015.03.04 CN 104391021 A 1/2 页 2 1. 一种酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法，其特征是该方法包括以下内容：一 . 酪氨酸酶生物传感器的制备酪氨酸酶生物传感器包括一玻碳电极，在玻碳电极的检测端表面沉积有聚硫堇分子，聚硫堇分子外表面偶联一层戊二醛薄膜，在戊二醛薄膜外侧键合酪氨酸酶分子；二 . 检测溶液中酚类化合物以酪氨酸酶生物传感器作为工作电极，银 / 氯化银作为参比电极，铂电极作为对电极，建立三电极系统，三电极系统。

4、与电化学工作站连接，将工作电极的检测端置于待测溶液中，通过电化学工作站检测出待测溶液中还原电流大小，然后根据酚类化合物浓度与还原电流的线性回归方程，测定待测溶液中的酚类化合物的种类和含量。 2. 根据权利要求 1 所述的一种酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法，其特征是所说的酪氨酸酶生物传感器的制备包括以下步骤： a. 沉积聚硫堇分子膜，在一清洗好的玻碳电极的检测端表面用电化学方法沉积硫堇分子，得到聚硫堇分子膜修饰电极，晾干备用； b. 偶联戊二醛，向步骤 a 中制得的硫堇修饰电极上滴加配制好的戊二醛水溶液，通过化学偶联反应使戊二醛与玻碳电极上的硫堇共价。

5、偶联，得到戊二醛 - 硫堇修饰电极； c. 固定酪氨酸酶，在步骤 b 中制得的戊二醛 - 硫堇修饰电极上滴加配制好的酪氨酸酶溶液，通过化学偶联反应使酪氨酸酶固定于修饰电极的戊二醛上，得到酪氨酸酶生物传感器。 3. 根据权利要求 2 所述的一种酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法，其特征是所述步骤a中，硫堇的浓度为0.1mmol/L-1.0mmol/L，所用溶剂为Britton-Robinson 缓冲溶液，包括硼酸、醋酸、磷酸和氢氧化钠，缓冲溶液浓度为 10-100mM， pH 值为 4.0-9.5，扫描起始电压为 0.4V，终止电压为 0.4V，最高。

6、电压为 1.1V，最低电压为 -0.4V，扫面方向负向，扫描循环为 20-100 次，扫描速度为 100mV/s ；所述步骤 b 中的戊二醛水溶液体积百分比浓度为 5-25，用量为 5L-10L，反应时间为 15 分钟 -1 小时；所述步骤 c 中酪氨酸酶浓度范围为 0.1mg/mL-1mg/mL，用量为 5L-10L。 4. 根据权利要求 1 所述的一种酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法，其特征是所述的测定待测溶液中的酚类化合物为苯二酚，特别是对苯二酚或邻苯二酚，对苯二酚和邻苯二酚的浓度线性检测范围均为 510-7 110-4M。 5. 根据权利。

7、要求 1 所述的一种酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法，其特征是所说的根据酚类化合物浓度与还原电流的线性回归方程，测定待测溶液中的酚类化合物的含量，电流信号变化公式为： P Ib-Ia，式中 P 为酚类污染物溶液处理前后电流信号变化量； Ia为修饰后玻碳电极在空白缓冲溶液中扫描的电流； Ib为酚类污染物溶液滴加到检测缓冲溶液后扫描的电流，对苯二酚浓度与还原电流变化的线性回归方程为： PHQ 67.582-5.4614lgCHQ (1) 式 (1) 中， PHQ为对苯二酚检测时电流信号变化值，单位为 A ； CHQ为待测溶液中对苯二酚的浓度值，单位为 M。

8、；以底物浓度为横坐标，所对应的电流信号变化值作为纵坐标，作校正曲线，找出校正曲线的线性范围后，所得到相关系数 R2，式 (1) 的相关系数为 R2 0.9502，检测下限为 510-8M ；邻苯二酚浓度与还原电流变化的线性回归方程为：权利要求书 CN 104391021 A 2 2/2 页 3 PCC 86.954-7.0386lgCCC (2) 式(2)中， PCC为邻苯二酚检测时电流信号变化值，单位为A ； CCC为待测溶液中邻苯二酚的浓度值，单位为 M ；式 (2) 的相关系数为 R2 0.9751，检测下限为 1.510-8M。权利要求。

9、书 CN 104391021 A 3 1/5 页 4 酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法技术领域 0001 本发明涉及检测酚类化合物的方法，特别是一种酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法。背景技术 0002 酚类化合物是环境中广泛存在的一类有机污染物，主要来自化工、医药、炼焦等工业排放及农药降解，威胁人类用水安全。随着人们对环境安全意识的逐步提高，迫切要求快速准确测量地表水及饮用水的安全状况。目前对于酚类有机污染物的主要测定方法有色谱法、紫外分光光度法、流动注射分析法等。但这些方法都存在着仪器昂贵、样品预处理、操作过程复杂、分析周期长。

10、以及对工作人员的操作水平要求高等缺点，难以实现产业化，无法满足环境中酚类化合物的准确快速检测的要求。 0003 生物传感器是基于生物组分对底物进行专一的识别，通过信号传导器将产生的信号以光、电等形式传递出来，通过信号大小定量检测底物的一项新技术。运用生物传感器来检测环境中的有机污染物、重金属、病菌微生物具有专一性强、灵敏度高、样品量少、成本低廉的特点，因此成为环境保护研究中的一个热点课题。 0004 酪氨酸酶是一种具有生物催化活性的蛋白质，在生物体外容易失去活性，在生物传感器应用中，生物酶需要被固定在一个基板上以实现直接电子传递或者增大表面积以达到效率。

11、放大作用。利用各种固定方法将生物敏感元件固定于基板表面并保持活性是生物传感器发展的重要方向。目前许多酪氨酸酶传感器普遍存在的问题是制备方法复杂、成本高、操作和存储稳定性不够高等。 0005 查阅相关专利文献，公开(公告)号： 102854233A，公开了一种 “基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器及其制备方法和应用” ，通过在玻碳电极表面沉积纳米金粒子，之后吸附 L- 赖氨酸薄膜，在 L- 赖氨酸薄膜上加载有序介孔碳载纳米金，最后吸附酪氨酸酶。制备过程中所使用的纳米金材料昂贵，制备过程复杂，并且酪氨酸酶的用量为 0.05mg/L-0.1mg/ L，生产成本很高。公。

12、开 ( 公告 ) 号： 102928488A，公开了一种 “酶电化学生物传感器检测水体环境中酚类化合物的方法” ，利用亲水性离子液体与介孔碳制备复合材料，再将酪氨酸酶加入到复合材料中制备酪氨酸酶工作电极。介孔碳材料的制备过程复杂，需要使用浓硫酸，并且制备过程中需要升温 750-950 度，使用有机溶剂，易造成环境污染，酪氨酸酶的用量为 2.5-20mg/mL，生产成本较高。公开 ( 公告 ) 号： 103278541A 公开了一种 “用于检测双酚A的电化学生物传感器及其制备方法和应用” ，使用石墨烯/金复合物以及壳聚糖来修饰固定酪氨酸酶电极，使用的石墨烯及。

13、金等材料价格昂贵，其中氧化石墨烯的制备过程复杂，需要多种有机及无机试剂，并且使用酪氨酸酶的浓度为 4.5mg/mL。发明内容 0006 本发明提供了一种酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法，能够低成本、高效准确的检测水体环境中酚类化合物。说明书 CN 104391021 A 4 2/5 页 5 0007 本发明提供的酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法包括以下内容： 0008 一 . 酪氨酸酶生物传感器的制备 0009 酪氨酸酶生物传感器包括一玻碳电极，在玻碳电极的检测端表面沉积有聚硫堇分子，聚硫堇分子外表面偶联一层戊二醛薄膜，在戊二醛薄膜外侧键。

14、合酪氨酸酶分子； 0010 二 . 检测溶液中酚类化合物 0011 以酪氨酸酶生物传感器作为工作电极，银 / 氯化银作为参比电极，铂电极作为对电极，建立三电极系统，三电极系统与电化学工作站连接，将工作电极的检测端置于待测溶液中，通过电化学工作站检测出待测溶液中还原电流大小，然后根据酚类化合物浓度与还原电流的线性回归方程，测定待测溶液中的酚类化合物的种类和含量。 0012 所述酪氨酸酶生物传感器的制备包括以下步骤： 0013 a. 沉积聚硫堇分子膜，在一清洗好的玻碳电极的检测端表面用电化学方法沉积硫堇分子，得到聚硫堇分子膜修饰电极，晾干备用； 0014 b. 。

15、偶联戊二醛，向步骤 a 中制得的硫堇修饰电极上滴加配制好的戊二醛水溶液，通过化学偶联反应使戊二醛与玻碳电极上的硫堇共价偶联，得到戊二醛 - 硫堇修饰电极； 0015 c. 固定酪氨酸酶，在步骤 b 中制得的戊二醛 - 硫堇修饰电极上滴加配制好的酪氨酸酶溶液，通过化学偶联反应使酪氨酸酶固定于修饰电极的戊二醛上，得到酪氨酸酶生物传感器。 0016 所述酪氨酸酶生物传感器的制备，步骤 a 中，硫堇的浓度为 0.1mmol/L-1.0mmol/ L，所用溶剂为 Britton-Robinson 缓冲溶液，包括硼酸、醋酸、磷酸和氢氧化钠，缓冲溶液浓度为 10-100mM。

16、， pH 值为 4.0-9.5，扫描起始电压为 0.4V，终止电压为 0.4V，最高电压为 1.1V，最低电压为 -0.4V，扫面方向负向，扫描循环为 20-100 次，扫描速度为 100mV/s ；所述步骤 b 中的戊二醛水溶液体积百分比浓度为 5-25，用量为 5L-10L，反应时间为 15 分钟 -1 小时；所述步骤 c 中酪氨酸酶浓度范围为 0.1mg/mL-1mg/mL，用量为 5L-10L。 0017 所述的测定待测溶液中的酚类化合物为苯二酚，特别是对苯二酚或邻苯二酚，待测溶液中对苯二酚、邻苯二酚的浓度线性检测范围均为 510-7 110-4M。

17、。 0018 所述的根据酚类化合物浓度与还原电流的线性回归方程，测定待测溶液中的酚类化合物的含量，电流信号变化公式为： P Ib-Ia，式中 P 为酚类污染物溶液处理前后电流信号变化量； Ia为修饰后玻碳电极在空白缓冲溶液中扫描的电流； Ib为酚类污染物溶液滴加到检测缓冲溶液后扫描的电流，对苯二酚浓度与还原电流变化的线性回归方程为： 0019 PHQ 67.582-5.4614lgCHQ (1) 0020 式(1)中， PHQ为对苯二酚检测时电流信号变化值，单位为A ； CHQ为待测溶液中对苯二酚的浓度值，单位为 M ；以底物浓度为横坐标，所对应的电流信号变化量。

18、作为纵坐标，作校正曲线，找出校正曲线的线性范围后，所得到相关系数 R2，式 (1) 的相关系数为 R2 0.9502，检测下限为 510-8M ；邻苯二酚浓度与还原电流变化的线性回归方程为： 0021 PCC 86.954-7.0386lgCcc (2) 0022 式(2)中， PCC为邻苯二酚检测时电流信号变化值，单位为A ； CCC为待测溶液中邻苯二酚的浓度值，单位为 M ；式 (2) 的相关系数为 R2 0.9751，检测下限为 1.510-8M。 0023 本发明与现有技术相比，其显著的有益效果体现在：说明书 CN 104391021 A 5 3/5 。

19、页 6 0024 1. 本发明的基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器采用了化学偶联的修饰方式，具有较好的稳定性。首先，将硫堇溶液用电化学的方法沉积在电极表面，使玻碳表面具有伯胺基团，然后通过戊二醛作为偶联试剂，通过化学反应固定到玻碳电极表面，化学键的形成能够提高酶电极的操作稳定性及储存稳定性，最后通过戊二醛的另一端醛基与酪氨酸酶的伯胺基团发生反应，将酪氨酸酶固定在玻碳电极上，因化学偶联方法提供了稳定的化学键，因此能够维持酪氨酸酶的高活性，使酪氨酸酶生物传感器使用寿命更长，酪氨酸酶活性更高。此外，本发明所使用的有机染料并不局限于吩噻嗪类染料，对于吖啶橙类染料。

20、同样适用，具有很好的生物兼容性，扩大了制备电极的物质种类，电极的修饰材料更易获得。可见，本发明的酪氨酸酶生物传感器充分集成了现有技术中的技术手段，使组合后的生物传感器实现了各技术手段的优势互补、协同增效，大大提高了生物传感器的稳定性、重复性，提高了现有生物传感器的检测水平。 0025 2. 本发明的基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器可用于检测邻苯二酚、对苯二酚等有机酚类污染物，由于生物传感器上酪氨酸酶的高活性，对于邻苯二酚、对苯二酚的氧化能够起到良好的催化效果，本发明的酪氨酸酶生物传感器具有卓越的电子传导能力，使得每次达到稳定响应电流的时间很短，因此。

21、，在可测定的浓度范围内，测定结果较理想，用于水样测定的响应值准确，与传统的高效液相色谱法相比，成本低廉、操作简单、响应速度快、检测精度高、抗干扰性强。附图说明 0026 图 1 为酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法中，酪氨酸酶生物传感器的制备过程示意图。图中编号： 1. 玻碳电极 (GC) ； 2. 聚硫堇分子膜 (TN) ； 3. 戊二醛分子 (GA) ； 4. 酪氨酸酶 (TYR) 0027 图 2 为酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法的检测反应原理图。 0028 图 3 为酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法制得的 (TN-GA-T。

22、YR/ GC) 修饰电极的扫描电镜图。 0029 图 4 为酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法中检测酪氨酸酶与玻碳电极组装过程。图中 a 为未修饰的玻碳电极在 100mmolL-1PBS 缓冲溶液中的循环伏安 (CV) 曲线； b 为酪氨酸酶修饰的玻碳电极的 CV 曲线，扫描速度为 100mV/s。 0030 图 5 为酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法中酪氨酸酶生物传感器检测时的 pH 值优化图。 0031 图6为酪氨酸酶修饰电极在PBS溶液中不同扫速下扫描曲线，自上到下为100、 90、 80、 70、 60、 50、 30、 20、 10mV/s。 0032。

23、图 7 为酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法中扫描速度与电流信号相关曲线。 0033 图 8 为酪氨酸酶生物传感器组装过程，图中 a 为未修饰的玻碳电极在 100mmolL-1PBS 缓冲溶液中的电化学阻抗谱图 (EIS) ； b 为硫堇修饰的玻碳电极的 EIS 谱图； c 为戊二醛 / 硫堇修饰的玻碳电极的 EIS 谱图； d 为酪氨酸酶 / 戊二醛 / 硫堇修饰玻碳电极的电化学阻抗谱图。说明书 CN 104391021 A 6 4/5 页 7 具体实施方式 0034 下面结合附图用实施例对本发明做进一步详细说明。。

24、0035 如图 1 所示，酪氨酸酶生物传感器检测溶液中酚类化合物的方法，该方法采用基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器，酪氨酸酶生物传感器包括一玻碳电极 1，在玻碳电极 1 的检测端表面沉积有硫堇聚合物分子膜 2，硫堇聚合物分子膜 2 外表面吸附一层戊二醛分子 3，戊二醛分子 3 外层偶联酪氨酸酶 4。 0036 一 . 酪氨酸酶生物传感器的制备步骤 0037 1.直径为0.3cm的玻碳电极用粒径分别为1M、 0.3M、 0.05M的三氧化二铝粉末抛光，然后在去离子水中超声清洗 3 次，每次 2 分钟； 0038 2. 在一清洗好的玻碳电极的检测端表面用电化学方法沉积硫堇。

25、(TN) 分子，具体操作方法是：将该玻碳电极放入含有 0.1mmol/LTN 的磷酸缓冲溶液中，循环伏安法扫描，初始电位为 0.4V，时间为 50min，得到硫堇修饰电极，备用； 0039 3. 在步骤 2 中制得的硫堇修饰电极的检测端滴加配置好的 5的戊二醛水溶液，室温静置放置 1 小时，使硫堇与戊二醛充分反应，其扫描电镜图如图 3 所示。由图 3 可知，戊二醛已经分布在玻碳电极的表面，验证了戊二醛 / 硫堇修饰电极的固定化过程； 0040 4. 在步骤 3) 中制得的戊二醛 / 硫堇修饰电极的检测端滴加 10L 的酪氨酸酶溶液(0.1mg/mL)，室温。

26、放置1小时，通过充分的化学偶联反应使酪氨酸酶固定于硫堇/戊二醛修饰电极表面，得到酪氨酸酶生物传感器，其扫描电镜图如图 3 所示。由图 3 可知，酪氨酸酶被固定在玻碳电极表面； 0041 5. 将修饰后的玻碳电极放入 0.1mol L-1PBS 溶液中搅拌清洗 3 次，每次 5 分钟，去除表面吸附弱的酶分子，将该酪氨酸酶生物传感器保存于 4条件下备用。 0042 二 . 采用酪氨酸酶生物传感器检测酚类化合物 0043 将酪氨酸酶生物传感器作为工作电极，银 / 氯化银作为参比电极，铂电极作为对电极，建立三电极系统，将三电极系统与电化学工作站连接，对待测溶液中的对苯。

27、二酚、邻苯二酚浓度进行检测。 0044 工作条件：所用的电解液为0.1mol/L的Britton-Robinson缓冲溶液(BRS)，在pH 4.0-9.5 范围内测定酪氨酸酶生物传感器对同一浓度邻苯二酚的电流响应值，优化结果如图 5 所示，选定 pH 6.5 为最佳 pH 值，因此在此 pH 值下，其响应电流大且稳定。 0045 酪氨酸酶生物传感器的检测原理如下：酪氨酸酶催化氧化邻苯二酚成邻醌，邻醌在电极上得到电子，又被还原成邻苯二酚，通过检测还原电流的大小来定量指示待测液中邻苯二酚的浓度；但对苯二酚不是酪氨酸酶的直接底物，在酪氨酸酶和邻醌的作用下形成。

28、对醌，对醌在电极上得到电子，又被还原成邻苯二酚，通过检测还原电流的大小来定量指示待测液中对苯二酚的浓度，由于对苯二酚不是酪氨酸酶的直接底物，因此，在后面检测下限中，邻苯二酚的检测下限更低。 0046 本发明检测过程的主反应式如下所示： 0047 CC+O2 o-quinone+2H2O 0048 CC+O2 benzoquinone+2H2O 0049 o-quinone(benzoquinone)+2e+2H+ CC(HQ) 0050 对苯二酚浓度与还原电流变化的线性回归方程为：说明书 CN 104391021 A 7 5/5 页 8 0051 PHQ 67.5。

29、82-5.4614lgCHQ (1) 0052 式(1)中， PHQ为对苯二酚检测时的电流变化值，单位为A ； CHQ为待测溶液中对苯二酚的浓度值，单位为 M ；式 (1) 的相关系数为 R2 9502，检测下限为 510-8M。 0053 邻苯二酚浓度与还原电流变化的线性回归方程为： 0054 PCC 86.954-7.0386lgCcc (2) 0055 式(2)中， PCC邻苯二酚检测时的电流变化值，单位为A ； CCC为待测溶液中邻苯二酚的浓度值，单位为 M ；式 (1) 的相关系数为 R2 0.9751，检测下限为 1.510-8M。 0056 本实施例中对苯二。

30、酚、邻苯二酚的线性范围均为 510-7 110-4M。 0057 本实施例检测的是水样样品，检测结果如下表 1、表 2 所示，该表中原水取自鞍山城市饮用水， C1为原水过滤后测定的对苯二酚、邻苯二酚的浓度，经过过滤后加入确定浓度的对苯二酚、邻苯二酚，制成 A、 B、 C、 D 四个水样，四个水样的配置浓度为 C2栏所示，而 C3栏为按照本实施例的检测方法和检测条件测定的浓度值。从加标回收率可以看出，本发明在可测定的浓度范围内，加标回收率在 95.4 -103.2之间，测定结果理想，相比传统的高效液相色谱法，本发明的检测方法操作简单，且不受其它污染物的干。

31、扰。 0058 在上述检测方法下，对 30M 浓度的邻苯二酚标准溶液连续进行 10 次平行测定，邻苯二酚峰电流和迁移时间的相对标准偏差分别是为3.2和1.5。将电极保存在4环境下，每 5 天检测一次活性，一个月后仍然保持初始活性的 90。 0059 表 1 酪氨酸酶生物传感器检测水中的对苯二酚 0060 水样C1molL-1C2molL-1C3molL-1回收率 A0110-60.96510-696.5 B0110-51.0310-5103 C0510-54.9710-599.4 D0110-41.0210-4102 0061 0062 表 2 酪氨酸酶生物传感器检测水中的邻苯二酚。

32、 0063 水样C1molL-1C2molL-1C3molL-1回收率 A0110-60.954210-695.4 B0110-51.00510-5100.5 C0510-55.1610-5103.2 D0110-40.97210-497.2 说明书 CN 104391021 A 8 1/4 页 9 图 1 图 2 图 3 说明书附图 CN 104391021 A 9 2/4 页 10 图 4 图 5 说明书附图 CN 104391021 A 10 3/4 页 11 图 6 图 7 说明书附图 CN 104391021 A 11 4/4 页 12 图 8 说明书附图 CN 104391021 A 12 。

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