多叶越南槐中总生物碱的提取方法、检测方法及其应用.pdf

摘要
申请专利号：	CN201410371787.2	申请日：	2014.07.31
公开号：	CN104095907A	公开日：	2014.10.15
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):A61K 36/48申请日:20140731\|\|\|公开
IPC分类号：	A61K36/48; A61P1/04; A61P7/02; A61P9/10; A61P3/06; G01N30/90	主分类号：	A61K36/48
申请人：	广西壮族自治区中医药研究院
发明人：	卢文杰; 陈家源; 陆国寿; 谭晓; 黄建猷; 黄周锋; 何开家; 李燕婧; 钟正贤
地址：	530022 广西壮族自治区南宁市青秀区东葛路20-1号
优先权：
专利代理机构：	北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙) 11350	代理人：	罗保康
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内容摘要

本发明公开了多叶越南槐中总生物碱的提取方法、检测方法及其应用，其中提取方法分为两种：①将多叶越南槐药材用70-95%乙醇加热回流提取得到流浸膏，经过加水混悬和调酸处理后用氯仿萃取，最终得到总生物碱；②先将多叶越南槐药材渗漉提取，经732阳离子交换树脂洗脱提取，最后对树脂进行氯仿洗脱处理得到总生物碱。所得总生物碱通过薄层色谱法进行检测，使用三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（4:1:0.1）为展开剂，以苦参碱、氧化苦参碱和氧化槐果碱作为总生物碱中定性成分，结果准确可靠。本发明中提取方法过程简单，所得总生物碱具有抗胃溃疡，抗凝血，抗脑缺血，抗血栓和降血脂等药理作用，具有较大的市场开发前景。

权利要求书

权利要求书
1.  一种多叶越南槐中总生物碱的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）将多叶越南槐药材粉碎成20-80目粗粉，用70-95%乙醇在80-90℃下回流提取3-5次，每次1-3小时，趁热过滤，回收溶剂，得到60-70℃下相对密度为1.10-1.20的流浸膏；
（2）将流浸膏加水混悬，滴加浓硫酸至pH值为3；
（3）用氯仿萃取至氯仿颜色变浅，酸水层加碳酸钾至pH值为11，用氯仿萃取至氯仿液蒸干无生物碱反应，回收氯仿得氯仿提取物，即得总生物碱。

2.  一种多叶越南槐中总生物碱的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将多叶越南槐药材粉碎成20-80目粗粉，用1%盐酸水溶液渗漉提取1-7天，收集渗漉液；
（2）渗漉液通过预先处理好的732阳离子交换树脂柱，用水洗脱树脂柱至水液无色；
（3）将树脂倒入敞开的器皿中，晾干，用氨水捏溶，用氯仿回流提取，至氯仿提取液蒸干检查无生物碱反应，回收氯仿提取液得氯仿提取物，即得总生物碱。

3.  根据权利要求2所述的多叶越南槐中总生物碱的提取方法，其特征在于：所述渗漉提取中加入1%盐酸水溶液为多叶越南槐药材质量的8-20倍。

4.  根据权利要求2所述的多叶越南槐中总生物碱的提取方法，其特征在于：步骤（3）中所述氯仿回流提取2-5次。

5.  权利要求1-2任一项所述的提取方法得到的多叶越南槐总生物碱的检测方法，其特征在于：采用薄层色谱进行定性鉴别，具体步骤为：
（1）取多叶越南槐总生物碱10mg，置10ml容量瓶中，加三氯甲烷至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
（2）取多叶越南槐药材粉末0.5g，加三氯甲烷10ml，浓氨试液0.2ml，振摇15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加0.5ml三氯甲烷使溶解，作为对照药材溶液；
（3）另取苦参碱对照品，氧化苦参碱对照品，氧化槐果碱对照品加三氯甲烷制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液；
（4）吸取供试品溶液，对照药材溶液各1~2 μl，对照品溶液4~6 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（4:1:0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化鉍钾试液，供试品色谱中，在与对照药材，对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色斑点。

6.  权利要求1-2任一项所述的提取方法得到的多叶越南槐总生物碱，在制备抗胃溃疡，抗凝血，抗脑缺血，抗血栓和降血脂药物中的应用。

说明书

说明书多叶越南槐中总生物碱的提取方法、检测方法及其应用
技术领域
本发明属于药液提取技术领域，具体涉及一种多叶越南槐中总生物碱的提取方法、检测方法及其应用。
背景技术
多叶越南槐Sophora tonkinensis Gagnep.var.polyphyllaS. Z.Huang et Z.C.Zhou为豆科槐属植物，与常用中药材山豆根[学名：越南槐Sophora tonkinensis Gagnep]是同科同属同种的根，是越南槐的一个变种。生长于石山区，分布于广西、广东、云南、贵州和江西等省，在广西主要分布于红水河流域，如都安、马山、忻城、武鸣等地。其性寒，味苦，具有清热解毒、消肿利咽之功效，常用于火毒蕴结，咽喉肿痛，齿龈肿痛，肺热咳嗽，肝炎等疾患的治疗。
有关多叶越南槐药物成分目前有了一些研究：
1、卢文杰、牙启康在《广西科学》2011年第四期发表了“多叶越南槐脂溶性成分研究” 的文章，采用索氏提取法提取多叶越南槐（Sophora tonkinensis Gagnep.var.polyphyllaS.Z.Huang et Z.C.Zhou）的脂溶性成分,甲酯化后,用气相色谱-质谱联用（GC-MS）进行分析,计算机检索结合人工解析进行成分分析和鉴定,共分离得到41个峰,鉴定了其中32种成分。多叶越南槐脂溶性成分主要含长链脂肪酸。所有成分均首次在该植物中鉴定。
2、卢文杰、陆国寿、谭晓、陈家源、黄周锋在《中国实验方剂学杂志》2014年第20卷第8期发表了“多叶越南槐生物碱类成分的研究”的文章，采用Sephadex LH-20柱色谱、硅胶柱色谱、重结晶等方法分离和纯化多叶越南槐的生物碱成分，综合运用红外光谱、质谱、核磁共振等技术和理化方法进行分析，并确定分离得到的生物碱结构。结果：根据理化性质及波谱数据，鉴定了各化合物的结构分别是：槐果碱，苦参碱，槐花醇，9α-羟基苦参碱，12α-羟基槐果碱，氧化槐果碱，氧化苦参碱，金雀花碱。结论：化合物1～8均为首次从多叶越南槐中分离得到。
多叶越南槐与山豆根具有相同的药用功效，广西民间常把多叶越南槐当作山豆根药材来使用，《广西中药材标准，1990版》也将多叶越南槐作为山豆根药材的植物来源之一收载。据分析，多叶越南槐与山豆根一样含有苦参碱，槐果碱，槐花醇，9α–羟基苦参碱，12α-羟基槐果碱，氧化苦参碱，氧化槐果碱，金雀花碱等多种生物碱成分。目前市场上山豆根面临日益枯竭的现状，因此，对多叶越南槐中总生物碱进行提取开发，探索多叶越南槐药材能否作为山豆根的代用品，为资源利用和临床应用提供科学依据，显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是针对目前市场山豆根资源逐渐减少的问题，提供一种多叶越南槐中总生物碱的提取方法、检测方法及其应用，以此探索多叶越南槐药材能否作为山豆根的代用品，为资源利用和临床应用提供科学依据。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
本发明多叶越南槐中总生物碱的提取方法分为两种：
第一种方法为：将多叶越南槐药材用70-95%乙醇加热回流提取得到流浸膏，经过加水混悬和调酸处理后用氯仿萃取，最终得到总生物碱。
具体步骤为：（1）将多叶越南槐药材粉碎成20-80目粗粉，用70-95%乙醇在80-90℃下回流提取3-5次，每次1-3小时，趁热过滤，回收溶剂，得60-70℃下相对密度为1.10-1.20的流浸膏；（2）将流浸膏加水混悬，滴加浓硫酸至pH值为3；（3）用氯仿萃取至氯仿颜色变浅，酸水层加碳酸钾至pH值为11，用氯仿萃取至氯仿液蒸干无生物碱反应，回收氯仿得氯仿提取物，即得总生物碱。
第二种方法为：先将多叶越南槐药材渗漉提取，经732阳离子交换树脂洗脱提取，最后对树脂进行氯仿洗脱处理得到总生物碱。
具体步骤为：（1）将多叶越南槐药材粉碎成20-80目粗粉，用多叶越南槐药材质量的8-20倍的1%盐酸水溶液渗漉提取1-7天，收集渗漉液；（2）渗漉液通过预先处理好的732阳离子交换树脂柱，用水洗脱树脂柱至水液无色；（3）将树脂倒入敞开的器皿中，晾干，用氨水捏溶，用氯仿回流提取2-5次，至氯仿提取液蒸干检查无生物碱反应，回收氯仿提取液得氯仿提取物，即得总生物碱。
732阳离子交换树脂为强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，是一种磺酸化苯乙烯系凝胶型强酸阳离子交换树脂，具有交换容量高、交换速度快、机械强度高的特点，在多叶越南槐中提取总生物碱过程中较为合适，经发明人多次验证，使用该树脂洗脱提取总生物碱具有较高的收率。另外，732阳离子交换树脂柱预处理方法为：将树脂置于洁净的容器中，用清水漂洗，直到排水清晰为止。用水浸泡树脂12~24小时，使树脂充分膨胀。如为干树脂，应先用饱和氯化钠溶液浸泡，再逐步稀释氯化钠溶液，以免树脂突然急剧膨胀而破碎。用树脂体积2倍量的2~5%HCl溶液浸泡树脂2~4小时，并不时搅拌。然后用低纯水洗涤树脂，直至溶液pH接近于4，再用2~5%NaOH溶液处理，处理后用水洗至中性。
为更好的控制多叶越南槐中总生物碱的质量，发明人还对从多叶越南槐中提取出的总生物碱进行反复探索和研究，制定了其检测标准，具体检测方法为：
采用总生物碱的薄层色谱进行定性鉴别，取多叶越南槐总生物碱10mg，置10ml容量瓶中，加三氯甲烷至刻度，摇匀，作为供试品溶液；取多叶越南槐药材粉末0.5g，加三氯甲烷10ml，浓氨试液0.2ml,振摇15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加0.5ml三氯甲烷使溶解，作为对照药材溶液；另取苦参碱对照品，氧化苦参碱对照品，氧化槐果碱对照品加三氯甲烷制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液，对照药材溶液各1~2 μl，对照品溶液4~6 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（4:1:0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化鉍钾试液，供试品色谱中，在与对照药材，对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色斑点。
本发明多叶越南槐中总生物碱，在制备抗胃溃疡，抗凝血，抗脑缺血，抗血栓和降血脂药物中的应用。经过发明人再三验证，多叶越南槐总生物碱高剂量与山豆根总生物碱高剂量均能减轻小鼠胃溃疡指数，延长小鼠凝血时间，延长小鼠脑缺血呼吸时间，降低大鼠静脉血栓重量，降低高脂血症小鼠血脂水平，两者作用相当；多叶越南槐总生物碱中剂量能减轻小鼠胃溃疡指数，延长小鼠脑缺血呼吸时间，降低大鼠静脉血栓重量；急性毒性结果表明，多叶越南槐总生物碱的半数致死量（LD50）为55.30g.kg-1，95%可信限为48.15～64.37g.kg-1。
本发明的多叶越南槐中总生物碱的提取方法、检测方法及其应用具有以下显著进步和优点：
一、本发明的多叶越南槐中总生物碱的提取方法，可以使用乙醇回流提取得到流浸膏，然后进行氯仿萃取的方法，还可以使用盐酸水溶液渗漉提取后，经过732阳离子交换树脂柱洗脱，最后由氯仿提取的方法，以上两种提取方法均无需高温、高压环境，提取过程简单、易操作、易控制，较易实现工业化生产，对于多叶越南槐中总生物碱的批量提取提供了详实、可靠的数据资料。
二、本发明的多叶越南槐中总生物碱的检测方法，通过薄层色谱法定性总生物碱中苦参碱，氧化苦参碱和氧化槐果碱来控制总生物碱的质量，较为准确。因为总生物碱中苦参碱、氧化苦参碱和氧化槐果碱是其中的主要成分，在其应用中起着主要作用。经发明人多次验证，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（4:1:0.1）为展开剂对于定性总生物碱中的主要成分准确、可靠，同时使用薄层色谱法流程简单，重复性高，适合作为多叶越南槐中总生物碱的生产在线控制及出厂控制标准方法。
三、本发明的多叶越南槐中总生物碱的提取方法提取的总生物碱含量较高，经发明人对其药理学研究发现，多叶越南槐总生物碱高剂量与山豆根总生物碱高剂量均能减轻小鼠胃溃疡指数，延长小鼠凝血时间，延长小鼠脑缺血呼吸时间，降低大鼠静脉血栓重量，降低高脂血症小鼠血脂水平，两者作用相当，多叶越南槐总生物碱具有一定的抗胃溃疡，抗凝血，抗脑缺血，抗血栓和降血脂作用，其毒性较低。
具体实施方式
实施例1 多叶越南槐中总生物碱提取方法（方法一）
1-1将多叶越南槐药材粉碎成20目粗粉，用70%乙醇在90℃下回流提取5次，每次1小时，趁热过滤，回收溶剂，得到60℃下相对密度为1.20的流浸膏；将流浸膏加水混悬，滴加浓硫酸至pH值为3；用氯仿萃取至氯仿颜色变浅，酸水层加碳酸钾至pH值为11，用氯仿萃取至氯仿液蒸干无生物碱反应，回收氯仿得氯仿提取物，即得总生物碱。
1-2将多叶越南槐药材粉碎成80目粗粉，用75-90%乙醇在85℃下回流提取4次，每次2小时，趁热过滤，回收溶剂，得到65℃时相对密度为1.15的流浸膏；将流浸膏加水混悬，滴加浓硫酸至pH值为3；用氯仿萃取至氯仿颜色变浅，酸水层加碳酸钾至pH值为11，用氯仿萃取至氯仿液蒸干无生物碱反应，回收氯仿得氯仿提取物，即得总生物碱。
1-3将多叶越南槐药材粉碎成50目粗粉，用95%乙醇在80℃下回流提取3次，每次3小时，趁热过滤，回收溶剂，得到70℃时相对密度为1.10的流浸膏；将流浸膏加水混悬，滴加浓硫酸至pH值为3；用氯仿萃取至氯仿颜色变浅，酸水层加碳酸钾至pH值为11，用氯仿萃取至氯仿液蒸干无生物碱反应，回收氯仿得氯仿提取物，即得总生物碱。
实施例2 多叶越南槐中总生物碱提取方法（方法二）
2-1 将20公斤多叶越南槐药材粉碎成粗粉，过20目筛，放入渗漉器中，层层压实，然后用配制好的1%盐酸水溶液160公斤放入渗漉器，密闭，提取7天，渗漉过程中不搅动，收集渗漉液；将渗漉液通过预先处理好的732阳离子交换树脂柱，然后用水洗脱树脂柱至水液无色；将树脂倒入敞开的容器中，晾干或在55-65℃下烘干，用氨水捏溶，用氯仿回流提取5次，至氯仿提取液蒸干检查无生物碱反应，回收氯仿提取液得氯仿提取物，即得总碱。
2-2 将15公斤多叶越南槐药材粉碎成粗粉，过20目筛，放入渗漉器中，层层压实，然后用配制好的1%盐酸水溶液300公斤放入渗漉器，密闭，提取1天，渗漉过程中不搅动，收集渗漉液；将渗漉液通过预先处理好的732阳离子交换树脂柱，然后用水洗脱树脂柱至水液无色；将树脂倒入敞开的容器中，晾干或在55-65℃下烘干，用氨水捏溶，用氯仿回流提取2次，至氯仿提取液蒸干检查无生物碱反应，回收氯仿提取液得氯仿提取物，即得总碱。
2-3 将30公斤多叶越南槐药材粉碎成粗粉，过20目筛，放入渗漉器中，层层压实，然后用配制好的1%盐酸水溶液450公斤放入渗漉器，密闭，提取3-5天，渗漉过程中不搅动，收集渗漉液；将渗漉液通过预先处理好的732阳离子交换树脂柱，然后用水洗脱树脂柱至水液无色；将树脂倒入敞开的容器中，晾干或在55-65℃下烘干，用氨水捏溶，用氯仿回流提取3-4次，至氯仿提取液蒸干检查无生物碱反应，回收氯仿提取液得氯仿提取物，即得总碱。
上述提取方法中732阳离子交换树脂柱预处理方法为：将树脂置于洁净的容器中，用清水漂洗，直到排水清晰为止。用水浸泡树脂15小时，使树脂充分膨胀。用树脂体积2倍量的5%HCl溶液浸泡树脂4小时，并不时搅拌，然后用低纯水洗涤树脂，直至溶液pH接近于4，再用5%NaOH溶液处理，处理后用水洗至中性。
732阳离子交换树脂规格型号如下：

实施例3 多叶越南槐中总生物碱的检测方法
取实施例1或2提取方法所得多叶越南槐总生物碱10mg,置10ml容量瓶中，加三氯甲烷至刻度，摇匀，作为供试品溶液；取多叶越南槐药材粉末0.5g，加三氯甲烷10ml，浓氨试液0.2ml，振摇15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加0.5ml三氯甲烷使溶解，作为对照药材溶液；另取苦参碱对照品，氧化苦参碱对照品，氧化槐果碱对照品加三氯甲烷制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液，对照药材溶液各1~2 μl，对照品溶液4~6 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（4:1:0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化鉍钾试液，供试品色谱中，在与对照药材，对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色斑点。
实施例4 效果实施例
发明人对从多叶越南槐中提取的总生物碱进行了诸多药理作用研究，试用药品如下：
多叶越南槐总生物碱（多叶越南槐中自提-实施例1或2）；
山豆根总生物碱药膏；广西中医药研究院化学所提供；
西米替丁片，江西济民可信药业有限公司；
阿司匹林肠溶片，武汉远大制药集团股份有限公司产品；
复方丹参片，广东白云山和记黄埔中药有限公司产品；
血脂康胶囊，北京北大维信生物科技有限公司产品。
供试动物：昆明种小鼠，体重18-22g, 雌雄各半；SD大鼠，200±20g，雌雄各半，由广西医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK桂2009-0002，SPF级。大鼠饲养于空调实验室内，室温22±2℃，湿度60±5℃，自由饮水和摄食。
发明人对小鼠进行了抗胃溃疡、抗凝血、脑缺血缺氧、抗静脉血栓和抗高血脂的影响，具体结果见表1-表5。

本发明在药物的制备、剂量、给药途径平行的条件下对多叶越南槐总生物碱和山豆根总生物碱进行抗溃疡、抗凝血、抗脑缺血、抗血栓、降脂等药理作用研究。实验结果表明，多叶越南槐总生物碱和山豆根总生物碱均能减轻小鼠胃溃疡指数，延长小鼠凝血时间，延长小鼠脑缺血呼吸时间，降低大鼠静脉血栓重量以及降低高脂血症小鼠血脂水平；多叶越南槐总生物碱200mg.kg-1与山豆根总生物碱200mg.kg-1药效指标的作用程度相当。证实多叶越南槐总生物碱与山豆根总生物碱具有相近的药理作用，本发明的研究成果使用多叶越南槐来替代山豆根生产总生物碱成为可能，在未来将会有不可估计的市场前景及价值。

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1、(10)申请公布号 CN 104095907 A (43)申请公布日 2014.10.15 CN 104095907 A (21)申请号 201410371787.2 (22)申请日 2014.07.31 A61K 36/48(2006.01) A61P 1/04(2006.01) A61P 7/02(2006.01) A61P 9/10(2006.01) A61P 3/06(2006.01) G01N 30/90(2006.01) (71)申请人广西壮族自治区中医药研究院地址 530022 广西壮族自治区南宁市青秀区东葛路 20-1 号 (72)发明人卢文杰陈家源陆国寿谭晓黄。

2、建猷黄周锋何开家李燕婧钟正贤 (74)专利代理机构北京科亿知识产权代理事务所 ( 普通合伙 ) 11350 代理人罗保康 (54) 发明名称多叶越南槐中总生物碱的提取方法、检测方法及其应用 (57) 摘要本发明公开了多叶越南槐中总生物碱的提取方法、检测方法及其应用，其中提取方法分为两种：将多叶越南槐药材用 70-95% 乙醇加热回流提取得到流浸膏，经过加水混悬和调酸处理后用氯仿萃取，最终得到总生物碱；先将多叶越南槐药材渗漉提取，经 732 阳离子交换树脂洗脱提取，最后对树脂进行氯仿洗脱处理得到总生物碱。所得总生物碱通过薄层色谱法进行检测，。

3、使用三氯甲烷 - 甲醇 - 浓氨试液（4:1:0.1）为展开剂，以苦参碱、氧化苦参碱和氧化槐果碱作为总生物碱中定性成分，结果准确可靠。本发明中提取方法过程简单，所得总生物碱具有抗胃溃疡，抗凝血，抗脑缺血，抗血栓和降血脂等药理作用，具有较大的市场开发前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书7页 (10)申请公布号 CN 104095907 A CN 104095907 A 1/1 页 2 1. 一种多叶越南槐中总生物碱的提取方法，其特征在于：包括。

4、以下步骤：（1）将多叶越南槐药材粉碎成 20-80 目粗粉，用 70-95% 乙醇在 80-90下回流提取 3-5 次，每次 1-3 小时，趁热过滤，回收溶剂，得到 60-70下相对密度为 1.10-1.20 的流浸膏；（2）将流浸膏加水混悬，滴加浓硫酸至 pH 值为 3 ；（3）用氯仿萃取至氯仿颜色变浅，酸水层加碳酸钾至 pH 值为 11，用氯仿萃取至氯仿液蒸干无生物碱反应，回收氯仿得氯仿提取物，即得总生物碱。 2. 一种多叶越南槐中总生物碱的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将多叶越南槐药材粉碎成 20-80 目粗粉，用 1% 盐酸。

5、水溶液渗漉提取 1-7 天，收集渗漉液；（2）渗漉液通过预先处理好的 732 阳离子交换树脂柱，用水洗脱树脂柱至水液无色；（3）将树脂倒入敞开的器皿中，晾干，用氨水捏溶，用氯仿回流提取，至氯仿提取液蒸干检查无生物碱反应，回收氯仿提取液得氯仿提取物，即得总生物碱。 3. 根据权利要求 2 所述的多叶越南槐中总生物碱的提取方法，其特征在于：所述渗漉提取中加入 1% 盐酸水溶液为多叶越南槐药材质量的 8-20 倍。 4.根据权利要求2所述的多叶越南槐中总生物碱的提取方法，其特征在于：步骤（3）中所述氯仿回流提取 2-5 次。 5. 权利要求 1-2。

6、任一项所述的提取方法得到的多叶越南槐总生物碱的检测方法，其特征在于：采用薄层色谱进行定性鉴别，具体步骤为：（1）取多叶越南槐总生物碱 10mg，置 10ml 容量瓶中，加三氯甲烷至刻度，摇匀，作为供试品溶液；（2）取多叶越南槐药材粉末 0.5g，加三氯甲烷 10ml，浓氨试液 0.2ml，振摇 15 分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加 0.5ml 三氯甲烷使溶解，作为对照药材溶液；（3）另取苦参碱对照品，氧化苦参碱对照品，氧化槐果碱对照品加三氯甲烷制成每 1ml 各含 1mg 的混合溶液，作为对照品溶液；（4）吸取供试品溶液，对照。

7、药材溶液各 12 l，对照品溶液 46 l，分别点于同一硅胶 G 薄层板上，以三氯甲烷 - 甲醇 - 浓氨试液（4:1:0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化鉍钾试液，供试品色谱中，在与对照药材，对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色斑点。 6. 权利要求 1-2 任一项所述的提取方法得到的多叶越南槐总生物碱，在制备抗胃溃疡，抗凝血，抗脑缺血，抗血栓和降血脂药物中的应用。权利要求书 CN 104095907 A 2 1/7 页 3 多叶越南槐中总生物碱的提取方法、检测方法及其应用技术领域 0001 本发明属于药液提取技术领域，具。

8、体涉及一种多叶越南槐中总生物碱的提取方法、检测方法及其应用。背景技术 0002 多叶越南槐Sophora tonkinensis Gagnep.var.polyphyllaS. Z.Huang et Z.C.Zhou 为豆科槐属植物，与常用中药材山豆根学名：越南槐Sophora tonkinensis Gagnep 是同科同属同种的根，是越南槐的一个变种。生长于石山区，分布于广西、广东、云南、贵州和江西等省，在广西主要分布于红水河流域，如都安、马山、忻城、武鸣等地。其性寒，味苦，具有清热解毒、消肿利咽之功效，常用于火毒蕴结，咽喉肿痛，齿龈。

9、肿痛，肺热咳嗽，肝炎等疾患的治疗。 0003 有关多叶越南槐药物成分目前有了一些研究： 1、卢文杰、牙启康在广西科学 2011 年第四期发表了 “多叶越南槐脂溶性成分研究” 的文章，采用索氏提取法提取多叶越南槐（Sophora tonkinensis Gagnep.var. polyphyllaS.Z.Huang et Z.C.Zhou）的脂溶性成分 , 甲酯化后 , 用气相色谱 - 质谱联用（GC-MS）进行分析 , 计算机检索结合人工解析进行成分分析和鉴定 , 共分离得到 41 个峰 , 鉴定了其中 32 种成分。多叶越南槐脂溶性成分主要含长链脂肪酸。所有成分均。

10、首次在该植物中鉴定。 0004 2、卢文杰、陆国寿、谭晓、陈家源、黄周锋在中国实验方剂学杂志 2014 年第 20 卷第 8 期发表了 “多叶越南槐生物碱类成分的研究” 的文章，采用 Sephadex LH-20 柱色谱、硅胶柱色谱、重结晶等方法分离和纯化多叶越南槐的生物碱成分，综合运用红外光谱、质谱、核磁共振等技术和理化方法进行分析，并确定分离得到的生物碱结构。结果：根据理化性质及波谱数据，鉴定了各化合物的结构分别是：槐果碱，苦参碱，槐花醇， 9- 羟基苦参碱， 12- 羟基槐果碱，氧化槐果碱，氧化苦参碱，金雀花碱。结论：化合物 1 。

11、8 均为首次从多叶越南槐中分离得到。 0005 多叶越南槐与山豆根具有相同的药用功效，广西民间常把多叶越南槐当作山豆根药材来使用，广西中药材标准， 1990 版也将多叶越南槐作为山豆根药材的植物来源之一收载。据分析，多叶越南槐与山豆根一样含有苦参碱，槐果碱，槐花醇， 9 羟基苦参碱， 12-羟基槐果碱，氧化苦参碱，氧化槐果碱，金雀花碱等多种生物碱成分。目前市场上山豆根面临日益枯竭的现状，因此，对多叶越南槐中总生物碱进行提取开发，探索多叶越南槐药材能否作为山豆根的代用品，为资源利用和临床应用提供科学依据，显得尤为重要。发明内容 0006 本发明的目的是针对。

12、目前市场山豆根资源逐渐减少的问题，提供一种多叶越南槐中总生物碱的提取方法、检测方法及其应用，以此探索多叶越南槐药材能否作为山豆根的代用品，为资源利用和临床应用提供科学依据。说明书 CN 104095907 A 3 2/7 页 4 0007 本发明的目的是通过如下技术方案实现的：本发明多叶越南槐中总生物碱的提取方法分为两种：第一种方法为：将多叶越南槐药材用 70-95% 乙醇加热回流提取得到流浸膏，经过加水混悬和调酸处理后用氯仿萃取，最终得到总生物碱。 0008 具体步骤为：（1）将多叶越南槐药材粉碎成 20-80 目粗粉，用 70-95% 乙醇在 80-。

13、90下回流提取 3-5 次，每次 1-3 小时，趁热过滤，回收溶剂，得 60-70下相对密度为 1.10-1.20 的流浸膏；（2）将流浸膏加水混悬，滴加浓硫酸至 pH 值为 3 ；（3）用氯仿萃取至氯仿颜色变浅，酸水层加碳酸钾至 pH 值为 11，用氯仿萃取至氯仿液蒸干无生物碱反应，回收氯仿得氯仿提取物，即得总生物碱。 0009 第二种方法为：先将多叶越南槐药材渗漉提取，经 732 阳离子交换树脂洗脱提取，最后对树脂进行氯仿洗脱处理得到总生物碱。 0010 具体步骤为：（1）将多叶越南槐药材粉碎成 20-80 目粗粉，用多叶越南槐药材质量的 8-2。

14、0 倍的 1% 盐酸水溶液渗漉提取 1-7 天，收集渗漉液；（2）渗漉液通过预先处理好的 732 阳离子交换树脂柱，用水洗脱树脂柱至水液无色；（3）将树脂倒入敞开的器皿中，晾干，用氨水捏溶，用氯仿回流提取 2-5 次，至氯仿提取液蒸干检查无生物碱反应，回收氯仿提取液得氯仿提取物，即得总生物碱。 0011 732 阳离子交换树脂为强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，是一种磺酸化苯乙烯系凝胶型强酸阳离子交换树脂，具有交换容量高、交换速度快、机械强度高的特点，在多叶越南槐中提取总生物碱过程中较为合适，经发明人多次验证，使用该树脂洗脱提取总生物碱具有较高的收率。。

15、另外， 732 阳离子交换树脂柱预处理方法为：将树脂置于洁净的容器中，用清水漂洗，直到排水清晰为止。用水浸泡树脂1224小时，使树脂充分膨胀。如为干树脂，应先用饱和氯化钠溶液浸泡，再逐步稀释氯化钠溶液，以免树脂突然急剧膨胀而破碎。用树脂体积 2 倍量的 25%HCl 溶液浸泡树脂 24 小时，并不时搅拌。然后用低纯水洗涤树脂，直至溶液 pH 接近于 4，再用 25%NaOH 溶液处理，处理后用水洗至中性。 0012 为更好的控制多叶越南槐中总生物碱的质量，发明人还对从多叶越南槐中提取出的总生物碱进行反复探索和研究，制定了其检测标准，具体检测方法为：。

16、采用总生物碱的薄层色谱进行定性鉴别，取多叶越南槐总生物碱 10mg，置 10ml 容量瓶中，加三氯甲烷至刻度，摇匀，作为供试品溶液；取多叶越南槐药材粉末 0.5g，加三氯甲烷 10ml，浓氨试液 0.2ml, 振摇 15 分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加 0.5ml 三氯甲烷使溶解，作为对照药材溶液；另取苦参碱对照品，氧化苦参碱对照品，氧化槐果碱对照品加三氯甲烷制成每 1ml 各含 1mg 的混合溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液，对照药材溶液各 12 l，对照品溶液 46 l，分别点于同一硅胶 G 薄层板上，以三氯甲烷。

17、- 甲醇 - 浓氨试液（4:1:0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化鉍钾试液，供试品色谱中，在与对照药材，对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色斑点。 0013 本发明多叶越南槐中总生物碱，在制备抗胃溃疡，抗凝血，抗脑缺血，抗血栓和降血脂药物中的应用。经过发明人再三验证，多叶越南槐总生物碱高剂量与山豆根总生物碱高剂量均能减轻小鼠胃溃疡指数，延长小鼠凝血时间，延长小鼠脑缺血呼吸时间，降低大鼠静脉血栓重量，降低高脂血症小鼠血脂水平，两者作用相当；多叶越南槐总生物碱中剂量能减轻小鼠胃溃疡指数，延长小鼠脑缺血呼吸时间，降低大鼠静脉血栓。

18、重量；急性毒性结说明书 CN 104095907 A 4 3/7 页 5 果表明，多叶越南槐总生物碱的半数致死量（LD50）为 55.30g.kg-1， 95% 可信限为 48.15 64.37g.kg-1。 0014 本发明的多叶越南槐中总生物碱的提取方法、检测方法及其应用具有以下显著进步和优点：一、本发明的多叶越南槐中总生物碱的提取方法，可以使用乙醇回流提取得到流浸膏，然后进行氯仿萃取的方法，还可以使用盐酸水溶液渗漉提取后，经过 732 阳离子交换树脂柱洗脱，最后由氯仿提取的方法，以上两种提取方法均无需高温、高压环境，提取过程简单、易操作、易。

19、控制，较易实现工业化生产，对于多叶越南槐中总生物碱的批量提取提供了详实、可靠的数据资料。 0015 二、本发明的多叶越南槐中总生物碱的检测方法，通过薄层色谱法定性总生物碱中苦参碱，氧化苦参碱和氧化槐果碱来控制总生物碱的质量，较为准确。因为总生物碱中苦参碱、氧化苦参碱和氧化槐果碱是其中的主要成分，在其应用中起着主要作用。经发明人多次验证，以三氯甲烷 - 甲醇 - 浓氨试液（4:1:0.1）为展开剂对于定性总生物碱中的主要成分准确、可靠，同时使用薄层色谱法流程简单，重复性高，适合作为多叶越南槐中总生物碱的生产在线控制及出厂控制标准方法。 0016 三。

20、、本发明的多叶越南槐中总生物碱的提取方法提取的总生物碱含量较高，经发明人对其药理学研究发现，多叶越南槐总生物碱高剂量与山豆根总生物碱高剂量均能减轻小鼠胃溃疡指数，延长小鼠凝血时间，延长小鼠脑缺血呼吸时间，降低大鼠静脉血栓重量，降低高脂血症小鼠血脂水平，两者作用相当，多叶越南槐总生物碱具有一定的抗胃溃疡，抗凝血，抗脑缺血，抗血栓和降血脂作用，其毒性较低。 0017 具体实施方式实施例 1 多叶越南槐中总生物碱提取方法（方法一） 1-1 将多叶越南槐药材粉碎成 20 目粗粉，用 70% 乙醇在 90下回流提取 5 次，每次 1 小时，趁热过滤，回收溶剂，。

21、得到 60下相对密度为 1.20 的流浸膏；将流浸膏加水混悬，滴加浓硫酸至 pH 值为 3 ；用氯仿萃取至氯仿颜色变浅，酸水层加碳酸钾至 pH 值为 11，用氯仿萃取至氯仿液蒸干无生物碱反应，回收氯仿得氯仿提取物，即得总生物碱。 0018 1-2 将多叶越南槐药材粉碎成 80 目粗粉，用 75-90% 乙醇在 85下回流提取 4 次，每次 2 小时，趁热过滤，回收溶剂，得到 65时相对密度为 1.15 的流浸膏；将流浸膏加水混悬，滴加浓硫酸至pH值为3 ；用氯仿萃取至氯仿颜色变浅，酸水层加碳酸钾至pH值为11，用氯仿萃取至氯仿液蒸干无生物碱反应，。

22、回收氯仿得氯仿提取物，即得总生物碱。 0019 1-3将多叶越南槐药材粉碎成50目粗粉，用95%乙醇在80下回流提取3次，每次 3小时，趁热过滤，回收溶剂，得到70时相对密度为1.10的流浸膏；将流浸膏加水混悬，滴加浓硫酸至 pH 值为 3 ；用氯仿萃取至氯仿颜色变浅，酸水层加碳酸钾至 pH 值为 11，用氯仿萃取至氯仿液蒸干无生物碱反应，回收氯仿得氯仿提取物，即得总生物碱。 0020 实施例 2 多叶越南槐中总生物碱提取方法（方法二） 2-1 将20公斤多叶越南槐药材粉碎成粗粉，过20目筛，放入渗漉器中，层层压实，然后用配制好的 1% 盐酸水溶液。

23、 160 公斤放入渗漉器，密闭，提取 7 天，渗漉过程中不搅动，收集渗漉液；将渗漉液通过预先处理好的 732 阳离子交换树脂柱，然后用水洗脱树脂柱至水液无色；将树脂倒入敞开的容器中，晾干或在 55-65下烘干，用氨水捏溶，用氯仿回流提取 5 说明书 CN 104095907 A 5 4/7 页 6 次，至氯仿提取液蒸干检查无生物碱反应，回收氯仿提取液得氯仿提取物，即得总碱。 0021 2-2 将 15 公斤多叶越南槐药材粉碎成粗粉，过 20 目筛，放入渗漉器中，层层压实，然后用配制好的 1% 盐酸水溶液 300 公斤放入渗漉器，密闭，提取 1。

24、天，渗漉过程中不搅动，收集渗漉液；将渗漉液通过预先处理好的 732 阳离子交换树脂柱，然后用水洗脱树脂柱至水液无色；将树脂倒入敞开的容器中，晾干或在 55-65下烘干，用氨水捏溶，用氯仿回流提取 2 次，至氯仿提取液蒸干检查无生物碱反应，回收氯仿提取液得氯仿提取物，即得总碱。 0022 2-3 将30公斤多叶越南槐药材粉碎成粗粉，过20目筛，放入渗漉器中，层层压实，然后用配制好的 1% 盐酸水溶液 450 公斤放入渗漉器，密闭，提取 3-5 天，渗漉过程中不搅动，收集渗漉液；将渗漉液通过预先处理好的 732 阳离子交换树脂柱，然后用水。

25、洗脱树脂柱至水液无色；将树脂倒入敞开的容器中，晾干或在 55-65下烘干，用氨水捏溶，用氯仿回流提取 3-4 次，至氯仿提取液蒸干检查无生物碱反应，回收氯仿提取液得氯仿提取物，即得总碱。 0023 上述提取方法中 732 阳离子交换树脂柱预处理方法为：将树脂置于洁净的容器中，用清水漂洗，直到排水清晰为止。用水浸泡树脂 15 小时，使树脂充分膨胀。用树脂体积 2 倍量的 5%HCl 溶液浸泡树脂 4 小时，并不时搅拌，然后用低纯水洗涤树脂，直至溶液 pH 接近于 4，再用 5%NaOH 溶液处理，处理后用水洗至中性。 0024 732 阳离子交换树脂。

26、规格型号如下：实施例 3 多叶越南槐中总生物碱的检测方法取实施例 1 或 2 提取方法所得多叶越南槐总生物碱 10mg, 置 10ml 容量瓶中，加三氯甲烷至刻度，摇匀，作为供试品溶液；取多叶越南槐药材粉末 0.5g，加三氯甲烷 10ml，浓氨试液 0.2ml，振摇 15 分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加 0.5ml 三氯甲烷使溶解，作为对照药材溶说明书 CN 104095907 A 6 5/7 页 7 液；另取苦参碱对照品，氧化苦参碱对照品，氧化槐果碱对照品加三氯甲烷制成每 1ml 各含 1mg 的混合溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法试验，。

27、吸取供试品溶液，对照药材溶液各 12 l，对照品溶液 46 l，分别点于同一硅胶 G 薄层板上，以三氯甲烷 - 甲醇 - 浓氨试液（4:1:0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化鉍钾试液，供试品色谱中，在与对照药材，对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色斑点。 0025 实施例 4 效果实施例发明人对从多叶越南槐中提取的总生物碱进行了诸多药理作用研究，试用药品如下：多叶越南槐总生物碱（多叶越南槐中自提 - 实施例 1 或 2）；山豆根总生物碱药膏；广西中医药研究院化学所提供；西米替丁片，江西济民可信药业有限公司；阿司匹林肠溶片。

28、，武汉远大制药集团股份有限公司产品；复方丹参片，广东白云山和记黄埔中药有限公司产品；血脂康胶囊，北京北大维信生物科技有限公司产品。 0026 供试动物：昆明种小鼠，体重 18-22g, 雌雄各半； SD 大鼠， 20020g，雌雄各半，由广西医科大学实验动物中心提供，许可证号： SCXK 桂 2009-0002， SPF 级。大鼠饲养于空调实验室内，室温 222，湿度 605，自由饮水和摄食。 0027 发明人对小鼠进行了抗胃溃疡、抗凝血、脑缺血缺氧、抗静脉血栓和抗高血脂的影响，具体结果见表 1- 表 5。说明书 CN 104095907。

29、 A 7 6/7 页 8 说明书 CN 104095907 A 8 7/7 页 9 0028 本发明在药物的制备、剂量、给药途径平行的条件下对多叶越南槐总生物碱和山豆根总生物碱进行抗溃疡、抗凝血、抗脑缺血、抗血栓、降脂等药理作用研究。实验结果表明，多叶越南槐总生物碱和山豆根总生物碱均能减轻小鼠胃溃疡指数，延长小鼠凝血时间，延长小鼠脑缺血呼吸时间，降低大鼠静脉血栓重量以及降低高脂血症小鼠血脂水平；多叶越南槐总生物碱200mg.kg-1与山豆根总生物碱200mg.kg-1药效指标的作用程度相当。证实多叶越南槐总生物碱与山豆根总生物碱具有相近的药理作用，本发明的研究成果使用多叶越南槐来替代山豆根生产总生物碱成为可能，在未来将会有不可估计的市场前景及价值。说明书 CN 104095907 A 9 。

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