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1、(10)申请公布号 CN 104119629 A (43)申请公布日 2014.10.29 CN 104119629 A (21)申请号 201410337431.7 (22)申请日 2014.07.16 C08L 49/00(2006.01) C08K 5/521(2006.01) G01N 21/78(2006.01) C09K 9/02(2006.01) (71)申请人 江苏东博生物医药有限公司 地址 215200 江苏省苏州市吴江经济开发区 云梨路 539 号 (72)发明人 刘东 郑明彬 黄桂贤 (74)专利代理机构 苏州创元专利商标事务所有 限公司 32103 代理人 孙仿卫 汪青。
2、 (54) 发明名称 一种叶酸靶向聚丁二炔显色纳米粒及其制备 方法 (57) 摘要 本发明涉及一种叶酸靶向聚丁二炔显色纳米 粒及其制备方法， 所述叶酸靶向聚丁二炔显色纳 米粒包括聚丁二炔纳米粒， 特别是， 还包括形成在 所述聚丁二炔纳米粒表面与所述聚丁二炔纳米粒 通过化学键连接的叶酸分子。本发明的叶酸靶向 聚丁二炔显色纳米粒在聚丁二炔纳米粒的基础上 接入了叶酸分子， 使得这种显色纳米粒即包含了 聚丁二炔的变色功能， 又保留了叶酸的靶向作用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明。
3、书4页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104119629 A CN 104119629 A 1/1 页 2 1. 一种叶酸靶向聚丁二炔显色纳米粒， 包括聚丁二炔纳米粒， 其特征在于， 还包括形成 在所述聚丁二炔纳米粒表面与所述聚丁二炔纳米粒通过化学键连接的叶酸分子。 2. 根据权利要求 1 所述的叶酸靶向聚丁二炔显色纳米粒， 其特征在于， 所述聚丁二炔 纳米粒由含有丁二炔结构的单体和磷脂分子的混合物， 在254 nm的紫外光照射下通过拓扑 聚合形成。 3. 根据权利要求 2 所述的叶酸靶向聚丁二炔显色纳米粒， 其特征在于， 所述含有丁二 炔结构的单体具有羧基。 4. 根据权利要求 2 所。
4、述的叶酸靶向聚丁二炔显色纳米粒， 其特征在于， 所述含有丁二 炔结构的单体为 10,12- 二十五二炔酸。 5. 根据权利要求 2 所述的叶酸靶向聚丁二炔显色纳米粒， 其特征在于， 所述磷脂分子 为合成磷脂和天然磷脂组成的混合物。 6. 一种如权利要求 15 中任一项权利要求所述的叶酸靶向聚丁二炔显色纳米粒的制 备方法， 其特征在于， 所述制备方法包括以下步骤 ： （1） 制备聚丁二炔纳米粒溶液 ； （2） 取出一定量步骤 （1） 所述聚丁二炔纳米粒溶液， 在所述聚丁二炔纳米粒溶液中加入 过量的 1- 乙基 -3-(3- 二甲基氨丙基 )- 碳化二亚胺和过量的羟基琥珀酰亚胺， 室温避光振 荡 。
5、1.53 h， 然后加入叶酸， 室温振荡 1618 h， 反应完成后， 用纯水透析 2325 h， 制得叶酸 靶向聚丁二炔显色纳米粒。 7. 根据权利要求 6 所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 （1） 中， 所述聚丁二炔纳米粒溶 液的制备方法为 ： 将含有丁二炔结构的单体和磷脂分子溶于有机溶剂中混合， 再除去所述 有机溶剂， 然后加入去离子水， 使得所述含有丁二炔结构的单体的浓度为 0.051 mmol/L， 在 7076下， 超声分散 315min， 直至溶液呈透明或半透明状， 用 0.8m 滤膜滤去未分散 的组分， 然后置于4下1618 h， 再放置在室温下， 待溶液恢复到室温后置于波。
6、长为254 nm 的紫外光下照射 230 min， 得到蓝色或深蓝色的聚丁二炔纳米粒的溶液。 8. 根据权利要求 7 所述的制备方法， 其特征在于， 所述叶酸与所述含有丁二炔结构的 单体的摩尔比为 1:21:10。 9. 根据权利要求 7 所述的制备方法， 其特征在于， 所述磷脂分子与所述含有丁二炔结 构的单体的摩尔比为 2:3， 所述磷脂分子为合成磷脂和天然磷脂按摩尔比为 1:1 组成的混 合物。 权 利 要 求 书 CN 104119629 A 2 1/4 页 3 一种叶酸靶向聚丁二炔显色纳米粒及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于纳米医学领域， 涉及一种叶酸靶向聚丁二炔显色纳米粒及。
7、其制备方 法。 背景技术 0002 含有丁二炔 (diacetylene， DA) 结构 (-C C-C C-) 的类脂在一定表面压力 下疏水链会形成高度有序而紧密的排列， 在 254 nm 的紫外光照射下通过拓扑聚合形成蓝 色的聚丁二炔 (polydiacetylene， PDA) 结构。这种聚丁二炔结构随着所处环境的温度、 溶剂、 pH、 机械应力及特异性结合的改变， 其颜色都会发生蓝色到红色的变化， 是生物传 感器中的信号传输元件的理想材料。1969 年 Wegner 对其进行了首次报道， 自此， 聚丁二 炔成为各国科学家研究的热点， 对其制备、 结构、 性质、 应用等各个方面进行了深入。
8、研究。 1993 年 D. H. Charyc 等人利用化学方法在 10, 12 - 二十五烷基二炔酸单体 (10, 12 - Pentacosadiynoic acid， PCDA) 的羧基端修饰了流感病毒的特异性受体唾液酸， 并将这种 修饰的含有丁二炔结构的单体和未修饰的单体混合， 制备聚合的变色 LB 膜， 利用唾液酸与 流感病毒表面凝集素 (hemagglutinin， HA) 能够特异性识别的原理来实现检测。研究显示， 随着流感病毒增加， 聚丁二炔变色程度 (CR%) 也随之增加， 它们之间成正相关。 0003 脂质体具有与生物体细胞相类似的结构， 因此有很好的细胞相容性。将脂质类化。
9、 合物引入到囊泡， 并在不会改变聚丁二炔结构的显色性和变色性的前提下， 制备了聚丁二 炔 / 脂质的混合囊泡， 应用于水溶液中活性多肽分子与脂质膜作用的研究以及某些特殊药 物的筛选。 0004 叶酸对叶酸受体具有高度的亲和性， 并且是细胞增殖时碱基合成所必须的维生 素， 很多研究发现叶酸受体在多种恶性肿瘤细胞表面高水平表达。叶酸靶向纳米载体转基 因治疗肿瘤成为近年来国内外研究的热点。 发明内容 0005 为解决上述技术问题， 本发明目的在于提供一种既有聚丁二炔的色变功能， 又有 叶酸的靶向作用的叶酸靶向聚丁二炔显色纳米粒。 0006 本发明同时还提供一种叶酸靶向聚丁二炔显色纳米粒的制备方法， 。
10、该制备方法工 艺简单、 性质稳定且成本低。 0007 为达到上述目的， 本发明的技术方案如下 ： 一种叶酸靶向聚丁二炔显色纳米粒， 包括聚丁二炔纳米粒， 所述叶酸靶向聚丁二炔显 色纳米粒还包括形成在所述聚丁二炔纳米粒表面与所述聚丁二炔纳米粒通过化学键连接 的叶酸分子。 0008 所述聚丁二炔纳米粒由含有丁二炔结构的单体和磷脂分子的混合物， 在254 nm的 紫外光照射下通过拓扑聚合形成。 0009 所述含有丁二炔结构的单体具有羧基， 包括所有能呈现蓝色 - 红色变化的单体， 说 明 书 CN 104119629 A 3 2/4 页 4 如 10, 12- 二十五二炔酸 （PCDA） ， 但并不。
11、局限于它。 0010 所述磷脂分子并不仅限于合成磷脂， 也不限于天然磷脂， 较好为天然磷脂和合成 磷脂的混合物。 0011 所述磷脂分子可以选用二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱 （DMPC） 、 二棕榈酰 -a 磷脂酰胆碱 （DPPC） 、 大豆卵磷脂 （PC） 等。 0012 一种上述叶酸靶向聚丁二炔显色纳米粒的制备方法， 该方法包括以下步骤 ： （1） 制备聚丁二炔纳米粒溶液 ； （2） 取出一定量步骤 （1） 所述聚丁二炔纳米粒溶液， 在所述聚丁二炔纳米粒溶液中加入 过量的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺 （EDC） 和过量的羟基琥珀酰亚胺 （NHS） ， 室温避光振荡 1.53 h，。
12、 然后加入叶酸， 室温振荡 1618 h， 反应完成后， 用纯水透析 2325 h， 制得叶酸靶向聚丁二炔显色纳米粒。 0013 步骤 （1） 中， 所述聚丁二炔纳米粒溶液的制备方法为 ： 将含有丁二炔结构的单体 和磷脂分子溶于有机溶剂中混合， 然后除去所述有机溶剂， 再加入去离子水， 使得所述含 有丁二炔结构的单体的浓度为 0.051 mmol/L， 然后在 7076下， 超声分散 315min， 直至 溶液呈透明或半透明状， 用 0.8m 滤膜滤去未分散的组分， 然后置于 4下 1618 h， 再放 置在室温下， 待所述溶液恢复到室温后置于波长为 254 nm 的紫外光下照射 230 mi。
13、n， 得到 蓝色或深蓝色的聚丁二炔纳米粒的溶液。 0014 所述叶酸与所述含有丁二炔结构的单体的摩尔比为 1:21:10。 0015 上述步骤 （1） 中， 所述磷脂分子与所述含有丁二炔结构的单体的摩尔比并不局限 于一种特定的比例， 而包括所有可能存在的比例， 并不改变聚丁二炔的变色反应。 优选摩尔 比为 2:3。 0016 所述磷脂分子为天然磷脂和合成磷脂按摩尔比为 1:1 组成的混合物。 0017 上述步骤 （2） 中， 所述 1- 乙基 -3-(3- 二甲基氨丙基 )- 碳化二亚胺 （EDC） 和所述 羟基琥珀酰亚胺 （NHS） 的摩尔比为 1:1。 0018 本发明最后制得的叶酸靶向聚。
14、丁二炔显色纳米粒， 采用紫外分光光度计测定其接 入叶酸的含量， 测试选用 286nm。 0019 由于上述技术方案的实施， 本发明与现有技术相比具有如下优点 ： 本发明的叶酸靶向聚丁二炔显色纳米粒在聚丁二炔的基础上引入了形成磷脂双分子 层的磷脂分子， 并接入叶酸分子， 使得这种纳米粒即包含了聚丁二炔的色变功能， 又保留了 叶酸的靶向作用。 0020 本发明的叶酸靶向聚丁二炔显色纳米粒具有显色性和变色性。 0021 本发明的叶酸靶向聚丁二炔显色纳米粒性质稳定、 可以在体外快速检测肿瘤细 胞。 0022 本发明的制备方法简单易行， 便于操作推广。 附图说明 0023 图 1 为本发明的叶酸靶向聚丁。
15、二炔显色纳米粒的结构示意图 ； 图 2 为实施例一的聚丁二炔纳米粒的色变图 ； 图 3 为实施例一的聚丁二炔纳米粒的紫外图谱 ； 说 明 书 CN 104119629 A 4 3/4 页 5 图 4 为实施例一的聚丁二炔纳米粒的粒径图。 具体实施方式 0024 在聚丁二炔显色纳米粒表面修饰叶酸分子， 在外加紫外及叶酸双重主动靶向作用 下， 将加强靶细胞对目的基因摄取。 0025 本发明的叶酸靶向聚丁二炔显色纳米粒， 结构如图 1 所示， 其通过疏水相互作用 以非共价键力的形式在聚丁二炔分子中加入一种或几种不同的磷脂分子， 形成磷脂双分子 层， 组装成聚丁二炔混合纳米粒， 这种聚丁二炔纳米粒可以。
16、通过化学键将叶酸分子连接到 该纳米粒表面， 利用其特异性结合的特点， 使其产生快速的肉眼可见的明显颜色变化。 这类 叶酸靶向聚丁二炔显色纳米粒具有制备简单、 成本低、 快速检测的优点， 可以通过色变反应 定性或定量检测生物活性分子的存在， 可广泛地应用于生物医学， 如活性药物筛选、 临床检 验诊断等方面。 0026 下面通过实施例对本发明的具体实施方式进行说明。 0027 实施例 1 将10,12-二十五二炔酸 （PCDA） 、 二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱 （DMPC)、 大豆卵磷脂 （PC） 以摩 尔比例 3 : 1 : 1 溶于氯仿中， 真空干燥至恒重除去氯仿， 再用一定量的去离子水溶解， 调 。
17、整PCDA的浓度为1 mmol/L， 在72 下， 超声分散10 min， 直至溶液呈透明状， 保温30 min， 冷却至室温后， 用 0.8 m 滤膜滤去未分散的组分， 溶液置于 4 16 h。待溶液恢复到室 温后， 将溶液置于波长为254 nm的紫外光下照射30 min， 通过紫外跟踪变色 （如图23） ， 得 到蓝色的聚丁二炔混合磷脂显色颗粒， 颗粒粒径范围为 50 - 800 nm（如图 4） 。其中， 紫外 图谱采用紫外 - 可见光谱仪测定， 颗粒粒径采用 Malvern ZetasizerNano ZS 测定。 0028 图 2 显示在紫外照射过程中， 随着照射时间的延长， 聚丁二。
18、炔颜色由无色变为浅 蓝色， 直至深蓝色。图 3 为对变色机理的解释。 0029 取50 L PCDA/DMPC/PC(1 mmol/L)变色颗粒， 加入6 L 4 mmol/L NHS和6 L 4 mmol/L EDC， 室温避光振荡 2 h， 活化羧基端。加入叶酸， 叶酸的加入量按叶酸与 PCDA 的 摩尔比为1:10加入， 室温振荡17 h， 反应结束后， 用纯水透析24 h除去未反应的叶酸， 即得 叶酸靶向聚丁二炔显色纳米粒， 接入叶酸的含量采用紫外分光光度计测定 （286 nm） ， 测得 接入的叶酸含量为 0.877 mg/L。 0030 实施例 2 本实施例中相比实施例 1， 只改。
19、变叶酸的加入量， 叶酸的加入量按叶酸与 PCDA 的摩尔 比为 1:5 加入， 最后制得的叶酸靶向聚丁二炔显色纳米粒上的叶酸含量为 2.110 mg/L。 0031 实施例 3 本实施例中相比实施例 1， 只改变叶酸的加入量， 叶酸的加入量按叶酸与 PCDA 的摩尔 比为 3:10 加入， 最后制得的叶酸靶向聚丁二炔显色纳米粒上的叶酸含量为 2.642 mg/L。 0032 实施例 4 本实施例中相比实施例 1， 只改变叶酸的加入量， 叶酸的加入量按叶酸与 PCDA 的摩尔 比为 1:2.5 加入， 最后制得的叶酸靶向聚丁二炔显色纳米粒上的叶酸含量为 3.560 mg/L。 0033 综上所述。
20、， 本发明的叶酸靶向聚丁二炔显色纳米粒具有如下优点 ： （1） 本发明使用的天然磷脂以大豆卵磷脂 （磷脂酰胆碱， PC） 为主， 来源于蛋黄和大豆， 说 明 书 CN 104119629 A 5 4/4 页 6 成本低 ； 本发明使用的合成磷脂具有与生物细胞相类似的结构， 因此有很好的生物相容性， 同时可以提高纳米粒的稳定性。 0034 （2） 制备的显色纳米粒通过掺杂含有丁二炔结构的单体进入两亲性的脂质纳米颗 粒小体， 可以形成稳定的微组装结构。 这种微组装结构在温度、 溶剂、 pH、 机械应力及交变磁 场等条件下， 其颜色会发生蓝色 - 红色的变化。 0035 （3） 采用超声分散法制备聚。
21、丁二炔纳米粒， 所制备出的纳米粒粒径均匀， 分布范围 窄， 结构稳定。 0036 （4） 制备的聚丁二炔纳米粒通过碳化二胺法接入叶酸分子， 得到具有色靶向及叶 酸分子靶向的纳米粒。 0037 （5） 本发明的制备方法简便易行， 便于操作推广。 0038 以上对本发明做了详尽的描述， 其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本 发明的内容并加以实施， 并不能以此限制本发明的保护范围， 且本发明不限于上述的实施 例， 凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 104119629 A 6 1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104119629 A 7 2/2 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 104119629 A 8 。