喜树碱衍生物及其作为抗肿瘤剂的应用 本发明涉及喜树碱衍生物，其制备方法，其作为活性成分用于制备治疗肿瘤的药物的应用以及含有它的药物制剂。
下式的抗肿瘤剂20S-喜树碱
其中R1、R2和R3是氢，于1966年由M.E.Wall等公开(美国化学学会会志，88,3888-90(1966))，在作过初步的临床评价之后，它便不再作为治疗剂，这是由于其对人的毒性以及其低的溶解性，而低溶解性使之难于用适合的药物制剂给药。科学及工业界的科研者的注意力专注在具有改善的治疗作用的喜树碱类似物。上述化学式描述的多种类似物之中的两种，一种称作托泊替堪(Topotecan)，其中R1是氢，R2是基团-CH2-NH(CH3)2,R3是OH；另一种称作CPT-11，其中R1是乙基，R2是氢，R3是最近被肿瘤医生用于治疗一些肿瘤(临床肿瘤学杂志，10,1775-80(1992)；全国癌症协会杂志，85,271(1993))。最近进行临床试验的其它衍生物是9-氨基喜树碱和下述化学式的类似物
(癌症治疗综述20,73-96(1994))。
大多数的合成努力集中在引入适合的取代基，克服几乎无水溶解性的问题，而水溶性极低是这一类化合物的特点，且因此而导致其配制上的困难以及药物不可预见的血浆水平。然而，闭合形式的内酯环的稳定性是抗肿瘤效力的重要因素。
这类化合物地相关性还在于其独特的作用机理：事实上，它们通过抑制拓扑异构酶Ⅰ即一种调节DNA拓扑学且因此在基本的细胞途径如DNA复制、转录、重组以及修复中起关键作用的酶，来显示其抗肿瘤作用(C.Capranico和F.Zunino，现代药物设计，1,1-14(1995))。对新的对结肠直肠癌、非小细胞肺癌、卵巢瘤和前列腺癌有效，而对化学治疗处理反应小的药物的需要，使得具有改善药理性能的新的喜树碱衍生物的研究有价值。
业已发现，喜树碱衍生物和在C-7上带有取代基的10-羟基喜树碱衍生物显示出抗肿瘤活性，且具有有利的理化性能，让其可配制成适合的药物组合物。
本发明包含式(Ⅰ)化合物，
其中
R1是-CN、-CH(CN)-R4、-CH=C(CN)-R4、-CH2-CH(CN)-R4、-C(=NOH)-NH2、-C(=NH)-NH2、-CH=C(NO2)-R4、-CH(CN)-R5、-CH(CH2NO2)-R5；5-四唑基、2-(4,5-二氢噁唑基)、1,2,4-噁二唑啉-3-基-5-酮；
R2是氢；
R3是氢、OR6；
R4是氢、C1-C6直链或支链烷基、CN、COOR7；
R5是氢、OR8；
R6是氢、C1-C6直链或支链烷基、(C6-C12)芳基(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷基(C6-C12)芳基、(C6-C12)芳基(C2-C4)酰基、(C2-C4)酰基、氨基(C1-C4)烷基、氨基(C2-C4)酰基、糖基；
R7是氢、C1-C6直链或支链烷基、(C6-C12)芳基(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷基(C6-C12)芳基；
R8具有与R6一样的含意，前者独立于后者；
其N1-氧化物、其异构体、非对映异构体、对映体及其混合物，以及其代谢物，特别是活性代谢物。
本发明还包括可药用的盐。
本发明还包括式(Ⅰ)化合物作为活性成分用于制备药品，特别是用于治疗肿瘤的药品的应用。
本发明包括含有作为活性成分的式(Ⅰ)化合物的药用组合物。
本发明包括制备式(Ⅰ)化合物的方法。
本发明包括其中R1是CN的式(Ⅰ)化合物作为中间体，用于制备其它式(Ⅰ)化合物，其中R1是-C=(NOH)-NH2、-C(=NH)-NH2、5-四唑基、2-(4,5-二氢噁唑基)。
C1-C6烷基的实例是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、2-甲基丁基、异戊基、己基、3-甲基戊基、2-乙基丁基。
(C6-C12)芳基(C1-C4)烷基的实例是：苄基、单或多取代的C1-C6烷基苄基、α-或β-苯乙基、单或多C1-C4烷基取代的α-或β-苯乙基、单或多C1-C4烷基取代的α-、β-或γ-苯丙基、α-或β-萘甲基、单或多C1-C2烷基取代的α-或β-萘甲基。
(C1-C2)烷氧基(C1-C4)烷基的实例是：甲氧基甲基、乙氧基乙基、乙氧基甲基、丙氧基乙基、丁氧基乙基。
(C1-C4)烷基(C6-C12)芳基的实例是：甲苯基、二甲苯基、乙基苯基、异丙基苯基、三丁基苯基、甲基萘基。
(C6-C12)芳基(C2-C4)酰基的实例是：苯基乙酰基、萘基乙酰基、2-苯基丙酰基、3-苯基丙酰基、2-、3-或4-苯基丁酰基(phenylbutirryl)、单、二或三(C1-C4)烷基取代的苯基乙酰基。
C2-C4-酰基的实例是乙酰基、丙酰基、丁酰基及其异构体。
氨基(C1-C4)烷基和氨基(C2-C4)酰基的实例是C1-C4烷基和C2-C4酰基，其中氨基取代基可以在碳链的任何位置。
可药用的盐的实例是：在碱性氮原子的情况下，与可药用的酸形成的盐，酸可以是无机酸和有机酸，如盐酸、硫酸、乙酸；在酸基团如-COOH的情况下，与可药用的碱形成的盐，碱可以是无机和有机碱，如碱金属和碱土金属氢氧化物、氢氧化铵、胺。
第一组优选的化合物包括其中R3是氢的式(Ⅰ)化合物。
第二组优选的化合物包括其中R3是OR6且R6如上所定义的式(Ⅰ)化合物。
第三组优选的化合物包括其中R1是CN,R3是氢或OR6且R6如上所定义的式(Ⅰ)化合物。
第四组优选的化合物包括其中R1是CH(CN)-R4，其中R4优选是CN或COOR7且R7如上所定义的式(Ⅰ)化合物。
第五组优选的化合物包括其中R1是CH(=NOH)NH2，R3是如上所定义的OR6的式(Ⅰ)化合物。
第六组优选的化合物包括其中R1是CH(=NH)NH2，R3是如上所定义的OR6的式(Ⅰ)化合物。
第七组优选的化合物包括其中R1是CH=C(CN)R4，而其中R4优选是CN或COOR7，R7如上所定义的式(Ⅰ)化合物。
第八组优选的化合物包括其中R1是CH(CH2NO2)R5，R5是根据上面定义的OR8的式(Ⅰ)化合物。
第九组优选的化合物包括其中R1是CH=C(NO2)-R4，而其中R4是H，R3是根据上面定义的OR6的式(Ⅰ)化合物。
特别优选的式(Ⅰ)化合物是其中R1是CN或CH=C(CN)2或-CH2CH(CN)-R4且R2和R3是氢的式(Ⅰ)化合物。
式(Ⅰ)化合物可以由如下起始物获得：由喜树碱-7-甲醇(Ⅱ,R1=CH2OH、R2=H、R3=H)或由10-羟基喜树碱-7-甲醇(Ⅱ,R1=CH2OH、R2=H、R3=OH)，或由喜树碱-7-醛(Ⅱ,R1=CHO、R2=H、R3=H)、或由喜树碱-N-氧化物，所有这些化合物均可由Sawada等描述于化学药物公报，39,2572(1991)中的方法获得。
其中R1=-CN的式(Ⅰ)化合物通过这样一种方法制备，所述的方法包括将式(Ⅱ,R1=-CH2OH)化合物氧化成式(Ⅱ,R1=-CHO)，用已知的将醇氧化成醛的方法，如Moffatt或Swern氧化法，或用亚碘酰基苯甲酸在二甲亚砜中氧化(Frigerio等，有机化学杂志，60,7272-6(1995))或通过如Sawada等所述的方法酸处理(化学药物公报，39,2572(1991))，之后用羟胺处理这些醛，给出相应的肟，接着将肟与甲酸和甲酸钠一起加热，或用其它的将醛转化成腈的已知的方法。
式(Ⅰ,R1=-CN、R1=-CH(CN)-R4)的化合物也可以如下获得：使喜树碱的N-氧化物，例如由Sawada等描述的那些(化学药物公报，39,2572(1991))，分别与氰化钾或三甲基甲硅烷基氰化物反应，或与丙二腈或氰基乙酸的酯反应(如A.Albini和S.Pietra描述于杂环N-氧化物，CRC,1991，第165页的方法)，或用酰胺脱水成腈的已知方法将式(Ⅱ,R1=-CONH2)反应，或用其它适合于制备喹啉-4-腈的方法。
氨基肟(Ⅰ,R1=-C(=NOH)-NH2)通过相应的腈(Ⅰ,R1=-CN)与羟胺反应而获得(F.Eloy和R.Lenaers，化学评论，61,157,(1961))。氨基肟可以通过催化氢化，优选用阮内镍作催化剂，还原成相应的脒(Ⅰ,R1=-C(=NH)-NH2)(F.Eloy和R.Lenaers，同上，第166页)。相同的脒也可以用已知的将腈转化成脒的方法，如与HCl和一种醇反应，接着用氨或铵盐处理，由腈(Ⅰ,R1=-CN)获得，或用氟硼酸三乙基氧鎓，由酰胺(Ⅱ,R=-CONH2)获得(A.I.Meyers等，四面体39,1991(1983))。
式(Ⅰ,R1=-CH=C(CN)-R4)的化合物例如如下制备，在有或无有机或无机碱存在下，使醛(Ⅱ,R1=-CHO)与丙二腈反应，或与丙二酸或氰基乙酸的酯反应，或者根据Wittig或Wadsworth-Emmons反应，使醛或酮(Ⅱ,R1=-CHO或-CO-烷基)与适合的膦酸的内鎓盐或阴离子反应。如果需要，式(Ⅰ,R1=-C=C(CN)-R4)的化合物可以在催化剂如Pd或Pt或Ni存在下氢化而成相应的式Ⅰ(R1=CH2CH(CN)-R4)化合物。
式(Ⅰ,R1=-CH(CN)-R4,-CH(CH2NO2)-R5)的化合物，其中R5是OH，可以如下制备：在有机或无机碱存在下，使醛(Ⅱ,R1=-CHO)与氰化钾或氰化钠或三甲基甲硅烷基氰化物反应，并分别与硝基甲烷反应。
式(Ⅰ,R1=-CH=CH(NO2)-R4)的化合物通过酸处理其中R1是-CH(CH2NO2)-R5的化合物而获得。
如果需要，式(Ⅰ,R1=-CN)化合物可以用已知的适合方法转化成式(Ⅰ)化合物，其中R1是杂环状环，优选2-(4,5-二氢噁唑)(J.F.Bower等，J.Chem.Soc.Perkin Trans.1,333(1996))或5-四唑(Duncia等，有机化学杂志，56,2395(1991))。
式(Ⅰ,R1=1,2,4-噁二唑啉-3-基-5-酮)的化合物由相应的脒获得。
式(Ⅰ)化合物的N-氧化物根据已知的氧化杂芳族氮的方法，优选通过用乙酸或三氟乙酸和过氧化氢氧化的方法，或通过与有机过氧酸反应来制备(A.Albini和S.Pietra，杂环状N-氧化物，CRC,1991)。
式(Ⅰ)化合物的可药用的盐可以根据文献已知的方法获得。
描述于本发明中的化合物表现出强的抗增生活性，且具有使之适合于包括在可药用组合物中的理化性能。
在人肿瘤细胞的细胞系统中，使用抗增生试验作为评价细胞毒性强度的方法，进行了本发明化合物的细胞毒性试验。此方法要点是与细胞毒性剂接触1小时后，确定72小时存活细胞数。本发明化合物的细胞活性与下述二种药剂作了比较：1)托泊替堪作为参考药剂，它属于DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂；ⅱ)阿霉素，标准的抗肿瘤剂，属于那些采用于肿瘤临床治疗的最有效的药剂之一。报道于表1中的结果表明，描述于下文实施例1中的式(Ⅰ)化合物(1,R1=-CN,R2=H,R3=H)和描述于下文实施例4中的式(Ⅰ)化合物(Ⅰ,R1=CH=C(CN)-R4,R4=CN,R2=H,R3=H)表现出在非小细胞肺癌体系(非SCLC)(H-460)中强于参考化合物的细胞毒性活性，该体系对细胞毒性治疗有内在抗性和对拓扑异构酶Ⅰ抑制剂只有中度的响应，尽管有靶体酶的超表述。
表1
一组人肿瘤细胞中喜树碱类似物的细胞毒性活性
(与药剂接触1小时；与药剂接触72小时后确定抗增生活性) 细胞系 实施例1 实施例4 托泊替堪 阿霉素H460(肺癌非SCLC)0.08±0.02 0.19 0.34±0.04 0.09 H460/TPT 12±2 80 GBM(恶性胶质瘤) 2.7 1.2
而且，实施例1化合物在处理细胞系(H460/TPT)上显示出明显的效力，该细胞系在与托泊替堪延长接触之后选择和对托泊替堪有高程度的强抗性的特点。由于H460系表达高水平的拓扑异构酶Ⅰ，报道于下文实施例1中的化合物在处理此肿瘤细胞系上的改善的细胞毒性表明，该化合物对细胞靶体有改善的特异性。这些化合物在GBM细胞系上效力降低支持此解释，即，由于拓扑异构酶Ⅰ的低表达，它们对这些抑制剂有相当的抗性。
设计出一种临床前效力研究，与作为参考药剂的托泊替堪(已用于临床试验的第一代喜树碱)相比较，评价本发明化合物的抗肿瘤活性。选择人肿瘤系NCI-H460，一种非小细胞肺癌，是因为拓扑异酶Ⅰ(喜树碱药物的已知靶体)的高度表达。此肿瘤模型对用常规的细胞毒性剂(例如，阿霉素、顺铂)体内处理有一定的抗性。将肿瘤细胞腹膜内注射(i.p.)入大约10周龄的裸鼠(2.5×106细胞/鼠)中，3天后将药剂注射入腹腔内(10ml/kg b.w.)中，让药剂与肿瘤细胞直接接触。将托泊替堪和描述于下文实施例1中的化合物给予q4d×4次。此方案据报道是其它临床前研究中喜树碱药物的最佳方案。每天观察小鼠的死亡情况。药剂的抗肿瘤活性用T/C％来表达，即，药剂处理的小鼠平均存活时间(T)与对照的未处理小鼠的存活时间(C)之比×100。先于第一只对照小鼠死亡或在处理之后不久即体重减轻的处理后的小鼠，被认为是由于药剂毒性而死亡的。在肿瘤细胞接种后100天仍存活的小鼠被认为是长期存活者(LTS)。(仍进行第二项实验，超过70天被认为是LTS)。二项独立实验的结果报道于表2中。
表2
CPT83在处理NCI-H460人肺肿瘤异种移植物(i.p.生长)的效力，
处理i.p.q4d×4次，从肿瘤细胞移植3天后开始药剂mg/kg ％T/C 中毒的数目/小鼠总数LTS(100天)实验1实施例1托泊替堪实验2实施例1托泊替堪 6.6 10 10 10 12 14.4 10 12 14.4 157 258 215 233 200 277 261 77 77 0/8 0/8 0/8 0/7 0/7 1/7 4/7 5/7 2/8 3/8 2/8 1/7 1/7 2/7 1/7 0/7 0/7
本发明实施例1化合物，编号为CPT83，在增加i.p.肿瘤携带的小鼠的存活时间上是高效的，在所有的试验剂量下，T/C％值高于200。考虑药剂的毒性，只有一只小鼠在14.4mg/kg×4的剂量下(总累积剂量：49.6mg/kg)死亡。在实验1中，在肿瘤细胞造成延迟死亡(缓慢生长肿瘤)的条件下，CPT83的药剂效力优于托泊替堪。使用迅速生长肿瘤(实验2)，CPT83的效力在T/C％方面，可以与托泊替堪的相比。然而，在二项实验中，CPT83处理的组中发现更高比率的长期存活者(LTS，即，治愈动物)。此发现反映了与改善的治疗指数相关的有希望的治疗作用。CPT83潜在的治疗优点还突出表现在其处理缓慢生长肿瘤的良好活性，而缓慢生长肿瘤是更具代表性的临床环境中的生长。综上所述，在NCI-H460肿瘤异种移植上，与托泊替堪相比，CPT83具有可比的活性和更好的耐受性。
本发明化合物显示出特别优越的性能，这些性能概述成如下几点：
1．对细胞靶体的增强特异性，且因此对表达高水平拓扑异构酶Ⅰ的肿瘤细胞的增强特异性。这一可能性得到了H460肿瘤细胞(已知它具有高的拓扑异构酶Ⅰ水平)的增加的敏感性的支持。的确，此选择性在特征为低水平靶体表达的细胞系(GMB)中丧失。
2．其活性与托泊替堪相比明显不太依赖于肿瘤的增生速率，如体内实验和对特征在于非常缓慢增生的H460/TPT细胞系明显活性所表明的。此活性作用可以具有临床意义，因为缓慢生长是典型的人固体肿瘤。
3．体外的细胞毒性潜能与体内增加的毒性无关，因此可使得使用大范围的有效剂量。这与改善的治疗指数相吻合。
4．本发明化合物，特别是CPT83，已由口服途径证明是有活性的。出人意外的是，口服CPT83比(按最佳处理方案)i.v.给药托泊替堪更有活性。
考虑本发明的工业方面时，含有有效量的至少一种式Ⅰ化合物作为活性成分与载体和赋形剂混合的药物组合物是本发明的另一目的。
药物组合物用本领域公知的常规方法制备，例如按描述于，美国纽约Mack,Pub.出版的Remington’Pharmaceutical Sciences Hanbdbook一书中的方法。
药物组合物的实例是可注射组合物，如溶液、悬浮液、于含水或非含水载体中的乳液；经肠组合物，如胶囊、片剂、丸剂、糖浆、可饮用液体制剂。可与式(Ⅰ)化合物相容的其它药物组合物，如控释制剂，包含在本发明中。
药物组合物中的活性成分的剂量将由本领域技术人员，依据活性成分的活性以及药物动力学特点来确定。剂量学将由医生根据待处理的肿瘤类型、患者的病症来决定。
本发明化合物还可以用于与其它抗肿瘤药剂组合。
下列实施例进一步说明本发明。
实施例1
20S-喜树碱-7-腈
1)将400毫克喜树碱-7-醛的肟(Sawada等，化学药物公报，39,2572(1991))、102毫克甲酸钠和15毫升99％甲酸回流6小时。向此溶液中加入150毫升水和50毫升二氯甲烷，分离出二相，水相再萃取4次。将有机萃取液蒸发，残留物在硅胶MerckR上，用二氯甲烷-甲醇96∶4进行色谱分离。获得腈(300毫克)，为黄色固体，
m.p.2 63℃.Mass(M/e％):374(16),373(98),344(36),329(48),314(55),301(53),300(53),273(100).1H NMR(DMSO-d6)0.92(CH3),1.92(CH2),5.48,5.51(CH2-5),5.56(CH2-17),6.62(OH),7.13(CH-14),8.02(CH-11),8.10(CH-10),8.30(CH-9),8.39(CH-12).
2)将320毫克喜树碱-7-醛、154毫克NH2OH.HCl、578毫克甲酸钠和20毫升甲酸回流3小时，加入60毫克NH2OH.HCl，将此混合物回流2小时。加入水(90毫升)，混合物用二氯甲烷萃取。如上所述回收和纯化化合物。
3)将500毫克喜树碱N-氧化物与0.86毫升三甲基甲硅烷基氰化物和0.32毫升过氧化苯甲酰在45毫升1,1,2,2-四氯乙烷中回流12小时。将混合物冷却并蒸发，残留物在硅胶MerekR上，用己烷-乙酸乙酯4∶6作洗脱液进行色谱分离，给出喜树碱-7-腈。
由适合的10-取代的喜树碱为原料，类似地制备出下列化合物：
20S-10-羟基喜树碱-7-腈
20S-10-乙酰氧基喜树碱-7-腈
20S-10-甲氧基喜树碱-7-腈
20S-10-甲氧基甲氧基喜树碱-7-腈
20S-10-乙氧基喜树碱-7-腈
20S-10-苄氧基喜树碱-7-腈
20S-10-β-D-糖基氧基喜树碱-7-腈
20S-喜树碱-7-基-丙二腈
20S-喜树碱-7-基氰基乙酸乙酯
实施例2
20S-喜树碱-7-脲肟(carbamidoxime)
将60毫克喜树碱-7-腈、40毫克羟胺盐酸盐和0.2毫升三乙胺在5毫升无水乙醇中的悬浮液回流8小时，4小时后，加入另一份40毫克NH2OH.HCl和0.2毫升Et3N。将混合物蒸发，用水溶解，过滤，并将沉淀物在硅胶MerekR上，用二氯甲烷-甲醇9∶1作洗脱液进行色谱分离，给出喜树碱-7-脲肟。
类似地制备出下列化合物：
20S-10-羟基喜树碱-7-脲肟
20S-10-乙酰氧基喜树碱-7-脲肟
20S-10-甲氧基喜树碱-7-脲肟
实施例3
20S-7-脒基喜树碱
将在10毫升甲醇中的100毫克20S-喜树碱-7-脲肟在1克阮内镍催化剂存在下，在50atm的压力下和70℃温度下氢化5小时。滤出催化剂，蒸发，给出20S-7-脒基喜树碱，为玻璃状固体。
类似地制备出下列化合物：
20S-10-羟基-7-脒基喜树碱
20S-10-乙酰氧基-7-脒基喜树碱
20S-10-甲氧基-7-脒基喜树碱
实施例4
20S-7-(2,2-二氰基乙烯基)喜树碱
将60毫克喜树碱-7-醛与3毫升丙二腈在8毫升1,1,2,2-四氮乙烷中，在20毫克溴化锂存在下回流4小时。冷却，过滤并在硅胶上用乙酸乙酯作洗脱液进行色谱分离，给出20S-7-(2,2,-二氰基乙烯基)-喜树碱，为玻璃状固体。(M/e)424,380.1H NMR(DMSO-d6)0.85(CH3),1.88(CH2),5.38,(CH2-5),5.45(CH2-17),6.56(OH),7.36(CH-14),7.82(CH-11),7.96(CH-10),8.18(CH-9),8.26(CH-12),9.30(CH=).
类似地制备下列化合物：
20S-7-(2,2-二氰基乙烯基)-10-羟基喜树碱
20S-7-(2,2-二氰基乙烯基)-10-甲氧基喜树碱
20S-7-(2,2-二氰基乙烯基)-10-乙氧基喜树碱
20S-7-((2-氰基-2-乙氧基羰基)乙烯基)喜树碱
实施例5
20S-7-(2-硝基-1-羟基乙基)喜树碱
将150毫克喜树碱、0.05毫升硝基甲烷、0.01毫升三乙胺在3毫升异丙醇中回流10小时。蒸发，用稀HCl和二氯甲烷处理，色谱分离用二氯甲烷中含4％甲醇萃取的萃取液，给出20S-7-(2-硝基-1-羟基乙基)喜树碱。
1H NMR(DMSO-d6)0.80(CH3),1.84(CH2),4.90-5.05(CH2-7),5.46,(CH2-5),5.54(CH2-17),6.33(CHOH),6.56(OH-16),6.91(CHOH),7.33(CH-14),7.70(CH-11),7.82(CH-10),8.17(CH-9),8.20(CH-12.
类似地制备下列化合物：
20S-7-(2-硝基-1-羟基乙基)-10-甲氧基喜树碱
20S-7-(2-硝基-1-羟基乙基)-10-乙氧基喜树碱
实施例6
20S-7-(2-硝基乙烯基)-喜树碱
将50毫克20S-7-(2-硝基-1-羟基乙基)-喜树碱在5毫升四氢呋喃中与20毫克对甲苯磺酸或与0.03毫升三氟乙酸一起回流1-2小时，给出20S-7-(2-硝基乙烯基)-喜树碱，为黄色玻璃状固体。
类似地制备出下列化合物：
20S-7-(2-硝基乙烯基)-10-甲氧基喜树碱
20S-7-(2-硝基乙烯基)-10-乙氧基喜树碱。