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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410692134.4 (22)申请日 2014.11.25 G01N 1/30(2006.01) (71)申请人 扬州大学 地址 225009 江苏省扬州市大学南路 88 号 (72)发明人 郑彦坤 王忠 (74)专利代理机构 南京钟山专利代理有限公司 32252 代理人 戴朝荣 (54) 发明名称 树脂切片的番红与甲基紫混合染色法及其染 色液 (57) 摘要 本发明提供了一种树脂切片的番红与甲基紫 混合染色法及其染色液， 包括以下步骤 ： (1) 染色 液配制 ： 配制质量浓度为 0.5的番红溶液和质 量浓度为 1的甲基紫溶液 。
2、； (2) 将上述质量浓度 为 0.5的番红溶液与质量浓度为 1的甲基紫 溶液分别按多种体积比混合后对树脂半薄切片进 行染色， 在光镜下观察显微结构。 本发明的方法针 对甲苯胺蓝 -O 染色缺点， 可以满足不同的组织染 色要求， 且具有成本低、 易保存的优点。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图6页 (10)申请公布号 CN 104390834 A (43)申请公布日 2015.03.04 CN 104390834 A 1/1 页 2 1. 一种树脂切片的番红与甲基紫混合染色法， 其特征在于 ： 包括以下步骤 ：。
3、 (1) 染色液配制 ： 配制质量浓度为 0.5的番红溶液和质量浓度为 1的甲基紫溶液 ； (2) 将上述质量浓度为 0.5的番红溶液与质量浓度为 1的甲基紫溶液分别按多种 体积比混合后对树脂半薄切片进行染色， 在光镜下观察显微结构。 2. 如权利要求 1 所述的树脂切片的番红与甲基紫混合染色法， 其特征在于 ： 步骤 (2) 中， 将质量浓度为 0.5的番红与质量浓度为 1的甲基紫分别按 1 ： 1， 1 ： 2， 2 ： 1 的体积比 混合后对树脂半薄切片进行染色。 3. 如权利要求 1 所述的树脂切片的番红与甲基紫混合染色法， 其特征在于 ： 步骤 (1) 中， 质量浓度为 0.5的番红。
4、溶液的配制方法是 ： 用电子天平称取 0.5g 番红， 放入烧杯中 ； 加入 100mL 75的酒精溶解 ； 溶解后过滤， 将除去杂质的滤液倒入普通试剂瓶中备用。 4. 如权利要求 1 所述的树脂切片的番红与甲基紫混合染色法， 其特征在于 ： 步骤 (1) 中， 质量浓度为 1的甲基紫溶液的配制方法是 ： 用电子天平称取 1g 甲基紫， 放入烧杯中 ； 加入 100ml 蒸馏水溶解 ； 溶解后过滤， 将除去杂质的滤液倒入普通试剂瓶中备用。 5. 一种树脂切片的番红与甲基紫混合染液， 其特征在于 ： 包括质量浓度为 0.5的番 红溶液和质量浓度为 1的甲基紫溶液。 权 利 要 求 书 CN 10。
5、4390834 A 2 1/3 页 3 树脂切片的番红与甲基紫混合染色法及其染色液 技术领域 0001 本发明属于生物科学与农业科学技术领域， 是一种树脂半薄切片的染色方法及其 染色液。 背景技术 0002 树脂半薄切片是一种应用非常广泛的形态学研究技术， 在植物学、 动物学及医学 领域的相关研究中更是显得尤为重要。 一种好的染色方法， 就会起到画龙点睛的作用， 将树 脂半薄切片技术的优势与特点更加完美的体现出来。甲苯胺蓝 -O 是一种常用的树脂半薄 切片染色剂， 它可以将胚乳细胞中的多种结构 ( 如细胞壁、 质膜、 细胞核、 蛋白体和淀粉体 等 ) 都同时显现出来。但是， 甲苯胺蓝 -O 具。
6、有以下多种缺点 ： (1) 价格昂贵 ； (2) 储存要求 高， 固体药品也要密闭低温保存 ； (3) 配制过程时， 要加碳酸钠等弱碱试剂作为辅助 ； (4) 溶 液易沉淀变性 ； (5) 染色时间与温度都需要较为精确的控制， 否则会皱片或裂片 ； (6) 因为 易受空气中 CO2的影响， 对染色时间与温度要求高， 所以很难保证同一种组织不同发育天数 的切片染色效果一致， 最终使得多图拼合图版的外观效果不好 ； (7) 对树脂切片的干燥程 度要求高， 如果树脂切片受潮， 那么此染色剂对切片的染色效果就会大打折扣 ； (8) 染色较 为单一， 有些组织成分区别不太明显。以上这些甲苯胺蓝 -O 的。
7、染色缺点是我们实验室经过 多年经验总结出来的。 发明内容 0003 针对上述现有技术中甲苯胺蓝 -O 染色缺点， 本发明的目的是提供了一种树脂切 片的番红与甲基紫混合染色法， 以满足不同的组织染色要求。 0004 为实现上述目的， 本发明采用以下技术方案 ： 0005 一种树脂切片的番红与甲基紫混合染色法， 包括以下步骤 ： 0006 (1) 染色液配制 ： 配制质量浓度为 0.5的番红溶液和质量浓度为 1的甲基紫溶 液 ； 0007 (2) 将上述质量浓度为 0.5的番红溶液与质量浓度为 1的甲基紫溶液分别按 多种体积比混合后对树脂半薄切片进行染色， 在光镜下观察显微结构。 0008 步骤 。
8、(2) 中， 将质量浓度为 0.5的番红与质量浓度为 1的甲基紫分别按 1 ： 1， 1 ： 2， 2 ： 1 的体积比混合后对树脂半薄切片进行染色。 0009 步骤 (1) 中， 质量浓度为 0.5的番红溶液的配制方法是 ： 用电子天平称取 0.5g 番红， 放入烧杯中 ； 加入 100mL 75的酒精溶解 ； 溶解后过滤， 将除去杂质的滤液倒入普通 试剂瓶中备用。 0010 步骤 (1) 中， 质量浓度为 1的甲基紫溶液的配制方法是 ： 用电子天平称取 1g 甲 基紫， 放入烧杯中 ； 加入 100ml 蒸馏水溶解 ； 溶解后过滤， 将除去杂质的滤液倒入普通试剂 瓶中备用。 0011 本发。
9、明的另一个目的是提供一种树脂切片的番红与甲基紫混合染液， 其技术方案 说 明 书 CN 104390834 A 3 2/3 页 4 是 ： 0012 一种树脂切片的番红与甲基紫混合染液， 包括质量浓度为 0.5的番红溶液和质 量浓度为 1的甲基紫溶液。 0013 本发明的有益效果是 ： 0014 本发明与常用的甲苯胺蓝 -O 染色方法相比， 具有以下优点 ： 0015 (1) 无论国产还是进口， 与甲苯胺蓝 -O 相比， 番红与甲基紫要便宜的多， 而且国产 的番红与甲基紫染色效果也不错 ； 0016 (2) 储存要求不高， 可在室温下常规保存， 保存多年后任然染色效果依然良好， 无 需像甲苯胺。
10、蓝 -O 那样非常严格的密封 ； 0017 (3) 配制过程简便易行， 不需要其它辅助试剂 ； 0018 (4) 溶液不易变性， 普通试剂瓶内室温保存即可 ； 0019 (5) 染色时不易产生沉淀， 没有严格的温度与时间控制 ； 0020 (6) 同一种组织不同发育天数的切片染色效果可以基本保持一致， 大大提高了图 的外观效果 ； 0021 (7) 对树脂切片的干燥程度要求不高， 甲苯胺蓝 -O 无法染好的一些受潮样品切 片， 利用此种方法也可以染好 ； 0022 (8) 可以更加明显地体现出细胞的不同结构与成分。 附图说明 0023 图 1 是玉米 (A,B)， 高粱 (C,D) 和小麦 (。
11、E,F) 颖果的树脂半薄切片， 以 0.5番红 与 1甲基紫的混合染液染色的效果图 ； 0024 图 2 是水稻胚乳组织的树脂半薄切片， 以 0.5甲苯胺蓝 -O 染色的效果图 ； 0025 图 3 是高粱胚乳组织的树脂半薄切片， 以 1甲基紫单染的效果图 ； 0026 图 4 是小麦颖果母体组织的树脂半薄切片的效果图 ； 0027 图 5 是不同发育天数的玉米胚乳传递细胞的树脂半薄切片， 以 0.5甲苯胺蓝 -O 染色的效果图 ； 0028 图 6 是甲苯胺蓝 -O 染色失败的例子的效果图。 具体实施方式 0029 下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。 0030 实施例 1 0031 。
12、以下以玉米、 小麦、 高粱胚乳为材料展示本染色方法的具体操作过程 ： 0032 (1) 树脂样品制作与半薄切片 0033 将颖果纵切或横切， 取所要观察的部位， 先用 2.5戊二醛前固定 3 小时， 然后以 pH7.2 的 0.1mol/L 的磷酸缓冲液清洗 3 次， 再用 0.5锇酸后固定 3 小时。以 pH7.2 的 0.1mol/L 的磷酸缓冲液清洗后， 乙醇系列脱水， 环氧丙烷置换， 用低粘性的 Spurr 树脂浸透 与包埋， 最终制成样品。用 Leica 超薄切片机将样品切成 1m 半薄切片。 0034 (2) 染色剂配制 0035 0.5番红溶液 ： 用电子天平称取0.5g番红， 。
13、放入烧杯中 ； 加入100ml 75的酒精 说 明 书 CN 104390834 A 4 3/3 页 5 溶解 ； 溶解后过滤， 将除去杂质的滤液倒入普通试剂瓶中备用。 0036 1甲基紫溶液 ： 用电子天平称取 1g 甲基紫， 放入烧杯中 ； 加入 100ml 蒸馏水溶 解 ； 溶解后过滤， 将除去杂质的滤液倒入普通试剂瓶中备用。 0037 (3) 染色 0038 按照不同组织的染色需求， 可以将 0.5番红与 1甲基紫分别按 1 ： 1， 1 ： 2， 2 ： 1 等几种体积比混合， 然后对树脂半薄切片进行染色。至于通常的染色需求， 1 ： 1 的 0.5番 红与 1甲基紫即可。 0039。
14、 染色效果如附图所示， 图 1 是玉米 (A,B)， 高粱 (C,D) 和小麦 (E,F) 颖果的树脂半 薄切片， 以 0.5番红与 1甲基紫的混合染液染色， 此图未经任何处理。图 2 是水稻胚乳 组织的树脂半薄切片， 以0.5甲苯胺蓝-O染色， 图内各图片虽然经过Photoshop软件特殊 处理 ( 科研要求， 仅限于亮度 / 对比度、 色彩平衡、 色相 / 饱和度调节等不改变图片内容的 处理， 决不允许图章工具、 橡皮擦及涂抹与锐化工具等的使用 )， 但还是无法掩饰一些不好 的染色效果。例如 A,B 染色过深， C,F 染色过浅 ； 图整体颜色单一， 不如图 1 美观。图 3 是 高粱胚乳。
15、组织的树脂半薄切片， 以 1甲基紫单染。因为采用快染、 快拍的省时方法， 图片 本身的清晰度要比图版 1 差一些， 但是从染色后图版的整体美观程度而言， 仍然要比图版 2 的好一些。图 4 是小麦颖果母体组织的树脂半薄切片 ； A,B 以 0.5番红与 1甲基紫的混 合液 (1 ： 1) 染色， 细胞核染色有点深， 但细胞质与液泡明显 ； C,D 以 0.5番红与 1甲基 紫的混合液 (2 ： 1) 染色， 细胞核染色适当， 但细胞质与液泡不太明显 ； 也就是说， 体积比 1 ： 1 的 0.5番红与 1甲基紫混合染液的染色效果还是相对好一些， 能兼顾到更多的细胞结 构。 图5是不同发育天数的。
16、玉米胚乳传递细胞的树脂半薄切片， 以0.5甲苯胺蓝-O染色 ； 图未经任何处理， 图版中各图片颜色差异太大， 使得图整体不美观。图 6 是甲苯胺蓝 -O 染 色失败的例子 ； A 中存在一些杂质， 是因为染液变质产生沉淀 ； B 中箭头所指是水渍， 具体原 因可能与烤片时间不足有关 ； C 中产生的小裂纹和 D 中细胞间的染色反常 ( 如箭头所示 )， 都是因为烤片时间过久导致的 ； 因此， 甲苯胺蓝 -O 染色法对染色的时间与温度要求都很严 格， 而本发明的番红与甲基紫混合染色法对时间与温度就没这么敏感。 说 明 书 CN 104390834 A 5 1/6 页 6 图 1 说 明 书 附 图 CN 104390834 A 6 2/6 页 7 图 2 说 明 书 附 图 CN 104390834 A 7 3/6 页 8 图 3 说 明 书 附 图 CN 104390834 A 8 4/6 页 9 图 4 说 明 书 附 图 CN 104390834 A 9 5/6 页 10 图 5 说 明 书 附 图 CN 104390834 A 10 6/6 页 11 图 6 说 明 书 附 图 CN 104390834 A 11 。