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1、(10)申请公布号 CN 104342395 A (43)申请公布日 2015.02.11 CN 104342395 A (21)申请号 201410602510.6 (22)申请日 2014.10.31 CGMCC No.9502 2014.07.18 C12N 1/20(2006.01) A01N 63/00(2006.01) A01N 63/02(2006.01) A01P 3/00(2006.01) A01G 7/06(2006.01) C12R 1/10(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院农产品加工研究所 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路 2 号 (72)发明。
2、人 刘阳 赵月菊 邢福国 周露 王龑 (74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 11350 代理人 汤东凤 (54) 发明名称 一株高地芽孢杆菌及其在防治禾谷镰刀菌方 面的应用 (57) 摘要 本发明公开了一株高地芽孢杆菌及其在防治 禾谷镰刀菌方面的应用。本发明公开的一株高地 芽孢杆菌 (Bacillus altitudinis)， 其保藏编号 为 CGMCC No.9502。作为小麦赤霉病的生物防治 材料， 无论开发新的生物农药或者生物防治菌剂， 该菌都具有很好的应用前景。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1。
3、 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104342395 A CN 104342395 A 1/1 页 2 1.一株高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)， 其保藏编号为CGMCC No.9502或保藏 编号为 CGMCC No.9502 的高地芽孢杆菌的直接传代物。 2. 权利要求 1 所述的菌株在生物防治镰刀菌引起的植物病害中的应用。 3. 根据权利要求 2 所述的应用， 其特征在于 ： 所述镰刀菌为禾谷镰刀菌。 4. 根据权利要求 2 或 3 所述的应用， 其特征在于 ： 所述病。
4、害为镰刀菌引起的赤霉病或 穗腐病或根腐病。 5.根据权利要求2-4任一所述的应用， 其特征在于 ： 所述植物为谷物 ； 所述谷物为麦类 作物或玉米 ； 所述麦类作物具体为小麦。 6. 权利要求 1 所述的菌株在制备抑制镰刀菌的产品中的应用。 7. 一种防治镰刀菌引起的植物病害的方法， 是在植物生长过程中进行喷雾处理 ； 所述 喷雾为权利要求 1 所述的高地芽孢杆菌的菌悬液或发酵液或代谢产物。 8. 根据权利要求 7 所述的方法， 其特征在于 ： 所述镰刀菌为禾谷镰刀菌。 9. 根据权利要求 7 或 8 所述的方法， 其特征在于 ： 所述病害为赤霉病或穗腐病或根腐 病。 10. 根据权利要求 7。
5、-9 任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述植物为谷物 ； 所述谷物为麦 类作物或玉米 ； 所述麦类作物具体为小麦。 权 利 要 求 书 CN 104342395 A 2 1/4 页 3 一株高地芽孢杆菌及其在防治禾谷镰刀菌方面的应用 技术领域 0001 本发明涉及一株高地芽孢杆菌及其在防治禾谷镰刀菌方面的应用。 背景技术 0002 禾谷镰刀菌 (Fusarium graminearum) 是禾本科作物的重要病原菌之一， 可引起 麦类赤霉病 (Fusarium Head Blight， FHB)， 禾谷镰刀菌为限制小麦产量的一个主要因素 (Dubin,1997)。我国气候条件十分有利于麦类赤霉。
6、病的发生， 长江中下游地区常年病害造 成产量损失 10 -15， 大流行年份减产近 50 ( 黄昌等， 2000)。由于全球气候变暖以及 秸秆还田、 免耕栽培等耕作制度改变的影响， 我国麦类赤霉病的发生区域由长江流域迅速 向西北、 华北扩展 ( 张昊， 2011)， 特别是在 2008、 2010 和 2012 年， 全国麦类赤霉病发生十分 严重， 造成了严重的产粮损失和不良的社会影响， 严重威胁我国粮食安全。 0003 禾谷镰刀菌产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (DON， 3,7,15 三羟基 -12,13 环氧单端孢 霉-9烯-8酮)是存在于赤霉病菌感染麦粒中的主要天然毒素之一。 DON已被认定。
7、为最危险 的自然发生食品污染物之一， 被列入国际研究的优先地位(Larsen et al.,2004)。 DON可致 人免疫力下降、 贫血、 头痛、 腹痛、 恶心 ； 致动物拒食、 生长延滞和流产(Rocha et al.,2005 ； Sobrova et al.,2010 ； Pestka,2010)。DON 广泛存在并大量污染小麦及其制品， 对人畜构 成很大危害， 严重威胁我国食品安全。 0004 因此， 加强禾谷镰刀菌防控研究已成为保障我国粮食安全和食品安全的迫切需 求。 0005 多年来对麦类赤霉病防治主要依靠化学农药 , 但随着化学农药带来的环境问 题， 加之多年用药已导致病原菌抗。
8、药性禾谷镰刀菌菌株的出现 (Chang jun Chen et al.， 2007), 使防治难度加大。虽然在赤霉病抗性品质方面国内外投入大量的精力开展相关研 究， 但至今尚无理想的高抗小麦品种 ( 李正辉等， 2007)。 0006 生物防治不仅可降低对环境的影响， 还不易产生抗药性， 相关理论和技术的研究 日益为人们所关注。高地芽孢杆菌营养简单， 在自然界中广泛存在 , 对人畜无毒无害 , 不 污染环境 , 能产生多种抗菌素和酶 , 具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力， 较其他微生物 更具有开发为生物防控菌剂的潜力。 发明内容 0007 本发明的目的是提供一株高地芽孢杆菌及其在防治禾谷镰刀菌。
9、方面的应用。 0008 本发明提供的一株高地芽孢杆菌 (Bacillus altitudinis)， 其保藏编号为 CGMCC No.9502。 0009 上述菌株在生物防治镰刀菌引起的植物病害中的应用也属于本发明的保护范围。 0010 上述应用中， 所述镰刀菌为禾谷镰刀菌。 0011 上述任一所述的应用中， 所述病害为镰刀菌引起的赤霉病或穗腐病或根腐病。 0012 上述任一所述的应用中， 所述植物为谷物 ； 所述谷物为麦类作物或玉米 ； 所述麦 说 明 书 CN 104342395 A 3 2/4 页 4 类作物具体为小麦。 0013 上述菌株在制备抑制镰刀菌的产品中的应用也属于本发明的保护。
10、范围。 0014 一种防治镰刀菌引起的植物病害的方法也属于本发明的保护范围， 该方法是在植 物生长过程中进行喷雾处理 ； 所述喷雾为上述高地芽孢杆菌的菌悬液或发酵液或代谢产 物。 0015 上述方法中， 所述镰刀菌为禾谷镰刀菌。 0016 上述任一所述的方法中， 所述病害为赤霉病或穗腐病或根腐病。 0017 上述任一所述的方法中， 所述植物为谷物 ； 所述谷物为麦类作物或玉米 ； 所述麦 类作物具体为小麦。 0018 本发明提供的高地芽孢杆菌不仅在平板培养时可高效抑制禾谷镰刀菌， 而且在温 室实验中其防治效果高达 85.2。作为小麦赤霉病的生物防治材料， 无论开发新的生物农 药或者生物防治菌剂。
11、， 该菌都具有很好的应用前景。 附图说明 0019 图 1 为对峙培养实验。图 2 为挥发性气体抑菌实验。 具体实施方式 0020 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0021 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0022 NB 液体培养基 ： 由溶剂和溶质组成 ； 溶质为蛋白胨、 牛肉膏和 NaCl， 溶剂为水 ； 蛋 白胨在 NB 液体培养基中的浓度为 1， 牛肉膏在 NB 液体培养基中的浓度为 0.3， NaCl 在 NB 液体培养基中的浓度为 0.5， 所述均为质量体积百分比 (g/100ml)。 0023 NA固体培养基 。
12、： 在NB液体培养基中加入琼脂(琼脂与液体培养基的比例为1.5g ： 100ml)， 得到 NA 固体培养基。 0024 PDA培养基 ： 马铃薯200g,加入少量水煮20min， 三层纱布过滤， 取滤液用水定容至 1L， 加入 20g 葡萄糖， 15g 琼脂， 121高压灭菌 20min。 0025 绿豆汤培养基 ： 绿豆 10g， 加入少量水煮 20min， 三层纱布过滤， 取滤液用水定容至 1L， 分装后 121高压灭菌 20min。 0026 磷酸盐缓冲液 ： 由溶剂和溶质组成 ； 溶质为磷酸二氢钾和氯化镁， 溶剂为水 ； 磷酸二氢钾的浓度为 0.004 , 氯化镁的浓度为 0.019。
13、， 所述均为质量体积百分比 (g/100ml)。 0027 2216E 液体培养基和 2216E 琼脂由青岛高科因海博生物技术有限公司生产。 0028 禾谷镰刀菌 (Fusarium graminearum)FG1在文献 “杨慧勇 , 李飞凤 , 陆琼娴 , 徐 剑宏 , 史建荣 . 拮抗菌株 AFR0406 对小麦赤霉病菌和纹枯病菌的生物活性测定 . 江苏农业 科学， 2006(06),142-144.” 中公开过， 公众可从中国农业科学院农产品加工研究所获得。 0029 小麦石新828品种在文献 “孙志军， 杨晓丽， 张辉， 张广辉.小麦新品种石新828选 育过程及高产栽培技术 . 现代农。
14、业科技， 2011(09)， 96-97.” 中公开过， 公众可从中国农业 科学院农产品加工研究所获得。 0030 实施例 1、 菌的分离与鉴定 说 明 书 CN 104342395 A 4 3/4 页 5 0031 一、 菌的分离 0032 (一)2012年6月， 在超净工作台中， 将每10穗江苏采集的小麦病穗放在100ml无 菌蒸馏水中震荡 15 分钟制备菌悬液， 然后 80水浴处理 10 分钟。 0033 ( 二 ) 将菌悬液用无菌蒸馏水进行浓度梯度稀释后涂布在 NA 培养基平板上， 30 条件下培养 24 小时， 菌落布满整个平板， 用接种环挑取平板上形态、 大小、 颜色、 透明度不 。
15、同的菌株平板划线纯化， 点接纯化后的菌株应用于禾谷镰刀菌对峙培养实验。将得到的对 禾谷镰刀菌拮抗能力强的一株菌命名为 JS60J。 0034 二、 鉴定 0035 ( 一 ) 按照 “伯杰细菌鉴定手册” ( 第八版 ) 和 “常见细菌系统鉴定手册” ( 东秀 珠， 蔡妙英等编著， 北京 ： 科学出版社， 2001.2) 中描述的方法， 对菌株 JS60J 进行形态特征、 培养特性和生理生化特性鉴定， 具体结果如下 ： 0036 菌体的形态和生理生化特性 ： 0037 在 NA 培养基， 28培养 1 天， 菌体杆状， 直径约为 0.6-0.7m4.0-6.0m ； 菌落 奶白色， 圆形， 微凸。
16、， 边缘整齐。 0038 生理生化特征 ： 0039 氧化酶 ： + ； 精氨酸双水解酶 ： - ； 明胶水解 ： + ； 淀粉水解 ： + ； 过氧化氢酶 ： + ； 三 丁酸甘油脂水解 ： - ； 硝酸盐还原 ： - ； 七叶灵水解 ： + ； 酪素水解 ： - ； Tween80 水解 ： - ； 吲哚 实验 ： - ； 脲酶 ： - ； 柠檬酸利用 ： - ； H2S 生成 ： - ； VP 实验 ： - ； 厌氧生长 ： - ； 4 NaCl ： + ； 3 NaCl ： - ； 45 ： + ； pH5 ： +。 0040 产酸自甘油、 D- 核糖、 L- 木糖、 D- 葡萄糖、 。
17、D- 果糖、 D- 甘露糖、 L- 山梨糖、 L- 鼠李 糖、 卫矛醇、 肌醇、 甘露醇、 山梨醇、 - 甲基 -D- 葡萄糖苷、 N- 乙酰葡糖胺、 七叶灵、 水杨苷、 D- 纤维二糖、 D- 麦芽糖、 D- 蔗糖、 D- 海藻糖、 D- 棉籽糖、 淀粉、 D- 来苏糖。 0041 将菌株 JS60J 鉴定为高地芽孢杆菌 (Bacillus altitudinis)。该菌株已于 2014 年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC， 地址 ： 北 京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所， 邮编 100101)， 保藏号为 CGMCC 。
18、No.9502。 0042 实施例 2、 高地芽孢杆菌 JS60J 对禾谷镰刀菌的拮抗作用 0043 采用对峙培养法检测高地芽孢杆菌 JS60J 对禾谷镰刀菌的拮抗。 0044 一、 用 直 径 为 5mm 的 打 孔 器 在 培 养 好 的 病 原 真 菌 禾 谷 镰 刀 菌 (Fusarium graminearum)FG1菌落边缘打取菌盘， 用灭菌的牙签将菌盘挑入 PDA 平板中心。 0045 二、 在距PDA平板中心25mm处四点划线接种相同体积和浓度的JS60J， 以仅接种禾 谷镰刀菌菌盘的 PDA 平板为对照组， 28培养 4-5 天， 观察有无抑菌带形成。每个组做三个 平行。结果。
19、如表 1 所示。表明， JS60J 对禾谷镰刀菌有很强的抑制效果 ( 图 1)。 0046 表 1 培养 5 天后 JS60J 对禾谷镰刀菌的抑制作用 0047 0048 ( 抑菌带宽度是指病原菌边缘至拮抗菌株边缘的最短距离 ) 说 明 书 CN 104342395 A 5 4/4 页 6 0049 实施例 3、 JS60J 挥发性气体对禾谷镰刀菌的抑制效果 0050 采用对峙培养法检测高地芽孢杆菌 JS60J 产生的挥发性气体对禾谷镰刀菌的拮 抗。 0051 一、 用 直 径 为 5mm 的 打 孔 器 在 培 养 好 的 病 原 真 菌 禾 谷 镰 刀 菌 (Fusarium gramin。
20、earum)FG1菌落边缘打取菌盘， 用灭菌的牙签将菌盘挑入 PDA 平板中心。 0052 二、 在 NA 平板中心接种 JS60J， 倒扣于接有禾谷镰刀菌的平板， 以仅接种禾谷镰刀 菌菌盘的 PDA 平板为对照组， 28培养 4-5 天， 观察有无抑菌效果。每个组做三个平行。结 果如图 2 所示。表明， JS60J 可产生抑制禾谷镰刀菌的挥发性气体。 0053 实施例 4、 JS60J 对禾谷镰刀菌抑制效果的温室实验 0054 一、 将JS60J在2216E培养基中28振荡过夜培养， 采用磷酸盐缓冲液稀释至浓度 为 2108cfu/ml。 0055 二、 将禾谷镰刀菌FG1用绿豆汤培养基振荡。
21、培养(28， 5天)， 得到菌悬液， 采用磷 酸盐缓冲液稀释菌液浓度为 2105cfu/ml。 0056 三、 将稀释后的 JS60J 与禾谷镰刀菌 FG1依照 1:1 的比例混合， 终浓度分别为 108cfu/ml 和 105cfu/ml。 0057 四、 在石新 828 品种的扬花早期进行麦穗中部接种， 接菌体积为 10l， 作为实验 组。同时以仅含有禾谷镰刀菌的磷酸盐缓冲液作为阳性对照组， 以仅接种磷酸缓冲液的作 为阴性对照。每组设 10 个重复， 实验重复 3 次， 结果取平均值。 0058 禾谷镰刀菌菌悬液接种 16 天后， 观察麦穗的发病， 有麦穗干枯发白或发红， 内部 籽粒不饱满、 重量减轻表现的麦穗为发病麦穗。 0059 其中赤霉病指数发病率 发病指数 /100。 0060 表 2 JS60J 对禾谷镰刀菌的温室防治效果 0061 0062 结果如表 2 所示， 高地芽孢杆菌 JS60J 在温室条件下能很好防治禾谷镰刀菌引起 的小麦赤霉病。 说 明 书 CN 104342395 A 6 1/1 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104342395 A 7 。