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1、(10)申请公布号 CN 104215617 A (43)申请公布日 2014.12.17 CN 104215617 A (21)申请号 201410466703.3 (22)申请日 2014.09.13 G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 福建医科大学 地址 350004 福建省福州市交通路 88 号 (72)发明人 陈伟 邓豪华 吴钢伟 刘银环 彭花萍 (74)专利代理机构 福州智理专利代理有限公司 35208 代理人 王义星 (54) 发明名称 基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法 (57) 摘要 本发明公开一种基于金纳米团簇的脲酶活性 荧光测定方法， 其特征是利用脲。
2、酶特异性催化尿 素生成氨和二氧化碳， 新生成的氨能提高体系的 pH 值， 使 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸保护的金纳米团簇 的荧光发生猝灭， 从而表现出荧光发射光谱特征 的变化， 可以用于脲酶活性的测定。在 2.244U/ L 范围内 F650与脲酶浓度呈线性关系， 检测限为 0.55U/L。 本发明灵敏度高， 重现性好， 可用于幽门 螺旋杆菌的测定。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104215617 A CN 10421561。
3、7 A 1/1 页 2 1. 一种基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法， 其特征是利用脲酶特异性催化尿素 生成氨和二氧化碳的体系， 新生成的氨能提高所述体系的 pH 值， 使 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸保 护的金纳米团簇的荧光发生猝灭， 从而表现出荧光发射光谱特征的变化， 能用于脲酶活性 的测定。 2. 根据权利要求 1 所述的基于荧光金纳米团簇的脲酶抑制剂测定方法， 其特征是所使 用的 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸保护的金纳米团簇采用 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸还原氯金酸的方法 制备 ： 将浓度为0.020.18 mol/L 的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和浓度为0.10.8 mol/L的。
4、 氢氧化钠溶液加入到浓度为0.010.1 g/L的氯金酸溶液中， 混匀， 置于2070C水浴恒温 反应 03.5 小时， 反应结束后用截留分子量为 3500 的透析袋对反应液进行透析纯化处理， 得到 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸 - 金纳米团簇荧光材料水溶液。 3. 根据权利要求 2 所述的基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法， 其特征是所使用 的 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸保护的金纳米团簇采用 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸还原氯金酸的方法制 备 ： 将 0.6 mL 浓度为 0.5 mol/L 的氢氧化钠溶液与 0.4 mL 浓度为 0.02 g/L 的氯金酸溶液 加入到 4 mL 浓度为。
5、 0.08 mol/L 的 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸溶液中， 混匀， 置于 37 C 恒温水 浴槽中反应 2.5 h， 反应液由浅黄色变为无色， 反应结束后用截留分子量为 3500 的透析袋 对反应液进行纯化处理， 纯化后的金纳米团簇溶液放置于 4 C 冰箱避光保存。 4. 根据权利要求 2 或 3 所述的基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法， 其特征是利 用 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸保护的金纳米团簇在 650 nm 处的发射光强度值 （F650） 以判断脲酶 含量， 所使用的激发波长为 355 nm。 5. 根据权利要求 4 所述的基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法， 其特征是将不。
6、同 浓度 pH=6.0 的脲酶溶液加入到 02.5 mol/L、 pH=6.0 的尿素溶液中， 混合均匀后在 25 C 的恒温水浴槽中反应 050 min， 测定发射光强度值 F650， 在脲酶浓度为 2.244 U/L 的范围 内其发射光强度值 F650与脲酶浓度呈线性关系， 检测限为 0.55 U/L。 6. 根据权利要求 4 所述的基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法， 其特征是尿素的 浓度优选为 1 mol/L， 反应时间优选为 40 min。 7. 根据权利要求 4 所述的基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法， 其特征是金纳米 团簇溶液， 脲酶溶液和尿素溶液按体积比为 4 ： 1 ：。
7、 4 混合， 反应总体积为 0.45 mL。 8. 一种基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法， 包括如下步骤 ： 取适量人胃组织， 加入 2 mL 浓度为 1 mol/L、 pH=6.0 的尿素溶液中， 混合均匀后在 25 C 的恒温水浴槽中反 应40 min， 取0.25 mL上述反应液， 加入0.2 mL N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶 液， 在 25 C 的恒温水浴槽中反应 3 min， 测定发射光强度值 F650以定性判断胃组织是否存 在幽门螺旋杆菌。 9. 根据权利要求 8 所述的基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法， 其特征是所使用 的 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸保护的。
8、金纳米团簇采用 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸还原氯金酸的方法制 备 ： 将 0.6 mL 浓度为 0.5 mol/L 的氢氧化钠溶液与 0.4 mL 浓度为 0.02 g/L 的氯金酸溶液 加入到 4 mL 浓度为 0.08 mol/L 的 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸溶液中， 混匀， 置于 37 C 恒温水 浴槽中反应 2.5 h， 反应液由浅黄色变为无色， 反应结束后用截留分子量为 3500 的透析袋 对反应液进行纯化处理， 纯化后的金纳米团簇溶液放置于 4 C 冰箱避光保存。 权 利 要 求 书 CN 104215617 A 2 1/4 页 3 基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法 技术。
9、领域 0001 本发明涉及以 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸保护的金纳米团簇为荧光探针的脲酶活性测 定方法， 属于分析化学及纳米技术领域。 背景技术 0002 脲酶 （urease） 是一种含镍的寡聚酶， 它能高效、 特异性催化尿素水解生成二氧化 碳和氨。 医学上， 细菌脲酶是一种不容忽视的致病因素， 它可诱发许多疾病， 如肾盂肾炎、 肝 昏迷、 消化性溃疡和感染性尿路结石等。农业上， 当土壤脲酶的活性过高时， 化肥中的尿素 被迅速分解生成氨， 排放到大气中， 造成经济损失及环境污染。 另外， 豆类制品如豆奶、 代乳 粉等， 如含有脲酶对人体有害， 会引起腹泻等症状， 故在制造工艺中， 要除去脲。
10、酶。由上可 见， 脲酶活性的测定在医学、 农业和食品等领域具有重要的意义。 0003 金纳米团簇 （gold nanoclusters, Au NCs） 是一种新型的荧光纳米材料， 由几个 到几百个原子组成， 尺寸接近于电子的费米波长 （约 0.7 nm） 。由于量子尺寸效应， 金纳米 团簇显示出独特的光学特性。荧光金纳米团簇具有尺寸小、 无毒、 水溶性好、 光稳定性好、 Stokes 位移大、 比表面积大、 制备条件温和、 表面易于修饰以及荧光性质随尺寸可调等突出 优点， 是近年来的研究热点， 其已被广泛应用于催化、 传感检测、 纳米标记、 医学成像和光电 子学等领域。 0004 本发明以 。
11、N- 乙酰 -L- 半胱氨酸保护的金纳米团簇作为荧光探针， 提供了一种简 便、 灵敏的脲酶检测新方法。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种以 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸保护的金纳米团簇为荧光 pH 探 针的脲酶活性测定方法。 0006 为了实现上述目的， 本发明采用以下技术方案 ： 本发明所述的基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法， 其特征是利用脲酶特异性催 化尿素生成氨和二氧化碳的体系， 新生成的氨能提高所述体系的 pH 值， 使 N- 乙酰 -L- 半胱 氨酸保护的金纳米团簇的荧光发生猝灭， 从而表现出荧光发射光谱特征的变化， 能用于脲 酶活性的测定。 0007 所使用的 N- 。
12、乙酰 -L- 半胱氨酸保护的金纳米团簇采用 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸还 原氯金酸的方法制备 ： 将浓度为 0.020.18 mol/L 的 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸溶液和浓度为 0.10.8 mol/L 的氢氧化钠溶液加入到浓度为 0.010.1 g/L 的氯金酸溶液中， 混匀， 置于 2070 C 水浴恒温反应 03.5 小时， 反应结束后用截留分子量为 3500 的透析袋对反应液 进行透析纯化处理， 得到 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸 - 金纳米团簇荧光材料水溶液。 0008 所使用的 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸保护的金纳米团簇采用 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸还原 氯金酸的方法。
13、制备 ： 将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL浓度为0.02 g/ L 的氯金酸溶液加入到 4 mL 浓度为 0.08 mol/L 的 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸溶液中， 混匀， 置 说 明 书 CN 104215617 A 3 2/4 页 4 于37C恒温水浴槽中反应2.5 h， 反应液由浅黄色变为无色， 反应结束后用截留分子量为 3500 的透析袋对反应液进行纯化处理， 纯化后的金纳米团簇溶液放置于 4 C 冰箱避光保 存。 0009 利用 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸保护的金纳米团簇在 650 nm 处的发射光强度值 （F650） 以判断脲酶含量， 所使用。
14、的激发波长为 355 nm。 0010 将不同浓度 pH=6.0 的脲酶溶液加入到 02.5 mol/L、 pH=6.0 的尿素溶液中， 混 合均匀后在 25 C 的恒温水浴槽中反应 050 min， 测定发射光强度值 F650， 在脲酶浓度为 2.244 U/L 的范围内其发射光强度值 F650与脲酶浓度呈线性关系， 检测限为 0.55 U/L。 0011 所述尿素的浓度优选为 1 mol/L， 反应时间优选为 40 min。 0012 金纳米团簇溶液， 脲酶溶液和尿素溶液按体积比为 4 ： 1 ： 4 混合， 反应总体积为 0.45 mL。 0013 本发明所述的基于金纳米团簇的脲酶活性荧。
15、光测定方法， 包括如下步骤 ： 取适量 人胃组织， 加入 2 mL 浓度为 1 mol/L、 pH=6.0 的尿素溶液中， 混合均匀后在 25 C 的恒温 水浴槽中反应40 min， 取0.25 mL上述反应液， 加入0.2 mL N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金 纳米团簇溶液， 在 25 C 的恒温水浴槽中反应 3 min， 测定发射光强度值 F650以定性判断胃 组织是否存在幽门螺旋杆菌。 0014 所使用的 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸保护的金纳米团簇采用 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸还原 氯金酸的方法制备 ： 将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL浓度为0.0。
16、2 g/ L 的氯金酸溶液加入到 4 mL 浓度为 0.08 mol/L 的 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸溶液中， 混匀， 置 于37C恒温水浴槽中反应2.5 h， 反应液由浅黄色变为无色， 反应结束后用截留分子量为 3500 的透析袋对反应液进行纯化处理， 纯化后的金纳米团簇溶液放置于 4 C 冰箱避光保 存。 0015 具体地说， 本发明采用的技术方案为 ： （一） 金纳米团簇荧光材料的制备 以下过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡， 并用双蒸水彻底清洗， 晾干。 金纳米 团簇荧光材料的制备方法如下 ： 将 0.6 mL 浓度为 0.5 mol/L 的氢氧化钠溶液与 0.4 mL 浓 度。
17、为 0.02 g/L 的氯金酸溶液加入到 4 mL 浓度为 0.08 mol/L 的 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸溶液 中， 混匀， 置于 37 C 恒温水浴槽中反应 2.5 小时， 反应液由浅黄色变为无色。反应结束后 用分子量为 3500 的透析袋对反应液进行纯化处理， 纯化后的金纳米团簇溶液放置于 4 C 冰箱避光保存。 0016 （二） 脲酶活性的测定 ： 脲酶活性的测定分两步进行 ：（一） 将 0.05 mL 脲酶样品溶液 （pH=6.0 缓冲液溶解） 加 入到 0.2 mL 浓度为 1 M 的尿素溶液 （pH=6.0） 中， 混合均匀后在 25 C 的恒温水浴槽中反 应 40 min。
18、 ；（二） 将 0.2 mL 的金纳米团簇溶液加入到第一步反应后的溶液中， 在 25 C 的 恒温水浴槽中反应 3 min， 在 355nm 激发波长下测定 650 nm 处的荧光强度值 （F650） ， 通过标 准曲线进行脲酶活性的测定。 0017 本发明的优点 ： （1） 本发明基于脲酶特异性催化尿素生成氨和二氧化碳， 新生成的氨能提高体系的 pH 值， 使 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸保护的金纳米团簇的荧光发生猝灭， 从而表现出荧光发射光谱 说 明 书 CN 104215617 A 4 3/4 页 5 特征的变化， 可以用于脲酶活性的检测。 0018 （2） 本发明所使用的金纳米团簇直接。
19、由 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸还原氯金酸得到， 无 需进行进一步的修饰， 制备过程简单快速。 0019 （3） 本发明的检测灵敏度高， 荧光分光光度计测定的检测限为 0.55 U/L。 附图说明 0020 图 1 为金纳米团簇溶液在紫外灯下的外观图。图中 ：（A） 空白对照组 ；（B） 脲酶组 （脲酶浓度为 22 U/L） 。 0021 图 2 为金纳米团簇溶液的发射光谱图。图中 ：（A） 空白对照组， 为上方的曲线 ；（B） 脲酶组 （脲酶浓度为 22 U/L） ， 为下方的曲线。 0022 图 3 为不同浓度尿素条件下金纳米团簇溶液与脲酶催化反应液 （脲酶浓度为 22 U/L） 作用后发。
20、射光强度 （F650） 变化值 （F650） 关系图。 0023 图 4 为在金纳米团簇溶液中加入脲酶和尿素后， 荧光发射光强度随时间的变化 图。 0024 图5为金纳米团簇溶液与脲酶催化反应液 （含不同浓度脲酶） 作用后的荧光发射光 谱图。 0025 图 6 为金纳米团簇溶液的发射光强度值 （F650） 与脲酶浓度之间的关系图。 0026 图 7 为金纳米团簇溶液的发射光强度值 （F650） 与脲酶浓度之间的线性关系图。图 8 为金纳米团簇溶液用于胃组织幽门螺旋杆菌测定结果图。 具体实施方式 0027 实例 1 ： 将 0.6 mL 浓度为 0.5 mol/L 的氢氧化钠溶液与 0.4 mL。
21、 浓度为 0.02 g/L 的氯金酸溶 液加入到 4 mL 浓度为 0.08 mol/L 的 N- 乙酰 -L- 半胱氨酸溶液中， 混匀， 置于 37 C 恒温 水浴槽中反应 2.5 h。反应结束后用截留分子量为 3500 的透析袋对反应液进行纯化处理。 所得到的金纳米团簇溶液可见光下为无色， 紫外灯照射下产生强烈的红色荧光。4 C 暗处 保存， 能保持至少一个月的相对稳定。 0028 实例 2 ： 将 0.05 mL 浓度为 22 U/L 的脲酶溶液 （pH=6.0） 加入到 0.2 mL 浓度为 1 mol/L 的尿 素溶液 （pH=6.0） 中， 混合均匀后在 25 C 的恒温水浴槽中反。
22、应 40 min。将 0.2 mL 的实例 1制备的金纳米团簇溶液加入到上述溶液中， 在25C的恒温水浴槽中反应3 min。 设置一 组无脲酶的空白对照组。反应结束后， 在紫外灯下观察， 空白对照组显现红色荧光 （图 1 中 的 A） ， 而加入 22 U/L 的脲酶的金纳米团簇的红色荧光发生猝灭 （图 1 中的 B） 。图 2 为空白 对照组和脲酶组金纳米团簇溶液的荧光发射光谱图。 0029 实例 3 ： 将 0.05 mL 浓度为 22 U/L 的脲酶溶液 （pH=6.0） 加入到 0.2 mL 不同浓度的尿素溶液 （pH=6.0） 中， 混合均匀后在 25 C 的恒温水浴槽中反应 40 。
23、min。将 0.2 mL 的实例 1 所制 得的金纳米团簇溶液加入到上述溶液中， 在25C的恒温水浴槽中反应3 min， 测定发射光 强度值 F650。由图 3 可知， 当尿素浓度为 1mol/L 时， 荧光猝灭值 F650达到最大。 说 明 书 CN 104215617 A 5 4/4 页 6 0030 实例 4 ： 将 0.05 mL 浓度为 22 U/L 的脲酶溶液 （pH=6.0） 加入到 0.2 mL 浓度为 1 mol/L 的尿 素溶液 （pH=6.0） 中， 混合均匀后在 25 C 的恒温水浴槽中反应 050 min。将 0.2 mL 的实 例 1 所制得的金纳米团簇溶液加入到上。
24、述溶液中， 在 25 C 的恒温水浴槽中反应 3 min， 测 定发射光强度值 F650。由图 4 可知， F650在 40 min 后达到稳定。 0031 实例 5 ： 将 0.05 mL 不同浓度的脲酶溶液 （pH=6.0） 加入到 0.2 mL 浓度为 1 mol/L 的尿素溶液 （pH=6.0） 中， 混合均匀后在 25 C 的恒温水浴槽中反应 40 min。将 0.2 mL 的实例 1 所制 得的金纳米团簇溶液加入到上述溶液中， 在25C的恒温水浴槽中反应3 min， 测定发射光 强度值 F650。由图 5 可知， 随着脲酶浓度的增大， 金纳米团簇的荧光逐渐受到抑制， F650逐渐 。
25、减小 （见图 6） 。如图 7 所示， 在 2.244 U/L 范围内 F650与脲酶浓度呈线性关系， 检测限为 0.55 U/L。 0032 实例 6 ： 将 0.05 mL 浓度为 11 U/L 的脲酶溶液 （pH=6.0） 加入到 0.2 mL 浓度为 1 mol/L 的尿 素溶液 （pH=6.0） 中， 混合均匀后在 25 C 的恒温水浴槽中反应 40 min。将 0.2 mL 的实例 1 所制得的金纳米团簇溶液加入到上述溶液中， 在 25 C 的恒温水浴槽中反应 3 min， 测定 发射光强度值 F650。重复上述实验 12 次， 得相对标准偏差 （RSD） 为 3.2%， 表明本方。
26、法重现性 良好。 0033 实例 7 ： 取 10 mg 人胃组织， 加入 2 mL 浓度为 1 mol/L 的尿素溶液 （pH=6.0） 中， 混合均匀后在 25 C 的恒温水浴槽中反应 40 min。取 0.25 mL 上述反应液， 加入 0.2 mL 实例 1 制得的金 纳米团簇溶液， 在 25 C 的恒温水浴槽中反应 3 min， 测定发射光强度值 F650。实验结果如 图 8， 由图可知， 本方法可用于人胃组织幽门螺旋杆菌的测定。 说 明 书 CN 104215617 A 6 1/2 页 7 图 1 图 2 图 3 图 4 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 104215617 A 7 2/2 页 8 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 104215617 A 8 。