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1、(10)申请公布号 CN 104090099 A (43)申请公布日 2014.10.08 CN 104090099 A (21)申请号 201210432970.X (22)申请日 2013.04.07 G01N 33/558(2006.01) G01N 33/577(2006.01) (71)申请人 江苏维赛科技生物发展有限公司 地址 212009 江苏省镇江市丁卯经十五路国 家科技核心区 99 号 B11 栋 3 层 (72)发明人 杜道林 尚苏林 (54) 发明名称 安普霉素胶体金试纸条的制备及使用方法 (57) 摘要 本发明涉及一种安普霉素药物残留快速检测 的胶体金试纸条的制备及使用。
2、方法。该方法在试 纸的背衬上依次粘贴有样品垫、 金标垫、 硝酸纤维 素膜和样品吸收垫。硝酸纤维素膜上面包被有检 测用抗原 1 条作为检测线， 同时还包被有抗第二 种属动物蛋白的 IgG1 条作为参照线。该快速检 测试纸条特异性强， 能够半定量检测， 环境温度为 4-40都可以使用， 适合于个体养殖户、 食品卫生 质检部门、 海关等动物源食品进行安普霉素残留 的快速检测。本发明具有特异性强、 灵敏性高、 能 够实现半定量检测， 且操作简单方便等有益效果。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求。
3、书1页 说明书4页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104090099 A CN 104090099 A 1/1 页 2 1. 安普霉素胶体金试纸条， 其特征在于 ： 在试纸的背衬上依次贴有样品垫、 金标垫、 硝 酸纤维素膜和吸水纸， 金标垫部分被标记的物质为第二种属动物蛋白和安普霉素抗体的混 合物 ； 硝酸纤维素膜部分包被有检测用安普霉素抗原 1 条作为检测线， 同时还包被有抗第 二种属动物蛋白的 IgG 1 条作为参照线。 2. 根据权利要求 1 所述的安普霉素胶体金试纸条， 其特征在于 ： 安普霉素检测用抗原 为安普霉素与载体物质形成的偶合物。 3. 根据权利要求 2 所述的安普霉素。
4、胶体金试纸条， 其特征在于 ： 所述的载体物质， 为蛋 白质、 蛋白质片段、 合成多肽、 半合成多肽或多糖。 4. 根据权利要求 1 所述的安普霉素胶体金试纸条， 其特征在于 ： 所述的第二种属动物 蛋白为非抗体来源动物的蛋白质。 权 利 要 求 书 CN 104090099 A 2 1/4 页 3 安普霉素胶体金试纸条的制备及使用方法 技术领域 0001 本发明属于食品安全检测领域， 具体涉及食品中安普霉素药物残留的一种快速胶 体金试纸条的制备及使用方法。 背景技术 0002 安普霉素又名阿普拉霉素， 易溶于水， 稍溶于低级醇， 不溶于其他有机溶剂。紫外 吸收光谱为末端吸收为红外光谱具有典型。
5、的氨基糖苷类抗生素的多氨基、 多羟基特征吸收 峰。是一种黑暗链菌产生的氨基糖苷类新兽用抗生素， 20 世纪 80 年代由美国开发成功， 其 特点是抗菌谱广， 不易产生抗药性， 可用于鸡大肠杆菌、 沙门氏杆菌和支原体引起的感染。 作为药物型饲料添加剂， 安普霉素能明显促进增重和提高饲料转化率， 在畜禽养殖领域得 到广泛应用。主要用于家禽的大肠杆菌、 沙门氏杆菌感染， 疗效非常显著， 被美国 FDA 推荐 为治疗大肠杆菌病的首选药物， 对支原体病也有效。 0003 安普霉素平时也称其为硫酸安普霉素， 是一种抗菌性抗生素。很多兽药当中都包 含安普霉素， 但使用过多可能导致动物机体虚软， 所以用量要适。
6、当。在食品和饲料中， 安普 霉素的检测方法有薄层色谱法， 气象色谱法， 气 - 质联机和高效液相色谱法， 由于以上诸分 析法样品前处理比较复杂， 操作时需专门的技术人员、 检测费用昂贵， 不利于推广应用。 发明内容 0004 本发明的目的是为了克服现有技术的不足， 提供一种特异性强， 灵敏度高， 且操作 简单方便， 对样品经过简单处理即可检测的安普霉素快速试纸半定量检测方法。 0005 本发明的目的可通过以下技术方案来实现 ： 安普霉素胶体金试纸条检测方法其技术要点是 ： 试纸的背衬上依次贴有样品垫和金标 垫和硝酸纤维素膜和吸水吸水纸， 金标垫上被标记的物质为第二种属动物蛋白与安普霉素 检测用。
7、抗原的混合物或第二种属动物蛋白与安普霉素抗体的混合物 ； 硝酸纤维素膜上包被 有安普霉素抗体 1 条作为检测线， 同时还包被有抗第二种属动物蛋白的 IgG 1 条作为参考 线或包被有安普霉素检测用抗原 1 条作为检测线， 同时还包被有抗第二种属动物蛋白的工 IgG1 条作为参考线。在试纸制备时通过调节检测线和参考线包被物的浓度， 控制检测时检 测线和参考线的显色深浅， 并将其显色深浅与标准物质浓度对应起来， 达到半定量检测。 0006 所述的检测用抗原是指安普霉素与载体物质明胶形成的偶合物， 免疫用抗原是指 安普霉素与载体物质匙孔血蓝蛋白 （KLH） 形成的偶合物。 0007 所述的载体物质也。
8、可以选用其他大分子物质， 如 ： 脂蛋白、 多聚氨基酸、 葡聚糖、 卵 清白蛋白等， 但要求检测用抗原与免疫用抗原的载体无交叉免疫反应。 0008 所述的第二种属动物蛋白指非抗体来源属动物的蛋白， 例如， 抗体为兔源性， 则第 二种属动物蛋白可以是卵清白蛋白、 猪血清白蛋白等鸡、 鸭或其他非兔源性动物蛋白。 0009 本发明所描述的试纸的各部分处理与功能如下 ： 背衬 ： 为一面涂有不干胶的不吸水的韧性材料， 如 PVC 板， 起固定支持试纸其他组成部 说 明 书 CN 104090099 A 3 2/4 页 4 分的作用。 0010 样品垫制备 ： 将滤纸或玻璃纤维纸浸入 pH 7.0- 8。
9、.4 的 PBS 中约莫 2 min， 取出， 80烘干或其他方式干燥， 即作为样品垫， 检测时起吸收样品溶液的作用， 便于样品溶液向 上移动。 0011 金标垫的制备 ： 该部分起固定胶体金标记的抗原或抗体的作用。 0012 制备步骤包括胶体金溶液的制备、 胶体金标记安普霉素抗原或安普霉素抗体 ： （1） 胶体金溶液的制备 ： 将氯金酸 （HAuCl4） 用超纯水配制成 1% 的母液， 取 1 mL 的母 液， 用超纯水定容至 100 mL， 配成 0.01% 的溶液， 加热至沸腾， 加入 15 mL 1% 的柠檬酸三 钠水溶液， 继续加热至出现透明的橙红色为止， 即为胶体金溶液 ； （2）。
10、 胶体金标记安普霉素抗原 ： 将安普霉素检测用抗原和第二种属动物蛋白分别用 PBS （0.01 mo1/L， pH 7.0-7.5） 溶解稀释至2-4 mg/mL， 每100 mL胶体金溶液加入1-3 mL的 2-4 mg/mL的检测用抗原1-1.5 mL 2-4 mg/mL第二种属动物蛋白震荡2 min， 用0.2 mol/L 的 K2CO3， 调节 pH 至 8.4， 震荡 5 min 加入 11% PEG-10000 2 mL， 震荡 5 min， 6000-13000r/ min 离心 15 min， 除去上清， 将沉淀用 PBS（0.0l mol/L， pH 7.0-7.5） 复溶，。
11、 以 8000-15000 r/min 离心 15 min， 除去上清， 将沉淀用 PBS（0.0l mol/L， pH 7.0-7.5） 释 500-2000 倍产 物作为金标记安普霉素抗原 ； （3） 胶体金标记安普霉素抗体 ： 将安普霉素单克隆抗体或多克隆抗体和第二种属蛋白 分别用 PBS（0.01 mo1/L， pH 7.0-7.5） 溶解稀释至 2-4 mg/mL， 每 100 mL 胶体金溶液加入 1-3mL 2-4 mg/mL的安普霉素抗体和1-1.5 mL 2-4 mg/mL第二种属动物蛋白， 震荡2 min， 用0. 2 mol/L的K2CO3， 调节pH至8.4， 震荡5 。
12、min， 加入11% PEG-10000 2 mL， 震荡5 min， 6000-13000r/min 离心 15 min， 除去上清， 将沉淀用 PBS（0.01 mo1/L， pH 7.0-7.5） 复溶， 以 8000-15000r/min 离心 15 min， 除去上清， 将沉淀用 PBS（0.0l mol/L， pH 7.0-7.5） 稀 释 500-2000 倍， 产物作为金标安普霉素抗体 ； （4） 金标垫处理 ： 将安普霉素抗原或安普霉素抗体倒入一槽中， 将玻璃纤维或滤纸浸入 1 min， 取出， 室温干燥后， 即作金标垫。 0013 硝酸纤维素膜制备 ： 用 0.8% 的戊二。
13、醛溶液或 0.2% 的碳二亚胺溶液浸泡硝酸纤维 膜或醋酸纤维膜或尼龙膜 30 min， 取出， 37烘干， 上边包被 1 条不同浓度的安普霉素检测 用抗原线或安普霉素抗体线作为检测线， 同时包被 1 条抗第二种属动物蛋白的工 IgG 线作 为参考线。当胶体金标记部分标记对象为安普霉素检测用抗原和第二种属蛋白时， 检测线 则包被安普霉素抗体。此即为硝酸纤维素膜， 该部分主要作用是将反应结果以肉眼可见的 颜色表征出来。 0014 吸水纸制备 ： 将玻璃纤维纸或滤纸或吸水纸室温干燥后， 即作为吸水部分。 该部分 主要作用在于将移动上来的多余的样品溶液吸收。 0015 试纸组装 ： 在背衬上依次粘贴有。
14、样品垫、 金标垫、 硝酸纤维素膜和样品吸收垫， 即 成安普霉素检测试纸。 0016 检测原理 ： 检测原理因胶体金标记的对象不同， 而稍有差异。 0017 当胶体金标记部分标记对象为安普霉素检测用抗原和第二种属动物蛋白时， 如果 样品中含有安普霉素， 样品溶液被试纸的样品垫吸收并通过毛细作用上移， 样品中的游离 安普霉素分子量小移动速度快， 先到达检测线， 先与检测线上包被的安普霉素抗体结合， 因 说 明 书 CN 104090099 A 4 3/4 页 5 检测线上包被的安普霉素抗体只有特定的结合位点， 而且样品中游离的安普霉素结合能力 比偶合态的安普霉素检测用抗原强， 于是胶体金标记的检测。
15、用抗原不能再被检测线上的安 普霉素抗体捕获， 于是检测线无色， 此即为阳性 ； 如果样品中无安普霉素， 则胶体金标记的 安普霉素检测用抗原到达检测线后就被检测线上包被的安普霉素抗体捕获， 形成肉眼可见 的红色， 此即为阴性。 无论样品中是否含有安普霉素， 胶体金标记的第二种属动物蛋白上移 到达参考线时都可被参考线上包被的抗第二种属动物蛋白的工 IgG 捕获形成肉眼可见的 红色， 此即为参考线。 0018 当金标垫标记对象为安普霉素抗体和第二种属动物蛋白时， 如果样品中含有安普 霉素， 样品溶液被试纸的样品垫吸收并通过毛细作用上移到达胶体金标记部分， 样品溶液 中的安普霉素与胶体金标记的安普霉素。
16、抗体反应形成结合物， 结合物继续上移到检测线， 因胶体金标记的安普霉素抗体只有特定的结合位点， 样品溶液中的安普霉素与之结合后， 检测线上的检测用抗原就不能再与胶体金标记的安普霉素抗体结合， 于是检测线无色， 此 即为阳性 ； 当样品中没有安普霉素时， 胶体金标记的安普霉素抗体到达检测线时被检测用 抗原捕获， 则形成肉眼可见的红色。 无论样品中是否含有安普霉素， 胶体金标记的第二种属 蛋白上移到达参考线时都可被参考线上包被的抗第二种属动物蛋白的工 IgG 捕获形成肉 眼可见的红色， 此即为参考线。 0019 以上两种方式的试纸， 在试纸制备时通过调节检测线和参考线包被物浓度， 控制 检测时检测。
17、线和参考线的显色深浅， 并将其显色深浅与标准物质浓度对应起来， 即可达到 半定量检测目的。 附图说明 0020 图 1 是安普霉素胶体金检测卡外壳及检测试纸条在外壳内的安置图， 1 为检测卡 外壳， 其中 2 为试纸条， 3 为检测窗口， 4 为加样孔。 0021 图 2 是安普霉素检测卡检测试纸条结构示意图， 其中 5 为支承背板， 6 为硝酸纤维 素膜， 7 为金标垫， 8 为样品垫， 9 为吸水纸。 0022 图 3 是检测试纸条硝酸纤维素膜上显示印迹带示意图， 其中 10 为检测线， 11 为参 照线。 具体实施方式 0023 安普霉素检测卡是在检测卡外壳1中设置检测试纸条2， 检测卡。
18、外壳1的结构及检 测试纸条 2 的设置见附图 1， 检测卡外壳 1 为长条扁平薄壳状外壳， 长 70 mm， 宽 20 mm， 厚 5mm， 薄壳壁厚 1 mm ， 由工程塑料制成， 检测卡外壳 1 由上盖和下盖两半联接而成， 在检测 卡外壳 1 上盖上有检测窗孔 3 和加样孔 4 。检测试纸条 2 放置在检测卡外壳 1 的下盖内。 0024 检测试纸条 2 是多层结构的窄条薄片， 片长 60 mm， 片宽约 4 mm， 厚度小于 2.5 mm 。 检测试纸条 2 是多层结构 ： 底层是支承背板 5， 为聚乙烯薄片， 厚度约 0.5 mm， 长 60 mm， 宽 4 mm ； 支承背板5中部粘。
19、贴硝酸纤维素膜6， 硝酸纤维素膜厚0.5 mm， 长20 mm， 宽4 mm。硝酸纤 维素膜6上有两条间隔开的横向显示印迹带， 参见附图3， 两条显示印迹中， 一条是检测线10， 含安普霉素偶联物， 另一条是参照线11， 含第二种属动物蛋白的IgG。 支承背板5一端上粘贴 吸水纸9， 另一端粘贴样品垫8， 吸水纸9内端与硝酸纤维素膜6搭接， 样品垫8与硝酸纤维素 说 明 书 CN 104090099 A 5 4/4 页 6 膜 6 之间则有一段金标垫 7， 由金标垫 7 将样品垫 8 与硝酸纤维素膜 6 连接在一起， 搭接宽度 在 1-2 mm。样品垫 8 材料为吸水玻璃纤维或聚酯膜。 002。
20、5 使用安普霉素胶体金检测卡时， 先将待检测的样品液 （药物的抽提液稀释后， 直接 用于检测） 从加样孔 4 中滴入安普霉素检测试纸条 2 的样品垫 8， 由于虹作用原理， 带动待 检测的样品液及胶体金膜 7 所含的抗安普霉素单克隆抗体胶体金标记物一起向硝酸纤维 素膜 6 扩散， 5-10 分钟内观察结果。 0026 检测卡的主要反应是免疫学的抗原和抗体反应， 在硝酸纤维素膜上迁移的胶体金 标记的抗体， 在测试线上与含有安普霉素蛋白质偶联物， 以及参照线含第二种属动物蛋白 的 IgG 反应， 形成棕红色条带。若样品中相应的待测安普霉素高于允许值， 样品加入后先与 金标垫中的抗体反应， 而不会与检测带所带有的安普霉素蛋白质偶联物反应， 从而不显色。 检测结果有以下三种 ： 1.检测线10和参照线11同时显现棕红色印迹， 表示检测结果为阴性， 说明被测样品中 不含安普霉素或含量低于允许值 ； 2. 检测线 10 不显色， 参照线 11 显现棕红色印迹， 表示检测结果为阳性， 说明被测样品 中安普霉素含量高于允许值 ； 3. 检测线 10 显现棕红色印迹， 参照线 11 不显色， 或检测线 10 和参照线 11 均不显色， 表示检测试纸条失效。 说 明 书 CN 104090099 A 6 1/1 页 7 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 104090099 A 7 。