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1、(10)申请公布号 CN 104330288 A (43)申请公布日 2015.02.04 CN 104330288 A (21)申请号 201410331877.9 (22)申请日 2014.07.14 G01N 1/28(2006.01) G01N 21/31(2006.01) (71)申请人 普研 （上海） 标准技术服务有限公司 地址 201204 上海市浦东新区张江高科技园 区张衡路 180 弄 1 号楼 4 楼 (72)发明人 胡国华 严婷 (74)专利代理机构 上海精晟知识产权代理有限 公司 31253 代理人 肖爱华 (54) 发明名称 一种高灵敏度测试游离生物素的方法 (57)。
2、 摘要 一种高灵敏度测试游离生物素的方法， 其特 征在于 ： 利用植物乳杆菌对游离生物素的特异性 和灵敏性， 通过游离生物素的浓度与菌体的生长 量和生长速度成正比的关系， 根据吸光值与工作 曲线进行比较， 即可算出试样中待测物的浓度 ； 其中， 所述吸光值为采用酶标仪测量培养后的液 体获得的吸光度。 本发明提供了一种简便、 高效的 游离生物素的检测方法。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 6 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书6页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104330288 A CN 1043302。
3、88 A 1/2 页 2 1. 一种高灵敏度测试游离生物素的方法， 其特征在于 ： 利用植物乳杆菌对游离生物素 的特异性和灵敏性， 通过游离生物素的浓度与菌体的生长量和生长速度成正比的关系， 根 据吸光值与工作曲线进行比较， 即可算出试样中待测物的浓度 ； 其中， 所述吸光值为采用酶标仪测量培养后的液体获得的吸光度。 2. 如权利要求 1 所述的一种高灵敏度测试游离生物素的方法， 其特征在于 ： 所述植物 乳杆菌为 ATCC8014。 3. 如权利要求 1 所述的一种高灵敏度测试游离生物素的方法， 其特征在于， 具体分析 步骤如下所示 ： 步骤一、 接种菌悬液的制备 ； 步骤二、 样品的处理 。
4、； 步骤三、 标准曲线的制作 ； 步骤四、 待测液的制作 ； 步骤五、 灭菌 ； 步骤六、 接种 ； 步骤七、 培养 ； 步骤八、 分析测试。 4. 如权利要求 3 所述的一种高灵敏度测试游离生物素的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 八中包括如下测试程序 : 步骤七中所述的培养步骤为将试管放入培养箱内， 36 1培 养 19h 20h。 5. 如权利要求 3 所述的一种高灵敏度测试游离生物素的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 八中包括如下测试程序 : (1)、 对每支试管进行视觉检查， 接种空白试管 S1 内培养液应是澄清的， 若出现浑浊， 则结果无效 ； (2)、 以接种空白孔 S1 做对照。
5、， 测定最高浓度标准曲线试管的吸光度， 两小时后重新测 定， 两次结果透光率差值若小于 2， 则取出全部检验管测其吸光度 A ； (3)、 以接种空白试管 S2 为空白， 调节吸光度为 0， 一次读出其他每支试管的吸光度 A， 样品空白的吸光度 A 一并读出 ； (4)、 充分混合每一支试管后， 立即将培养液移入96孔板中， 每孔200uL,每个试管读数 前摇匀样液， 于 660nm 波长下读吸光值 ； (5)、 对每个编号的待测液孔， 用每个孔的吸光度值计算每毫升该编号待测液生物素的 含量， 并计算该编号待测液的生物素含量平均值。 6. 如权利要求 5 所述的一种高灵敏度测试游离生物素的方法。
6、， 其特征在于 ： 每支试 管测得的该浓度不得超过该平均值的 15， 超过者要舍去， 如果符合该要求的孔少于所 有编号待测液总孔数的 2/3， 需要重新检验 ； 如果符合该要求的孔数大于等于原来孔数的 2/3， 重新计算每一编号的有效试样孔中每毫升测定液生物素含量的平均值， 以此平均值计 算全部编号试样孔的总平均值， 用于计算试样中的生物素含量。 7. 如权利要求 5 所述的一种高灵敏度测试游离生物素的方法， 其特征在于 ： 用漩涡混 合器充分混合每一支试管。 8. 如权利要求 7 所述的一种高灵敏度测试游离生物素的方法， 其特征在于 ： 充分混合 权 利 要 求 书 CN 104330288。
7、 A 2 2/2 页 3 后还可加入一滴消泡剂。 9. 如权利要求 1-8 任一所述的一种高灵敏度测试游离生物素的方法， 其特征在于 ： 用 于测定婴幼儿食品和乳品中的游离生物素。 权 利 要 求 书 CN 104330288 A 3 1/6 页 4 一种高灵敏度测试游离生物素的方法 技术领域 0001 本发明属于微生物食品检测领域， 具体地， 涉及一种高灵敏度测试游离生物素的 方法， 特别是针对婴幼儿食品和乳品中游离生物素的检测。 技术背景 0002 生物素又称为维生素H,是水溶性维生素， 属于B族维生素， 是含硫的一种维生素， 也是生物体内羧基转化酶作用的一种辅酶， 故又称为辅酶 R。 0。
8、003 生物素是生物题生长发育必需的一种营养素， 它参与有机体多种主要的新陈代谢 活动。特别是对婴幼儿及孕产妇有着特殊的重要性 , 因此在婴幼儿乳制品、 孕产妇乳制品 及食品营养强化剂中添加生物素是十分必要的。其主要的性能与用途有 ： 构成视沉细胞内 感光物质 ； 维持上皮组织结构的完整和健全 ； 增强机体免疫反应和抵抗力和维持正常生长 发育。 0004 生物素主要来源于牛奶、 牛肝、 蛋黄、 动物肾脏、 草莓、 柚子、 葡萄等水果中， 此外， 瘦肉、 糙米、 啤酒、 小麦中也含有生物素。 0005 近些年生物素的发展越来越受到关注， 检测的方法也比较多， 但每种检测方法的 原理， 时效， 以。
9、及针对的产品都各不相同， 故在实际应用上， 能针对样品的不同而选择合适 的生物素检测方法也是至关重要的。 0006 常用的生物素检测方法有很多， 主要包括微生物法、 高效液相色谱法、 酶联免疫 法、 荧光法等。 0007 其中微生物的方法是目前应用比较广泛的方法， 也是婴幼儿食品和乳品中游离生 物素国标检测方法中唯一的检测方法， 这个方法主要用于检测样品中生物素含量较少的情 况， 原理是利用生物素营养缺陷型菌株对生物素的特异性和灵敏性， 定量测定出试验中待 测物质的含量。在含有除待测物质以外的所有营养成分的培养基中， 微生物的生长与待测 物质含量呈线性关系， 根据透光率与标准工作曲线进行比较，。
10、 即可计算出试样中待测物质 的含量。 0008 选用上述传统的检测方式， 此方法虽然灵敏度高， 但该方法工作量大， 在用分光光 度计读数时要求漩涡混合后立即移入比色皿内进行读数， 并且要求每支试管的稳定时间相 同， 对操作者的熟练程度有较高的要求， 一次最多能检测1到3个培养管， 检测效率低， 也会 增加误差， 费时费力， 因此需要开发一种更简便和实用的检测方法。 发明内容 0009 本发明旨在克服现有技术中的不足之处， 提供一种简便、 高效的游离生物素的检 测方法。 0010 本发明提供的一种高灵敏度测试游离生物素的方法， 其特征在于 ： 利用植物乳杆 菌对游离生物素的特异性和灵敏性， 通过。
11、游离生物素的浓度与菌体的生长量和生长速度成 正比的关系， 根据吸光值与工作曲线进行比较， 即可算出试样中待测物的浓度 ； 其中， 吸光 说 明 书 CN 104330288 A 4 2/6 页 5 值为采用酶标仪测量培养后的液体获得的吸光度。 0011 其中， 本发明提供的一种高灵敏度测试游离生物素的方法， 其植物乳杆菌为 ATCC8014。 0012 另外， 本发明提供的一种高灵敏度测试游离生物素的方法， 还具备这样的特点， 即、 具体分析步骤如下所示 ： 步骤一、 接种菌悬液的制备 ； 步骤二、 样品的处理 ； 步骤三、 标 准曲线的制作 ； 步骤四、 待测液的制作 ； 步骤五、 灭菌 ；。
12、 步骤六、 接种 ； 步骤七、 培养 ； 步骤八、 分析测试 ； 其中， 在步骤七中将试管放入培养箱内， 36 1培养 19h 20h。 0013 此外， 在上述步骤八中具体地， 包括如下测试程序 : 0014 (1)、 对每支试管进行视觉检查， 接种空白试管 S1 内培养液应是澄清的， 若出现浑 浊， 则结果无效 ； 0015 (2)、 以接种空白孔 S1 做对照， 测定最高浓度标准曲线试管的吸光度， 两小时后重 新测定， 两次结果透光率差值若小于 2， 则取出全部检验管测其吸光度 A ； 0016 (3)、 以接种空白试管 S2 为空白， 调节吸光度为 0， 一次读出其他每支试管的吸光 度。
13、 A， 样品空白的吸光度 A 一并读出 ； 0017 (4)、 充分混合每一支试管后， 立即将培养液移入96孔板中， 每孔200uL,每个试管 读数前摇匀样液， 于 660nm 波长下读吸光值 ； 0018 上述混合过程， 优选用漩涡混合器充分混合每一支试管， 之后还可根据需要加入 一滴消泡剂。 0019 (5)、 对每个编号的待测液孔， 用每个孔的吸光度值计算每毫升该编号待测液生物 素的含量， 并计算该编号待测液的生物素含量平均值。每支试管测得的该浓度不得超过该 平均值的 15， 超过者要舍去， 如果符合该要求的孔少于所有四个编号待测液总孔数的 2/3， 需要重新检验 ； 如果符合该要求的孔。
14、数大于等于原来孔数的 2/3， 重新计算每一编号 的有效试样孔中每毫升测定液生物素含量的平均值， 以此平均值计算全部编号试样孔的总 平均值， 用于计算试样中的生物素含量。 0020 上述方法主要应用于测定婴幼儿食品和乳品中的游离生物素。 0021 本发明的作用和效果 0022 本发明提供了一种检测生物素含量的方法。主要是对 “GB5413.19-2010 婴幼儿食 品和乳品中游离生物素的测定” 方法进行了改进发明， 用 96 孔板代替传统的比色皿进行读 数， 在读数时可以省去单支试管逐一读数所用的时间， 减少误差， 使该方法操作更简便和准 确， 节省人力和物力。 0023 另外， 本发明无须特。
15、别的培养方式即可施行， 操作简单， 限定条件少。 0024 此外， 还限定了具体的分析条件等参数， 能够更为准确、 快捷的测定婴幼儿食品中 的游离生物素。 附图说明 0025 附图 1 为分光光度计法测定读数曲线 ； 0026 附图 2 为酶标仪测定读数。 具体实施方式 说 明 书 CN 104330288 A 5 3/6 页 6 0027 1、 范围 0028 本方法适用于婴幼儿食品和乳品中游离生物素的测定。 0029 2、 原理 0030 利用植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum) 对游离生物素的特异性和灵敏性， 定量测定出试样中待测物质的含量。在含有除待测物质以外。
16、所有营养成分的培养基中， 微 生物的生长与待测物质含量呈线性关系， 根据透光率与标准工作曲线进行比较， 即可计算 出试样中待测物质的含量。 0031 3 试剂和材料 0032 除非另有规定， 本方法所用试剂均为分析纯， 水为 GB/T6682 规定的二级水。 0033 3.1 菌株 ： 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)， ATCC8014。 0034 3.2 生物素 (d-Biotin 或 Vitamin H) 标准品 (C10H16N2O3S) ： 纯度 99。 0035 3.3 培养基 0036 3.3.1 乳酸杆菌琼脂培养基。 0037 3.3.2 乳酸杆菌。
17、肉汤培养基。 0038 3.3.3 生物素测定用培养基。 0039 注 ： 一些商品化合成培养基效果良好， 商品化合成培养基按标签说明进行配制。 0040 3.4 乙醇溶液 (50 )。 0041 3.5 硫酸溶液 (3 ) ： 量取 3mL 硫酸加入到水中， 定容至 100mL。 0042 3.6 氢氧化钠溶液 (2.0mol/L) ： 称取 80g 氢氧化钠溶于 1000mL 水中。 0043 3.7 氯化钠溶液 (9g/L) ： 称取 9.0g 氯化钠溶解于 1000mL 水中， 分装试管， 每管 10mL。121灭菌 15min。 0044 3.8 标准溶液的制备 0045 3.8.1。
18、 生物素标准贮备液 (100g/mL) ： 称取生物素标准品 (3.2) 用乙醇溶液 (3.4) 定容至生物素浓度为 100g/mL， 贮于冰箱中。 0046 3.8.2 生物素标准中间液 (1g/mL) ： 吸取 1mL 生物素标准贮备液 (3.8.1)， 用乙 醇溶液 (3.4) 定容至 100mL。 0047 3.8.3 生物素标准工作液 (10ng/mL) ： 吸取 1mL 生物素标准中间液 (3.8.2)， 用乙 醇溶液 (3.4) 定容至 100mL。 0048 3.8.4 标准曲线工作液分两个浓度， 高浓度溶液的浓度为 0.2ng/mL ； 低浓度溶液 的浓度为0.1ng/mL。。
19、 从工作液中(3.8.3)吸取两次各5mL， 用水分别定容到250mL和500mL。 0049 注 ： 所有标准溶液要储存于冰箱内。3.8.1、 3.8.2、 和 3.8.3 保存期三个月， 3.8.4 临用前配制。 0050 4、 仪器和设备 0051 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外， 其他设备和材料如下 ： 0052 4.1 天平 ： 感量为 0.1mg。 0053 4.2 pH 计 ： 精度 0.02。 0054 4.3 分光光度计。 0055 4.4 涡旋混合器。 0056 4.5 离心机 ： 转速 2000 转 / 分钟。 说 明 书 CN 104330288 A 6 4/6 页。
20、 7 0057 4.6 恒温培养箱 ： 36 1。 0058 4.7 冰箱 ： 2 5。 0059 4.8 无菌吸管 ： 10mL( 具 0.1mL 刻度 ) 或微量移液器或吸头。 0060 4.9 瓶口分液器 ： 0mL 10mL。 0061 4.10 锥形瓶 ： 200mL。 0062 4.11 容量瓶 (A 类 ) ： 100mL， 250mL， 500mL。 0063 4.12 单刻度移液管 (A 类 ) ： 容量 5mL。 0064 4.13 漏斗 ： 直径 90mm。 0065 4.14 定量滤纸 ： 直径 90mm。 0066 4.15 试管 ： 18mm180mm。 0067 。
21、4.16 96 孔板。 0068 4.17 酶标仪。 0069 注 ： 玻璃仪器使用前， 用活性剂 ( 月桂磺酸钠或家用洗涤剂加入到洗涤用水中即 可 ) 对硬玻璃测定管及其他必要的玻璃器皿进行清洗， 清洗之后在 200干热 2h。 0070 5、 分析步骤 0071 5.1 接种菌悬液的制备 0072 5.1.1 将冻干菌株 (3.1) 活化后， 转接到乳酸杆菌琼脂培养基 (3.3.1) 中， 36 1培养过夜。再转接 2 3 代来增强活力。然后再将其从固体培养上转接到乳酸 杆菌肉汤培养基 (3.3.2) 中培养。 0073 5.1.2 将乳酸杆菌肉汤中的培养液以 2000 转 / 分钟离心 。
22、2min 3min， 倾出上清 液， 加入 10mL 氯化钠溶液 (3.7)， 混匀， 再离心 2min 3min， 如此清洗 3 次 4 次， 吸适量 该菌悬液于 10mL 盐水 (4.7) 中， 待测。 0074 5.1.3 用分光光度计以氯化钠溶液 (3.7) 做空白， 于 550nm 波长下测菌悬液 (5.1.2) 的透光率， 使其透光率在 60 80之间。 0075 5.2 样品的处理 0076 5.2.1 干粉样品 0077 称取一定量样品 ( 精确至 0.0001g) 于 250mL 三角瓶中， 该样品应含 0.2g 0.5g 生物素。继续 5.2.3 步骤。 0078 5.2.。
23、2 液体样品 0079 吸一定量的液体样品于250mL三角瓶中， 该样品应含0.2g0.5g生物素。 继 续 6.2.3 步骤。 0080 5.2.3 样品的提取 0081 加入硫酸溶液 (3.5)100mL， 121水解 30min， 冷却后用氢氧化钠溶液 (3.6) 调节 pH 至 4.50.2， 定量转到 250mL 容量瓶中， 用水定容， 充分混合。用滤纸过滤， 弃去最初的 几毫升。吸取滤液 5mL， 加入约 20mL 水， 用氢氧化钠溶液 (3.6) 调 pH 为 6.80.2, 定量转 到 100mL 容量瓶中， 用水定容。 0082 5.3 标准曲线的制作 0083 按表 1 顺。
24、序加入已灭菌的水、 标准曲线工作液 (3.8.4) 和生物素测定用培养基 (3.3.3) 于培养管中， 一式三份。 说 明 书 CN 104330288 A 7 5/6 页 8 0084 表 1 标准曲线的制作 0085 0086 5.4 待测液的制作 0087 按表 2 顺序加水、 样品溶液 (5.2.3) 和生物素测定用培养基 (3.3.3) 于培养管内， 一式三份。 0088 每份样品需带样品空白试管一只， 管内分别加入 5mL 待测液和 5mL 培养基。 0089 表 2 待测液的制作 0090 1234样品空白 水 (mL)43210 样品溶液 (mL)12345 培养基 (mL)5。
25、5355 0091 5.5 灭菌 0092 将 5.3 和 5.4 中所有的试管盖上试管帽， 放入灭菌锅内， 121灭菌 5min( 商品培 养基按标签说明进行灭菌 )。 0093 5.6 接种 0094 从灭菌锅内取出试管， 将试管迅速冷却至 30以下， 将接种菌悬液 (5.1.2) 用移 液枪向上述试管中各加 50uL， 其中标准曲线管中未接种空白 S1 和样品空白除外。 0095 5.7 培养 0096 将试管放入培养箱内， 36 1培养 19h 20h。 0097 5.8 对每支试管进行视觉检查， 接种空白试管 S1 内培养液应是澄清的， 若出现浑 浊， 则结果无效。 0098 5.8。
26、.1 以接种空白孔 S1 做对照， 测定最高浓度标准曲线试管的吸光度， 两小时后 重新测定。两次结果透光率差值若小于 2， 则取出全部检验管测其吸光度 A。 0099 5.8.2 以接种空白试管 S2 为空白， 调节吸光度为 0， 一次读出其他每支试管的吸 光度 A， 样品空白的吸光度 A 一并读出。 0100 5.8.3 用漩涡混合器充分混合每一支试管后 ( 也可加一滴消泡剂 ) 后， 立即用排 枪将培养液移入 96 孔板中， 每孔 200uL, 每个试管读数前摇匀样液， 于 660nm 波长下读吸光 值。以生物素标准品的含量为横坐标， 吸光值 A 为纵坐标作标准曲线。 0101 5.8.4。
27、 对每个编号的待测液孔， 用每个孔的吸光度值计算每毫升该编号待测液生 说 明 书 CN 104330288 A 8 6/6 页 9 物素的含量， 并计算该编号待测液的生物素含量平均值， 每支试管测得的该浓度不得超过 该平均值的 15， 超过者要舍去。如果符合该要求的孔少于所有四个编号待测液总孔数 的 2/3， 需要重新检验。如果符合该要求的孔数大于等于原来孔数的 2/3， 重新计算每一编 号的有效试样孔中每毫升测定液生物素含量的平均值， 以此平均值计算全部编号试样孔的 总平均值 Cx， 用于计算试样中的生物素含量。 0102 6 分析结果的表述 0103 试样中生物素的含量按下述公式进行计算 。
28、： 0104 0105 式中 ： 0106 X试样中生物素的含量， 单位为微克每百克 (g/100g) ； 0107 Cx5.8.4 中计算所得的总平均值， 单位为纳克 (ng) ； 0108 m试样的质量， 单位为克 (g) ； 0109 f稀释倍数。 0110 以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示， 结果保留两位有效 数字。 0111 7、 精密度 0112 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10。 0113 8、 其他 0114 本标准检出限为 20.0g/kg。 0115 9、 传统方法与本发明方法的结果分别如图 1 和图 2 所示。 说 明 书 CN 104330288 A 9 1/1 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104330288 A 10 。