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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410684970.8 (22)申请日 2014.11.25 G01N 21/64(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) (71)申请人 浙江农林大学 地址 311300 浙江省杭州市临安市锦城镇环 城北路 88 号 (72)发明人 宋厚辉 金庆日 杨梦华 邵春艳 程昌勇 王晓杜 杨杨 杨永春 卫芳芳 桂海娈 张亚军 方维焕 (74)专利代理机构 杭州中成专利事务所有限公 司 33212 代理人 周世骏 (54) 发明名称 基于非标记荧光染料和核酸适配体的检测生 物分子的方法 (57) 摘要 本发明涉及生物工程领域。
2、， 旨在提供一种基 于非标记荧光染料和核酸适配体的检测生物分子 的方法。该方法是将核酸适配体和待检测的生物 分子混合后， 加入与核酸适配体互补的寡核酸链 ； 核酸适配体与待检测的生物分子发生特异性结 合， 未结合的多余核酸适配体则与互补的寡核酸 链杂交生成双链DNA， 而双链DNA与非标记荧光染 料 PicoGreen 结合释放荧光 ； 不同浓度的待检测 的生物分子与固定浓度的核酸适配体结合时反应 液中的荧光强度不同， 通过检测荧光强度就能实 现对生物分子快速、 定量的检测。 本发明在提高检 测灵敏度和特异性的同时， 缩短了检测的时间， 仅 需 25-40 分钟 ； 对待检测物质的检测灵敏度可。
3、以 达到皮克 - 纳克水平 ； 本发明中使用的核酸适配 体可以方便合成， 成本低。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表3页 (10)申请公布号 CN 104458684 A (43)申请公布日 2015.03.25 CN 104458684 A 1/1 页 2 1. 基于非标记荧光染料和核酸适配体的检测生物分子的方法， 其特征在于， 是将核酸 适配体和待检测的生物分子混合后， 加入与核酸适配体互补的寡核酸链 ； 核酸适配体与待 检测的生物分子发生特异性结合， 未结合的多余核酸适配体则与互补的寡核酸链杂交生成 双。
4、链 DNA， 而双链 DNA 与非标记荧光染料 PicoGreen 结合释放荧光 ； 不同浓度的待检测的生 物分子与固定浓度的核酸适配体结合时反应液中的荧光强度不同， 通过检测荧光强度就能 实现对生物分子快速、 定量的检测。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 具体包括以下步骤 ： (1) 将核酸适配体分别与不同浓度的待检测生物分子的标准品在微孔板的孔板内混 匀， 缓冲液为 ： 10mmol/L Tris， 120mmol/L NaCl， 5mmol/L KCl， 20mmol/L CaCl2， pH 8.5 ； 反 应体系内核酸适配体的浓度为 0.1 10 纳摩尔 / 升 ；。
5、 反应时间为 5-10 分钟 ； (2) 加入与核酸适配体的序列互补的寡核酸链， 反应体系内寡核酸链的浓度为 0.1 10 纳摩尔 / 升 ； 反应时间为 5-10 分钟 ； (3) 加入非标记荧光染料 PicoGreen， 其在反应体系内浓度根据生产商的推荐值确定 ； 反应 15 分钟后， 用酶标仪或荧光分光光度计检测非标记荧光染料 PicoGreen 的荧光强度， 激发波长为 480nm， 发射波长为 520nm ； (4) 根据待检测生物分子的标准品浓度和非标记荧光染料 PicoGreen 释放的荧光强度 拟合曲线 ； (5) 以未知浓度的待检样品替换标准品， 按照步骤 (1)-(3) 。
6、进行操作， 检测非标记荧光 染料PicoGreen释放的荧光强度 ； 然后根据步骤(4)拟合的标准品的曲线， 计算待检样品的 浓度。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征在于， 所述待检测的生物分子是微生物、 蛋 白质、 多糖、 多肽、 毒素或化学药物中的任意一种。 权 利 要 求 书 CN 104458684 A 2 1/4 页 3 基于非标记荧光染料和核酸适配体的检测生物分子的方法 技术领域 0001 本发明属于生物工程领域， 具体涉及一种基于非标记荧光染料 PicoGreen 和核酸 适配体检测生物分子的快速检测方法。 背景技术 0002 微生物、 蛋白质、 多糖、 多肽。
7、、 毒素、 化学药物等生物分子的检测依据检测原理不同 可以分为 ： 基于抗原 - 抗反应技术的酶联免疫吸附试验法、 基于核酸扩增的聚合酶链式反 应技术的PCR和RT-PCR法、 基于侧向层析技术的胶体金法、 基于仪器分析技术的质谱、 色谱 法等。除了仪器分析方法之外， 其他各种方法虽然检测方法快速， 但是灵敏度和特异性低。 基于核酸扩增的聚合酶链式反应技术的PCR和RT-PCR法虽然检测灵敏度也高， 但是对于非 微生物类样品， 无法进行 PCR 或 RT-PCR 检测。 发明内容 0003 本发明要解决的技术问题是， 克服现有技术中的不足， 提供一种基于非标记荧光 染料和核酸适配体检测生物分子。
8、的方法。 0004 为解决技术问题， 本发明的解决方案是 ： 0005 提供一种基于非标记荧光染料和核酸适配体的检测生物分子的方法， 是利用非标 记荧光染料 PicoGreen 能特异性结合双链核苷酸且在结合后释放荧光， 而非标记荧光染料 PicoGreen 与单链核苷酸不结合且游离的 PicoGreen 无荧光的特性。将核酸适配体和待检 测的生物分子混合后， 加入与核酸适配体互补的寡核酸链 ； 核酸适配体与待检测的生物分 子发生特异性结合， 未结合的多余核酸适配体则与互补的寡核酸链杂交生成双链 DNA， 而双 链 DNA 与非标记荧光染料 PicoGreen 结合释放荧光 ； 不同浓度的待检。
9、测的生物分子与固定 浓度的核酸适配体结合时反应液中的荧光强度不同， 通过检测荧光强度就能实现对生物分 子快速、 定量的检测。 0006 本发明具体包括以下步骤 ： 0007 (1) 将核酸适配体分别与不同浓度的待检测生物分子的标准品在微孔板的孔板内 混匀 ； 缓冲液为 ： 10mmol/L Tris， 120mmol/L NaCl， 5mmol/L KCl， 20mmol/L CaCl2， pH8.5 ； 反应 5-10 分钟 ； 反应体系内核酸适配体的浓度为 0.1 10 纳摩尔 / 升 ； 0008 (2) 加入与核酸适配体的序列互补的寡核酸链， 反应体系内寡核酸链的浓度为 0.1 10 。
10、纳摩尔 / 升 ； 反应时间为 5-10 分钟 ； 0009 (3) 加入非标记荧光染料 PicoGreen ； 其在反应体系内浓度根据生产商的推荐值 确定 ； 反应 15 分钟后， 用酶标仪或荧光分光光度计检测非标记荧光染料 PicoGreen 的荧光 强度， 激发波长为 480nm， 发射波长为 520nm ； 0010 (4) 根据待检测生物分子的标准品浓度和非标记荧光染料 PicoGreen 释放的荧光 强度拟合曲线 ； 0011 (5) 以未知浓度的待检样品替换标准品， 按照步骤 (1)-(3) 进行操作， 检测非标记 说 明 书 CN 104458684 A 3 2/4 页 4 荧。
11、光染料PicoGreen释放的荧光强度 ； 然后根据步骤(4)拟合的标准品的曲线， 计算待检样 品的浓度。 0012 本发明中， 所述待检测的生物分子是微生物、 蛋白质、 多糖、 多肽、 毒素或化学药物 中的任意一种。 0013 非标记荧光染料 PicoGreen 是一种可以特异性与双链 DNA 结合的荧光染料， 可以 检测到皮克级的双链 DNA。单链的核酸不能结合 PicoGreen， 不产生荧光。 0014 核酸适配体又称适体(Aptamer)， 是一条约20100个核苷酸组成的单链、 寡核苷 酸， 最早于 20 世纪 90 年代由 Andrew D.Ellington 和 Jack W.。
12、Szostak 通过 “指数富集配体 系统进化技术” 体外筛选获得。 由于核酸适配体在范德华力、 碱基堆积力等作用下折叠形成 特殊的三级结构， 因此可以和特定的生物分子结合。 与传统的抗体相比， 寡核酸链具有制备 方便， 易修饰， 亲和力高， 稳定性好等特点， 在生物传感器、 荧光检测等方面得到广泛应用。 0015 本发明正是利用 PicoGreen 可以特异性结合皮克浓度的双链 DNA， 而核酸适配体 是单链这一特性， 设计了一种基于核酸适配体的、 非荧光标记的检测生物分子的方法， 检测 下限可以达到皮克和纳克水平。 0016 与现有技术相比， 本发明的有益效果是 ： 0017 本发明利用非。
13、标记荧光染料 PicoGreen 和核酸适配体技术， 开发了快速检测技 术， 在提高检测灵敏度和特异性的同时， 缩短了检测的时间， 仅需 25-40 分钟。 0018 本发明对待检测物质的检测灵敏度可以达到皮克 - 纳克水平 ； 本发明中使用的核 酸适配体可以方便合成， 成本低。 0019 相对于背景技术， 本发明具有高效、 简捷、 快速、 方便、 适用广等优点。 具体实施方式 0020 发明原理介绍 ： 0021 本发明通过在反应体系中加入核酸适配体和待检测的生物分子， 然后再加入与核 酸适配体互补的寡核酸链。核酸适配体与待检测的生物分子将发生特异性结合， 而溶液中 多余的、 未结合生物分子。
14、的核酸适配体可以与反应体系中互补的寡核酸链杂交生成双链 DNA。而双链 DNA 又与 PicoGreen 结合， 释放荧光。不同浓度的待检测的生物分子与固定浓 度的核酸适配体结合时， 反应液中的荧光强度不同， 从而可以实现快速、 定量检测目的。 0022 本发明中， 非标记荧光染料 PicoGreen 通常使用商品化的产品， 具体的反应浓度 则依据生产商推荐使用浓度来确定， 不同生产商推荐数据略有变化。 0023 以下的实施例可以使本专业技术领域的技术人员更全面的了解本发明， 但不以任 何方式限制本发明。 0024 实施例 1 ： 毒素类的快速检测 0025 以下程序以锗曲毒素 OTA 和 O。
15、TA 适配体 ( 序列 5-GCATCTGATCGGGTGTGGGTGGCGTA AAGG-3) 为例， 阐述基于 PicoGreen 技术的快速检测方法 ： 0026 标准曲线的绘制 ： 0027 取 10 微升 10nmol/L OTA 核酸适配体分别与 10 微升终浓度为 0、 0.1、 1、 2、 4、 8、 10ng/mL 的 OTA 溶液在 96 孔板内混匀反应。反应缓冲液为 ： (10mmol/L Tris， 120mmol/L NaCl， 5mmol/L KCl， 20mmol/L CaCl2， pH8.5)， 反应体积 50 微升， 反应时间 5-10 分钟。加入 说 明 书。
16、 CN 104458684 A 4 3/4 页 5 10 微升 10nmol/L 与 OTA 适配体互补的单链寡核苷酸 ( 序列为 ： 5-CCTTTACGCCACCCACACCC GATCAGATGC-3)， 反应 5-10 分钟， 再加入 10 微升 PicoGreen( 终浓度为 1pmol/L)， 混匀。反 应 15 分钟后， 利用酶标仪或荧光分光光度计， 连续检测荧光 5 分钟， 记录荧光的变化 ()。 利用 Excel 或者统计学分析软件 SPSS、 Sigma Plot 或 GraphPad 等作图， 横坐标为 OTA 浓度 ( 对数 Log)， 纵坐标为 PicoGreen 荧。
17、光的增加值 ()。 0028 未知样品的检测 ： 0029 取 10 微升 10nmol/L OTA 核酸适配体与 10 微升未知 OTA 浓度的待检样品在 96 孔 板内混匀反应。反应缓冲液为 ： (10mmol/L Tris， 120mmol/L NaCl， 5mmol/L KCl， 20mmol/L CaCl2， pH8.5)， 反应体积 50 微升， 反应时间 5-10 分钟。加入 10 微升 10nmol/L 与 OTA 适配 体互补的单链寡核苷酸(序列为 ： 5-CCTTTACGCCACCCACACCCGATCAGATGC-3)， 反应5-10分 钟， 再加入 10 微升 Pico。
18、Green( 终浓度为 1pmol/L)， 混匀。反应 15 分钟后， 利用酶标仪或荧 光分光光度计， 连续检测荧光 5 分钟， 记录荧光的变化 ()。根据 PicoGreen 荧光的变化 值， 利用标准曲线定量 OTA 的浓度。 0030 根据此实施例， 待检测的OTA的检测下限线浓度为0.1ppb(高于此浓度均可检出。 不同的毒素适配体不同， 因此针对不同的毒素， 应选择特异性的适配体。 常见的毒素适配体 核苷酸序列如下 ： 0031 锗曲毒素 OTA 适配体 : 0032 5 -GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3 0033 或者 ： 5 -GCA。
19、TCTGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGG-3 0034 伏马毒素 FB1 适配体 ： 0035 5 -AATCGCATTACCTTATACCAGCTTATTCAATTACGTCTGCACATACCAGCTTATTCAATT-3 0036 黄曲霉毒素 AFB1 适配体 ： 0037 5-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC-3 0038 黄曲霉毒素 AFM1 适配体 ： 0039 5 -ACT GCT AGA GAT TTT CCA CAT-3 0040 玉米赤霉烯醇适配体 : 0041 5 -TCATCTATCTATGGT。
20、ACATTACTATCTGTAATGTGATATG3 0042 桔青毒素适配体 ： 0043 5 -GGCCAGGCGGGGCCTGTTCGCTGGGGCCGTGTCTTCGCGCTCGCTCGGTGTTGTTTGGCG-3 0044 实施例 2 ： 抗生素类的检测 0045 以下程序以氨苄青霉素 Amp 和 Amp 适配体 ( 序列 5 -GCGGGCGGTTGTATAGCGG-3 ) 为例， ， 阐述基于 PicoGreen 技术的快速检测方法 ： 0046 标准曲线的绘制 ： 0047 取 10 微升 10nmol/L Amp 核酸适配体分别与 10 微升终浓度为 0、 0.1、 1、 。
21、2、 4、 8、 10ng/mL 的 Amp 溶 液 在 96 孔 板 内 混 匀 反 应。 反 应 缓 冲 液 为 ： (10mmol/L Tris， 120mmol/L NaCl， 5mmol/L KCl， 20mmol/L CaCl2， pH8.5)，反 应 体 积 50 微 升，反 应 时 间 5-10 分钟。加入 10 微升 10nmol/L 与 Amp 适配体互补的单链寡核苷酸 ( 序列为 ： 5 -CCGCTATACAACCGCCCGC-3 )， 反应 5-10 分钟， 再加入 10 微升 PicoGreen( 终浓度为 1pmol/L)， 混匀。反应 15 分钟后， 利用酶标仪。
22、或荧光分光光度计， 连续检测荧光 5 分钟， 记 说 明 书 CN 104458684 A 5 4/4 页 6 录荧光的变化 ()。利用 Excel 或者统计学分析软件 SPSS、 Sigma Plot 或 GraphPad 等作 图， 横坐标为 Amp 浓度 ( 对数 Log)， 纵坐标为 PicoGreen 荧光的增加值 ()。 0048 未知样品的检测 ： 0049 取 10 微升 10nmol/L Amp 核酸适配体与 10 微升未知 Amp 浓度的待检样品在 96 孔 板内混匀反应。反应缓冲液为 ： (10mmol/L Tris， 120mmol/L NaCl， 5mmol/L KC。
23、l， 20mmol/L CaCl2， pH8.5)， 反应体积 50 微升， 反应时间 5-10 分钟。加入 10 微升 10nmol/L 与 Amp 适配 体互补的单链寡核苷酸 ( 序列为 ： 5 -CCGCTATACAACCGCCCGC-3 )， 反应 5-10 分钟， 再加入 10 微升 PicoGreen( 终浓度为 1pmol/L)， 混匀。反应 15 分钟后， 利用酶标仪或荧光分光光 度计， 连续检测荧光 5 分钟， 记录荧光的变化 ()。根据 PicoGreen 荧光的变化值， 利用标 准曲线定量 Amp 的浓度。 0050 根据此实施例， 待检测的Amp的检测下限线浓度为0.1。
24、ppb(高于此浓度均可检出。 不同的抗生素适配体不同， 因此针对不同的抗生素， 应选择特异性的适配体。 常见的抗生素 适配体核苷酸序列如下 ： 0051 氨苄青霉素 Amp 适配体 ： 0052 5 -GCGGGCGGTTGTATAGCGG-3 。 0053 四环素 Tet 适配体 ： 0054 5 -GGGCCTAAAACATACCAGATCGCCACCCGCGCTTTAATCTGGAGAGGTGAAGAATACGACCACCTA GGCTC-3 0055 卡那霉素 Kan 适配体 ： 0056 5 -TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA3 0057 特别说明 ： 0058 虽然本发明。
25、的实施例中只列举了两类生物分子， 以及对应的特异性结合的核酸适 配体、 适配体互补序列， 并没有列举全部生物分子的核酸适配体以及与其各自互补的寡核 酸链。 但是， 不同生物分子对应的核酸适配体可以通过查阅相关文献获得， 属于本领域技术 人员公知常识。核酸适配体的互补链序列就是根据碱基互补原则形成的反向互补序列， 属 于本领域技术人员公知常识。 在本发明提供所述基于非标记荧光染料和核酸适配体的检测 生物分子的方法之后， 本领域技术人员能够根据其掌握的技能举一反三， 实现其他生物材 料的检测目的。本发明只是提供一种新思路去利用这些核酸适配体， 对于相应的核酸适配 体的序列并不要求保护。 0059 以上是结合具体实施例子对本发明所做的进一步描述。 本行业的技术人员应该了 解， 本发明不受上述实施例的限制， 上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理， 在不脱离本发明原理的前提下， 本发明及其应用还会有各种变化和改进， 这些变化和改进 都落入要求保护的本发明范围内。 本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界 定。 说 明 书 CN 104458684 A 6 1/3 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 104458684 A 7 2/3 页 8 0003 序 列 表 CN 104458684 A 8 3/3 页 9 序 列 表 CN 104458684 A 9 。