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1、10申请公布号CN104087584A43申请公布日20141008CN104087584A21申请号201410345130922申请日20140721C12N15/11200601C12Q1/6820060171申请人张洁地址100101北京市朝阳区北辰西路1号院5号72发明人张洁陈骁张保卫王慧54发明名称尖嘴魟微卫星位点、引物及其用途57摘要本发明公开了尖嘴魟微卫星位点、引物及其用途，尖嘴魟微卫星位点包括10个稳定的多态性微卫星位点，其序列分别如SEQIDNO1SEQIDNO10所示。所述的尖嘴魟微卫星位点的引物，其序列分别如SEQIDNO11SEQIDNO30所示。所述的尖嘴魟微卫星位。
2、点或者所述的引物的用途，包括分子生态学研究，谱系分析，种质资源调查，辅助育种和个体识别，所述10对引物在15个尖嘴魟个体中的基因分型结果显示，等位基因数为324个，平均等位基因数为136个。期望杂合度HE为050984，观测杂合度HO为04291，表明这10对引物多态性高，可以满足尖嘴魟的个体识别。51INTCL权利要求书1页说明书8页序列表8页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书8页序列表8页附图2页10申请公布号CN104087584ACN104087584A1/1页21一种尖嘴魟微卫星位点，包括10个稳定的多态性微卫星位点，其序列分别如SEQIDN。
3、O1SEQIDNO10所示。2根据权利要求1所述的尖嘴魟微卫星位点的引物，其序列分别如SEQIDNO11SEQIDNO30所示。3权利要求1所述的尖嘴魟微卫星位点或者权利要求2所述的引物的用途，包括分子生态学研究，谱系分析，种质资源调查，辅助育种和个体识别，所述10个稳定的多态性微卫星位点组合使用，或者其对应的引物组合使用。权利要求书CN104087584A1/8页3尖嘴魟微卫星位点、引物及其用途技术领域0001本发明涉及，尤其涉及的是一种尖嘴魟微卫星位点序列、引物及其用途。背景技术0002尖嘴魟DASYATISZUGEI隶属鲼形目、魟科，是一种生活在近海区域的软骨鱼。受到污染、过度捕捞、渔业。
4、养殖等影响，目前种群数量日益减少，亟待保护。对其保护需要了解其种群结构及遗传背景等遗传学信息，目前国内尚没有开展软骨鱼的分子遗传学研究。发明内容0003本发明针对现有技术的不足，首次提供尖嘴魟的微卫星位点及引物，也是目前国内首次针对软骨鱼类的分子遗传学研究结果。0004本发明的技术方案如下0005尖嘴魟微卫星位点，包括10个稳定的多态性微卫星位点，其序列分别如SEQIDNO1SEQIDNO10所示。0006所述的尖嘴魟微卫星位点的引物，其序列分别如SEQIDNO11SEQIDNO30所示。0007所述的尖嘴魟微卫星位点或者所述的引物的用途，包括分子生态学研究，谱系分析，种质资源调查，辅助育种和。
5、个体识别，所述10个稳定的多态性微卫星位点组合使用，或者其对应的引物组合使用。0008所述10对引物在15个尖嘴魟个体中的基因分型结果显示，等位基因数为324个，平均等位基因数为136个。期望杂合度HE为050984，观测杂合度HO为04291，表明这10对引物多态性高，可以满足尖嘴魟的个体识别。附图说明0009图1尖嘴魟DNA1琼脂糖EB凝胶电泳结果；MTRANS2KDNAMARKER；14尖嘴魟全基因组DNA；Y空白对照；0010图2AFLP扩增产物1琼脂糖EB凝胶电泳结果；MTRANS2KDNAMARKER；18AFLP扩增产物；Y空白对照；0011图3菌落PCR2琼脂糖EB凝胶电泳结果。
6、；MTRANS2KDNAMARKER同图2；18菌落PCR结果，其中2、6、7和8号为双带，被认为阳性重组子；Y空白对照；具体实施方式0012以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。00131、DNA抽提0014利用尖嘴魟肌肉组织，提取基因组DNA。抽提方法采用SDS/蛋白酶K裂解、酚氯仿抽提途径SAMBROOKETAL，1999。DNA抽提效果见图1展示部分说明书CN104087584A2/8页400152、尖嘴魟微卫星富集文库的构建0016取基因组DNA250NG左右，使用限制性内切酶MSEI打断，同时与MSEI的AFLP受体接头5TACTCAGGACTCAT3/5GACGATGAGTC。
7、CTGAG3进行连接。将消化产物稀释十倍以后，使用AFLP受体特异的引物5GATGAGTCCTGAGTAAN3，简称MSEIN进行PCR扩增。扩增产物使用1琼脂糖EB凝胶检测，结果为大于200BP的弥散带，见图2。0017分别使用带有生物素接头的探针AC12和AG12与上述PCR扩增片段进行杂交后，使用链霉亲和素磁珠进行吸附洗脱，以获得所需的单链微卫星重复序列。以捕获的DNA为模板，以MSEIN为引物进行双链DNA恢复。PCR产物经PCR清洁试剂盒AXYGEN纯化，并用1琼脂糖EB凝胶检测，结果为大于200BP的弥散带则视为成功。0018将纯化后的双链恢复产物与PEASYT1SIMPLECLO。
8、NINGVECTORTRANSGENBIOTECH连接后转化于TRANS5CHEMICALLYCOMPETENTCELLSTRANSGENBIOTECH中。将已转化的感受态细胞涂布于添加05MMIPTG和05G/MLXGAL含006MG/ML氨苄AMP的LB固体培养基平板上，在恒温培养箱中37培养13H，得到包含AC、AG两种重复的微卫星文库。00193、阳性克隆的筛选、测序及引物设计0020挑取白色饱满的菌落置于AMPLB液体培养基中扩大培养37，5H。采用三引物PCR法ZANEETAL，2002检测含有微卫星片段的阳性重组子。实验中选用M13载体通用引物M1347和克隆对应的无生物素标记的。
9、探针AC12/AG12进行反应。如果产物在2琼脂糖EB凝胶电泳结果中出现两条或两条以上的条带，则认为该单克隆含有目的序列，见图3展示部分。通过三引物法成功检验出有目的序列的阳性重组子107个，对这些重组子的质粒使用M13通用引物进行测序。00214、序列分析、引物设计及微卫星位点的初步筛选0022检查测序结果，去除M13的载体序列后，使用TRF软件TANDEMREPEATSFINDER，VERSION321寻找其中含有微卫星重复单元的序列BENSON，1999。使用PRIMER5软件LALITHA，2000；SINGHETAL，1998在重复单元序列上、下游的侧翼序列中设计引物，将目的片段设置。
10、为100400BP之间。共选择28个微卫星重复位点作为备选标记。00235、基因分型数据的读取和微卫星位点的获得0024对初选出的28个微卫星位点的单侧引物5端加上荧光基团标记FAM/HEX/TAMRA，然后使用15个尖嘴魟个体的DNA对上述微卫星位点进行扩增筛选。首先对待选位点的PCR进行扩增条件的优化，循环设置为95预变性5MIN；95变性30SEC，48到60中选择8个温度梯度退火30SEC，72延伸60SEC，反应30个循环；72延伸10MIN。扩增产物使用2琼脂糖EB凝胶电泳检测，确定出最合适的引物退火温度。排除出现以下情况的备选位点在8个温度梯度中均未得到清晰的单一条带；扩增结果不。
11、稳定，在不同个体中不具有重复性。对具有稳定单一条带的扩增产物使用TAMARA500荧光分子量标准在ABI3730DNA测序仪中使用聚丙烯酰胺凝胶进行基因分型，基因分析的结果使用GENESCAN20软件进行读取。基因分型结果经过分析后，去除出现下列情况的备选位点无基因分型结果的位点；在任一个体中等位基因数在两个以上的位点；在15个野生尖嘴魟中等位基因在两个以下的位点。经过筛选后，最终获得10个稳定的多态性微卫星位点，微卫星序列如下所说明书CN104087584A3/8页5示0025DZUI25291BP0026ACATTGAATGACATTTAGAAATGGGAACAGAAGTGCTTGTCAG。
12、CCAACCATGAGTCTTCTTTAGATAACAGCAACAACAAACAGCAAAACAGCAAACCAGATCCTTTCCCACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACCACACACACACACACTCACACACACACACTCACACACACACACATACACACACACACACACACACAGGCTATTATTTATACAAAATAGCATAGAAAGAAAGAGGCATTTATTCTCTTTTCACTCCTCACTCCT0027DZUI45520BP0028ATGGTGAAACTGAAGGAGCTGGACTTGGTGGGG。
13、ATCACGCTATTGCCTGTGTTGGAGAGGCCTCGGTGTGCGAAGGTGGTGTGTAGTCCAACAGCGAGTGACTGTCTTAGTTGCTTGTCTTGTGATCACAAGACCCTGTTGGAAGTTGTTGGTGTGGAGCGCTGCAAGTCCAATTCCTGATTTATTGGCGGGGGGCGGGGGAGCTGCGTGGCCTCTGACCTGGCGAGGAGTGGGCCTCAAGCCGCAGTGTTGCCTGTTTACAGACACCCAGGAGAGAGGCATTGGAGTCGGAGGCGGCGTCAGAGCTGAAGCTGGGTGCTGCCATCTAGTGTT。
14、TGCCCAGCAGAATACAAGGTGCATGTTCGACTGCAACTGCTGCAGCATTAGCGGACTCACAGCCTTGGACTATTGTGTGTGTGTCTGTGTGTGTGTGTCTGTGTGTGTGTCTGTGTGTGATTGTCGGTACTGTGTCTTGGCCCCAGTACTAGCAACACTTTTGTTTGTCTGTAAACCTGGATATGGT0029DZUI31569BP0030ACTCCACCCTGCCACTTTCCCACTTGGCACAAGCTGCCATCACCCCTCCTCAGTCTGCCTATCATAGTTGCTGCATGTTTTACCTCTCCCGCTC。
15、TCCTCTTTACACTGGCCATCTTACCTCTCCAATCCTGGTCGTGACACAGGGTTTTGACCCAAAATGCCAGACCCCAGTTCCTCGATACACACAGATACTGCTTGATCACTGAGTTCATGCATCTGCATTCCGTCATATTGTAATGTGTGCGAGCAATATCTGATAACAGCATCTCCAGTGACATTGGGGGAGTGAGGGAAGTACTAACTTTCCAATGGGGCATAAATCAAGGGGATTTACAAATACAGTCTTGTGCAAAAGTCTTACACACACACACACACACACACACACACACACAGA。
16、GAGCTAGGGTTTGTAAGACTTTATCTGGCAGGAGCAAAGGATGTTGGGAATGGTGAGGGTGGAGGACTGTAGGACTGGTGGTAGAGAGGAGTGACAAGACTGGGAGGGTGGTGCAGGTGCAGACACACCCAGCCCTGAGACACCAGGCAAGGTCATTTGATTCTAAACAATTGGT0031DZUI46472BP0032CGTTATGTAGGCAGTCCTGGAAACAAAGTTATAGAGAAATATCAGACAGAGGCAAAATACTTAGATGAGTCATTCCTTCAATGTCATCATTTTGCTCTTACTTTGA。
17、TCGCTGAAATCTCCGGAGAAGTTGGTGAGGTATATTTCATGTACCACAGTGGCAGAAATCGCTGCTTTCCTTCTCTTTGTGATACAGAATACATCCGTTTGATCCGTCAGAACCATGCAGGCCCCCGACGGAGGGATTACTTACTCTCCTCACTCTATTTTTTCTGTATCCCTGTAGTTCTGCCCTCTCTCTCTCTCACACACACTCTCTCTCTCTCTCTCACACACACACTCTCTCTCTCTCTCTCACACACACACATCCTACACACACACACACACACACACACACACACTCACACTC。
18、ACACAGACACACACACACACACACACAAATATCCATGCCTCTTTGATTGTTTGCTGCTATGGAGAT0033DZUI51430BP0034CCCACCATGGGCAATAGAAAAGTCACTGTTGCAAACAGTGCAGCGAGCAACACTGTCATTATTTTTTACCCCTATTAGGCAGGGGTACACTTCGGTGTAGTCTGGGGTGAAGTATGTTTTATATTTTCATTTTTTGGAACACTTTGCCATGGTTCATGTTTTCTCTCTTACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAC。
19、ACACACCGCATATACTGTAGCAGAGGTCCCAATACAGACTGGTTACAGACCTCCAGCCAGAACCACTACCATTGACAGCTACTTTCTATCTTCTATGGTCTGAGTCCAACATCCAAGTCACTGCAGATTGCATGCATCCTTTTCTCTGCATGAGCCCTCCATGAGGGACCTGATCGAATAGGTTACTAAAATCCATGTAGACAACATCCTTACCT0035DZUI57720BP说明书CN104087584A4/8页60036TGCCAAACAAAGTCACCCTCACTTTCCAAAACAAGAGAAAATCTGC。
20、AGATGCTCAAAATCCAAGCAACACACACACACACACACACACACACACACACACACAAAATGCTGCAGGAACTCTGCAGGCTAGGTAGCATCCATGGAAAATAATAAACAGTCGATGCTTCTGGCCAAGACTCCTTCGGCGCCCTCAGTTTCCCTCTGGATTTCACCCCAAGGGTTCAGGGAGTGATGATGGTTAGAACTGTTGGTCCTGAAACCCAAACCGTTTATACTGAGTAAATGCCTCGTCGCCATTGTCATTACTTTGCTAATGACTGAGGACAGACCAATCAGGTGCTAAATA。
21、GGTACATAATGGGTCTGTCATGTTTCTGTGATCAGAACTTATCTCAGAAGCTTTATGCATGGTTGGGCAAATGTCAGTGCTGTAACTACACTGGACAGCTTGGCTAGAGATGCGACTAATACTGGAATAGAAACCTTCACCACTGCAATGGTTTCCCTTTGCCCTGTCTTATAGCCTTTACTGCATCCTGCGCCTCTTGGCCGTTTCTTGGAGTGAAATGAGTGAGCTAAATCCTGGATACCAAGACAGCAGCTATCCCCAGGAGAAAGCATTTACTTTGAATGAAGATCGCTGTACATG。
22、GACTTATCAAAAGATGTTTGCAAATGCTGGAACAATACAAGTTTCTAACACTTAGATCAAAAGATTTTTTTTGT0037DZUI71811BP0038ACTAACTAATGCCACATAAATACTGCATGATTATTTATCCCCTCGTGTGGCCAGTAGTCATCCGCCATCATCTACAAATGGCCATTGAGATTCTTTTGACATAGGGAGGCCATTACCTCAAGGATTTGGCAGAGCAAGATCTTGGCAACAAGATCCAAAATGGTCAAACTGGCTCGGCTACACACACACACACACACACACACACAC。
23、ACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAAATTCCACCTAACTGCCCCCCATCTGTCAGACACTACCCTCTCAACTTCCTCCCCTTTCACTTGACCCCTTCCTTTCTCCCTCTTTCTTCTTCCGAATCCGGCCTCCTCCTCTCCATTTGCCAGGAGCCTGCTCCCTCTGATAATCACAGGTGTTCAGTTTATTAGTGTCTGCTTCCCAACTGCACGATACTTCCCCATTACAACTGGT。
24、CCCCAAAGTTACACCACCGCAGAATTTCTGAAATTTCCCCAGAAAACCACAGGATGTTCTGCAAGTGACTACCCAAAGCCGCTCAACGTTGGCAGATGGTGGTTTCTTGGTGCTCTGTTGGTGGAGGACATGTGGGTTTTGAGGGAAAGGGTAGTGTGTGGAAGGCAGAGTTTAAGATCATTGTATATGCTGAGCGATCCGATGATGAGCAATGAGGGACCCTCACTCCTGCAGAATGTAATCTCCTTCACAGTTAGGACTTACCAAAACCTTCACAGAGAGCTGAAAGAATGTTTGGTT。
25、TTGT0039DZUI82352BP0040CAAATAAAGGCGCCCTATACACACAGACAAGCTAAATCACACACACACACACACAATCTATAAATATTCTCTCTCCCTCACTCACTCACTCACACACATACACTACAGACATAGGCAGACTATCTCTCTTTTTCACCCACCTATCCCACCCCCTCTATACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAGTTGGAAGGAGACACAAATGAAATATAACGGGAAGTAACTCAATACAACTCTATCTTCGTTTATCACAGA。
26、CACAATGGGACGAACCGTCTCCTCTGTGTGCGTCGGATTTCAAATATACAGAGATGCGTACACGATAAACCAGAT0041DZUII15410BP0042GGATAGTTCACGATAATACGGTATATATCCTGGAATGTAGAACGCAGCGGTACAACAGGTGGTGCTGCTGCATGACCTCCAGTGTCTAGCATTTGACCCTGACTTTGGATGCAAACTGTCTCCCTGTAGCTGCAAGGGTTTCTGCCAGATGCACTGCATTCCTGCCTTATCCCAAAGTTGTGCTGGCAGGTTAGCTGGCTGTTGT。
27、AAATTGCCGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGTGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGTGTGTGTGTGTGTTGGCACGTGGCCTAGTGGGCAAGGCATCAGACTAGTAACCTGAAGGTCACAGGTTCAAGCCTCAGCTGAGGCAGCGAGTGTGTGTCCTTGAGCAAGGCAGT0043DZUII64649BP0044CTATTTATGCCTGCCAGCATCTTTTATATCTACTTCTATACATGTAACTGTTCAGTATTTTTCCCAGTGGTCGCA。
28、GGATACATATATAAATGTTCTGCATTTCTCCTACTGATTACATTTGTATCATTCTGGAAAGCTCTGGAAGTTTCTCCGGTGTTGCATTATTTGTATAGGGGCTATCTGATTGGTTGACTCTTATCTACAGATTTGAATGAAATGTTCC说明书CN104087584A5/8页7TCATCTATGGGGGTTCAAAAAGCTCCTTGCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCCCTCTCTCTCTCTCCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCCTCTGCCCCTCTTACTGCCGGATTTCAATTTTCTTTCTTTCATT。
29、AGTGCTCCATAAAATGACAGGGAGGCAAGAAGTTTTGTGCCTCTTCCTGACTTCCGAAAGAATCTTGGATAAAATATATCAGAGTCCACGTGACACTGTCTGAGCGGAGCTTGTGCGTCCCCCCCAGGACCACGACGGTTCCCTCTGGGTTCTCTGGATCGCCCCTACTTCCGAAGACATACGGATTCAAGTTGGTCCGGTGGCATTGTGAACATTCTTTGCTGTGATTCGCCCTCCGAACAGTCTGTGTCAGTGGTGACTCACCGAGTGCCTCCTCCATTCATCCCTGTCGGT004510。
30、个位点的引物序列如下表1所示0046表110个位点的引物序列00470048说明书CN104087584A6/8页8004910对引物在15个尖嘴魟个体中的基因分型结果如下表2所示0050表210对引物在15个尖嘴魟个体中的基因分型结果0051样品IDDZUI25DZUI45DZUI31DZUI46DZUI51DZUI57DZUI71DZUI82DZUII15DZUII64DZR01198201218375386250236174270304198213272381386252258184288306DZR02216233238365386230244184178234220237244379。
31、386230246194226234说明书CN104087584A7/8页90052DZR03198233206381386230242144182256216245282385386256244148226256DZR042182192063753862302381381822562182432663913862502441482762562010G11842112083693862302401701842761922612643873882462461781922722010G218423320637338824025013618827218824320839739624225814426。
32、02762010G31422112384033862302441741942741662232744853962302461782182802010G41422112183733862302361601841662612203733962362441682182010G51441872063793862362361441962801482112743733882442441622682742010B32113732422421601822482433792462461662022682010B417820121438338622824013025824817820124439138622825。
33、01462622682010B51962112203913862302422001903441962432743953962482482022063562010B61642112423833962302461781802801642432423873962482481801923082010B7174187230373386230238178214344说明书CN104087584A8/8页101842232504013862542422043063562010B820218722238938624625015425625023022125638938625225818227828000530。
34、054分型数据经分析后，等位基因数为324个，平均等位基因数为136个。期望杂合度HE为050984，观测杂合度HO为04291，这表明这10对引物多态性高，可以满足尖嘴魟的个体识别。具体结果如下表3所示0055表300560057应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。说明书CN104087584A101/8页1100010002序列表CN104087584A112/8页120003序列表CN104087584A123/8页130004序列表CN104087584A134/8页140005序列表CN104087584A145/8页150006序列表CN104087584A156/8页160007序列表CN104087584A167/8页170008序列表CN104087584A178/8页18序列表CN104087584A181/2页19图1图2说明书附图CN104087584A192/2页20图3说明书附图CN104087584A20。