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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410692979.3 (22)申请日 2014.11.25 A61D 1/00(2006.01) G01N 33/483(2006.01) (71)申请人 广州医科大学附属第一医院 地址 510530 广东省广州市越秀区沿江西路 151 号 (72)发明人 李君 沈粤春 陆东风 李新春 (74)专利代理机构 广州广信知识产权代理有限 公司 44261 代理人 石泽智 (54) 发明名称 利用小鼠制作动脉内皮细胞损伤模型的方法 及检测方法 (57) 摘要 本发明公开了一种利用小鼠制作动脉内皮细 胞损伤模型的方法及检测方法， 其制作动。
2、脉内皮 细胞损伤模型的方法步骤是 ： 步骤一 ： 切开小鼠 股动脉表面皮肤， 分离此股动脉和股动脉分支 ； 步骤二 ： 将股动脉分支剪一小口， 利用螺旋状不 锈钢丝从股动脉分支的此剪口处插入股动脉主干 内 ； 步骤三 ： 停留 1-3 分钟后抽出螺旋状不锈钢 丝， 结扎股动脉分支并缝合皮肤 ； 步骤四 ： 3-5 周 后将损伤的股动脉制作成动脉断面切片， 制成标 本。 本发明采用小鼠作为实验对象， 用于动脉内皮 细胞的机械性损伤， 结合动脉内皮细胞检测过程， 可达到研究动脉内皮细胞对损伤之反应程度的目 的。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权。
3、利要求书1页 说明书3页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104398313 A (43)申请公布日 2015.03.11 CN 104398313 A 1/1 页 2 1. 利用小鼠制作动脉内皮细胞损伤模型的方法， 其特征在于该方法的步骤是 ： 步骤一 ： 切开小鼠股动脉表面皮肤， 分离此股动脉和股动脉分支 ； 步骤二 ： 将股动脉分支剪一小口， 利用螺旋状不锈钢丝从股动脉分支的此剪口处插入 股动脉主干内 ； 步骤三 ： 停留 1-3 分钟后抽出螺旋状不锈钢丝， 结扎股动脉分支并缝合皮肤 ； 步骤四 ： 3-5 周后将损伤的股动脉制作成动脉断面切片， 制成标本。 2. 根据权利要求 1 。
4、所述的利用小鼠制作动脉内皮细胞损伤模型的方法， 其特征是 ： 所 述的小鼠为 8-11 周龄。 3. 根据权利要求 1 所述的利用小鼠制作动脉内皮细胞损伤模型的方法， 其特征是 ： 步 骤二中螺旋状不锈钢丝从股动脉分支插入股动脉主干内 0.5-1.5 厘米。 4. 根据权利要求 1 所述的利用小鼠制作动脉内皮细胞损伤模型的方法， 其特征是 ： 步 骤三中利用螺旋状不锈钢丝从股动脉分支插入股动脉主干内停留时间为 1-3 分钟。 5. 根据权利要求 1 所述的利用小鼠制作动脉内皮细胞损伤模型的方法， 其特征是 ： 所 述的螺旋不锈钢导管的直径为 0.2-0.5cm。 6. 根据权利要求 1 所述的。
5、利用小鼠制作动脉内皮细胞损伤模型的方法， 其特征是 ： 步 骤四制成标本方法包括 ： (1) 标本的提取 ： 于手术 3-5 周后对小鼠实施全身麻醉， 将小鼠仰卧于手术台上， 四肢 用胶布固定， 剪开胸壁、 暴露心脏， 通过注射器从左心室抽出全部血液后， 先后用生理盐水 和 3-5甲醛溶液冲洗动脉系统， 切取损伤的股动脉切段， 形成标本 ； (2) 标本的处理 ： 用石蜡包埋标本， 用机器切出切片， 用载玻片将切片组织置于其表 面， 切片厚度 4-6um， 动脉段每隔 1.5-3mm 保留切片， 平均每个动脉分析 3-4 个截面 ； (3) 标本的染色 ： 常规 HE 染色， 之后脱水、 透明。
6、、 中性树胶封固盖玻片。 7. 根据权利要求 6 所述的利用小鼠制作动脉内皮细胞损伤模型的方法， 其特征是 ： 所 述的冲洗动脉系统方法是 ： 首先， 将右心房剪一开口， 将生理盐水从左心室抽血的针眼处缓 慢注射入左心室， 待右心房流出血液消失取代为生理盐水时为止 ； 其次， 用 3-5甲醛溶液 从左心室抽血的针眼处缓慢注射入左心室， 进行一次或多次冲洗 ； 最后， 切除损伤的股动脉 段浸泡于 3-4甲醛溶液 6-24 小时后形成标本。 8. 根据权利要求 1 所述的利用小鼠制作动脉内皮细胞损伤模型的方法， 其特征是 ： 该 方法还包括动脉内皮细胞损伤模型的检测方法， 采用分析软件， 测量动脉。
7、内膜面积 (I)， 动 脉中膜面积(M)及其比值(I/M)， 与阴性对照组比较， 若实验组I增大及/或I/M减小， 说明 动脉内皮细胞对损伤的反应严重， 易于发生动脉粥样硬化 ； 反之， 不易发生。 权 利 要 求 书 CN 104398313 A 2 1/3 页 3 利用小鼠制作动脉内皮细胞损伤模型的方法及检测方法 技术领域 0001 本发明涉及动物实验过程中的动脉内皮细胞损伤， 特别是制作小鼠股动脉内皮细 胞的机械性损伤模型的方法及其检测方法。 本动脉内皮细胞损伤方法用于动脉内皮细胞及 其相关疾病， 例如动脉粥样硬化的发生机制及治疗效果等的研究。 背景技术 0002 大或中型动脉壁的解剖分。
8、为三层 ： 动脉内膜、 中膜和外膜。 其中动脉内膜位于血管 腔内侧、 直接接触血液， 由一层动脉内皮细胞组成， 起到保护动脉壁免受血液内不良成分伤 害的作用， 另外分泌一些生物学物质， 以调节动脉的收缩和舒张， 从而维持心血管系统的正 常功能。 0003 动脉粥样硬化发生发展机制中的一个重要环节是动脉内皮细胞受到血脂的侵害、 特别是氧化型低密度脂蛋白的损伤。动脉内膜遭破坏后， 血脂、 血小板、 吞噬细胞等继而沉 积在内膜上形成动脉粥样硬化斑块， 使血管的管腔变小、 血管壁僵硬失去弹性、 血液不能充 分供应至全身组织器官、 致组织器官缺血缺氧、 功能衰竭。 因此动脉内皮细胞是动脉粥样硬 化发生的。
9、起始环节。 0004 在动脉内皮细胞及其相关疾病， 例如动脉粥样硬化的发生机制及治疗效果等研究 中， 经常需要对动脉内皮细胞进行研究， 特别是动脉内皮细胞对损伤的增殖反应是多还是 少进行分析。分析的意义在于 ： 在动脉内皮细胞损伤同时加用某种刺激 ( 例如某种药物 )， 一定时间后 ( 一般 4 周达饱和 )， 与阳性组和阴性组进行比较， 若实验组的动脉内皮细胞对 此种刺激反应性增殖速度快、 增殖量大， 说明这种刺激可促进动脉粥样硬化的发生发展， 应 该避免此种刺激。相反， 若动脉内皮细胞损伤加用另一种药物 4 周后， 动脉内皮细胞不增 殖， 则说明这种药物具有保护动脉内皮细胞免受增殖之不良反。
10、应， 具有抗动脉粥样硬化发 生发展的作用， 可以用于抗动脉粥样硬化的治疗。 0005 因此， 需要一种诱导动脉内皮细胞损伤以研究其增殖程度的方法。 0006 由于人类疾病的发展十分复杂， 探讨疾病发生机制时以人本身为实验对象存在时 间、 空间、 风险、 伦理、 方法、 多种因素(年龄、 性别、 社会、 文化、 经济等)限制， 故需借助于动 物模型， 通过动物生理、 病理、 毒理、 药理等间接研究， 以揭示人类疾病的发生发展机制及防 治手段。小动物实验也越来越多的用于各种科研活动。 0007 小鼠价格低廉、 易于操作， 虽然其脂肪代谢过程不同于人类、 血脂不高、 所以不易 发生动脉粥样硬化， 但。
11、载脂蛋白 E 基因敲除 (ApoE-/-) 小鼠模型的成功制备， 使此种小鼠易 发动脉粥样硬化、 且病理过程与人类相似。故动脉粥样硬化的研究多采用 ApoE-/-小鼠作为 载体进行研究。 发明内容 0008 本发明的目的是， 提供一种便于诱导动脉内皮细胞损伤以研究其增殖程度的制作 动脉内皮细胞损伤模型的方法及其检测方法。 说 明 书 CN 104398313 A 3 2/3 页 4 0009 本发明的目的可通过以下技术方案实现 ： 0010 利用小鼠制作动脉内皮细胞损伤模型的方法， 该方法步骤是 ： 0011 步骤一 ： 切开小鼠股动脉表面皮肤， 分离此股动脉和股动脉分支 ； 0012 步骤二。
12、 ： 在股动脉分支剪一小口， 利用螺旋状不锈钢丝从此剪口插入股动脉主干 内 ； 0013 步骤三 ： 停留 1-3 分钟抽出螺旋状不锈钢丝， 结扎股动脉分支， 并缝合皮肤切口 ； 0014 步骤四 ： 3-5 周后将损伤的股动脉制作成动脉断面切片， 形成标本。 0015 本发明的目的还可通过以下技术方案实现 ： 0016 进一步的， 所述的小鼠为 8-11 周龄。 0017 进一步的， 步骤二中螺旋状不锈钢丝从股动脉分支插入股动脉主干内 0.5-1.5 厘 米。 0018 进一步的， 步骤三中利用螺旋状不锈钢丝从股动脉分支插入股动脉主干内停留时 间为 1 分钟。 0019 进一步的， 所述的螺。
13、旋不锈钢导管的直径为 0.2-0.5cm。 0020 进一步的， 步骤四制成标本方法包括 ： 0021 (1) 标本的提取 ： 于手术 3-5 周后对小鼠实施全身麻醉， 将小鼠仰卧于手术台上， 四肢用胶布固定， 剪开胸壁、 暴露心脏， 通过注射器从左心室抽出全部血液后， 先后用生理 盐水和 3-5甲醛溶液冲洗动脉系统， 切除损伤的动脉段， 形成标本 ； 0022 (2) 标本的处理 ： 用石蜡包埋标本， 用机器切出切片， 用载玻片将切片组织置于其 表面， 切片厚度 4-6um， 动脉段每隔 1.5-3mm 保留切片， 平均每个动脉分析 3-4 个截面 ； 0023 (3) 标本的染色 ： 常规。
14、 HE 染色， 之后脱水、 透明、 中性树胶封固盖玻片。 0024 进一步的， 所述的冲洗动脉系统方法是 ： 首先， 将右心房剪一开口， 将生理盐水从 左心室抽血的针眼处缓慢注射入左心室， 待右心房流出血液消失取代为生理盐水时为止 ； 其次， 用 3-5甲醛溶液从左心室抽血的针眼处缓慢注射入左心室， 进行一次或多次冲洗 ； 最后， 切除损伤的股动脉段浸泡于 3-4甲醛溶液 6-24 小时后形成标本。 0025 一种动脉内皮细胞损伤模型的检测方法， 其方法是 ： 采用分析软件， 测量动脉内膜 面积(I)， 动脉中膜面积(M)及其比值(I/M)， 与阴性对照组比较， 若实验组I增大及/或I/ M 。
15、减小， 说明动脉内皮细胞对损伤的反应严重， 易于发生动脉粥样硬化 ； 反之， 不易发生。 0026 本发明的有益效果 ： 0027 1、 本发明采用小鼠作为实验对象， 用于动脉内皮细胞的机械性损伤， 结合动脉内 皮细胞检测过程， 可达到研究动脉内皮细胞对损伤之反应程度的目的。 0028 2、 本发明采用细的螺旋状不锈钢丝从股动脉分支插入股动脉主干内达到股动脉 内皮细胞的损伤， 对检测股动脉皮细胞对损伤的增殖反应、 研究内皮细胞增殖效果提供了 一种有效的手段。 0029 3、 本发明适应于小鼠股动脉内皮细胞的机械性损伤， 对动脉内皮细胞及其相关的 疾病例如动脉粥样硬化的研究具有实用价值。 附图说。
16、明 0030 图 1 为本发明具体实施方法的操作示意图。 说 明 书 CN 104398313 A 4 3/3 页 5 0031 图中标记 ： 1 表示股动脉主干、 2 表示股动脉分支、 3 星号表示从此处剪一小开口然 后插入导管的部位、 4 箭头表示导管插入的方向 , 插入深度为从分支算起向心性方向 1 厘 米、 5 表示抽出导管后用丝线结扎的部位。 具体实施方式 0032 参照图 1 所示的利用小鼠制作动脉内皮细胞损伤模型的方法， 其方法步骤是 ： 0033 (1) 术前准备 ： 经腹腔注射戊巴比妥钠 (120mg/kg) 进行小鼠全身麻醉后， 将小鼠 仰卧于手术台上， 四肢用胶布固定。 。
17、0034 (2) 手术过程 ： 0035 A、 剃毛、 消毒 ： 一侧 ( 右手优势者取左侧 ) 腹股沟区剃毛、 碘酒消毒。另一侧不动， 用做对照。 0036 B、 分离股动脉及其分支 ： 腹股沟正中纵向切开皮肤、 分离股动脉主干 ( 如图中标 记1)。 用两根外科缝合线分别从股动脉近端和远端的底下穿过并用胶布固定以临时控制血 流。分离位于主干中端的较粗动脉分支 - 股动脉肌支 ( 如图中标记 2)。 0037 C、 插管 ： 在动脉表面滴一滴 l利多卡因以防止动脉痉挛。在股动脉肌支近端剪 一小口 ( 如图中标记 3)， 将不锈钢导管通过这一切口向心性延着股动脉分支插入股动脉主 干内方向 ( 。
18、如图中标记 4) 内 1 厘米， 在其内停留 1 分钟， 然后缓慢抽出。 0038 (3) 关闭切口 ： 用 7.0 号丝线 5 结扎股动脉分支， 结扎部位 ( 见图中标记 5)。放松 股动脉近端和远端用于控制血流的缝合线， 恢复血流， 皮肤用丝线缝合， 手术后保温， 自然 苏醒。 0039 (4) 标本的提取 ： 0040 A、 标本的提取过程 ： 于手术 4 周后对小鼠实施全身麻醉， 方法同前。之后将小鼠 仰卧于手术台上， 四肢用胶布固定。剪开胸壁、 暴露心脏。通过注射器从左心室抽出全部血 液后， 先后用生理盐水和 4甲醛溶液冲洗动脉系统。冲洗动脉系统方法 ： 将右心房剪一开 口， 将生理。
19、盐水从刚才左心室抽血的针眼处缓慢注射入左心室， 待右心房流出血液消失取 代为生理盐水时为止， 约 10ml ； 用 4甲醛溶液重复上述步骤。冲洗动脉系统完毕后， 切除 损伤的股动脉段浸泡于 4甲醛溶液 6-24 小时。 0041 B、 标本的处理 ： 用石蜡包埋标本， 用机器切出切片， 用载玻片将切片组织置于其表 面。切片厚度 5um。动脉段每隔 2mm 保留切片， 平均每个动脉分析 3-4 个截面。 0042 C、 标本的染色 ： 常规 HE 染色。之后脱水、 透明、 中性树胶封固盖玻片。 0043 (5)标本的检测分析 ： 采用分析软件， 测量动脉内膜面积(I)， 动脉中膜面积(M)及 其比值 (I/M)。与对照组比较， 若实验组 I 增大及 / 或 I/M 减小， 说明动脉内皮细胞对损伤 的反应严重， 易于发生动脉粥样硬化 ； 反之， 不易发生。 说 明 书 CN 104398313 A 5 1/1 页 6 图 1 说 明 书 附 图 CN 104398313 A 6 。