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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410767029.2 (22)申请日 2014.12.11 G01N 30/88(2006.01) (71)申请人 广西万寿堂药业有限公司 地址 530219 广西壮族自治区南宁市大沙田 经济开发区荣光南路 1 号 (72)发明人 蒋冰清 罗盛东 陈良 (74)专利代理机构 广西南宁公平专利事务所有 限责任公司 45104 代理人 杨立华 (54) 发明名称 壮药材滇桂艾纳香 HPLC 指纹图谱的建立方 法 (57) 摘要 本发明公开了一种壮药材滇桂艾纳香 HPLC 指纹图谱的建立方法， 采用高效液相色谱， 以滇桂 艾纳香中的主要。
2、成分原儿茶酸和原儿茶醛为参照 物， 据此获得了壮药滇桂艾纳香药材共有模式的 指纹图谱。指纹图谱共有色谱峰 13 个， 它能充分 反应滇桂艾纳香药材中的化学成分， 信息量丰富， 方法重现性良好， 对控制药材质量和鉴别药材优 劣提供了更有力的理论依据， 提高了壮药滇桂艾 纳香药材的质量控制和真伪鉴别的水平， 实现了 快速、 准确地鉴别滇桂艾纳香的真伪优劣。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104458993 A (43)申请公布日 2015.03.25 CN 104458993 A 。
3、1/1 页 2 1.一种壮药材滇桂艾纳香 HPLC 指纹图谱的建立方法， 其特征在于包括以下步骤 ： (1) 制备对照品溶液 ： 加甲醇配制成每 1ml 分别含原儿茶酸、 原儿茶醛 25g 的混合对 照品溶液 ； (2) 供试品溶液的制备 ： 精密称取壮药滇桂艾纳香药材粗粉， 加水浸泡后， 煎煮 3 次， 每 次 1.5h， 滤过， 合并滤液并浓缩至约 40ml， 用稀盐酸调 pH 后， 用乙醚萃取， 合并乙醚液蒸干 后用甲醇溶解残渣， 滤过， 即可 ； (3) 色谱条件 ： 色谱柱以十八烷基键合硅胶为填料， 采用梯度洗脱， 流动相为甲醇与冰 醋酸组成的梯度洗脱液， 紫外检测 ： 波长为 20。
4、0 300nm ； (4) 测定 ： 精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪， 照高效液相色谱法测定， 得到指 纹图谱。 2.根据权利要求1所述的壮药材滇桂艾纳香HPLC指纹图谱的建立方法， 其特征在于步 骤(2)按以下操作进行 ： 精密称取滇桂艾纳香药材粗粉约28g， 精密稳定， 加水煎煮3次， 每次加水 200ml 煎煮 1.5h， 其中第一次加水 200ml， 先浸泡 10 40min 后， 煎煮 ； 滤过， 合并 3 次煎煮的滤液并浓缩至约 40ml， 放冷， 用稀盐酸调 pH 2-3， 用乙醚萃取 4 次， 合并乙醚 液， 蒸干， 残渣加甲醇适量溶解， 并转移至 10ml 的量瓶中， 。
5、加甲醇至刻度， 摇匀， 滤过， 即可。 3.根据权利要求2所述的壮药材滇桂艾纳香HPLC指纹图谱的建立方法， 其特征在于步 骤 (2) 按以下操作进行 ： 精密称取滇桂艾纳香药材粗粉约 5g， 精密稳定， 加水煎煮 3 次， 每 次加水 200ml 煎煮 1.5h， 其中第一次加水 200ml， 先浸泡 30min 后， 煎煮 ； 滤过， 合并 3 次煎 煮的滤液并浓缩至约 40ml， 放冷， 用稀盐酸调 pH 2-3， 用乙醚萃取 4 次， 每次 20ml、 15ml、 15ml、 15ml， 合并乙醚液， 蒸干， 残渣加甲醇适量溶解， 并转移至 10ml 的量瓶中， 加甲醇至刻 度， 摇匀。
6、， 用 0.45m 微孔滤膜滤过， 取续液即可。 4.根据权利要求 1 所述的壮药材滇桂艾纳香 HPLC 指纹图谱的建立方法， 其特征在于 步骤 (3) 的色谱条件为 ： 色谱柱以十八烷基键合硅胶为填料， 采用梯度洗脱， 流动相为 1 的冰醋酸(色谱用)与甲醇组成的梯度洗脱液， 柱温25， 紫外检测 ： 波长为256nm， 流速为 1.0ml/min， 分析时间为 85min。 5.根据权利要求 4 所述的壮药材滇桂艾纳香 HPLC 指纹图谱的建立方法， 其特征在 于 ： 所述梯度洗脱的程序设为时间梯度0min4min10min20min35min40min85m in ； 对应的梯度洗脱液按。
7、以下体积比由流动相A甲醇和流动相B1冰醋酸组成， 流动相A的 体积百分数梯度10101823254040， 流动相B的体积百分数 梯度 90 90 82 77 75 60 60。 6.根据权利要求1所述的壮药材滇桂艾纳香HPLC指纹图谱的建立方法， 其特征在于步 骤 (4) 按以下操作进行 ： 精密吸取供试品溶液 10 20l 注入高效液相色谱仪， 照高效液 相色谱法测定， 得到指纹图谱。 7.根据权利要求 1 所述的壮药材滇桂艾纳香 HPLC 指纹图谱的建立方法， 其特征在于 ： 所述指纹图谱共有色谱峰有 13 个， 其保留时间分别为 5.919min、 14.515min、 17.867m。
8、in、 21.74min、 24.579min、 25.785min、 29.338min、 31.880min、 37.903min、 49.410min、 51.148min、 53.373min、 60.022min。 权 利 要 求 书 CN 104458993 A 2 1/6 页 3 壮药材滇桂艾纳香 HPLC 指纹图谱的建立方法 技术领域 0001 本发明属于药物分析中的中药材指纹图谱技术领域， 尤其涉及一种壮药材滇桂艾 纳香 HPLC 指纹图谱的建立方法。 背景技术 0002 滇桂艾纳香为菊科艾纳香属植物Blumea riparia(Bl)DC的干燥全草， 在广西尤其 是在百色地。
9、区有较长的使用历史。滇桂艾纳香主产于广西西南部 ( 百色、 德保、 凌云 )、 广 东南部、 云南西南至东南部， 具有活血、 止血、 利水的功效， 用于经期提前、 产后血崩、 产后浮 肿， 不孕症， 阴疮。 0003 中药指纹图谱是指中药材或中成药经光谱或色谱等现代分析技术得到的中药各 组分群体共有特征的图谱或图象。 中药指纹图谱是一种综合的、 可量化的鉴定手段， 它是建 立在中药化学成分系统研究的基础上， 主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真 实性、 优良性和稳定性。从中药全面质量控制的角度看， 高效液相色谱 (HPLC) 指纹图谱在 国际上容易获得认可， 包括美国、 英国、 法国、。
10、 加拿大、 德国、 日本和印度在内的许多国家更 愿意接受 HPLC 指纹图谱。 0004 近年来的生药学、 化学中记载的壮药滇桂艾纳香主要有性状鉴别、 显微鉴别及理 化鉴别方法， 其质量标准起草说明中也用到了薄层鉴别方法， 但这些方法都存在提供的信 息量小， 样品化学成分体现不完全， 可鉴别的成分数量较少等问题， 因而不能很好地代表壮 药滇桂艾纳香的整体质量。Leelakittisin Benjakarn 等 ( 滇桂艾纳香的高效液相色谱指 纹图谱的鉴别方法的研究， 中国临床新医学， 2014 年， 第 5 期 ) 对滇桂艾纳香指纹图谱鉴别 研究进行了有益尝试， 他采用原儿茶酸、 绿原酸为参照。
11、物进行标定， 共标定 11 个共有峰。 发明内容 0005 本发明要解决的技术问题是提供一种简便、 稳定、 精密度高、 重现性好的壮药材滇 桂艾纳香 HPLC 指纹图谱的建立方法， 以实现快速、 准确地鉴别滇桂艾纳香的真伪优劣。 0006 为解决上述技术问题， 本发明采用以下技术方案 ： 壮药材滇桂艾纳香 HPLC 指纹图 谱的建立方法， 包括以下步骤 ： 0007 (1) 制备对照品溶液 ： 加甲醇配制成每 1ml 分别含原儿茶酸、 原儿茶醛 25g 的混 合对照品溶液 ； 0008 (2) 供试品溶液的制备 ： 精密称取壮药滇桂艾纳香药材粗粉， 加水浸泡后， 煎煮 3 次， 每次1.5h，。
12、 滤过， 合并滤液并浓缩至约40ml， 用稀盐酸调pH后， 用乙醚萃取， 合并乙醚液 蒸干后用甲醇溶解残渣， 滤过， 即可 ； 0009 (3) 色谱条件 ： 色谱柱以十八烷基键合硅胶为填料， 采用梯度洗脱， 流动相为甲醇 与冰醋酸组成的梯度洗脱液， 紫外检测 ： 波长为 200 300nm ； 0010 (4) 测定 ： 精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪， 照高效液相色谱法测定， 得 到指纹图谱。 说 明 书 CN 104458993 A 3 2/6 页 4 0011 步骤 (2) 按以下操作进行 ： 精密称取滇桂艾纳香药材粗粉约 2 8g， 精密稳定， 加 水煎煮 3 次， 每次加水 。
13、200ml 煎煮 1.5h， 其中第一次加水 200ml， 先浸泡 10 40min 后， 煎 煮 ； 滤过， 合并 3 次煎煮的滤液并浓缩至约 40ml， 放冷， 用稀盐酸调 pH 2-3， 用乙醚萃取 4 次， 合并乙醚液， 蒸干， 残渣加甲醇适量溶解， 并转移至 10ml 的量瓶中， 加甲醇至刻度， 摇 匀， 滤过， 即可。 0012 步骤 (2) 按以下操作进行 ： 精密称取滇桂艾纳香药材粗粉约 5g， 精密稳定， 加水煎 煮 3 次， 每次加水 200ml 煎煮 1.5h， 其中第一次加水 200ml， 先浸泡 30min 后， 煎煮 ； 滤过， 合并 3 次煎煮的滤液并浓缩至约 4。
14、0ml， 放冷， 用稀盐酸调 pH 2-3， 用乙醚萃取 4 次， 每次 20ml、 15ml、 15ml、 15ml， 合并乙醚液， 蒸干， 残渣加甲醇适量溶解， 并转移至 10ml 的量瓶中， 加甲醇至刻度， 摇匀， 用 0.45m 微孔滤膜滤过， 取续液即可。 0013 步骤 (3) 的色谱条件为 ： 色谱柱以十八烷基键合硅胶为填料， 采用梯度洗脱， 流 动相为 1的冰醋酸 ( 色谱用 ) 与甲醇组成的梯度洗脱液， 柱温 25， 紫外检测 ： 波长为 256nm， 流速为 1.0ml/min， 分析时间为 85min。 0014 梯度洗脱的程序设为时间梯度0min4min10min20m。
15、in35min40min85m in ； 对应的梯度洗脱液按以下体积比由流动相A甲醇和流动相B1冰醋酸组成， 流动相A的 体积百分数梯度10101823254040， 流动相B的体积百分数 梯度 90 90 82 77 75 60 60。 0015 步骤 (4) 按以下操作进行 ： 精密吸取供试品溶液 10 20l 注入高效液相色谱 仪， 照高效液相色谱法测定， 得到指纹图谱。 0016 指 纹 图 谱 共 有 色 谱 峰 有 13 个， 其 保 留 时 间 分 别 为 5.919min、 14.515min、 17.867min、 21.74min、 24.579min、 25.785min。
16、、 29.338min、 31.880min、 37.903min、 49.410min、 51.148min、 53.373min、 60.022min。 0017 为提高壮药滇桂艾纳香药材的质量控制和真伪鉴别的水平， 发明人采用高效液相 色谱， 以滇桂艾纳香中的主要成分原儿茶酸和原儿茶醛为参照物， 研发了一种壮药材滇桂 艾纳香 HPLC 指纹图谱的建立方法， 据此获得了壮药滇桂艾纳香药材共有模式的指纹图谱， 指纹图谱共有色谱峰 13 个， 它能充分反应滇桂艾纳香药材中的化学成分， 信息量丰富， 方 法重现性良好， 对控制药材质量和鉴别药材优劣提供了更有力的理论依据。相对于现有技 术， 本发。
17、明具有以下突出优势 ： 0018 (1) 将不同产地和不同采集时间的壮药滇桂艾纳香药材， 在同一指纹图谱条件下 分别建立指纹图谱， 然后将其进行融合， 达到信息互补， 增加指纹图谱的信息量， 从而提高 其指纹鉴定能力， 以实现指纹图谱的全面和整体评价。 0019 (2) 供试品制备方便， 分析时间短， 色谱条件容易实现。 0020 (3) 方法简便、 稳定， 精密度高、 重现性好。 0021 (4) 适于对壮药滇桂艾纳香药材真伪、 产地和品质的鉴别和控制， 弥补了现有质量 控制技术的不足， 使滇桂艾纳香药材的质量控制更加完善和科学。 附图说明 0022 图 1 是对照品 HPLC 图谱， 图中。
18、 ： 1 原儿茶酸， 2 原儿茶醛。 0023 图 2 是壮药滇桂艾纳香药材的 HPLC 指纹图谱。 说 明 书 CN 104458993 A 4 3/6 页 5 0024 图 3 是各批壮药滇桂艾纳香药材的 HPLC 指纹图谱整合叠加图。 具体实施方式 0025 发明人将 13 批不同来源的滇桂艾纳香药材， 在同一指纹图谱条件下分别建立指 纹图谱， 然后将这些指纹图谱进行融合， 确定其共用指纹特征图， 增加指纹图谱的信息量， 从而提高其指纹鉴定能力， 以实现指纹图谱的全面和整体评价。为了更一步阐述本发明的 研究过程， 以下通过实例来说明。 0026 实施例 1 0027 1 实验材料和仪器 。
19、0028 1.1 药材 ： 产地及采收时间如表 1。 0029 表 1 滇桂艾纳香药材的产地及采收时间 0030 0031 0032 1.2 仪器 ： Agilent1100 高效液相色谱仪 ( 包括 G1311A 四元泵， G1313A 自动进样 器， G1314A VWD检测器， G1316A柱温箱， Agilengt1100色谱工作站(美国安捷伦科技公司) 电子分析天平 ： BP211D(德国赛多利斯) ； PS-60AL超声波清洗仪(40kHz， 360W) ；中药色谱 指纹图谱相似度评价系统 2004 年 A 版 ( 国家药典委员会 )。 0033 1.3 试 剂 ： 原 儿 茶 酸。
20、 对 照 品 ( 购 于 中 国 药 品 生 物 制 品 检 定 所 ) 批 号 110809-200604 ； 原儿茶醛对照品 ( 购于中国药品生物制品检定所 ) 批号 110810-200506， 流动相甲醇、 冰醋酸为色谱纯， 其它试剂都是分析纯。 0034 2 高效液相色谱 0035 2.1 色谱条件 ： 色谱柱以十八烷基硅烷合硅胶为填料 (SinoChrom ODS-BP 5um 的 依利特 ODS C18 色谱柱 4.6250mm) ； 采用梯度洗脱， 洗脱程序如表 2。 0036 表 2 色谱流动相洗脱程序 0037 说 明 书 CN 104458993 A 5 4/6 页 6 。
21、0038 流动相 A 为 ： 甲醇 ； 流动相 B 为 ： 1冰醋酸 ； 检测波长 256nm， 流速 1mL/min ； 柱温 25 ； 进样量 10l ； 检测时间为 85min， 理论塔板数以原儿茶酸、 原儿茶醛计应分别不低于 3000。 0039 2.2 对照品溶液的制备 ： 取原儿茶酸对照品 6.26mg、 原儿茶醛对照品 6.68mg， 分 别置 50ml 的容量瓶， 加甲醇溶解并定容， 制得浓度分别为原儿茶酸 0.1252mg/ml、 原儿茶醛 0.1336mg/ml的对照品储备液。 精密吸取原儿茶酸储备液5ml、 原儿茶醛储备液5ml置25ml 的容量瓶中， 用甲醇稀释至刻度，。
22、 即得原儿茶酸 25.04g/ml、 原儿茶醛 26.72g/ml 的混 合对照品溶液。 0040 2.3 供试品溶液的制备 ： 精密称取滇桂艾纳香药材粗粉约 5g， 精密稳定， 加水煎煮 3 次， 每次加水 200ml 煎煮 1.5h， 其中第一次加水 200ml， 先浸泡 30min 后， 煎煮 ； 滤过， 合并 3次煎煮的滤液并浓缩至约40ml， 放冷， 用稀盐酸调pH2-3， 用乙醚萃取4次(20ml、 15ml、 15ml、 15ml)， 合并乙醚液， 蒸干， 残渣加甲醇适量溶解， 并转移至 10ml 的量瓶中， 加甲醇至 刻度， 摇匀， 用 0.45m 微孔滤膜滤过， 取续液即得 。
23、； 0041 2.4 测定 ： 精密吸取供试品溶液与对照品溶液各 10l 注入高效液相色谱仪， 照高 效液相色谱法测定， 得到指纹图谱 ( 图 1、 图 2)。 0042 实施例 2 0043 取壮药滇桂艾纳香药材 13 批次， 按照实施例 1 的条件进行检测， 得到 13 批样品的 HPLC 指纹图谱的叠加图， 如图 3 所示。通过对这 13 批 HPLC 图谱的比较， 进行相识度评价， 确定其特征共有峰 ： 指纹图谱中有 13 个特征共有峰， 其保留时间、 峰面积的平均值以及占 总峰面积的比例汇总如下 ： 0044 1 号峰， 平均保留时间为 5.919min， RSD为 0.23， 峰面。
24、积为 294.446， RSD为 70.14 ； 占总峰面积的 4.027 ； 0045 2 号峰， 平均保留时间为 14.515min， RSD为 0.12， 峰面积为 960.173， RSD为 26.12 ； 占总峰面积的 13.131 ； 0046 3 号峰， 平均保留时间为 17.867min， RSD为 0.08， 峰面积为 305.170， RSD为 25.56 ； 占总峰面积的 4.172 ； 0047 4 号峰， 平均保留时间为 21.74min， RSD为 0.09， 峰面积为 251.465， RSD为 26.74 ； 占总峰面积的 3.439 ； 0048 5 号峰， 。
25、平均保留时间为 24.579min， RSD为 0.10， 峰面积为 173.950， RSD为 29.31 ； 占总峰面积的 2.379 ； 0049 6 号峰， 平均保留时间为 25.785min， RSD为 0.13， 峰面积为 163.555， RSD为 说 明 书 CN 104458993 A 6 5/6 页 7 44.38 ； 占总峰面积的 2.237 ； 0050 7号峰， 平均保留时间为29.338min， RSD为0.12， 峰面积为1625.124， RSD为 32.00 ； 占总峰面积的 22.225 ； 0051 8 号峰， 平均保留时间为 31.880min， RSD。
26、为 0.11， 峰面积为 89.740， RSD为 29.41 ； 占总峰面积的 1.227 ； 0052 9 号峰， 平均保留时间为 37.903min， RSD为 0.18， 峰面积为 151.487， RSD为 50.00 ； 占总峰面积的 2.072 ； 0053 10 号峰， 平均保留时间为 49.410min， RSD为 0.08， 峰面积为 1216.851， RSD 为 65.94 ； 占总峰面积的 16.641 ； 0054 11号峰， 平均保留时间为51.148min， RSD为0.11， 峰面积为715.884， RSD为 66.62 ； 占总峰面积的 9.790 ； 0。
27、055 12号峰， 平均保留时间为53.373min， RSD为0.14， 峰面积为163.202， RSD为 79.27 ； 占总峰面积的 2.232 ； 0056 13 号峰， 平均保留时间为 60.022min， RSD为 0.18， 峰面积为 1201.212， RSD 为 75.50 ； 占总峰面积的 16.428。 0057 可见， 壮药滇桂艾纳香药材的指纹图谱中有 13 个特征峰， 2 号为原儿茶酸参照峰， 3号为原儿茶醛参照峰， 图谱总长度为85min。 其中， 单峰面积超总峰面积1的峰有13个， 它们是 1 13 号峰 ； 单峰面积超总峰面积 5的峰有 5 个， 它们是 2 。
28、号峰、 7 号峰、 10 号峰、 11 号峰、 13 号峰 ； 单峰面积超总峰面积 10的峰有 4 个， 它们是 2 号峰、 7 号峰、 10 号峰、 13 号峰。 0058 相似度评价 ： 采用中国药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件 2004A 版， 对 HPLC 图谱进行综合评价， 相似度评价结果见表 3。 0059 表 3 HPLC 指纹图谱相似度评价 0060 S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13 相似度 0.974 0.917 0.944 0.953 0.986 0.900 0.991 0.923 0.948 0.936 0.964 0.957。
29、 0.965 0061 10 批壮药滇桂艾纳香药材的 HPLC 指纹图谱的相似度均大于 0.90。 0062 实施例 3 0063 1、 方法学考察 0064 1.1 精密度实验 0065 取编号为6号的供试品， 按实施例1中供试品溶液制备方法制备， 在上述色谱条件 下记录指纹图谱。结果表明， 各色谱图的相对保留时间 RSD 值为 0.068 0.204， 各峰 相对峰面积 RSD 值在 0.045 1.76。表明仪器的精密度良好。 0066 1.2 稳定性实验 0067 取编号为 6 号的供试品， 按实施例 1 供试品溶液制备方法制备， 在上述色谱条件 下， 分别在 0、 4、 8、 12、。
30、 16、 24h 检测指纹图谱， 考察实验方法的重复性。结果表明， 6 份样品 和色谱峰的相对保留时间 RSD 在 0.038 0.336， 各峰相对峰面积 RSD 值在 0.073 说 明 书 CN 104458993 A 7 6/6 页 8 1.35。 0068 1.3 重复性实验 0069 精密称取滇桂艾纳香药材粉末 (6 号药材 )6 份， 按实施例 1 供试品溶液制备方法 制备， 考察实验方法的重复性。 结果表明， 6份样品和色谱峰的相对保留时间RSD在0.042 0.212， 各峰相对峰面积 RSD 值在 0.081 2.26。 说 明 书 CN 104458993 A 8 1/2 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104458993 A 9 2/2 页 10 图 3 说 明 书 附 图 CN 104458993 A 10 。