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1、(10)申请公布号 CN 104086657 A (43)申请公布日 2014.10.08 CN 104086657 A (21)申请号 201410321862.4 (22)申请日 2014.07.07 C07K 19/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/70(2006.01) G01N 33/68(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (71)申请人 同昕生物技术 （北京） 有限公司 地址 102206 北京市昌平区生命园路29号A 座 211 室 (72)发明人 贾凤芹 (74)专利代理机构 北京海虹嘉诚知识产权代理 有限公司。
2、 11129 代理人 吴泳历 (54) 发明名称 用于联合检测 EB 病毒 Rta 蛋白抗体与 EB 病 毒早期抗原 EA 抗体的人工抗原及试剂盒 (57) 摘要 本发明涉及生物技术、 医学免疫学与体外血 清学诊断技术领域， 尤其涉及一种用于联合检测 EB 病毒 Rta 蛋白抗体与 EB 病毒早期抗原 EA 抗体 的人工抗原及试剂盒。 本发明提供的人工抗原， 能 够准确、 高效、 灵敏、 特异地检出待测样品中存在 的 EB 病毒 Rta 蛋白抗体与早期抗原 EA 抗体。采 用所述人工抗原制成的试剂盒， 与传统的检测方 法相比， 提高了鼻咽癌诊断的灵敏度和特异性， 缩 短了检测时间， 使患者能得。
3、到及时的治疗， 减轻痛 苦。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 16 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表16页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104086657 A CN 104086657 A 1/1 页 2 1. 一种用于联合检测 EB 病毒 Rta 蛋白抗体与 EB 病毒早期抗原 EA 抗体的人工抗原， 其氨基酸序列的结构为 N-R1-R2-C 或 N-R2-R1-C， 其中 R1 的氨基酸序列如 SEQ ID NO:1 所 示 ； R2 的氨基酸序列如 SEQ ID N。
4、O:2 所示。 2. 一种含有 EB 病毒 Rta 蛋白与早期抗原 EA 的抗原决定簇的抗原蛋白， 包含 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2 所示的氨基酸序列。 3. 编码权利要求 1 所述的人工抗原的基因。 4. 根据权利要求 3 所述的基因， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:4 所示。 5. 含有权利要求 3 或 4 所述的基因的重组质粒。 6. 根据权利要求 5 所述的重组质粒， 是以表达载体 pET32a(+) 为骨架载体， 以 SEQ ID NO:3 所示的基因为外源基因的重组质粒 pET32a-Rta-EA。 7.一种用于联合检测EB。
5、病毒Rta蛋白抗体与EB病毒早期抗原EA抗体的试剂盒， 其特 征在于 ： 以权利要求 1 所述的人工抗原为检测抗原。 8. 根据权利要求 7 所述的试剂盒， 其特征在于， 包括酶标板和酶标记的抗人 IgA、 校准 品溶液、 阳性对照溶液、 阴性对照溶液、 底物显色液、 终止液、 样品稀释液及浓缩洗涤液， 所 述人工抗原包被于所述酶标板的反应孔中。 9. 根据权利要求 8 所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述酶标记的抗人 IgA 在酶标记中所 用的标记酶为辣根过氧化物酶， 所述显色液由显色 A 液和显色 B 液组成， 显色 A 液为过氧化 氢或过氧化脲， 显色 B 液为邻苯二胺或四甲基联苯胺， 。
6、终止液为 1 2mol/L 硫酸或者盐酸 溶液， 所述辣根过氧化物酶标记的抗人 IgA 的工作稀释度为 1 ： 5000 1:80000 ； 或者所述标记酶为碱性磷酸酯酶， 显色液为硝基磷酸盐缓冲液， 终止液为 1 2mol/L 氢氧化钠溶液。 10. 根据权利要求 8 所述的试剂盒， 所述校准品溶液为含人 EBV-Rta-EA-IgA 阳性血清 的 pH7.4 磷酸盐缓冲液， 所述阳性对照溶液为含人 EBV-Rta-EA-IgA 阳性血清的 pH7.4 磷酸 盐缓冲液， 所述阴性对照溶液为含人 EBV-Rta-EA-IgA 阴性血清的 pH7.4 磷酸盐缓冲液， 所 述样品稀释液为含有 0.。
7、3M NaCl 的 50mM 的磷酸盐缓冲液， 所述浓缩洗涤液为含有 0.02 0.05 (v/v)Proclin300 和 1.0 2.0 (v/v) 吐温 -20 的 pH 值为 7.2 8.5 的 0.01 0.03mol/L 的磷酸盐缓冲液。 11. 权利要求 7 10 任一所述的试剂盒的制备方法， 包括如下步骤 ： 1) 制备酶标板 ： 用包被缓冲液将权利要求 1 所述的人工抗原稀释至 100ng/ml， 然后加入到酶标板孔 中， 每孔 100l， 进行反应 ； 所述包被缓冲液为 pH 值 9.0 9.6 的 0.1mol/L 的碳酸盐缓冲 液 ； 甩掉包被液后， 拍干， 每孔加入 。
8、200l 的封闭液， 反应， 甩掉封闭液， 拍干， 保存 ； 所述 封闭液为含有 1 10 (m/m) 牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液 ； 2) 配制酶标记的抗人 IgA ： 亲和层析纯化 HRP 标记的抗人 IgA， 纯度大于 95， 效价不低于 1:2000 ； 3) 配制校准品溶液、 阳性对照溶液、 阴性对照溶液、 底物显色液、 终止液、 样品稀释液及 浓缩洗涤液。 权 利 要 求 书 CN 104086657 A 2 1/6 页 3 用于联合检测 EB 病毒 Rta 蛋白抗体与 EB 病毒早期抗原 EA 抗体的人工抗原及试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及生物技术、 医学免疫学与体外血清。
9、学诊断技术领域， 尤其涉及一种用 于联合检测 EB 病毒 Rta 蛋白抗体与 EB 病毒早期抗原 EA 抗体的人工抗原及试剂盒。 背景技术 0002 EB 病毒是 Epstein 和 Barr 于 1964 年首次成功地将 Burkitt 非洲儿童淋巴瘤 细胞通过体外悬浮培养而建株， 并在建株细胞涂片中用电镜观察到的疱疹病毒颗粒。该 病毒是多种恶性肿瘤 ( 如鼻咽癌 ) 的病因之一， 它主要感染人类口咽部的上皮细胞和 B 淋巴细胞。在中国南方鼻咽癌患病人群中大多都检测到有 EB 病毒基因组存在。鼻咽癌 (nasopharygeal carcinoma,NPC) 是指发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性。
10、肿瘤， 多发于东南 亚地区， 在我国南方各种恶性肿瘤中占第一位。 0003 经多年研究发现， 鼻咽癌与 EB 病毒关系最为密切， EB 病毒被激活感染鼻咽部细 胞， 由潜伏期进入裂解复制状态时， 导致鼻咽部细胞发生异常分裂增生造成癌变。 鼻咽癌患 者血清中具有针对多种 EB 病毒抗原的抗体谱， 一般通过检测血清 EB 病毒抗体来评估患鼻 咽癌的危险度， 为鼻咽癌的诊断提供了有效的检测指标。申请号为 200610113403 的发明专 利申请公开了 Rta 是 EB 病毒刚刚进入裂解复制状态时就表达的立即早期基因 BRLF1 的编 码转录激活蛋白， 是 EB 病毒进入裂解复制状态必需的激活元件而。
11、且仅在鼻咽癌发生时表 达， 对诊断鼻咽癌具有极高的特异性。现在临床用于诊断鼻咽癌的主要指标为 ： EB 病毒衣 壳抗原(VCA)、 早期抗原(EA)， 且主要是检测其IgA抗体， 用于鼻咽癌患者的诊断和预警。 经 大量临床实验证实 EB 病毒 VCA-IgA 抗体用于鼻咽癌诊断虽然灵敏度高， 但是特异性差， 在 健康人群中有很高的检出率 ； EB 病毒 EA-IgA 抗体用于鼻咽癌诊断特异性好， 但灵敏度差， 鼻咽癌漏检率较高。而 EB 病毒 Rta-IgA 抗体用于鼻咽癌诊断特异性非常好。 发明内容 0004 本发明针对上述领域存在的问题， 提供一种用于联合检测EB病毒Rta蛋白抗体与 EB。
12、 病毒早期抗原 (EA) 抗体的人工抗原及试剂盒。 0005 本发明请求保护的技术方案如下 ： 0006 一种用于联合检测 EB 病毒 Rta 蛋白抗体与 EB 病毒早期抗原 EA 抗体的人工抗原， 其氨基酸序列的结构为 N-R1-R2-C 或 N-R2-R1-C， 其中 R1 的氨基酸序列如 SEQ ID NO:1 所 示 ； R2 的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2 所示。 0007 一种含有 EB 病毒 Rta 蛋白与早期抗原 EA 的抗原决定簇的抗原蛋白， 包含 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2 所示的氨基酸序列。 0008 编码上述人工抗原的基因。 0009 上。
13、述人工抗原的基因， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:4 所示。 0010 含有任一上述人工抗原的基因的重组质粒。 说 明 书 CN 104086657 A 3 2/6 页 4 0011 所述重组质粒， 是以表达载体pET32a(+)为骨架载体， 以SEQ ID NO:3所示的基因 为外源基因的重组质粒 pET32a-Rta-EA。 0012 一种用于联合检测 EB 病毒 Rta 蛋白抗体与 EB 病毒早期抗原 EA 抗体的试剂盒， 其 特征在于 ： 以上述人工抗原为检测抗原。 0013 所述试剂盒包括酶标板和酶标记的抗人 IgA、 校准品溶液、 阳性对照溶液、 。
14、阴性对 照溶液、 底物显色液、 终止液、 样品稀释液及浓缩洗涤液， 所述人工抗原包被于所述酶标板 的反应孔中。 0014 所述酶标记的抗人 IgA 在酶标记中所用的标记酶为辣根过氧化物酶， 所述显色液 由显色 A 液和显色 B 液组成， 显色 A 液为过氧化氢或过氧化脲， 显色 B 液为邻苯二胺或四甲 基联苯胺， 终止液为 1 2mol/L 硫酸或者盐酸溶液， 所述辣根过氧化物酶标记的抗人 IgA 的工作稀释度为 1 ： 5000 1:80000 ； 0015 或者所述标记酶为碱性磷酸酯酶， 显色液为硝基磷酸盐缓冲液， 终止液为 1 2mol/L 氢氧化钠溶液。 0016 所述校准品溶液为含人。
15、EBV-Rta-EA-IgA阳性血清的pH7.4磷酸盐缓冲液， 所述阳 性对照溶液为含人EBV-Rta-EA-IgA阳性血清的pH7.4磷酸盐缓冲液， 所述阴性对照溶液为 含人 EBV-Rta-EA-IgA 阴性血清的 pH7.4 磷酸盐缓冲液， 所述样品稀释液为含有 0.3M NaCl 的50mM的磷酸盐缓冲液， 所述浓缩洗涤液为含有0.020.05(v/v)Proclin300和1.0 2.0 (v/v) 吐温 -20 的 pH 值为 7.2 8.5 的 0.01 0.03mol/L 的磷酸盐缓冲液。 0017 任一上述试剂盒的制备方法， 包括如下步骤 ： 0018 1) 制备酶标板 ： 。
16、0019 用包被缓冲液将权利要求 1 所述的人工抗原稀释至 100ng/ml， 然后加入到酶标板 孔中， 每孔 100l， 进行反应 ； 所述包被缓冲液为 pH 值 9.0 9.6 的 0.1mol/L 的碳酸盐缓 冲液 ； 0020 甩掉包被液后， 拍干， 每孔加入 200l 的封闭液， 反应， 甩掉封闭液， 拍干， 保存 ； 所述封闭液为含有 1 10 (m/m) 牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液 ； 0021 2) 配制酶标记的抗人 IgA ： 0022 亲和层析纯化 HRP 标记的抗人 IgA， 纯度大于 95， 效价不低于 1:2000 ； 0023 3) 配制校准品溶液、 阳性对照溶液、。
17、 阴性对照溶液、 底物显色液、 终止液、 样品稀释 液及浓缩洗涤液。 0024 本发明所述的抗原蛋白为经优化后的串联表达的 EB 病毒早期抗原 EA 和 Rta 蛋 白。具体地， 在 NCBI 网站查找 EB 病毒 EA 抗原 (Protein Id ： CAA24844.1)、 Rta 蛋白的氨基 酸 (Protein Id ： CAA24813.1) 序列 (GenBank:V01555.2)， 对两个蛋白所具有的抗原表位进 行分析， 选择抗原表位比较集中且不影响蛋白空间结构的片段， 然后对两个蛋白中选择保 留的多肽片段的氨基酸序列信息进行连接得到人工抗原的氨基酸序列， 如 SEQ ID 。
18、NO:5 或 SEQ ID NO:6所示 ； 并对编码该人工抗原的核苷酸密码子进行优化， 根据优化的基因序列进 行人工抗原的基因合成， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:4 所示。 0025 利用 PCR 技术扩增上述合成的人工基因片段， 构建至原核表达载体， 并在大肠杆 菌中表达该重组蛋白， 将纯化后的重组蛋白通过 ELISA 方法检测 EB 病毒抗体， 用于辅助鼻 咽癌的临床筛查与诊断。 实验数据表明， 本发明的人工抗原蛋白在鼻咽癌的临床诊断中， 对 说 明 书 CN 104086657 A 4 3/6 页 5 EB病毒Rta-IgA抗体和EA-IgA抗体的联。
19、合检测能够弥补单独检测EA-IgA抗体时灵敏度差 这一缺点， 同时增强检测的特异性， 为鼻咽癌的诊断提供了有效的检测指标。 用本发明的人 工抗原以一定浓度包被酶标板， 制成的 ELISA 检测试剂盒能够准确、 高效、 灵敏、 特异地检 测样品中存在的 EB 病毒 Rta 蛋白与早期抗原 (EA) 的抗体。在鼻咽癌病人血清样本和健康 人血清样本的检测中， 鼻咽癌病人的阳性检出率， 即灵敏度为 91.4； 健康人群检测的阴性 率为 96.4， 均高于目前常规使用的单独的 EA、 VCA 抗体的检测， 有利于临床鼻咽癌筛查， 使患者得到及时、 恰当的治疗。 0026 本发明提供的人工抗原的制成的试剂。
20、盒形式不限于包被酶标板， 只要是基于 ELISA 原理的检测载体， 只要采用了本发明的人工抗原， 都包括在本发明请求保护的范围 内。 0027 本发明所用的表达载体不限于特定的表达载体， 只要它能与所述抗原蛋白的 DNA 片段重组， 形成适合蛋白表达的表达质粒即可。 0028 本发明还提供一种用于联合检测 EB 病毒 Rta 蛋白抗体与 EB 病毒早期抗原 (EA) 抗体的试剂盒， 其特征在于包括一个以本发明的人工抗原作为包被抗原的酶标板。 0029 本发明制备的优选试剂盒中， 主要试剂采用工作液形式， 成本低廉， 操作简便， 简 化了传统检测方法的步骤， 缩短了检测时间， 同时能实现多样本处。
21、理， 提高了检测效率， 使 医生能够迅速了解患者的病情， 及时提出合适的治疗方案。 0030 本发明的试剂盒采用板式酶标板， 能够适应国内普及的检测设备， 并且能保证检 测的灵敏度高、 特异性好、 准确度高、 稳定性好。 0031 综上， 本发明提供的人工抗原， 能够准确、 高效、 灵敏、 特异地检出待测样品中存在 的 EB 病毒 Rta 蛋白抗体与早期抗原 EA 抗体。采用所述人工抗原制成的试剂盒， 与传统的 检测方法相比， 提高了鼻咽癌诊断的灵敏度和特异性， 缩短了检测时间， 使患者能得到及时 的治疗， 减轻痛苦。 附图说明 0032 图 1pET32a-Rta-EA 重组质粒图谱 003。
22、3 图 2BCA-100 蛋白质定量试剂盒标准蛋白曲线 具体实施方式 0034 提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明， 并不局限于所述最佳实施方 式， 不对本发明的内容和保护范围构成限制。任何人在本发明的启示下或是将本发明与其 它现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品， 均落在本发明的 保护范围之内。 0035 本发明所用试剂来源及规格如下 ： 0036 实验所用载体、 限制性内切酶、 T4DNA 连接酶、 pMD18-T 和 pET32a 购自 TaKaRa 公 司 ； 0037 序列合成、 引物合成、 测序由上海生物工程公司完成 ； 0038 辣根过氧化物酶购于。
23、 SIGMA， 批号为 9003-99-0 ； 0039 过氧化氢购于 SIGMA， 批号为 7722-84-1 ； 说 明 书 CN 104086657 A 5 4/6 页 6 0040 过氧化脲购于 SIGMA， 批号为 U1753 ； 0041 邻苯二胺或四甲基联苯胺购于 SIGMA， 批号为 T2885 ； 0042 12mol/L 硫酸购于北京化工厂， 批号为 7647-02-0 ； 0043 盐酸溶液购于北京化工厂， 批号为 7647-01-0 ； 0044 12mol/L 氢氧化钠溶液购于北京化工厂， 批号为 1310-73-2。 0045 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说。
24、明， 均为本领域技术人员熟知的常规 实验方法。 0046 实施例 1 EB 病毒 Rta 蛋白、 EA 抗原在大肠杆菌中的串联表达 0047 在 NCBI 网站查找 EB 病毒 Rta 蛋白、 EA 抗原的氨基酸序列 ( 见序列表 SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8)，采 用 http:/www.imtech.res.in/raghava/bcepred/bcepred_ submission.html对其抗原表位进行分析， 对其抗原表位进行选择， 获得优化的EB病毒Rta 蛋白片段 (Seq ID No ： 1) 和优化的 EB 病毒 EA 抗原 (Seq ID No ： 2。
25、)， 并对密码子进行优化。 将优化后的 Rta、 EA 抗原基因序列组合并合成， 用 Primer5.0 引物设计软件设计引物， 0048 上游引物 P1 ： 5 -CCTCGAGATGGCTTCTTCTAACCGT-3 , 0049 下游引物 P2 ： 5 -CTGGATCCTTTGGTTTTGAAACGCAG-3 。 0050 Pl、 P2 引物中分别含有 Xho I、 BarmH I 酶切位点。 0051 利用 PCR 技术扩增上述合成基因。 0052 PCR 反应体系 ： 0053 0054 PCR反应参数 ： 94预变性5min， 94变性60S， 54退火60S， 72延伸60S，。
26、 共30 个循环， 最后 72延伸 10min。PCR 产物经凝胶电泳后回收大小为 1155bp 的 DNA 条带， 如 Seq ID No.3 所示， 为人工抗原基因序列。 0055 将回收后的目的片段与 pMD18-T 载体连接， 转化 ( 具体操作按照 分子克隆 指南进行 )， 将经 PCR、 酶切鉴定的阳性质粒 pMD18-Rta-EA 进行测序验证， 合格后将 pMD18-Rta-EA及表达载体pET32a(+)分别进行Xho I/BarmH I双酶切， 回收后进行连接， 转 化后所得阳性质粒命名为 pET32a-Rta-EA， 经测序合格后， 将其转化大肠杆菌 BL21 感受态 细。
27、胞， 挑取转化子， 接种于含 100mg/L 卡那抗生素的 LB 培养基中， 37振荡培养过夜。 说 明 书 CN 104086657 A 6 5/6 页 7 0056 将培养物按 l比例接种于含卡那抗生素的新鲜 LB 培养基中， 37振荡培养至 D600nm为0.40.6时， 加入IPTG至终浓度分别为0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0、 1.2mmol/L， 37诱 导培养 4h， 按常规方法离心收集菌体， 将采用超声波破碎的细菌上清、 沉淀及细菌总蛋白进 行SDS-PAGE电泳分析。 结果在64KD附近出现明显的蛋白条带， 大小与预期融合蛋白的分子 量一致， 用 BandSc。
28、an 软件分析， 表达的融合蛋白约占菌体总蛋白的 52.3。按照 BCA-100 蛋白质定量试剂盒 ( 北京赛驰生物， 产品货号 300001-B) 操作说明书进行试验， 为表达的 蛋白进行定量测定， 具体为根据BCA-100蛋白质定量试剂盒标准蛋白所测平均OD值为纵坐 标， 各孔的蛋白质浓度 (mg/m1) 为横坐标制作标准蛋白曲线， 经线性回归拟合得回归方程， 将样本的 OD 值代入， 计算出 EB 病毒 pET32a-Rta-EA 蛋白浓度为 1.78mg/ml。 0057 实施例2 用于联合检测EB病毒Rta蛋白抗体与早期抗原EA抗体的试剂盒的制备 0058 ( 一 ) 试剂盒的组成 。
29、0059 1、 包被有Rta-EA抗原的酶标板 ： 包被蛋白为高纯度基因重组Rta-EA蛋白， 包被浓 度可以为 0.05-0.25g/ml ； 0060 2、 HRP 标记的羊抗人 IgA， 其工作稀释度可以为 1 ： 50001:80000 ； 0061 3、 校准品溶液、 阳性对照溶液、 阴性对照溶液， 各 1 瓶， 1ml/ 瓶 ； 0062 4、 样品稀释液 ： 为含 0.3M NaCL 的 50mM 的磷酸盐缓冲液， 25ml/ 瓶， 2 瓶 ； 0063 5、 底物显色液 ： 由 A 液和 B 液组成， 底物显色液 A 液为过氧化脲， 7ml/ 瓶， 1 瓶 ； 底 物显色液 B。
30、 液为四甲基联苯胺， 7ml/ 瓶， 1 瓶 ； 0064 6、 终止液 ： 2mol/l 硫酸 ； 0065 7、 浓缩洗涤液 ： pH 值为 7.4， 含有终浓度为 0.05的 Proclin300、 终浓度为 2.0 的吐温 -20、 0.02mol/L 的磷酸盐缓冲液， 40ml/ 瓶， 1 瓶。 0066 ( 二 ) 试剂盒的制备 0067 1、 包被有高纯度基因重组 Rta-EA 抗原的酶标板的制备 0068 (1) 包被蛋白为实施例 1 制备的高纯度基因重组 Rta-EA 抗原。 0069 (2) 抗原包被酶标板的制备 ： 0070 用包被缓冲液 (pH 值为 9.6、 0.1m。
31、ol/L 碳酸盐缓冲液 ) 将以上 EB 病毒 Rta-EA 抗 原进行 1 ： 10000 稀释， 加入到酶标板孔中， 每孔 100l， 37反应 2 小时， 甩掉包被液后， 拍 干， 每孔加入 200l 的封闭液 ( 含终浓度为 2牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液 )， 37反应 2 小时， 甩掉封闭液， 拍干， 干燥， 用铝箔袋真空包装保存。 0071 2、 工作浓度酶溶液的配制 0072 HRP 标记羊抗人 IgA 需经亲和层析纯化， 种属特异性强， 纯度大于 95， 效价不低 于 1:2000。选择商品化酶联物稀释液， 由 biopanda 诊断试剂公司生产。 0073 3、 校准品、 阳性。
32、对照、 阴性对照的配制 0074 校准品、 阳性对照用经检测 HIV 抗体、 HCV 抗体和 HBsAg 均为阴性， 用本发明试剂 盒检测 EBV Rta-EA-IgA 为阳性的血清样本， 用 pH7.4 的磷酸盐缓冲液稀释为相应浓度。 0075 阴性对照用经检测 HIV 抗体、 HCV 抗体和 HBsAg 均为阴性， 用本发明试剂盒检测 EBVRta-EA-IgA 为阴性的血清样本， 用 pH7.4 的磷酸盐缓冲液稀释为相应浓度。 0076 ( 三 ) 试剂盒的使用方法 0077 1、 检测 说 明 书 CN 104086657 A 7 6/6 页 8 0078 向包被高纯度基因重组 Rta。
33、-EA 蛋白的酶标板中加入样本稀释液 100l， 每孔加 样本10l， 并在预留的孔中加入EBV Rta-IgG校准品溶液、 阴性对照、 阳性对照各100l， 用盖板膜封板， 37恒温箱中反应 30 分钟， 洗板 5 次， 拍干 ； 每孔中各加入辣根过氧化物 酶标记的羊抗人 IgA100l， 用盖板膜封板， 37恒温箱中反应 20 分钟， 甩干孔内液体， 洗 板 5 次， 拍干 ； 每孔加入底物显色液 A 液过氧化脲 50l， 底物显色液 B 液四甲基联苯胺 (TMB)50l， 轻轻振荡混匀， 37恒温箱避光显色 10 分钟， 每孔加入 2mol/L 硫酸终止液 50l， 轻轻振荡混匀， 将酶。
34、标仪波长设定在 450/630nm 处， 测定每孔吸光值 (OD 值 )。 0079 2、 检测结果分析 0080 以校准品的吸光度值作为临界值， 检测结果高于临界值的样本为阳性， 低于临界 值的样本为阴性。 0081 实施例 3 本发明试剂盒的临床试验评价 0082 用本发明制备的试剂盒对55例正常人样本和58例确诊鼻咽癌的病人样本进行检 测， 检测程序和结果判断严格按照实施例2提供的试剂盒的使用方法进行， 同时选用VCA抗 体检测试剂盒和 EA 抗体检测试剂盒 ( 均商购自中国预防医学病毒学研究所 ) 进行平行检 测， 具体操作按照试剂盒说明书进行。检测结果如表 1 所示。 0083 表 。
35、1 检测结果比较 0084 0085 由以上结果可以看出， 本发明提供的试剂盒在鼻咽癌的诊断和筛查中性能极好， 灵敏度为 91.4， 特异性为 96.4， 可用于临床使用。 说 明 书 CN 104086657 A 8 1/16 页 9 0001 0002 序 列 表 CN 104086657 A 9 2/16 页 10 0003 序 列 表 CN 104086657 A 10 3/16 页 11 0004 序 列 表 CN 104086657 A 11 4/16 页 12 0005 序 列 表 CN 104086657 A 12 5/16 页 13 0006 序 列 表 CN 1040866。
36、57 A 13 6/16 页 14 0007 序 列 表 CN 104086657 A 14 7/16 页 15 0008 序 列 表 CN 104086657 A 15 8/16 页 16 0009 序 列 表 CN 104086657 A 16 9/16 页 17 0010 序 列 表 CN 104086657 A 17 10/16 页 18 0011 序 列 表 CN 104086657 A 18 11/16 页 19 0012 序 列 表 CN 104086657 A 19 12/16 页 20 0013 序 列 表 CN 104086657 A 20 13/16 页 21 0014 序 列 表 CN 104086657 A 21 14/16 页 22 0015 序 列 表 CN 104086657 A 22 15/16 页 23 0016 序 列 表 CN 104086657 A 23 16/16 页 24 序 列 表 CN 104086657 A 24 1/1 页 25 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104086657 A 25 。