具有抗淋球菌作用的热淋清颗粒原料头花蓼提取物 技术领域 本发明属于中药领域， 用于制备中药热淋清颗粒的原料即药材头花蓼的提取物。 具体地， 本发明涉及由热淋清的原料即药材头花蓼的醇提取物所获得的有效部位， 以及该 有效部位的制备方法和用途。该有效部位具有良好抗淋球菌作用。
背景技术
头花蓼 (Polygonum capitatum Buch-Ham ex D.Don) 为蓼科蓼属多年生草本植 物。具有清热利湿、 利尿通淋之功效， 在临床上治疗泌尿系统感染有着显著的效果。以其为 原料制成的中成药制剂 “热淋清颗粒” 2004 年进入国家基本医疗保险目录， 2012 年进入贵 州省基本药物目录。
头花蓼是少数民族地区的常用药， 主要用于肾盂肾炎、 尿道感染、 利尿通淋等症。 相关的药理学研究少见， 目前仅有任光友等几篇报道。任光友采用大鼠细菌性肾盂肾炎模 型进行实验， 结果头花蓼水提取物组大鼠尿液中的 WBC 和 BLD 与对照组比较明显减少， 显示 头花蓼水提物对肾盂肾炎具有一定的抗炎作用。 任光友等以小鼠腹腔注射大肠杆菌菌液观 察 5 天内小鼠死亡情况， 结果对照组死亡率为 100%， 头花蓼组死亡率分别为 20% 和 50%， 显 示头花蓼水提物能够对抗大肠杆菌引起的感染。任光友等以头花蓼水提物灌胃给药予家 兔， 结果， 头花蓼水提物组与对照组比较， 体温无显著性差异， 但能降低静脉注射伤寒副伤 寒菌苗引起的家兔的发热体温。任光友等， 以头花蓼水提物分别灌胃给药家兔、 大鼠， 与空 白组和速尿对照组比较尿量。结果显示头花蓼水提物对家兔和大鼠无明显利尿作用。徐英 春等人采用琼脂稀释法检测了头花蓼对 10 株淋病奈瑟球菌 ( 淋球菌 ) 的体外抑菌活性， 结 果头花蓼对淋球菌有抑菌活性。其对 10 株淋球菌的最小抑菌浓度范围为 8~32g/L， 平均值 为 11.2g/L。
中国专利申请公开说明书 CN1054899A( 中国专利申请号 90107810.7， 公开日 1991 年 10 月 2 日 ) 中公开了一种泌感灵冲剂、 糖浆生产工艺。该生产工艺是以四季草为原料用 水煎煮 30-60 分钟， 提取液过滤浓缩， 将其上清液减压浓缩成膏， 再用 60-70% 乙醇提取， 将 乙醇提取液真空干燥， 得四季红浸膏， 进一步配制成冲剂或糖浆剂， 据信其具有解毒、 散瘀、 利尿、 通淋的功效。
中华人民共和国卫生部药典委员会 1998 年编的中华人民共和国卫生部 《药品标 准—中药成方制剂》 ( 第十七册 ) 中收载了名为 “热淋清颗粒” 的中成药制剂， 其是通过将 头花蓼加水煎煮两次后过滤浓缩制成的。
CN 1481832A( 中 国 专 利 申 请 号 02129686.3， 公 开 日 2004 年 3 月 17 日 ) 和 CN 1483466A( 中国专利申请号 03146381.9， 公开日 2004 年 3 月 24 日 ) 公开了头花蓼提取物， 其基本上是由以下步骤制备的 ： a. 由头花蓼全草的鲜品或干品用水分两次煎煮或者用醇 水混合物分二至三次回流提取， 每次 1-2 小时， 合并煎煮液， 过滤浓缩至 20° C 时的相对密 度为 1.2， 喷雾干燥或减压干燥得到 ； 或者， b. 由头花蓼全草及其水提药渣经二氧化碳超临 界萃取得到。据信此提取物可用于抗菌、 抗炎、 镇痛、 利尿、 治疗泌尿系统结石、 治疗肾盂肾炎以及前列腺炎。
尽管目前有诸多关于制备头花蓼提取物的报道， 然而本领域技术人员仍然期待从 头花蓼获得临床有效的产品。 发明内容 本发明目的是期待从头花蓼获得一种临床有效的产品。本发明人发现， 使用醇提 取头花蓼， 得到的提取物经特定的大孔树脂洗脱所获得的洗脱物， 其在生物活性方面具有 令人期待的效果。本发明基于此发现而得以完成。
为此， 本发明第一方面提供了一种头花蓼提取物， 其基本上由包括以下步骤的方 法制备得到 ：
(1) 将头花蓼地上部分鲜品或干品加 5-15 倍量 ( 例如 5-12 倍量， 例如 6-10 倍量 ) 的 50~90%( 例如 60~80%， 例如 65~75%， 例如约 70%) 乙醇回流提取 1-3 次 ( 例如 2 次 )， 每次 1-3 小时 ( 例如约 1.5 小时 )， 过滤， 使滤液浓缩、 干燥， 得醇浸膏 ；
(2) 使醇浸膏混悬于甲醇中， 超声处理 0.5~5 小时 ( 例如 0.5~3 小时， 例如 1~2 小 时， 例如约 1.5 小时 )， 离心， 将上清液加载到 MCI 大孔树脂柱 ( 例如， 每 100g 浸膏使用树脂 的量为 0.5-4 升， 例如 1-3 升， 例如 1.5-2.5 升， 例如 2 升 ) 上 ；
(3) 用水， 10%、 20%、 30%、 35%、 40%、 45%、 50%、 60%、 70%、 80%、 100% 甲醇依次进行梯度 洗脱 ( 例如每种溶剂用量为 0.5~5 倍柱体积， 例如 0.5~2.5 倍柱体积， 例如 0.5~2 倍柱体 积， 例如 1 倍柱体积 )， 收集各部分洗脱液， 回收溶剂， 由不同溶剂洗脱获得的部位干燥， 得 到 30%-50% 之间任意浓度间隔或浓度点的甲醇洗脱物， 或者它们的混合物， 即得。
根据本发明第一方面的头花蓼提取物， 其中步骤 (3) 所得甲醇洗脱物是 35%-40% 甲醇洗脱物 ( 在本发明中可简称为 ： 部位 B)。
根据本发明第一方面的头花蓼提取物， 其中部位 B 中含有可水解鞣质例如三没食 子酰葡萄糖。
根据本发明第一方面的头花蓼提取物， 其照超高效液相色谱 - 飞行时间 - 质谱联 用法 ( 在本发明中可简称为 UPLC-TOF-MS) 测定， 结果 ：
在保留时间 3.4-4.4min 之间 ( 例如约 3.9min 处 ) 和保留时间 4.8-5.8min 之间 ( 例如约 5.3min 处 ) 显示可水解鞣质 ( 例如三没食子酰葡萄糖 ) 的色谱峰 ；
其中， UPLC-TOF-MS 的测定方法如下 ：
(i) 供试液配制 ： 称取适量头花蓼提取物粉末 , 加入 70% 甲醇制成浓度约 5mg/ml 的混悬液， 超声使尽量溶解， 混悬液稀释 10 倍， 过滤， 进样 2μl 作质谱检测 ；
(ii) 色谱及质谱分析条件 ：
色谱柱 ： Acquity BEH C18 柱 (2.1×100mm,1.7μm)， 柱温 ： 40 ℃ ； 流速 ： 0.35ml/ min ； 进样量 ： 2μl ； 质谱条件 ： 离子源 ： ESI 源 ； 干燥气体温度 ： 180 ℃ ； 毛细管电压 ： 4500eV ； 检测模式 ： 负离子模式 ； 喷雾压力 ： 2.5bar ； 干燥气 (N2) 流速 ： 8L/min ； 扫描范围 ： 100-2000amu ； 碰撞能量 :10ev ； 以 0.1% 甲酸水溶液为流动相 A， 0.1% 甲酸乙腈溶液为流动 相 B， 按下表规定的程序进行梯度洗脱 ：
6CN 102805767 A 时间 (min) 0 0.5 20 28 30 30.1 32
说A(%) 95 95 81.5 0 0 95 95明书B(%) 5 5 18.5 100 100 5 53/9 页根据本发明第一方面的头花蓼提取物， 其照所述超高效液相色谱 - 飞行时间 - 质 谱联用法测定， 结果 ： (b) 在保留时间 3.4-4.4min 之间 ( 例如约 3.9min 处 ) 和保留时间 4.8-5.8min 之间 ( 例如约 5.3min 处 ) 显示可水解鞣质 ( 例如三没食子酰葡萄糖 ) 的色谱 峰。
根据本发明第一方面的头花蓼提取物， 其照所述超高效液相色谱 - 飞行时间 - 质 谱联用法测定， 结果 ：
在保留时间 3.4-4.4min 之间 ( 例如约 3.9min 处 ) 和保留时间 4.8-5.8min 之间 ( 例如约 5.3min 处 ) 显示可水解鞣质 ( 例如三没食子酰葡萄糖 ) 的色谱峰。
根据本发明第一方面的头花蓼提取物， 其具有本发明第二方面任一实施方案所述 特征。
本发明第二方面提供了一种头花蓼提取物， 其照超高效液相色谱 - 飞行时间 - 质 谱联用法 ( 在本发明中可简称为 UPLC-TOF-MS) 测定， 结果 ：
(b) 在保留时间 3.4-4.4min 之间 ( 例如约 3.9min 处 ) 和保留时间 4.8-5.8min 之 间 ( 例如约 5.3min 处 ) 显示可水解鞣质 ( 例如三没食子酰葡萄糖 ) 的色谱峰 ；
其中， UPLC-TOF-MS 的测定方法如下 ：
(i) 供试液配制 ： 称取适量头花蓼提取物粉末 , 加入 70% 甲醇制成浓度约 5mg/ml 的混悬液， 超声使尽量溶解， 混悬液稀释 10 倍， 过滤， 进样 2μl 作质谱检测 ； (ii) 色谱及质谱分析条件 ：
色谱柱 ： Acquity BEH C18 柱 (2.1×100mm,1.7μm)， 柱温 ： 40 ℃ ； 流速 ： 0.35ml/ min ； 进样量 ： 2μl ； 质谱条件 ： 离子源 ： ESI 源 ； 干燥气体温度 ： 180 ℃ ； 毛细管电压 ： 4500eV ； 检测模式 ： 负离子模式 ； 喷雾压力 ： 2.5bar ； 干燥气 (N2) 流速 ： 8L/min ； 扫描范围 ： 100-2000amu ； 碰撞能量 :10ev ； 以 0.1% 甲酸水溶液为流动相 A， 0.1% 甲酸乙腈溶液为流动 相 B， 按下表规定的程序进行梯度洗脱 ：
7CN 102805767 A 时间 (min) 0 0.5 20 28 30 30.1 32
说A(%) 95 95 81.5 0 0 95 95明书B(%) 5 5 18.5 100 100 5 54/9 页根据本发明第二方面的头花蓼提取物， 其照所述超高效液相色谱 - 飞行时间 - 质 谱联用法测定， 结果 ： (b) 在保留时间 3.4-4.4min 之间 ( 例如约 3.9min 处 ) 和保留时间 4.8-5.8min 之间 ( 例如约 5.3min 处 ) 显示可水解鞣质 ( 例如三没食子酰葡萄糖 ) 的色谱 峰。
根据本发明第二方面的头花蓼提取物， 其照所述超高效液相色谱 - 飞行时间 - 质 谱联用法测定， 结果 ：
在保留时间 3.4-4.4min 之间 ( 例如约 3.9min 处 ) 和保留时间 4.8-5.8min 之间 ( 例如约 5.3min 处 ) 显示可水解鞣质 ( 例如三没食子酰葡萄糖 ) 的色谱峰。
根据本发明第二方面的头花蓼提取物， 其基本上由包括以下步骤的方法制备得 到：
(1) 将头花蓼地上部分鲜品或干品加 5-15 倍量 ( 例如 5-12 倍量， 例如 6-10 倍量 ) 的 50~90%( 例如 60~80%， 例如 65~75%， 例如约 70%) 乙醇回流提取 1-3 次 ( 例如 2 次 )， 每次 1-3 小时 ( 例如约 1.5 小时 )， 过滤， 使滤液浓缩、 干燥， 得醇浸膏 ；
(2) 使醇浸膏混悬于甲醇中， 超声处理 0.5~5 小时 ( 例如 0.5~3 小时， 例如 1~2 小 时， 例如约 1.5 小时 )， 离心， 将上清液加载到 MCI 大孔树脂柱 ( 例如， 每 100g 浸膏使用树脂 的量为 0.5-4 升， 例如 1-3 升， 例如 1.5-2.5 升， 例如 2 升 ) 上 ； (3) 用水， 10%、 20%、 30%、 35%、 40%、 45%、 50%、 60%、 70%、 80%、 100% 甲醇依次进行梯度 洗脱 ( 例如每种溶剂用量为 0.5~5 倍柱体积， 例如 0.5~2.5 倍柱体积， 例如 0.5~2 倍柱体 积， 例如 1 倍柱体积 )， 收集各部分洗脱液， 回收溶剂， 由不同溶剂洗脱获得的部位干燥， 得 到 30%-50% 之间任意浓度间隔或浓度点的甲醇洗脱物， 或者它们的混合物， 即得。
根据本发明第二方面的头花蓼提取物， 其中步骤 (3) 所得甲醇洗脱物是 35%-40% 甲醇洗脱物 ( 在本发明中可简称为 ： 部位 B)。
根据本发明第二方面的头花蓼提取物， 其中部位 B 中含有可水解鞣质例如三没食 子酰葡萄糖。
根据本发明第二方面的头花蓼提取物， 其具有本发明第一方面任一实施方案所述 特征。
本发明第三方面提供了制备本发明第一方面或第二方面任一实施方案所述头花 蓼提取物的方法， 其基本上包括以下步骤 ：
(1) 将头花蓼地上部分鲜品或干品加 5-15 倍量 ( 例如 5-12 倍量， 例如 6-10 倍量 ) 的 50~90%( 例如 60~80%， 例如 65~75%， 例如约 70%) 乙醇回流提取 1-3 次 ( 例如 2 次 )， 每次 1-3 小时 ( 例如约 1.5 小时 )， 过滤， 使滤液浓缩、 干燥， 得醇浸膏 ；
(2) 使醇浸膏混悬于甲醇中， 超声处理 0.5~5 小时 ( 例如 0.5~3 小时， 例如 1~2 小 时， 例如约 1.5 小时 )， 离心， 将上清液加载到 MCI 大孔树脂柱 ( 例如， 每 100g 浸膏使用树脂 的量为 0.5-4 升， 例如 1-3 升， 例如 1.5-2.5 升， 例如 2 升 ) 上 ；
(3) 用水， 10%、 20%、 30%、 35%、 40%、 45%、 50%、 60%、 70%、 80%、 100% 甲醇依次进行梯度 洗脱 ( 例如每种溶剂用量为 0.5~5 倍柱体积， 例如 0.5~2.5 倍柱体积， 例如 0.5~2 倍柱体 积， 例如 1 倍柱体积 )， 收集各部分洗脱液， 回收溶剂， 由不同溶剂洗脱获得的部位干燥， 得 到 30%-50% 之间任意浓度间隔或浓度点的甲醇洗脱物， 或者它们的混合物， 即得。
根据本发明第三方面的方法， 其中步骤 (3) 所得甲醇洗脱物是 35%-40% 甲醇洗脱 物 ( 在本发明中可简称为 ： 部位 B)。
根据本发明第三方面的方法， 其中部位 B 中含有可水解鞣质例如三没食子酰葡萄 糖。 根据本发明第三方面的方法， 其中所得头花蓼提取物具有本发明第一方面或第二 方面任一实施方案所述特征。
本发明第四方面提供本发明第一方面或第二方面所述头花蓼提取物在制备抗淋 球菌的药物中的用途。
本发明第五方面提供了三没食子酰葡萄糖在制备抗淋球菌的药物中的用途。
本发明第六方面提供了一种药物组合物， 其中包含本发明第一方面或第二方面任 一实施方案所述的头花蓼提取物或三没食子酰葡萄糖以及任选的药学可接受的载体。
根据本发明第六方面的药物组合物， 其呈口服或注射给药的制剂形式。在一个实 施方案中， 所述药物组合物呈片剂、 胶囊剂、 颗粒剂、 丸剂、 口服液剂、 注射剂 ( 水针和 / 或粉 针 ) 等的形式。
根据本发明第六方面的药物组合物， 其是用于抗淋球菌的药物。
本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用 其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案， 只要它们不会相互矛盾， 当然在相互 之间适用时， 必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一 步的描述。
本发明所引述的所有文献， 它们的全部内容通过引用并入本文， 并且如果这些文 献所表达的含义与本发明不一致时， 以本发明的表述为准。 此外， 本发明使用的各种术语和 短语具有本领域技术人员公知的一般含义， 即便如此， 本发明仍然希望在此对这些术语和 短语作更详尽的说明和解释， 提及的术语和短语如有与公知含义不一致的， 以本发明所表 述的含义为准。
在本发明中， 本发明方法得到 “头花蓼提取物” ， 该术语亦可称为本发明的 “头花蓼 有效组分” 或者本发明的 “头花蓼有效部位” 。
在本发明中， MCI 大孔树脂可以是是由日本三菱公司生产的 MCIGEL 系列， MCI GEL
系列反相分离填料是在三菱化学 Diaion 和 Sepabeads 大孔吸附树脂基础上设计的， 因为基 于现代的 HPLC 高压液相色谱分离技术， 较小的颗粒有更高的色谱分离性能， 广泛地用于天 然产物和发酵产物的分离。MCI 大孔树脂有两种填料 ： 聚苯乙烯和丙烯酸型， 聚苯乙烯型的 树脂粒经范围为 4μm-100μm， 甲基丙烯酸酯型树脂的粒经范围为 4μm － 31μm。 此外 MCI 系列不仅有大孔型的树脂， 还有阴离子型及阳离子型等型号树脂。 MCI GEL 反相精细分离填 料是一种树脂类填料， 可用于分离皂苷类成分， 一般用甲醇水或乙醇水洗脱。再者 MCI 一般 用来去处极性小的成分中的叶绿素， 对石油醚部分和氯仿部分去处叶绿素的效果很好。在 本发明中， 优选使用的 MCI 大孔树脂是聚苯乙烯型， 其包括但不限于 MCI GEL CHP 10M、 MCI GEL CHP 5C、 MCI GEL CHP55A、 MCI GEL CHP 55Y、 MCI GEL CHP 20Y、 MCI GEL CHP 20P、 MCI GEL CHP 20SS。此外， 在本发明中， 如未另外特别说明， 优选地使用到型号为 MCI GEL CHP 20P(75~150μm) 的大孔树脂， 其是最为广泛使用的型号。它是一种多孔性的聚苯乙烯高 聚物， 它所显示的反相吸附作用广泛， 除了对高极性的糖、 氨基酸基本没有吸附作用外， 对 大多数次生代谢产物有不同程度吸附， 这使得它一方面能有效地除去对水溶性干扰极大的 糖， 氨基酸， 另一方面又能分离不同类型的化合物。
本发明目的在于克服现有技术的不足， 提供一种高效低毒的头花蓼抗炎有效成分 ( 有效部位 ) 与应用。
在一个实施方案中， 发明通过以下技术方案实现上述目的 ：
本发明提供了一种头花蓼有效组分 ( 有效部位 )， 是由以下步骤获得 ：
(1) 将头花蓼地上部分鲜品或干品加 6-8 倍量的 65~75% 乙醇回流提取 2 次 ( 每次 约 1.5 小 )， 过滤， 使滤液浓缩、 干燥， 得醇浸膏 ；
(2) 使醇浸膏混悬于甲醇中， 超声处理约 1.5 小时 )， 离心， 将上清液加载到 MCI 大 孔树脂 (MCI GEL CHP 20P) 柱 ( 每 100g 浸膏使用树脂的量为约 2 升 ) 上 ；
(3) 用水， 10%、 20%、 30%、 35%、 40%、 45%、 50%、 60%、 70%、 80%、 100% 甲醇依次进行梯度 洗脱 ( 例如每种溶剂用量为约 1 倍柱体积 )， 收集各部分洗脱液， 回收溶剂， 由不同溶剂洗脱 获得的部位干燥， 得到 30%-50% 之间任意浓度间隔或浓度点的甲醇洗脱物， 或者它们的混 合物， 即得。
以上步骤 (3) 所得甲醇洗脱物可以是 35%-40% 甲醇洗脱物 ( 部位 B)。
以上步骤 (3) 所得部位 B 中含有可水解鞣质例如三没食子酰葡萄糖。
根据本发明的任一个方面， 其中部位 B 的头花蓼提取物中三没食子酰葡萄糖含量 在 30% 以上， 例如 30-70%， 例如 50-70%。
在本发明中， 以 g/kg 表示试验的给药剂量时， 如无另外说明， 是指每 kg 动物体重 给予相应试药 ( 例如本发明提取物 ) 折合成头花蓼干品的重量。
本发明头花蓼有效组分可以与药物制造上可以接受的辅料组合制备成各种常用 制剂和缓释剂、 控释剂、 靶向制剂等。 附图说明
图 1 是部位 B 的液相色谱图。 图 2-6 分别显示了本发明提取物的抑菌效果。具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容， 特举以下实施例详细说明， 但本发明 的实施方式不限于此。
A、 提取物制备例部分
制备例 1 ： 头花蓼有效组分
(1) 将头花蓼地上部分干品 10Kg， 加 7 倍量的 70% 乙醇回流提取 2 次， 每次约 1.5 小时， 过滤， 使滤液浓缩、 干燥， 得醇浸膏 (885g) ； (2) 使醇浸膏 (45g) 混悬于甲醇中， 超声处 理约 1.5 小时， 离心， 将上清液加载到 MCI 大孔树脂 (MCI GEL CHP 20P) 柱 ( 每 100g 浸膏 使用树脂的量为约 2 升 ) 上 ； (3) 用水， 10%、 20%、 30%、 35%、 40%、 45%、 50%、 60%、 70%、 80%、 100% 甲醇依次进行梯度洗脱 ( 每种溶剂用量为约 1 倍柱体积 )， 收集各部分洗脱液， 回收溶剂， 由 不同溶剂洗脱获得的部位干燥， 得到 35%-40% 甲醇洗脱物是部位 B( 得率 6.38， 三没食子酰 葡萄糖含量为 62.6%%)。
在下文中， 如无另外说明， 所用部位 B 试样是用本制备例 1 的产物。
制备例 2 ： 头花蓼有效组分
(1) 将头花蓼地上部分干品 10Kg， 加 6 倍量的 60% 乙醇回流提取 3 次， 每次约 1 小 时， 过滤， 使滤液浓缩、 干燥， 得醇浸膏 (935g) ； (2) 使醇浸膏 (45g) 混悬于甲醇中， 超声处理 约 2 小时， 离心， 将上清液加载到 MCI 大孔树脂 (MCI GEL CHP 20Y) 柱 ( 每 100g 浸膏使用 树脂的量为约 3 升 ) 上 ； (3) 用水， 10%、 20%、 30%、 35%、 40%、 45%、 50%、 60%、 70%、 80%、 100% 甲醇 依次进行梯度洗脱 ( 每种溶剂用量为约 2 倍柱体积 )， 收集各部分洗脱液， 回收溶剂， 由不同 溶剂洗脱获得的部位干燥， 得到 35%-40% 甲醇洗脱物是部位 B( 得率 5.28%， 三没食子酰葡萄 糖含量为 73.7%)。 另外， 由以上提取物再经色谱纯化， 得到 96.6% 纯度的三没食子酰葡萄糖。
制备例 3 ： 头花蓼有效组分
(1) 将头花蓼地上部分干品 10Kg， 加 10 倍量的 80% 乙醇回流提取 1 次 3 小时， 过 滤， 使滤液浓缩、 干燥， 得醇浸膏 (818g) ； (2) 使醇浸膏 (45g) 混悬于甲醇中， 超声处理约 1 小时， 离心， 将上清液加载到 MCI 大孔树脂 (MCI GEL CHP 55A) 柱 ( 每 100g 浸膏使用树脂 的量为约 1 升 ) 上 ； (3) 用水， 10%、 20%、 30%、 35%、 40%、 45%、 50%、 60%、 70%、 80%、 100% 甲醇依次 进行梯度洗脱 ( 每种溶剂用量为约 0.5 倍柱体积 )， 收集各部分洗脱液， 回收溶剂， 由不同溶 剂洗脱获得的部位干燥， 得到 35%-40% 甲醇洗脱物是部位 B( 得率 8.93%， 三没食子酰葡萄糖 含量为 36.7%)。
B、 药效学试验 ： 抗淋球菌试验考察
1、 材料和方法
菌株 ： 淋球菌 (Neisseria gonorrhoeae)1 株
药物成分 ： 头花蓼组份 1 至 9， 分别记为 F1 至 F9， 它们分别是上文制备例 1 步骤 (3) 用水、 10%、 20%、 30%、 35%、 40%、 45%、 50%、 60%、 70%、 80%、 100% 甲醇依次进行梯度洗脱所收 集各部分洗脱液， 经回收溶剂处理后得到的、 不同溶剂洗脱获得的部位干燥。其中 ：
10-20% 甲醇洗脱物在本发明中可称为组分 1 或 F1 ； 30% 甲醇洗脱物在本发明中可 简称为部位 A， 或称为组分 2 或 F2 ； 35%-40% 甲醇洗脱物在本发明中可简称为部位 B， 或称为 组分 3 或 F3， 其为本发明第一方面的头花蓼提取物 ； 40% 甲醇洗脱物在本发明中可简称为部
位 C， 或称为组分 4 或 F4 ； 40%-50% 甲醇洗脱物在本发明中可简称为部位 D， 或称为组分 5 或 F5 ； 50% 甲醇洗脱物在本发明中可简称为部位 E， 或称为组分 6 或 F6 ； 50%-60% 甲醇洗脱物在 本发明中可简称为部位 F， 或称为组分 7 或 F7 ； 60%-80% 甲醇洗脱物在本发明中可简称为部 位 G， 或称为组分 8 或 F8 ； 80-100% 甲醇洗脱物在本发明中可称为组分 9 或 F9。
其中 F1-F5 用 DW( 去离子水 ) 溶解， F6-F9 用 50% 乙醇 (EtOH) 溶解， 浓度均为 40mg/ ml。另选一种抗生素 ： 四环素 (Tet， 浓度为 10mg/ml)
测试方法 ： 淋球菌用生理盐水配成 0.5 麦氏浊度的菌悬液， 涂布巧克力平板， 贴直 径约 6mm 的圆纸片， 每个纸片上分别加入 F1 至 F9 各试样、 DW、 50% 乙醇、 Tet。共三个平板， 上样量分别为 10μl、 3μl、 1μl。
2、 结果
如图 2、 图 3、 图 4 所示， 三个图分别显示了上样量 10μl、 3μl、 1μl 的试验结果。 各图中， 如图所示从 F1 位置开始， 逆时针方向依次为 F1-F9、 DW、 50% 乙醇、 Tet 的试药。图 三个图的结果显示， F3 试药的抑菌圈直径明显大于其它提取物试样或空白溶剂 ( 水或乙醇 溶液 )。
在此基础上， 发明人重复进行了一次试验， 上样量分别为 10μl 和 3μl 结果见图 5。图中， 左侧上样量 10μl， 右侧上样量 3μl， 从图中所示 F1 位置开始， 逆时针方向依次为 F1-F9、 DW、 50% 乙醇、 Tet。结果仍然显示 F3 的抑菌圈直径明显大于其它提取物试样或空白 溶剂 ( 水或乙醇溶液 )， 具有良好的抑菌效果。
经测量， 抑菌圈直径结果见下表 ：抑菌圈直径 6mm 即为与纸片直径相同， 无抑菌作用。抑菌圈直径越大， 抑菌作用越 强。在加样量为 10μl 时， F3(400μg) 有良好的抑菌作用， F2、 F4-6 有微弱的抑菌作用， 而 其它提取物无抑菌作用。在加样量 3μl 时， F3(120μg) 有一定的抑菌作用， 其它提取物无 抑菌作用。
以抑菌圈半径与纸片半径之差表示各组分抑菌结果参见图 6。图中上半部左侧显 示了抑菌圈半径与纸片半径之差计算结果， 上半部右侧显示了计算方法， 下半部以直方图 方式显示了各物质抑菌结果， 显示 F3 具有可以与四环素相比较的抑菌效果， 例如在 3ul 剂 量下甚至其抑菌效果比四环素好 ； 而其它各物质的抑菌效果弱。
发明人在另外的试验中， 使用获制备例获得的三没食子酰葡萄糖作为试药， 按上 面所述抗淋球菌试验考察进行试验， 结果在与 F3 相同剂量下， 其抑菌圈直径与 F3 基本相 同， 显示三没食子酰葡萄糖亦具有显著的抗淋球菌效果。
C、 化学分析例部分
使用 UPLC-TOF-MS 法测试制备例 1 所得醇提取物和各部位。
UPLC-TOF-MS 的测定方法如下 ：
(i) 供试液配制 ： 称取适量头花蓼提取物粉末 , 加入 70% 甲醇制成浓度约 5mg/ml 的混悬液， 超声使尽量溶解， 混悬液稀释 10 倍， 过滤， 进样 2μl 作质谱检测 ；
(ii) 色谱及质谱分析条件 ：
色谱柱 ： Acquity BEH C18 柱 (2.1×100mm,1.7μm)， 柱温 ： 40 ℃ ； 流速 ： 0.35ml/ min ； 进样量 ： 2μl ； 质谱条件 ： 离子源 ： ESI 源 ； 干燥气体温度 ： 180 ℃ ； 毛细管电压 ： 4500eV ； 检测模式 ： 负离子模式 ； 喷雾压力 ： 2.5bar ； 干燥气 (N2) 流速 ： 8L/min ； 扫描范围 ： 100-2000amu ； 碰撞能量 :10ev ； 以 0.1% 甲酸水溶液为流动相 A， 0.1% 甲酸乙腈溶液为流动 相 B， 按下表规定的程序进行梯度洗脱 ：
时间 (min) 0 0.5 20 28 30 30.1 32
A(%) 95 95 81.5 0 0 95 95 B(%) 5 5 18.5 100 100 5 5结果 ：
部位 B 样品显示， 在保留时间约 3.9min 处和保留时间约 5.3min 处显示可水解鞣 质 ( 例如三没食子酰葡萄糖 ) 的色谱峰， 参见图 1 ；
本发明提供的头花蓼各有效部位， 其中所包含的部位物质及其表征数据见下表 ：