一种慢病毒质粒表达载体及其构建方法和应用.pdf

本发明公开了一种慢病毒质粒表达载体及其构建方法和应用。所述慢病毒质粒表达载体为pCDH-MCS-MuSK-GFP，其核苷酸序列如序列表如SEQIDNO.2所示。本发明更进一步公开了慢病毒质粒表达载体在制备用于构建抗肌肉特异性受体酪氨酸激酶抗体检测方面的应用。本发明通过构建病毒载体建立稳定转染MuSK的细胞系，采用灵敏度和特异性更高的荧光免疫细胞染色结合流式细胞检测技术，用于临床定性、定量检测MuSK抗体，使检测结果更加稳定，且极大节约人力和时间成本。该项目的建立将极大提高重症肌无力的诊疗水平，提高患者的劳动能力和生活质量，将产生很大的社会效益和经济效益。

权利要求书
1.  一种慢病毒质粒表达载体，其特征在于所述慢病毒质粒表达载体为pCDH-MCS-MuSK-GFP，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.  一种权利要求1所述慢病毒质粒表达载体的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行：
1)载体构建：以人肌肉组织cDNA为模板，利用引物MuskF: 5'-CCAGCTAGCATGAGAGAGCTCGTCAACATTCCAC-3' 和MuskR     5'-CACAGCGGCCGCTTAGACACTCACAGTTCCCTCTGCC-3' 扩增MuSK isoform 2  cDNA序列，序列表中SEQ ID NO.1所示，具体步骤如下：
向PCR反应管中依次加入DNA模板 300 ng，引物各终浓度为0.4μmol/L，dNTP终浓度为0.2μmol/L，10×PCR缓冲液 5μl ，Taq DNA聚合酶 0.5μl，终浓度约5U/μl，ddH2O补到终体积为50μl； PCR的循环程序为：94℃变性4分钟， 98℃10s，68℃退火45s，72℃延伸2min，共循环32次，以确保充分延伸；
2)应用胶回收试剂盒对扩增片段切胶回收；后连入T载体，经测序比对序列正确后将其用NheI和NotI双酶切，具体步骤如下：
加入DNA 1μg和相应的限制性内切酶NheI和NotI 2μl,再加入重蒸水使总体积为19μl，将管内溶液混匀后加入1μl酶液；混匀反应体系后，37℃水浴保温2-3小时,使酶切反应完全，反应完成后制备琼脂糖凝胶，取10μl酶解液与2μl 6×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中，加完样后合上电泳槽盖，立即接通电源，控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳，紫外成像系统观察并测定DNA酶切片段大小，鉴定正确后，与经NheI和NotI双酶切后的pCDH-MCS-MCS-EF1-copGFP质粒载体相连接，得到所用的表达MuSK和GFP的慢病毒质粒载体：pCDH-MCS-MuSK-GFP。

3.  权利要求1所述慢病毒质粒表达载体在制备用于构建抗肌肉特异性受体酪氨酸激酶抗体检测方面的应用。

4.  权利要求3所述构建抗肌肉特异性受体酪氨酸激酶抗体检测的应用，其特征在于它是由下述步骤组成：
1）利用CaCl2法病毒包装表达MuSK-GFP（pCDH-MCS-Musk-EF1-copGFP）融合蛋白的慢病毒，收集病毒悬液在6 μg/ml Polybrene存在的情况下感染HEK293细胞，1周后，分选阳性稳定转染细胞。

5.  继续传代培养后进行二次筛选，获得100%转染过的稳定表达融合蛋白的HEK293细胞系，培养条件：37℃、含10%胎牛血清的DMEM培养基培养转染稳定表达融合蛋白的HEK293细胞；
具体步骤：待HEK293细胞长至70%密度时，撤掉旧的培养基，用PBS清洗细胞，利用CaCl2法病毒包装表达MuSK-GFP融合蛋白的慢病毒，收集病毒悬液在6 μg/ml Polybrene存在的情况下感染HEK293细胞，37℃培养14小时，第二天换成完全培养基，1周后，流式细胞术分选阳性稳定转染细胞；继续传代培养后进行二次筛选，获得100%转染过的稳定表达融合蛋白的HEK293细胞系；
2）流式细胞术测定血清Musk抗体：
获得待检血清后，用含1%BSA（Sigma）DMEM-Hepes洗液稀释待测血清，收集转染及未转染的HEK293细胞，按1：1的比例混合，总数为5×105，用流式staining缓冲液（1×PBS含3%的马血清及0.02%的叠氮钠NaN3)清洗1次，离心后弃去上清，用100μl稀释过的血清或人Ig对照重悬细胞，4度孵育30min，然后加入流式staining缓冲液清洗1次，离心收集细胞后加入100ul稀释后的Fast blue标记的山羊抗人IgG，4度避光孵育30 min，流式staining缓冲液清洗1次，然后用300ul流式staining缓冲液重悬细胞，流式细胞仪双通道检测荧光信号，以未转染细胞亚群及人IgG染色组为对照，判断MuSK抗体阳性样本，此外，GFP阳性细胞类群中的Fast blue信号强弱可用来标示抗体浓度的相对量；
3）细胞免疫荧光法测定血清Musk抗体，具体实验方法过程：
对HEK293细胞进行培养、传代，并转入细胞培养瓶中；利用PEI对EGFP标记的人MuSK cDNA (MuSK-GFP)质粒进行细胞转染；待转染效率至70%以上时，加入适量细胞裂解缓冲液，再加入适量蛋白酶抑制剂；收集细胞裂解液于EP管中，轮转1小时，13000rpm离心15min，收集上清,即为相应抗原提取液；
解冻待测组血清， 观察滤光离心5min，取上清10μl，分别加入已稀释的50μl抗原提取液, 混合后轮转过夜，然后加入适量非特异山羊抗人IgG，孵育后离心，弃上清，收集沉淀，最后用1ml裂解提取缓冲液漂洗沉淀，重复3次；将沉淀移入96孔板中，在高速多通道连续波长酶标仪上获取荧光吸光度，以健康对照组荧光均值+3倍标准差以上为阳性判断标准，每份血清检测均双盲，并重复3遍；
4）统计分析：使用GraphPad Prism 4对数据进行绘图及统计分析。

说明书一种慢病毒质粒表达载体及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及一种慢病毒质粒表达载体及其构建方法和应用，具体是慢病毒质粒表达载体及其构建方法和在构建抗肌肉特异性受体酪氨酸激酶（muscle specific kinase, MuSK）抗体检测的应用。 
背景技术
症肌无力(Myasthenia gravis，MG)是一种由抗体介导的，主要累及神经肌肉接头突触后膜乙酰胆碱受体(acytylcholine receptor，AchR)，导致神经肌肉接头传递障碍的自身免疫性疾病。其临床特征为部分或全身骨骼肌易疲劳，呈波动性肌无力，具有在活动后加重，休息后缓解和晨轻暮重等特点。随着医疗诊断水平的不断提高和人们生活环境等因素的变化，MG的发病率呈逐渐升高的趋势，因此，早期鉴别诊断对指导两种疾病的治疗和评估预后非常重要。 
重症肌无力因其症状具有波动性的特点且易与其它相似疾病混淆，所以诊断一直是医学上的难点。血清特异性抗体的检测在MG的诊断和发病机制研究等方面有重要意义。研究证明MG的发病机制可能为体内产生的AChR-Ab同AChR相结合，在补体参与下与AChR发生应答。一方面引起细胞膜溶解，使AChR大量破坏；一方面可以使膜表面的AChR交联，增加AChR的退化速度。但是约20％的重症肌无力患者体内不能检测到AChR-Ab。研究发现，50％AChR-Ab阴性患者血清IgG能与肌肉特异性TE671细胞株结合，而不与表达AChR的人囊胚肾细胞(human embryonic kidney cells，HEK293)结合。虽然AChR-Ab阴性患者血清能抑制TE671细胞株AChR的功能，但这些血清中AChR的数目并不减少。这些证明AChR-Ab阴性患者血清IgG抗体结合的不是AChR，而是同AChR有密切联系的，能调节AChR的肌蛋白，并证明是抗肌肉特异性受体酪氨酸激酶（muscle specific kinase, MuSK）。 MuSK-Ab与 MuSK的细胞外段直接结合，抑制发育中凝集蛋白(Agrin)介导的AChRs在细胞突触后膜的聚集。虽然这些抗体在体内引起肌无力的机制还不明确，但是MuSK-Ab的出现定义了一组AChR-Ab阴性患者亚群。40％-70％AChR-Ab阴性MG患者血清中含有抗肌肉特异性受体酪氨酸激酶抗体。所以现在将AChR-Ab阴性MG又分为两部分，一是MuSK-Ab阳性；二是AChR-Ab和MuSK-Ab均阴性，也称为血清抗体阴性重症肌无力(seronegative myasthenia gravis，SNMG)。MuSK-Ab的发现，有助于进一步研究MG的发病机制和总结临床特征。 
MuSK抗体阳性的患者，多是女性并且中早发型(发病年龄小于40岁者)占70％，临床症状多表现为延髓肌无力、面肌无力，随着病情的发展容易出现肌无力危象，面肌萎缩。胸腺区组织学多正常或轻微不正常，胸腺切除对MuSK-Ab阳性MG患者疗效无显著意义。MuSK-Ab阳性MG患者通常对抗胆碱酯酶药物疗效差，传统的免疫抑制治疗反应差。MuSK-Ab只能在AChR-Ab阴性的MG患者血清中检测出，不存在于AChR-Ab阳性MG的血清中，而且在其他肌肉相关疾病的患者血清中也不能检测出。MuSK抗体在AChR-Ab阴性MG的出现是有特异性的，在检测AChR-Ab阴性患者中具有诊断意义。而我国目前对MuSK-Ab阳性MG的特征认识不足，对MuSK-Ab的检测尚处空白。 
目前国际上检测MuSK抗体的技术主要有间接免疫荧光法 (Indirect Immunofluorescence, IIF)、荧光免疫沉淀法(Fluoroimmunoprecipitation Assay, FIPA)、放射免疫沉淀法(Radioimmunoprecipitation Assay, RIPA)、荧光免疫细胞染色法(Cell-Based fluorescent immunostaining Assay, CBA)及酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)。ELISA是较常用的方法，但是其敏感性和特异性不高；RIPA虽然敏感性和特异性高但因放射性物质对环境等的不利影响，其应用受到限制；目前以CBA和FIPA的敏感性和特异性最为理想。然而，CBA法平均检测周期超过两天，荧光效率不稳定，而且需要人为观察 ，费时费力，而且可能会增加检测中的人为误差；FIPA法同样涉及到同位素的应用，环境危害性大大增加。此外，针对MuSK自身抗体的检测国内目前只少数研究者利用CBA和FIPA做了科研研究，尚未常规应用于临床，因此何种方法作为“金标准”被推荐应用于临床MuSK抗体的检测尚待阐明。 
发明内容
本发明的目的是提供一种慢病毒质粒表达载体及其构建方法和应用。本发明结合病毒载体构建，转染，荧光免疫染色及流式细胞分析技术，主要应用于重症肌无力临床鉴别诊断，提高重症肌无力诊断水平；能辅助作为用药疗效、病情监测、复发预测的指标；本发明提供一种抗肌肉特异性受体酪氨酸激酶自身抗体的检测方法，可以克服已有技术的缺陷。将人MuSK isoform 2的cDNA全长克隆到双表达慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP的多克隆位点区，包装病毒，用病毒侵染293T细胞，流式分选稳定转染的细胞，获得稳定表达MuSK和GFP的细胞系，采用灵敏度和特异性更高的细胞免疫荧光染色结合流式细胞检测技术用于临床定性、定量检测MuSK-Ab。MuSK-Ab检测平台的建立能为进一步研究MuSK抗体的致病机制提供基础。 
为实现上述目的为发明公开了如下的技术内容： 
本发明的一个目的是提供一种慢病毒质粒表达载体，其特征在于所述慢病毒质粒表达载体为pCDH-MCS-MuSK-GFP，其核苷酸序列如序列表如SEQ ID NO.2所示。
本发明另一个目的是提供一种慢病毒质粒表达载体的构建方法，它包括的步骤： 
1）载体构建：
以人肌肉组织cDNA为模板，利用引物MuskF: 5'-CCAGCTAGCATGAGAGAGCTCGTCAACATTCCAC-3' 和MuskR     5'-CACAGCGGCCGCTTAGACACTCACAGTTCCCTCTGCC-3' 扩增MuSK isoform 2  cDNA序列，序列表中SEQ ID NO.1所示，具体步骤如下：
向PCR反应管中依次加入DNA模板 300 ng，引物各终浓度为0.4μmol/L，dNTP终浓度为0.2μmol/L，10×PCR缓冲液 5μl ，Taq DNA聚合酶 0.5μl，终浓度约5U/μl，ddH2O补到终体积为50μl。 PCR的循环程序为：94℃变性4分钟， 98℃10s，68℃退火45s，72℃延伸2min，共循环32次，以确保充分延伸。
2）应用胶回收试剂盒对扩增片段切胶回收（Axygen公司）后连入T载体，经测序比对序列正确后将其用NheI和NotI双酶切。具体步骤如下： 
加入DNA 1μg和相应的限制性内切酶NheI和NotI 2μl,再加入重蒸水使总体积为19μl，将管内溶液混匀后加入1μl酶液。混匀反应体系后，37℃水浴保温2-3小时,使酶切反应完全。反应完成后制备琼脂糖凝胶，取10μl酶解液与2μl 6×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中，加完样后合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳，紫外成像系统观察并测定DNA酶切片段大小。鉴定正确后，与经NheI和NotI双酶切后的pCDH-MCS-MCS-EF1-copGFP质粒载体（上海吉凯基因有限公司）相连接，得到所用的表达MuSK和GFP的慢病毒质粒载体：pCDH-MCS-MuSK-GFP。构建好的病毒载体的完整序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。构建好的病毒载体的完整序列：
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本发明再一个目的是提供慢病毒质粒表达载体在制备用于构建抗肌肉特异性受体酪氨酸激酶（muscle specific kinase, MuSK）抗体检测方面的应用。其中抗肌肉特异性受体酪氨酸激酶抗体的检测包括的步骤： 
1）利用CaCl2法病毒包装表达MuSK-GFP（pCDH-MCS-Musk-EF1-copGFP）融合蛋白的慢病毒，收集病毒悬液在6 μg/ml Polybrene存在的情况下感染HEK293细胞，1周后，分选阳性稳定转染细胞。继续传代培养后进行二次筛选，获得100%转染过的稳定表达融合蛋白的HEK293细胞系，培养条件：37℃、含10%胎牛血清的DMEM培养基培养转染稳定表达融合蛋白的HEK293细胞；
具体步骤：待HEK293细胞长至70%密度时，撤掉旧的培养基，用PBS清洗细胞，利用CaCl2法病毒包装表达MuSK-GFP融合蛋白的慢病毒，收集病毒悬液在6 μg/ml Polybrene存在的情况下感染HEK293细胞，37℃培养14小时，第二天换成完全培养基，1周后，流式细胞术分选阳性稳定转染细胞；继续传代培养后进行二次筛选，获得100%转染过的稳定表达融合蛋白的HEK293细胞系；
2）流式细胞术测定血清Musk抗体：
获得待检血清后，用含1%BSA（Sigma）DMEM-Hepes洗液稀释待测血清，收集转染及未转染的HEK293细胞，按1：1的比例混合，总数为5×105，用流式staining缓冲液（1×PBS含3%的马血清及0.02%的叠氮钠NaN3)清洗1次，离心后弃去上清，用100μl稀释过的血清或人Ig对照重悬细胞，4度孵育30min，然后加入流式staining缓冲液清洗1次，离心收集细胞后加入100ul稀释后的Fast blue标记的山羊抗人IgG，4度避光孵育30 min，流式staining缓冲液清洗1次，然后用300ul流式staining缓冲液重悬细胞，流式细胞仪双通道检测荧光信号，以未转染细胞亚群及人IgG染色组为对照，判断MuSK抗体阳性样本，此外，GFP阳性细胞类群中的Fast blue信号强弱可用来标示抗体浓度的相对量；
3）细胞免疫荧光法测定血清Musk抗体，具体实验方法过程：
对HEK293细胞进行培养、传代，并转入细胞培养瓶中；利用PEI对EGFP标记的人MuSK cDNA (MuSK-GFP)质粒进行细胞转染；待转染效率至70%以上时，加入适量细胞裂解缓冲液，再加入适量蛋白酶抑制剂；收集细胞裂解液于EP管中，轮转1小时，13000rpm离心15min，收集上清,即为相应抗原提取液；
解冻待测组血清，察滤光 离心5min，取上清10μl，分别加入已稀释的50μl抗原提取液, 混合后轮转过夜，然后加入适量非特异山羊抗人IgG，孵育后离心，弃上清，收集沉淀，最后用1ml裂解提取缓冲液漂洗沉淀，重复3次；将沉淀移入96孔板中，在高速多通道连续波长酶标仪上获取荧光吸光度，以健康对照组荧光均值+3倍标准差以上为阳性判断标准，每份血清检测均双盲，并重复3遍。
4）统计分析：使用GraphPad Prism 4对数据进行绘图及统计分析。 
将人MuSK isoform 2（序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列）的cDNA全长克隆到双表达慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP的多克隆位点区，包装病毒，用病毒侵染293T细胞，流式分选稳定转染的细胞，获得稳定表达MuSK和GFP的细胞系，采用灵敏度和特异性更高的细胞免疫荧光染色结合流式细胞检测技术用于临床定性、定量检测MuSK-Ab。 
Musk isoform 2序列（SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列）： 
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本发明通过构建病毒载体建立稳定转染MuSK的细胞系，采用灵敏度和特异性更高的荧光免疫细胞染色结合流式细胞检测技术，用于临床定性、定量检测MuSK抗体，使检测结果更加稳定，且极大节约人力和时间成本。MuSK抗体检测技术的平台的建立，为进一步研究MuSK抗体的致病机制提供基础，有利于提高重症肌无力的临床诊疗水平。具有国际认可的检测技术基础上的诊断标准将利于进一步的国内和国际合作，提高我市在国内和国际中枢神经系统脱髓鞘疾病诊治方面的影响和地位。该项目的建立将极大提高重症肌无力的诊疗水平，提高患者的劳动能力和生活质量，将产生很大的社会效益和经济效益。
  
附图说明
图1  MuSK病毒质粒图谱； 
图2  HEK293细胞感染MuSK病毒表达载体后MuSK基因表达水平示意图；
图3  HEK293细胞感染MuSK病毒表达载体后MuSK蛋白表达水平示意图；
图4  流式细胞术检测待检血清：灰色阴影表示MuSK(-)血清标本，灰色实线表示MuSK(+)血清标本，黑色实线表示MuSK强阳性血清标本；
图5  流式细胞术检测待检血清，阴性、阳性及强阳性MuSK表达定量分析；
图6  流式结合细胞免疫荧光法及传统CBA法检测重症肌无力（MG）组血清MuSK抗体表达水平；
图7  流式结合细胞免疫荧光法及传统CBA法检测乙酰胆碱受体抗体阴性的重症肌无力（AchR-Ab- MG）组血清MuSK抗体表达水平。
具体实施方式
以下实施例将有助于理解本发明，但不能限制本发明的内容。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 
实施例1 
一种慢病毒质粒表达载体为pCDH-MCS-MuSK-GFP，其核苷酸序列如序列表如SEQ ID NO.2所示，它的构建方法按如下的步骤进行：
1)载体构建：以人肌肉组织cDNA为模板，利用引物MuskF: 5'-CCAGCTAGCATGAGAGAGCTCGTCAACATTCCAC-3' 和MuskR     5'-CACAGCGGCCGCTTAGACACTCACAGTTCCCTCTGCC-3' 扩增MuSK isoform 2  cDNA序列，序列表中SEQ ID NO.1所示，具体步骤如下：
向PCR反应管中依次加入DNA模板 300 ng，引物各终浓度为0.4μmol/L，dNTP终浓度为0.2μmol/L，10×PCR缓冲液 5μl ，Taq DNA聚合酶 0.5μl，终浓度约5U/μl，ddH2O补到终体积为50μl； PCR的循环程序为：94℃变性4分钟， 98℃10s，68℃退火45s，72℃延伸2min，共循环32次，以确保充分延伸；
2)应用胶回收试剂盒对扩增片段切胶回收；后连入T载体，经测序比对序列正确后将其用NheI和NotI双酶切，具体步骤如下：
加入DNA 1μg和相应的限制性内切酶NheI和NotI 2μl,再加入重蒸水使总体积为19μl，将管内溶液混匀后加入1μl酶液；混匀反应体系后，37℃水浴保温2-3小时,使酶切反应完全，反应完成后制备琼脂糖凝胶，取10μl酶解液与2μl 6×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中，加完样后合上电泳槽盖，立即接通电源，控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳，紫外成像系统观察并测定DNA酶切片段大小，鉴定正确后，与经NheI和NotI双酶切后的pCDH-MCS-MCS-EF1-copGFP质粒载体相连接，得到所用的表达MuSK和GFP的慢病毒质粒载体：pCDH-MCS-MuSK-GFP。
实施例2 
构建抗肌肉特异性受体酪氨酸激酶抗体检测的应用，它是由下述步骤组成：
1）利用CaCl2法病毒包装表达MuSK-GFP（pCDH-MCS-Musk-EF1-copGFP）融合蛋白的慢病毒，收集病毒悬液在6 μg/ml Polybrene存在的情况下感染HEK293细胞，1周后，分选阳性稳定转染细胞。继续传代培养后进行二次筛选，获得100%转染过的稳定表达融合蛋白的HEK293细胞系，培养条件：37℃、含10%胎牛血清的DMEM培养基培养转染稳定表达融合蛋白的HEK293细胞；
具体步骤：待HEK293细胞长至70%密度时，撤掉旧的培养基，用PBS清洗细胞，利用CaCl2法病毒包装表达MuSK-GFP融合蛋白的慢病毒，收集病毒悬液在6 μg/ml Polybrene存在的情况下感染HEK293细胞，37℃培养14小时，第二天换成完全培养基，1周后，流式细胞术分选阳性稳定转染细胞；继续传代培养后进行二次筛选，获得100%转染过的稳定表达融合蛋白的HEK293细胞系；
2）流式细胞术测定血清Musk抗体：
获得待检血清后，用含1%BSA（Sigma）DMEM-Hepes洗液稀释待测血清，收集转染及未转染的HEK293细胞，按1：1的比例混合，总数为5×105，用流式staining缓冲液（1×PBS含3%的马血清及0.02%的叠氮钠NaN3)清洗1次，离心后弃去上清，用100μl稀释过的血清或人Ig对照重悬细胞，4度孵育30min，然后加入流式staining缓冲液清洗1次，离心收集细胞后加入100ul稀释后的Fast blue标记的山羊抗人IgG，4度避光孵育30 min，流式staining缓冲液清洗1次，然后用300ul流式staining缓冲液重悬细胞，流式细胞仪双通道检测荧光信号，以未转染细胞亚群及人IgG染色组为对照，判断MuSK抗体阳性样本，此外，GFP阳性细胞类群中的Fast blue信号强弱可用来标示抗体浓度的相对量；
3）细胞免疫荧光法测定血清Musk抗体，具体实验方法过程：
对HEK293细胞进行培养、传代，并转入细胞培养瓶中；利用PEI对EGFP标记的人MuSK cDNA (MuSK-GFP)质粒进行细胞转染；待转染效率至70%以上时，加入适量细胞裂解缓冲液，再加入适量蛋白酶抑制剂；收集细胞裂解液于EP管中，轮转1小时，13000rpm离心15min，收集上清,即为相应抗原提取液；
解冻待测组血清， 察滤光离心5min，取上清10μl，分别加入已稀释的50μl抗原提取液, 混合后轮转过夜，然后加入适量非特异山羊抗人IgG，孵育后离心，弃上清，收集沉淀，最后用1ml裂解提取缓冲液漂洗沉淀，重复3次；将沉淀移入96孔板中，在高速多通道连续波长酶标仪上获取荧光吸光度，以健康对照组荧光均值+3倍标准差以上为阳性判断标准，每份血清检测均双盲，并重复3遍。
4）统计分析：使用GraphPad Prism 4对数据进行绘图及统计分析。 
实施例3 
实际应用情况：
本发明随机选择AchR阳性重症肌无力患者127例，年龄13-80岁，男性30例，女性37例；AchR阴性重症肌无力患者103例，年龄13-80岁，男性56例，女性71例。来源于2008年至2013年在天津医科大学总医院神经内科门诊和病房确诊的重症肌无力患者。重症肌无力最重要的诊断依据是病人的既往史、临床表现和波动性易疲劳的检查发现，特别是具有眼外肌和延髓肌受累表现。我们所纳入患者均表现有病态的波动性的肌疲劳，且至少满足下面一个诊断标准：
1)抗胆碱酯酶药物—新斯的明试验引出明显的肌力改善；
2)低频神经重复电刺激运动波幅波幅衰减>15％；
3)单纤维肌电图检查出现异常的颤抖和阻滞。对照组为20例健康体检者，年龄20-60岁，10例男性，10例女性，年龄、性别均与待测血清相匹配。
人胚肾HEK293细胞（市售）由本实验室保存，转染试剂购自Invitrogen，感受态细胞购自Tiangen公司，质粒提取试剂盒质粒快速小提试剂盒购自Tiangen公司，质粒快速中提试剂盒购自Biodev公司，质粒快速大量提取试剂盒购自Tiangen、Biodec公司，DMEM培养基(高糖，含有青、链霉素)购自Solarbia公司，胰蛋白酶购自Solarbia公司，胎牛血清(FCS)购自GIBCO公司。 
双表达慢病毒载体pCDH-MCS-MCS-EF1-copGFP 购自上海吉凯基因有限公司 
1、载体构建： 
以人肌肉组织cDNA（人肌肉组织）为模板，利用引物MuskF: 5'-CCAGCTAGCATGAGAGAGCTCGTCAACATTCCAC-3' 和MuskR: 5'-CACAGCGGCCGCTTAGACACTCACAGTTCCCTCTGCC-3' 扩增MuSK isoform 2 cDNA序列（序列表中SEQ ID NO.1所示），具体步骤如下：
向PCR反应管中依次加入DNA模板 300 ng，引物各终浓度为0.4μmol/L，dNTP终浓度为0.2μmol/L，10×PCR缓冲液 5μl ，Taq DNA聚合酶 0.5μl (终浓度约5U/μl)，ddH2O补到终体积为50μl。 PCR的循环程序为：94℃变性4分钟， 98℃10s，68℃退火45s，72℃延伸2min，共循环32次。以确保充分延伸。
2）应用胶回收试剂盒对扩增片段切胶回收（Axygen公司）后连入T载体，经测序比对序列正确后将其用NheI和NotI双酶切。具体步骤如下：加入DNA 1μg和相应的限制性内切酶（NheI和NotI）2μl,再加入重蒸水使总体积为19μl，将管内溶液混匀后加入1μl酶液。混匀反应体系后，37℃水浴保温2-3小时,使酶切反应完全。反应完成后制备琼脂糖凝胶，取10μl酶解液与2μl 6×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中，加完样后合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳，紫外成像系统观察并测定DNA酶切片段大小。鉴定正确后，与经NheI和NotI双酶切后的pCDH-MCS-MCS-EF1-copGFP质粒载体相连接，得到所用的表达MuSK和GFP的慢病毒质粒表达载体。构建好的病毒载体的完整序列（序列表中SEQ ID NO.2所示）。慢病毒质粒表达载体：pCDH-MCS-MuSK-GFP。 
2、病毒包装及HEK293稳定转染细胞系的获得 
    细胞系及其培养：人胚肾HEK293细胞系由本室常规培养。细胞置于含有10%灭活胎牛血清的DMEM培养基中，放入37℃，5% CO2孵箱，按常规方法培养，取处于对数生长期的细胞用于实验。
    细胞的复苏和传代：预先向50ml 离心管中加入20mL DMEM培养基，从液氮罐取出冻存的细胞迅速投入37oC 水浴中并不断摇动使其在最短时间内解冻，用70%酒精消毒冻存管外表后，将细胞存储液转移至上述离心管中，1000rmp离心10分钟。弃上清，重悬细胞置于含10% 胎牛血清的DMEM培养基中，37°C、5%CO2、饱和湿度下培养。 
待HEK293细胞长至70%密度时，撤掉旧的培养基，用PBS清洗细胞，利用CaCl2法病毒包装表达MuSK-GFP融合蛋白的慢病毒（pCDH-MCS-Musk-EF1-copGFP），收集病毒悬液在6 μg/ml Polybrene存在的情况下感染HEK293细胞，37℃培养过夜（14小时），第二天换成完全培养基，1周后，流式细胞术分选阳性稳定转染细胞。继续传代培养后进行二次筛选，获得100%转染过的稳定表达融合蛋白的HEK293细胞系。 
3、细胞免疫荧光染色法结合流式细胞术（FlowCytometry, FCM，结合流式细胞术操作原理见文献Nat Methods. 2013 Mar;10(3):228-38.）测定血清MuSK抗体： 
获得待检血清后，用含1%BSA（Sigma）DMEM-Hepes洗液稀释待测血清，收集转染及未转染的HEK293细胞，按1：1的比例混合，总数为5×105，用流式staining缓冲液（1×PBS含3%的马血清及0.02%的叠氮钠NaN3）清洗1次，离心后弃去上清，用100μl稀释过的血清或人免疫球蛋白对照重悬细胞，4度孵育30min，然后加入流式staining缓冲液清洗1次，离心收集细胞后加入100ul稀释后的Fast blue标记的山羊抗人IgG，4度避光孵育30 min，流式staining缓冲液清洗1次，然后用300ul流式staining缓冲液重悬细胞，流式细胞仪双通道检测荧光信号，以未转染细胞亚群及人IgG染色组为对照，判断MuSK抗体阳性样本。此外，GFP阳性细胞类群中的Fast blue信号强弱可用来标示抗体浓度的相对量。
4、细胞免疫荧光法测定血清MuSK抗体： 
对HEK293细胞进行培养、传代，并转入细胞培养瓶中；利用PEI对EGFP标记的人MuSK cDNA (MuSK-GFP)质粒进行细胞转染；待转染效率至70%以上时，加入适量细胞裂解缓冲液，再加入适量蛋白酶抑制剂；收集细胞裂解液于EP管中，轮转1小时，13000rpm离心15min，收集上清,即为相应抗原提取液。
     解冻待测组血清， 察滤光离心5min，取上清10μl，分别加入已稀释的50μl抗原提取液, 混合后轮转过夜，然后加入适量非特异山羊抗人IgG，孵育后离心，弃上清，收集沉淀，最后用1ml裂解提取缓冲液漂洗沉淀，重复3次；将沉淀移入96孔板中，在高速多通道连续波长酶标仪上获取荧光吸光度，以健康对照组荧光均值+3倍标准差以上为阳性判断标准，每份血清检测均双盲，并重复3遍。 
5、统计分析：使用GraphPad Prism 4对数据进行绘图及统计分析。 
6、结果 
MuSK质粒DNA转染HEK293细胞的转染效率及亚细胞定位：DAPI染核行亚细胞定位分析显示，细胞核染为蓝色，HEK293细胞表达的MuSK抗原蛋白主要表位于细胞膜上。
细胞免疫荧光结合流式细胞术测定血清MuSK抗体：MG组MuSK抗体阳性率为9.1%(21/230)；健康对照组均为阴性；重复三次试验，检测结果相一致。比较分析发现，在AChR-Ab阳性的患者血清中没有检出MuSK抗体，MuSK抗体在AChR-Ab阴性的MG患者中阳性率为20.4％（21/103）。 
细胞免疫荧光（CBA）测定血清MuSK抗体：MG组MuSK抗体阳性率为6.9% (16/230)；健康对照组均为阴性；重复三次试验，检测结果相一致。比较分析发现，在AChR-Ab阳性的患者血清中没有检出MuSK抗体，MuSK抗体在AChR-Ab阴性的MG患者中阳性率为15.5％（16/103）。 
细胞免疫荧光结合流式细胞术与传统CBA方法对比：对于AQP4抗体，CBA结合流式法灵敏度为6.9%，CBA法灵敏度为9.1%； 两种方法检测AQP4抗体特异性均为100% (见表1)。 
表1 患者血清MuSK抗体阳性率 。 
SEQUENCE LISTING
 
<110>  天津医科大学总医院
 
<120>  一种慢病毒质粒表达载体及其构建方法和应用
 
<160>  2    
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  2352
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
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<210>  2
<211>  9874
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
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