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1、(10)申请公布号 CN 103995115 A (43)申请公布日 2014.08.20 CN 103995115 A (21)申请号 201410232208.6 (22)申请日 2014.05.28 G01N 33/558(2006.01) G01N 33/531(2006.01) G01N 33/532(2006.01) (71)申请人 中生北控生物科技股份有限公司 地址 102200 北京市昌平区科技园区超前路 27 号 (72)发明人 蒋琳 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王文君 (54) 发明名称 用于特异性害虫类过敏原 IgE 筛查的试。
2、纸条 及其制备方法 (57) 摘要 本发明提供一种用于特异性害虫类过敏原 IgE 筛查的试纸条， 所述试纸条包被有胶体金标 记的害虫类抗原。 本发明利用胶体金标记技术， 首 次用胶体金标记特异性害虫类过敏原， 然后将标 记后的过敏原均匀喷线于醋酸纤维素膜或硝酸纤 维素膜上， 制备成试纸条产品进行过敏原检测， 操 作简便， 结果准确， 成本低廉， 可实现多项自由检 测。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 103995115 A CN 103995115 A 。
3、1/1 页 2 1. 一种用于特异性害虫类过敏原 IgE 筛查的试纸条， 其特征在于， 所述试纸条包被有 胶体金标记的害虫类抗原。 2. 根据权利要求 1 所述的试纸条， 其特征在于， 所述试纸条为包被有胶体金标记的害 虫类抗原的硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。 3. 根据权利要求 1 所述的试纸条， 其特征在于， 所述试纸条的 pH 值为 8.5-10， 胶体金 颗粒与害虫类抗原之间的摩尔比为 10-20:1。 4. 根据权利要求 1-3 任一项所述的试纸条， 其特征在于， 害虫类包括但不限于苍蝇、 蟑 螂、 蚊子、 跳蚤、 体虱、 米象、 牛虻、 蚂蚁、 蜗牛、 蛞蝓、 鼠妇、 蜈蚣、 马陆、。
4、 天牛、 松毛虫、 白蚁、 舞 毒蛾、 玉米螟、 斜纹夜蛾、 小菜蛾、 苹果蠹蛾、 纹白蝶。 5. 根据权利要求 4 所述的试纸条， 其特征在于， 所述害虫类抗原为蟑螂抗原 ； 所述蟑螂 抗原的制备方法为 ： 取蟑螂 35g， 加水 200mL， 冰冻后， 用粉碎机粉碎， 然后用孔径为 0.4m 的醋酸纤维素膜过滤， 收集滤膜上的蟑螂粉， 晾干后加入 200mL 甲苯分析纯进行脱脂处理， 重复脱脂 5 次以上， 每次脱脂结束后进行离心， 离心后的物质置于通风橱中， 将残余的甲苯 挥发完全， 即得蟑螂抗原。 6. 权利要求 1-5 任一项所述试纸条的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 1。
5、) 害虫类抗原溶液的制备 ： 将待标记的害虫类抗原溶解在 0.9 pH7.0 的 NaCl 溶液 中， 使其终浓度为 50-500g/ml， 即得害虫类抗原溶液 ； 2) 胶体金溶液的制备 ： 用 0.1M K2CO3溶液和 0.1M HCl 调 0.01 HAuCl4胶体金溶液的 pH 值至 8.5-10， 使胶体金的粒径达到 40-60nm， 浓度达到 0.5-2， 即得胶体金溶液 ； 3) 胶体金与害虫类抗原的结合 ： 用 0.1M K2CO3溶液调步骤 1) 的抗原溶液的 pH 值至 8.5-10， 边搅拌边向其中加入步骤 2) 的胶体金溶液， 抗原溶液与胶体金溶液的体积比为 1-10。
6、:100， 同时加入稳定剂以防止害虫类抗原与胶体金颗粒聚合沉淀， 即得胶体金 - 害虫 类抗原结合物 ； 所述稳定剂为 1 BSA 和 0.1分子量 20KD 的聚乙二醇 ； 4) 胶体金标记的害虫类抗原的纯化 ： 将步骤 3) 中制备的胶体金 - 害虫类抗原结合 物经 1500r/min 离心 20min ； 收集沉淀溶于稳定剂中， 使其浓度达到 5-30 ； 然后加至 Sephacryl S-400 层析柱上进行纯化， 将纯化的胶体金标记的害虫类抗原溶液过滤除菌， 4保存 ； 所述稳定剂为 1 BSA 和 0.1分子量 20KD 的聚乙二醇溶液 ； 5) 试纸条的包被 ： 将步骤 4) 中。
7、制备的胶体金标记的害虫类抗原溶液喷线于试纸条上， 干燥后即得用于特异性害虫类过敏原 IgE 筛查的试纸条成品。 7. 根据权利要求 6 所述的方法， 其特征在于， 步骤 4) 中加样量为 Sephacryl S-400 层 析柱体积的 1/10， 以稳定剂作为洗脱液， 流速为 5-10ml/h ； 所述稳定剂为 1 BSA 和 0.1 分子量 20KD 的聚乙二醇溶液。 权 利 要 求 书 CN 103995115 A 2 1/5 页 3 用于特异性害虫类过敏原 IgE 筛查的试纸条及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及胶体金标记技术领域， 具体地说， 涉及一种用于特异性害虫类过敏原 I。
8、gE 筛查的试纸条及其制备方法。 背景技术 0002 过敏性疾病是当代社会中最常见的一种疾病， 它是由广泛存在的过敏原引起的， 我国约 5 10、 美国和欧洲约 5 25的人群遭受过过敏性侵扰， 其中幼儿和青少年尤 为明显， 危害较严重。过敏反应 (allergy) 是免疫机体再次接触相同变应原时， 发生反应过 度剧烈而引起的生理功能紊乱和组织损伤的病理性免疫反应。涉及临床各科， 如内科包括 支气管哮喘、 过敏性休克、 血清病、 结缔组织病、 肾小球肾炎、 偏头痛等， 外科包括移植排异 反应、 耳鼻喉科有过敏性鼻炎、 渗出性中耳炎、 美尼尔病等， 妇产科包括新生儿溶血症， 眼科 包括过敏性结膜。
9、炎、 交感性眼炎， 口腔科包括复发性口疮， 皮肤科约半数以上的疾病为过敏 反应病， 另外还有输血反应、 药物过敏、 过敏性休克等。 0003 2011年4月国家统计局颁布的的调查统计数据显示， 全国城市人口约5.7亿， 其中 有 1.5 亿城市过敏原发病人口， 常年处于过敏原状态的人群达 5122 万人。据此估算， 中国 人口城市变态反应疾病发病率为 27， 加上非城市人口， 实际中国变态反应疾病发病人数 约为 3.6 亿。然而， 近十年来， 我国过敏原患者的诊治率不到 1， 近 99的过敏原患者得 不到及时的诊断和治疗。 0004 据不完全统计， 全国 15000 家县级以上医院中引进 Un。
10、iCAP 的不足 150 家， 引进率 仅占 1。这一比例与其他生化检测设备 ( 约 40 50 ) 的引进率相比， 足以说明过敏原 的体外诊断领域存在着巨大发展空间。 同时， 体外过敏原检测设备和试剂主要依赖进口， 这 些原料均采自欧美的进口过敏原试剂， 与我国患者的地域差和人种差也有待验证。基于上 述情况， 开发一种符合本土化要求的过敏原检测系统， 包括我国自主创新的过敏原检测仪 和试剂在内的研发势在必行。 0005 过敏原检测的方法主要分为体内诊断和体外诊断。体内诊断包括皮肤诊断 ( 定性 检查)和激发诊断。 常见的皮肤诊断包括皮内实验、 点刺实验、 划痕实验、 斑贴实验等。 激发 诊断。
11、包括结膜实验、 鼻实验、 支气管实验、 食物实验、 药物激发实验、 物理性激发实验等。由 于体内诊断的影响因素复杂， 准确性低， 结果只能进行定性， 且检查本身给患者带来痛苦， 对严重过敏患者甚至存在生命危险等诸多因素， 限制了体内诊断的进一步发展。 0006 体外诊断的原理是基于 IgE 抗体诊断， 在诊断技术上包括免疫印记法、 放射变应 原吸附诊断 (RAST)、 荧光酶标法 (FEIA)、 酶联免疫法 (ELISA) 等。 0007 目前， 国内常用的临床检测过敏原的方法是以皮肤针刺试验 (SPT) 为主的体内试 验方法， 即用稀释过敏原液直接点刺皮肤， 观察检测点是否出现风团或潮红反应。
12、， 进行阴性 或阳性判定。 SPT虽然有简便， 成本低， 患者可见结果等优点。 但是其结果受诸多因素影响， 准确性低， 检查本身给患者尤其是小儿患者带来痛苦， 对严重过敏患者甚至有生命危险。 国 内体外诊断领域处于落后状态， 基本集中在手工操作和半定量半自动分析状态。存在操作 说 明 书 CN 103995115 A 3 2/5 页 4 烦琐、 灵敏度和精密度差， 测试时间长的缺点。 0008 与体内试验相比， 只需少量血清即可筛选和确定百种过敏原， 具有效能参数可靠， 不受药物影响， 无全身反应危险等显著优点。应用比较突出的是 PHARDIA UNICAP 系统和 SIEMENS 诊断系统。。
13、PHARDIA UNICAP 系统自 70 年代问世以来， 一直被作为过敏原诊断的金 标准。80 年代进入中国， 一直处于垄断地位。而 SIEMENS 诊断系统是过敏原自动化新技术 的代表， 是近几年新兴的过敏原诊断系统， 尚未进入中国市场。 0009 在发达国家， 临床上通行的全自动过敏原检测是基于酶联免疫法。 常用两种方法 ： 酶联免疫荧光测定法和生物素 - 亲和素系统 - 酶联免疫法。 0010 酶联免疫荧光测定法的经典系统是 Pharmacia( 法玛西亚 ) 公司的 Immuno CAP 检 测系统， 它采用纤维素固相载体， 该固相载体经溴化氧活化后与过敏原共价结合。 过敏原预 先结。
14、合在固相载体上， 加入血样后37孵育,如患者血清中有针对该过敏原的特异性IgE， 即形成抗此过敏原抗体复合物。 洗脱后加入酶标记的酶标二抗， 形成固相载体-过敏原-特 异性 IgE- 酶标二抗的结合物。再次洗脱后加入底物， 产生酶催化荧光产物。测定荧光值。 根据荧光吸光度的大小换算成特异性 IgE 含量。 0011 生物素 - 亲和素系统 - 酶联免疫法采用 Fooke 公司的 ALLERG-O-LIQ 测定系统， 酶 标板由抗人 IgE 抗体包被， 可用来检测总 IgE 和特异性 IgE。加入血样后孵育和洗涤， 酶标 板结合所有 IgE， 洗涤可避免其他免疫球蛋干扰 ( 如特异性抗原 )， 。
15、再加入生物素标记的过 敏原， 然后加入结合了酶的链霉亲和素结合物和显色底物， 通过酶与底物反应后吸光度的 变化来检测针对特异性过敏原的 IgE 含量。 发明内容 0012 本发明的目的是提供一种用于特异性害虫类过敏原 IgE 筛查的试纸条。 0013 本发明的另一目的是提供所述试纸条的制备方法。 0014 为了实现本发明目的， 本发明的一种用于特异性害虫类过敏原 IgE 筛查的试纸 条， 所述试纸条包被有胶体金标记的害虫类抗原。 0015 具体地， 本发明所述试纸条为包被有胶体金标记的害虫类抗原的硝酸纤维素膜或 醋酸纤维素膜。 0016 其中， 所述试纸条的 pH 值为 8.5-10， 胶体金。
16、颗粒与害虫类抗原之间的摩尔比为 10-20:1。 所述害虫类包括但不限于苍蝇、 蟑螂、 蚊子、 跳蚤、 体虱、 米象、 牛虻、 蚂蚁、 蜗牛、 蛞 蝓、 鼠妇、 蜈蚣、 马陆、 天牛、 松毛虫、 白蚁、 舞毒蛾、 玉米螟、 斜纹夜蛾、 小菜蛾、 苹果蠹蛾、 纹 白蝶等。 0017 所述害虫类抗原为蟑螂抗原。所述蟑螂抗原的制备方法为 ： 取蟑螂 35g， 加水 200mL， 冰冻后， 用粉碎机粉碎， 然后用孔径为 0.4m 的醋酸纤维素膜过滤， 收集滤膜上的 蟑螂粉， 晾干后加入 200mL 甲苯分析纯进行脱脂处理， 重复脱脂 5 次以上， 每次脱脂结束后 进行离心， 离心后的物质置于通风橱中，。
17、 将残余的甲苯挥发完全， 即得蟑螂抗原。 0018 本发明还提供所述试纸条的制备方法， 包括以下步骤 ： 0019 1)害虫类抗原溶液的制备 ： 将待标记的害虫类抗原溶解在0.9pH7.0的NaCl溶 液中， 使其终浓度为 50-500g/ml， 即得害虫类抗原溶液 ； 0020 2) 胶体金溶液的制备 ： 用 0.1M K2CO3溶液和 0.1M HCl 调 0.01 HAuCl4胶体金溶 说 明 书 CN 103995115 A 4 3/5 页 5 液的 pH 值至 8.5-10， 使胶体金的粒径达到 40-60nm， 浓度达到 0.5-2， 即得胶体金溶液 ； 0021 3) 胶体金与害。
18、虫类抗原的结合 ： 用 0.1M K2CO3溶液调步骤 1) 的抗原溶液的 pH 值 至 8.5-10， 边搅拌边向其中加入步骤 2) 的胶体金溶液， 抗原溶液与胶体金溶液的体积比为 1-10:100， 同时加入稳定剂以防止害虫类抗原与胶体金颗粒聚合沉淀， 即得胶体金 - 害虫 类抗原结合物 ； 所述稳定剂为BSA(牛血清白蛋白)和分子量20KD的聚乙二醇， 二者终浓度 分别为 1和 0.1 ； 0022 4) 胶体金标记的害虫类抗原的纯化 ： 将步骤 3) 中制备的胶体金 - 害虫类抗原结 合物经 1500r/min 离心 20min ； 收集沉淀溶于稳定剂中， 使其浓度达到 5-30 ； 。
19、然后加至 Sephacryl S-400 层析柱上进行纯化， 将纯化的胶体金标记的害虫类抗原溶液过滤除菌， 4保存 ； 所述稳定剂为 1 BSA 和 0.1分子量 20KD 的聚乙二醇溶液 ； 0023 5) 试纸条的包被 ： 将步骤 4) 中制备的胶体金标记的害虫类抗原溶液喷线于试纸 条上， 干燥后即得用于特异性害虫类过敏原 IgE 筛查的试纸条成品。 0024 前述的制备方法， 步骤 4) 中加样量为 Sephacryl S-400 层析柱体积的 1/10， 以稳 定剂作为洗脱液， 流速为 5-10ml/h ； 所述稳定剂为 1 BSA 和 0.1分子量 20KD 的聚乙二 醇溶液。 00。
20、25 使用时， 将本发明的试纸条浸入人血清中， 使血清中 IgE 抗体与特异性过敏原结 合， 产生紫色条带。根据条带颜色的深浅对照比色卡进行分级， 0026 本发明利用胶体金标记技术， 首次用胶体金标记特异性害虫类过敏原抗原， 然后 将标记后的过敏原均匀喷线于醋酸纤维素膜或硝酸纤维素膜上， 制备成试纸条产品进行过 敏原检测， 操作简便， 结果准确， 成本低廉， 可实现多项自由检测。 具体实施方式 0027 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 若未特别指明， 实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段， 所用原料均为市售商品。 0028 实施例 用于特异性害虫类。
21、过敏原 IgE 筛查的试纸条及其制备方法 0029 用于特异性蟑螂过敏原 IgE 筛查的试纸条的制备包括待标记抗原溶液的制备、 待 标胶体金溶液的制备、 胶体金标记蟑螂抗原、 胶体金蟑螂抗原的纯化、 胶体金蛋白颗粒的粒 径鉴定以及试纸条的包被。具体步骤如下 ： 0030 1、 待标记抗原溶液的制备 0031 蟑螂抗原的制备方法为 ： 取蟑螂 35g， 加水 200mL， 冰冻后， 用粉碎机粉碎， 然后用 孔径为 0.4m 的醋酸纤维素膜过滤， 收集滤膜上的蟑螂粉， 晾干后加入 200mL 甲苯分析纯 进行脱脂处理， 重复脱脂 5 次以上， 每次脱脂结束后进行离心， 离心后的物质置于通风橱 中，。
22、 将残余的甲苯挥发完全， 即得蟑螂抗原。 0032 将待标记的蟑螂抗原溶解在 0.9 pH7.0 的 NaCl 溶液中， 使其终浓度为 50-500g/ml， 即得蟑螂抗原溶液。 0033 2、 待标胶体金溶液的制备 0034 用 0.1M K2CO3溶液或 0.1M HCl 调胶体金溶液的 pH 值至 9.0， 使胶体金的粒径达到 50nm， 浓度达到 1。 0035 3、 胶体金标记蟑螂抗原 ： 将胶体金和抗原溶液分别用0.1M K2CO3溶液调pH至9.0， 说 明 书 CN 103995115 A 5 4/5 页 6 电磁搅拌抗原溶液， 加入胶体金溶液， 抗原溶液与胶体金溶液的体积比为。
23、 1-10:100， 继续搅 拌 10min， 加入稳定剂 BSA 和分子量 20KD 的聚乙二醇， 得到 1 BSA 和 0.1分子量 20KD 的 聚乙二醇溶液。此过程需要调整抗原的用量， 以胶体金标记抗原完成后的溶液呈葡萄酒红 色为最佳。 0036 4、 胶体金标记的蟑螂抗原的纯化 ： 将步骤 3 中制备的胶体金 - 蟑螂抗原结合物经 1500r/min 离心 20min ； 收集沉淀溶于稳定剂 ( 所述稳定剂为 1 BSA 和 0.1分子量 20KD 的聚乙二醇溶液 ) 中， 使其浓度达到 5-30 ； 然后加至 Sephacryl S-400 层析柱上进行纯 化， 将纯化的胶体金标记。
24、的蟑螂抗原溶液过滤除菌， 4保存。 0037 纯化过程中， 加样量为Sephacryl S-400层析柱体积的1/10， 以稳定剂(所述稳定 剂为 1 BSA 和 0.1分子量 20KD 的聚乙二醇溶液 ) 作为洗脱液， 流速为 5-10ml/h。 0038 5、 胶体金蛋白颗粒的粒径鉴定 0039 胶体金颗粒平均直径的测量 ： 在透射电镜下观察胶体金颗粒， 计算 100 个金颗粒 的平均直径应在 40 60nm 范围内。 0040 6、 试纸条的包被 0041 将阴性对照溶液 ( 含 40-70牛血清白蛋白的 PBS 溶液 )， 步骤 4 纯化的抗原溶液 进行均匀喷线。 0042 在免疫层析。
25、试纸硝酸纤维素膜表面进行阴性对照和抗原溶液的喷线。 用气动喷头 进行定量操作。用三维平台往复来回间隔喷线。最后将喷好的硝酸纤维素膜干燥并裁切成 条。 0043 7、 结果判断 0044 根据条带颜色的深浅对照比色卡进行分级， 分级方法见表 1 ： 0045 表 1 分级标准 0046 血清中 IgE 浓度分级特异性 IgE 含量 0.35IU/mL0无 0.35-0.75IU/mL1低 0.75-3.5IU/mL2增加 3.5-17.5IU/mL3显著增加 17.5-50IU/mL4显著增加 50-100IU/mL5较高 100IU/mL6极高 0047 目测比色中， 比色卡上的条带为在免疫层。
26、析试纸硝酸纤维素膜表面直接进行葡萄 皮红喷线。根据喷线葡萄皮红的浓度不同形成梯度 ( 表 2) ： 0048 表 2 不同 IgE 浓度对应于比色卡上葡萄皮红的浓度 说 明 书 CN 103995115 A 6 5/5 页 7 0049 血清中 IgE 浓度葡萄皮红浓度 0.35 IU/mL无 0.35-0.75 IU/mL0.25g/L 0.75-3.5 IU/mL0.5g/L 3.5-17.5 IU/mL2g/L 17.5-50 IU/mL5g/L 50-100 IU/mL9g/L 100 IU/mL12g/L 0050 本发明提供的用于特异性害虫类过敏原 IgE 筛查的试纸条适于工业化大规模生 产， 降低了生产成本， 大大降低了过敏原单项检测的价格。另外， 对具有中国本土特点的过 敏原原料， 实现本土化， 更适于中国人群过敏原的诊断， 提高了诊断的准确性。 0051 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 CN 103995115 A 7 。