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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410727583.8 (22)申请日 2014.12.02 G01N 33/577(2006.01) (71)申请人 河南省科学院生物研究所有限责任 公司 地址 450003 河南省郑州市花园路 28 号 (72)发明人 刘丽 王玉金 王亚南 杨书豪 安明理 何蔚荭 杜迅 李姗姗 陈国参 (74)专利代理机构 郑州天阳专利事务所 ( 普通 合伙 ) 41113 代理人 聂孟民 (54) 发明名称 一种阿维菌素胶体金检测试纸条的制备方法 (57) 摘要 本发明涉及阿维菌素胶体金检测试纸条的制 备方法， 可有效解决对阿维菌素的快速检测。
2、问题， 方法是， PVC 基板上自左至右覆盖有引水玻璃纤 维层、 载体玻璃纤维层、 硝酸纤维层和吸水棉浆板 层， 吸水棉浆板层和硝酸纤维层的 1/2 处上面覆 盖有右部覆膜， 引水玻璃纤维层、 载体玻璃纤维层 和硝酸纤维层的 1/2 处上面覆盖有左部覆膜， 硝 酸纤维层上自上而下包被有一条抗鼠免疫球蛋白 抗体的质控线、 一条阿维菌素蛋白质偶联物的检 测线， 载体玻璃纤维层上吸附包被有胶体金标记 物， 本发明结构简单， 易生产制备， 使用方便， 准确 率高， 效果好， 有效用于快速检测阿维菌素， 是检 测阿维菌素上的创新， 经济和社会效益巨大。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家。
3、知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书4页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104407146 A (43)申请公布日 2015.03.11 CN 104407146 A 1/2 页 2 1. 一种阿维菌素胶体金检测试纸条的制备方法， 其特征在于， 该试纸条是 PVC 基板 （1） 上自左至右覆盖有引水玻璃纤维层 （3） 、 载体玻璃纤维层 （4） 、 硝酸纤维层 （2） 和吸水棉浆 板层 （5） ， 吸水棉浆板层 （5） 和硝酸纤维层 （2） 的 1/2 处上面覆盖有右部覆膜 （6） ， 引水玻璃 纤维层 （3） 、 载体玻璃纤维层 （4） 和硝酸纤维层 （2） 的 1。
4、/2 处上面覆盖有左部覆膜 （7） ， 硝酸 纤维层 （2） 上自上而下包被有一条抗鼠免疫球蛋白抗体的质控线、 一条阿维菌素蛋白质偶 联物的检测线， 载体玻璃纤维层 （4） 上吸附包被有胶体金标记物， 其制备方法由以下步骤实 现 ： （1） 、 制备单克隆抗体胶体金标记物 ： 将以体积计的 ： 1 份含有抗阿维菌素蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水与 2 份 60mM 醋酸缓冲液混合， 室温搅拌下逐滴加入辛酸， 每 1ml 小鼠腹水加入 33l 辛酸， 混匀， 室温 放置30分钟， 15000转/分 4离心20分钟， 得上清液， 上清液用玻璃棉过滤， 弃沉淀， 过滤 后的上清液用 NaOH 调 。
5、pH 值至 7.2， 加入硫酸铵， 每 1ml pH7.2 上清液加入 0.277g 硫酸铵， 快速使硫酸铵溶解， 室温搅拌 30 分钟， 15000 转 / 分 4 离心 20 分钟， 弃上清液， 得沉淀 物， 沉淀物用原小鼠腹水 1/2 体积的 0.01M 磷酸盐缓冲液溶液溶解， 再用 0.01M 磷酸盐缓冲 液 4透析 48 小时， 成单克隆抗体胶体金标记物 ； （2） 、 制备胶体金溶液 ： 将蒸馏水煮沸 4 6 分钟， 每 1000mL 蒸馏水中加入质量浓度 1% 的氯金酸溶液 10ml 和 质量浓度1%的柠檬酸三钠溶液1520ml， 搅拌至溶液呈深红色， 冷至室温， 调pH值至抗阿。
6、 维菌素蛋白质偶联物单克隆抗体的等电点或弱碱性， 成抗阿维菌素蛋白质偶联物单克隆抗 体预标记的胶体金溶液 ； （3） 、 制备胶体金标记物 ： 取步骤 （3） 制备的胶体金溶液 100ml， 加入步骤 （2） 制备的单 克隆抗体胶体金标记物 1 10g/ml， 搅拌反应 2 分钟， 加入质量浓度 10% 的牛血清白蛋 白， 每 1ml 胶体金溶液中加入 15l 质量浓度 10% 的牛血清白蛋白， 4下 15000 转 / 分离心 40 分钟， 弃上清， 得沉淀， 沉淀用 PBS 稀释至原胶体金溶液体积的 30% 40%， 成胶体金标记 物 ； （4） 、 固化胶体金标记物 ： 在载体玻璃纤维层。
7、 （4） 上吸附包被胶体金标记物， 干燥， 将胶 体金标记物固化在载体玻璃纤维层上 ； （5） 、 包被膜制备 ： 取抗鼠免疫球蛋白抗体、 阿维菌素蛋白质偶联物， 分别包被于硝酸纤 维层 （2） 上， 自上而下形成包被的一条抗鼠免疫球蛋白抗体的质控线、 一条阿维菌素蛋白质 偶联物的检测线， 其中， 抗鼠免疫球蛋白抗体包被浓度为 0.5 5mg/ml， 阿维菌素蛋白质偶 联物包被浓度为 0.05 2mg/ml ； （6） 、 切割 ： 将包括吸附有胶体金标记物的载体玻璃纤维层 （4） 、 包被抗鼠免疫球蛋白 抗体、 阿维菌素蛋白质偶联物的硝酸纤维层 （2） 后的试纸条载体切割成长条， 即成本发明。
8、试 纸条。 2. 根据权利要求 1 所述的阿维菌素胶体金检测试纸条的制备方法， 其特征在于， 所述 的试纸条为长 6.5 8.0 cm、 宽 0.3 0.4 cm 的长方条。 3. 根据权利要求 1 所述的阿维菌素胶体金检测试纸条的制备方法， 其特征在于， 所述 的步骤 （2） 中质量浓度 1% 的柠檬酸三钠溶液的加入量可为 16 18ml、 或 17ml。 4. 根据权利要求 1 所述的阿维菌素胶体金检测试纸条的制备方法， 其特征在于， 所述 权 利 要 求 书 CN 104407146 A 2 2/2 页 3 的步骤 （3） 中单克隆抗体胶体金标记物的加入量为 4 8g/ml、 或 6g/。
9、ml。 5. 根据权利要求 1 所述的阿维菌素胶体金检测试纸条的制备方法， 其特征在于， 所述 的步骤 （5） 中抗鼠免疫球蛋白抗体包被浓度为 1 4mg/ml、 或 3 4 mg/ml ； 阿维菌素蛋白 质偶联物包被浓度为 1 1.5mg/ml、 或 1.2 1.8mg/ml。 权 利 要 求 书 CN 104407146 A 3 1/4 页 4 一种阿维菌素胶体金检测试纸条的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及药物检测， 特别是一种阿维菌素胶体金检测试纸条的制备方法。 背景技术 0002 阿维菌素作为一种十六元大环内酯新型杀虫剂， 由链霉菌中阿维链霉菌发酵产 生， 因化学结构新颖、 作。
10、用机制独特 （干扰虫体的神经生理活动， 刺激释放 - 氨基丁酸， 从 而抑制节肢动物的神经传导） 、 杀虫活性强， 具有广谱、 高效、 持效、 相对安全等特点， 符合现 代生态农药要求， 被广泛用于体内外各种线虫， 节肢动物类寄生虫和昆虫等的驱杀。 目前全 球正大面积推广使用阿维菌素产品。 但随着害虫抗性提高， 阿维菌素用药量不断增加， 对环 境及人类、 动植物危害也日益显现， 主要表现为田间土壤的药物残留、 人和动物中枢和外周 神经症状， 如震颤、 共济失调、 精神抑郁、 高度昏迷乃至死亡， 并产生胚胎毒性。按世界卫生 组织 （WTO） 5 级分类标准， 将其列为高毒化合物。 0003 鉴于。
11、此， 土壤及动植物产品中阿维菌素药物残留检测成为国家重点监控指标， 阿 维菌素药物残留检测方法也成为重点研究内容。目前， 关于阿维菌素残留检测方法主要为 色谱检测法和免疫检测法， 色谱检测法有薄层色谱法、 液相色谱法、 液相色谱 - 质谱联用法 等， 这些检测方法存在样品前处理复杂、 需要专业操作人员、 需要昂贵仪器花费较高等不 足， 常用于阿维菌素药物残留的确证分析 ； 免疫检测法有酶联免疫法， 此方法简单、 快速， 避 免了色谱检测法的不足， 适合于快速、 大量样品筛查， 极易推广。 胶体金免疫层析技术 （gold immunochromatographic assay， GICA） 是在。
12、酶联免疫法基础上发展的又一种新型快速免疫 检测技术， 阿维菌素胶体金检测试纸条即是在胶体金免疫层析技术基础上融合现代单克隆 抗体技术、 新材料技术建立的一种简单、 快速、 经济的免疫检测方法， 该检测试纸条操作较 酶联免疫法更简单、 快速、 更易判断结果， 是又一种新型、 经济、 环保的检测阿维菌素的技术 方法。目前阿维菌素胶体金检测试纸条在国内外尚为空白。 发明内容 0004 针对上述情况， 为克服现有技术之缺陷， 本发明之目的就是提供一种阿维菌素胶 体金检测试纸条的制备方法， 可有效解决对阿维菌素的快速检测问题。 0005 本发明解决的技术方案是， 该试纸条是由， PVC 基板上自左至右覆。
13、盖有引水玻璃纤 维层、 载体玻璃纤维层、 硝酸纤维层和吸水棉浆板层， 吸水棉浆板层和硝酸纤维层的 1/2 处 上面覆盖有右部覆膜 （又称上部覆膜） ， 引水玻璃纤维层、 载体玻璃纤维层和硝酸纤维层的 1/2 处上面覆盖有左部覆膜 （又称下部覆膜） ， 硝酸纤维层上自上而下 （自右向左） 包被有一 条抗鼠免疫球蛋白抗体的质控线、 一条阿维菌素蛋白质偶联物的检测线， 载体玻璃纤维层 上吸附包被有胶体金标记物， 其制备方法由以下步骤实现 ： 1、 制备单克隆抗体胶体金标记物 ： 将含有抗阿维菌素蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水与醋酸缓冲液混合， 再加入辛 酸， 离心， 得上清液， 过滤， 调 pH 。
14、值后， 加入硫酸铵溶解， 离心沉淀， 沉淀物用磷酸盐缓冲液 说 明 书 CN 104407146 A 4 2/4 页 5 （PBS） 溶解， 再用磷酸盐缓冲液透析， 成单克隆抗体胶体金标记物 ； 2、 制备胶体金溶液 ： 将煮沸的蒸馏水中氯金酸溶液和柠檬酸三钠溶液， 搅拌成深红色， 冷却， 调 pH 值至等 电点或弱碱性， 成胶体金溶液 ； 3、 制备胶体金标记物 ： 取胶体金溶液加入单克隆抗体胶体金标记物， 搅拌反应， 加入牛 血清白蛋白， 离心， 得沉淀， 用 PBS 稀释， 成胶体金标记物 ； 4、 固化胶体金标记物 ： 在载体玻璃纤维层上吸附包被胶体金标记物， 干燥， 将胶体金标 记物。
15、固化在载体玻璃纤维层上 ； 5、 包被膜制备 ： 取抗鼠免疫球蛋白抗体、 阿维菌素蛋白质偶联物， 分别包被于硝酸纤维 层上， 自上而下 （自右向左） 形成包被的一条抗鼠免疫球蛋白抗体的质控线、 一条阿维菌素 蛋白质偶联物的检测线 ； 6、 切割 ： 将包括吸附有胶体金标记物的载体玻璃纤维层、 包被抗鼠免疫球蛋白抗体、 阿 维菌素蛋白质偶联物的硝酸纤维层后的试纸条载体切割成长条， 即成本发明试纸条。 0006 本发明结构简单， 易生产制备， 使用方便， 准确率高， 效果好， 有效用于快速检测阿 维菌素， 是检测阿维菌素上的创新， 经济和社会效益巨大。 附图说明 0007 图 1 为本发明的结构立。
16、体图。 具体实施方式 0008 以下结合附图和具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。 0009 本发明在具体实施中， 该试纸条是由 PVC 基板 1 上自左至右覆盖有引水玻璃纤维 层 3、 载体玻璃纤维层 4、 硝酸纤维层 2 和吸水棉浆板层 5， 吸水棉浆板层 5 和硝酸纤维层 2 的1/2处上面覆盖有右部覆膜 （又称上部覆膜） 6， 引水玻璃纤维层3、 载体玻璃纤维层4和硝 酸纤维层 2 的 1/2 处上面覆盖有左部覆膜 （又称下部覆膜） 7， 硝酸纤维层 2 上自上而下 （自 右向左） 包被有一条抗鼠免疫球蛋白抗体的质控线、 一条阿维菌素蛋白质偶联物的检测线， 载体玻璃纤维层 4 上。
17、吸附包被有胶体金标记物， 其制备方法由以下步骤实现 ： 1、 制备单克隆抗体胶体金标记物 ： 将以体积计的 ： 1 份含有抗阿维菌素蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水与 2 份 60mM 醋酸缓冲液混合， 室温 （18 25） 搅拌下逐滴加入辛酸， 每 1ml 小鼠腹水加入 33l 辛 酸， 混匀， 室温放置 30 分钟， 15000 转 / 分 4离心 20 分钟， 得上清液， 上清液用玻璃棉过 滤， 弃沉淀， 过滤后的上清液用 NaOH 调 pH 值至 7.2， 加入硫酸铵， 每 1ml pH7.2 上清液加入 0.277g 硫酸铵， 快速使硫酸铵溶解， 室温搅拌 30 分钟， 15000 。
18、转 / 分 4 离心 20 分钟， 弃 上清液， 得沉淀物， 沉淀物用原小鼠腹水 1/2 体积的 0.01M 磷酸盐缓冲液 （PBS） 溶液溶解， 再用 0.01M 磷酸盐缓冲液 （PBS） 4透析 48 小时， 成单克隆抗体胶体金标记物 ； 2、 制备胶体金溶液 ： 将蒸馏水煮沸 4 6 分钟， 每 1000mL 蒸馏水中加入质量浓度 1% 的氯金酸溶液 10ml 和 质量浓度1%的柠檬酸三钠溶液1520ml， 搅拌至溶液呈深红色， 冷至室温， 调pH值至抗阿 维菌素蛋白质偶联物单克隆抗体的等电点或弱碱性 （pH 值 7.35 7.44） ， 成抗阿维菌素蛋 说 明 书 CN 1044071。
19、46 A 5 3/4 页 6 白质偶联物单克隆抗体预标记的胶体金溶液 ； 3、 制备胶体金标记物 ： 取步骤 （2） 制备的胶体金溶液 100ml， 加入步骤 （1） 制备的单克 隆抗体胶体金标记物 1 10g/ml， 搅拌反应 2 分钟， 加入质量浓度 10% 的牛血清白蛋白 （BSA） ， 每 1ml 胶体金溶液中加入 15l 质量浓度 10% 的牛血清白蛋白， 4下 15000 转 / 分 离心40分钟， 弃上清， 得沉淀， 沉淀用PBS稀释至原胶体金溶液体积的30%40%， 成胶体金 标记物 ； 4、 固化胶体金标记物 ： 在载体玻璃纤维层 4 上吸附包被胶体金标记物， 干燥， 将胶体。
20、金 标记物固化在载体玻璃纤维层上 ； 5、 包被膜制备 ： 取抗鼠免疫球蛋白抗体、 阿维菌素蛋白质偶联物， 分别包被于硝酸纤维 层2上， 自上而下 （自右向左） 形成包被的一条抗鼠免疫球蛋白抗体的质控线、 一条阿维菌素 蛋白质偶联物的检测线， 其中， 抗鼠免疫球蛋白抗体包被浓度为 0.5 5mg/ml， 阿维菌素蛋 白质偶联物包被浓度为 0.05 2mg/ml ； 6、 切割 ： 将包括吸附有胶体金标记物的载体玻璃纤维层 4、 包被抗鼠免疫球蛋白抗体、 阿维菌素蛋白质偶联物的硝酸纤维层 2 后的试纸条载体切割成长条， 即成本发明试纸条。 0010 本发明在具体实施中， 所述的试纸条为长 6.5。
21、8.0 cm、 宽 0.30.4 cm的长方 条 ； 所述的步骤 （2） 中质量浓度 1% 的柠檬酸三钠溶液的加入量可为 16 18ml、 或 17ml ； 所述的步骤 （3） 中单克隆抗体胶体金标记物的加入量为 4 8g/ml、 或 6g/ml ； 所述的步骤 （5） 中抗鼠免疫球蛋白抗体包被浓度为 1 4mg/ml、 或 3 4 mg/ml ； 阿维 菌素蛋白质偶联物包被浓度为 1 1.5mg/ml、 或 1.2 1.8mg/ml。 0011 由上述可知， 本发明的试纸条包括基材 PVC 板 1、 粘附于基材中部的硝酸纤维膜 （自上而下包被有一条抗鼠免疫球蛋白抗体的质控线、 一条阿维菌素蛋。
22、白质偶联物的检测 线） 2、 粘附于基材下部 （本实施例中上、 下部以试纸条使用时样品泳动方向为准） 的引水玻 璃纤维 3、 载体玻璃纤维 （包被抗阿维菌素蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物） 4、 粘附 于基材上部的吸水棉浆板 5、 上部覆膜 6 及下部覆膜 7。硝酸纤维膜 （自上而下包被有一条 抗鼠免疫球蛋白抗体的质控线、 一条阿维菌素蛋白质偶联物的检测线） 2、 引水玻璃纤维 3、 载体玻璃纤维 （包被抗阿维菌素蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物） 4 和吸水棉浆板 5 端面紧密接触。实施例中， 胶体金溶液制备中 1% 柠檬酸三钠溶液量为 18ml， 载体玻璃纤维 （包被抗阿维菌素蛋白质。
23、偶联物单克隆抗体胶体金标记物） 4 中抗阿维菌素蛋白质偶联物单 克隆抗体胶体金标记物浓度为 5g/ml ； 中部硝酸纤维膜 （自上而下包被有一条抗鼠免疫球 蛋白抗体的质控线、 一条阿维菌素蛋白质偶联物的检测线） 2 中质控线包被的抗鼠免疫球蛋 白抗体包被浓度为 1mg/ml， 检测线包被的阿维菌素蛋白质偶联物包被浓度为 0.5mg/ml。 0012 本发明使用时， 将纤维膜一端竖向插入样品中浸没下部引水玻璃纤维， 或将样品 滴至试纸条下部引水玻璃纤维上， 在微孔膜的渗滤作用或毛细管虹吸作用下， 样品沿试纸 条向吸水棉浆板方向泳动。 本发明检测原理是阿维菌素与抗阿维菌素蛋白质偶联物单克隆 抗体胶。
24、体金标记物反应形成标记抗原 抗体复合物， 采用的是竞争抑制法， 如果样品中含 有阿维菌素， 样品泳动至包被有阿维菌素蛋白质偶联物的检测线时则两者同时竞争反应抗 阿维菌素蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物， 泳动至包被有抗鼠免疫球蛋白抗体的质 控线时抗阿维菌素蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物与抗鼠免疫球蛋白抗体发生反 说 明 书 CN 104407146 A 6 4/4 页 7 应， 显示出现一条红色线条 （质控线） 或者两条红色线条 （一条反应线、 一条质控线， 但质控 线红色线条较反应线红色线条深） ， 结果判断为阳性 ； 如果样品中不含有阿维菌素， 样品泳 动至包被有阿维菌素蛋白质偶联物。
25、的检测线时只有阿维菌素蛋白质偶联物与抗阿维菌素 蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物反应， 泳动至包被有抗鼠免疫球蛋白抗体的质控线 时抗阿维菌素蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物与抗鼠免疫球蛋白抗体发生反应， 显 示出现两条红色线条 （一条反应线、 一条质控线， 但质控线红色线条较反应线红色线条色浅 或红色颜色一致） ， 结果判断为阴性。如果加样后， 质控线处不出现红色线条， 则表明试纸条 检测结果无效或试纸条已失效。 本发明通过试纸条中检测线和质控线的比色半定量检测动 植物食品或土壤中阿维菌素药物残留。利用本试纸条， 5 10 分钟即可对动植物食品或土 壤中阿维菌素药物残留进行简单、 快速检测。
26、， 适用于相关检疫检测部门、 进出口检疫检测部 门及实验室中阿维菌素药物残留的快速检测或大规模筛查。 0013 本发明不仅可以填补阿维菌素在快速检测领域的空白， 而且具有色谱检测方法无 法比拟的简单、 快速、 便于筛查大量样品等优点， 是一种在动植物食品或土壤中简单、 快速 检测阿维菌素药物残留的新型技术， 适用于相关检疫检测部门、 进出口检疫检测部门及实 验室中阿维菌素药物残留的快速检测或大规模筛查， 简单、 快速、 准确， 经对 58 批杀虫药物 和 38 处田地土壤进行检测， 准确率达 99% 以上， 表明本发明试纸条具有很强的实际应用价 值， 经济和社会效益巨大。 说 明 书 CN 104407146 A 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 104407146 A 8 。