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1、(10)申请公布号 CN 103026901 A (43)申请公布日 2013.04.10 CN 103026901 A *CN103026901A* (21)申请号 201210580100.7 (22)申请日 2012.12.28 A01G 1/04(2006.01) (71)申请人 福建农林大学 地址 350002 福建省福州市仓山区建新镇金 山学区 (72)发明人 吴小平 柯斌榕 刘芳 刘新锐 (74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 代理人 蔡学俊 (54) 发明名称 一种赤芝担孢子萌发的方法 (57) 摘要 本发明涉及一种赤芝担孢子萌发的方法。通 过选择赤芝。
2、子实体时期， 采用套袋方法收集担孢 子并控制收集担孢子时间， 在麦芽赤芝培养基进 行萌发， 使赤芝担孢子的萌发率在 1.0% 以上， 从 而获得赤芝单孢菌株， 所述麦芽赤芝培养基配方 为 ： 麦芽汁200ml， 赤芝提取液100ml， 琼脂20g， 水 700ml， 121灭菌 30min。本方法解决了在实验室 条件下赤芝担孢子不易萌发的难题， 从而为赤芝 的单孢杂交育种打下基础。 本发明简单易行， 无需 用到特殊的药品及仪器设备， 普通实验室即可通 过本发明获得所需的单孢菌株用于赤芝的杂交育 种或用于赤芝的遗传分析。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 。
3、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种赤芝担孢子萌发的方法， 其特征在于 ： 所述方法包括以下步骤 ： （1） 担孢子收集 用于萌发的担孢子应选择孢子释放周期前 10 天释放的， 即待赤芝菌盖分化形成， 菌盖 边缘 1-2cm 呈白色生长圈时收集担孢子 ； 采用套袋收集的方法， 套袋材料选用无菌的白色或黄色的信封和硫酸纸， 将无菌的硫 酸纸光面向上放入信封， 再用信封将赤芝菌盖套住至菌柄， 使有放硫酸纸的一面对着菌盖 背面， 用橡皮筋将信封口固定在菌柄上 ； 担孢子收集期间控制环境相对湿度 80%。
4、-90%， 温度 24 -28， 套袋收集的时间为 20h-24h ； （2） 担孢子保存 收集的赤芝担孢子放在信封内， 控制环境温度 20 -30、 相对湿度 50%-75%， 或放置 在 4冰箱 ； 但放置时间不超过 24h ； （3） 担孢子萌发 取收集的赤芝担孢子， 在无菌操作下用无菌水稀释至 100 倍显微镜视野中有 10-20 个 孢子即可涂布赤芝担孢子萌发培养基， 然后在 28生化培养箱中黑暗培养， 至担孢子萌发 ； 使用的赤芝担孢子萌发培养基为麦芽赤芝培养基， 其配方为 ： 麦芽汁 200ml， 赤芝提取液 100 ml， 琼脂 20g， 水 700ml， 121灭菌 30 m。
5、in ； 所述麦芽汁 ： 取干麦芽粉15-20g加入300ml水中， 在6070浸渍60min， 过滤取浸渍 液， 将残渣同样再浸渍、 过滤一次， 将两次浸渍液混合， 过滤去除残渣并加水定容至 1L ； 所述赤芝提取液 ： 取 120-200g 切碎的干赤芝， 加入 1L 水煮沸 30min， 过滤去除残渣并 加水定容至 1L。 权 利 要 求 书 CN 103026901 A 2 1/4 页 3 一种赤芝担孢子萌发的方法 0001 技术领域 本发明涉及一种赤芝担孢子萌发的方法。 0002 背景技术 赤芝， 学名为Ganoderma lucidum (Leyss.Fr) Karst， 属于真菌。
6、门、 担子菌亚门、 层菌 纲、 非褶菌目、 灵芝科、 灵芝属。我国最早的药学著作 （神农本草经） 中记载有赤芝 “苦、 平、 无毒” ， 主治 “胸中结” ，“益心气， 补中， 增智慧， 不忘” ， 此外还强调灵芝可 “久食亲身不老， 延 年神仙” 。可见灵芝的使用早在公元一世纪左右便为人所知。上世纪 70 年代， 林志彬等在 对灵芝药理和临床的研究过程中提出来了灵芝 “扶正固本” 的作用机制的工作假说。并在 长期的研究中证明并完善这一假说。灵芝的药理作用主要表现在以下几个方面 ： 1、 抗肿瘤 作用 ； 2、 免疫调节作用 ； 3、 抗放射作用 ； 4、 对神经系统作用 ； 5、 对心血管的。
7、作用 ； 6、 对呼吸 系统的作用 ； 7、 对消化系统的作用 ； 8、 对内分泌代谢系统的作用。 0003 食用菌常用育种方法主要有单孢杂交育种， 原生质体融合育种， 诱变育种以及野 生菌株驯化等， 但灵芝担孢子细胞壁厚， 长期以来被认为不能萌发， 限制了灵芝的新品种选 育。据统计我国已通过省级以上审定的赤芝品种共计 18 个， 其中国家级审定品种 4 个， 省 级审定品种 14 个。18 个品种中引进品种 1 个， 野生驯化品种 13 个， 原生质体融合育成的品 种 2 个， 通过原生质体单核化育种品种 2 个。相较于其他食药菌品种， 杂交育种所在的比例 很少， 而通过单孢杂交选育而成的品。
8、种则没有。目前国内栽培的赤芝品种主要是从日本和 韩国引进的品种， 如从日本引进的日芝、 信州、 惠州等， 韩国引进的韩芝系列等。 0004 野生驯化菌种中高产优质的品种较少， 且筛选驯化工作繁重。诱变育种由于选育 定向性差及遗传稳定性差所以在生产栽培上很少推广使用。 原生质体单核化育种虽可以解 决由于灵芝担孢子难萌发， 单核菌株难以获得的难题， 但是原生质体单核化获得的单核菌 株未经减数分裂过程， 一个菌株只能获得两种类型的单核菌株， 因此通过原生质体技术很 难获得广泛变异的新品种。通过担孢子能获得具有丰富遗传多样性的单核菌株， 本发明解 决了赤芝担孢子难萌发的问题， 为赤芝的单孢杂交育种打下。
9、良好的基础， 具有广泛的应用 前景。 0005 发明内容 本发明的目的是提供一种赤芝担孢子萌发的方法， 解决赤芝担孢子不易萌发的难题， 为赤芝的单孢杂交育种打下基础。 0006 本发明的一种赤芝担孢子萌发的方法， 包括以下步骤 ： （1） 担孢子收集 用于萌发的担孢子应选择孢子释放周期前 10 天释放的， 即待赤芝菌盖分化形成， 菌盖 边缘 1-2cm 呈白色生长圈时收集担孢子 ； 采用套袋收集的方法， 套袋材料选用无菌的白色或黄色的信封和硫酸纸， 将无菌的硫 酸纸光面向上放入信封， 再用信封将赤芝菌盖套住至菌柄， 使有放硫酸纸的一面对着菌盖 背面， 用橡皮筋将信封口固定在菌柄上 ； 担孢子收。
10、集期间控制环境相对湿度 80%-90%， 温度 24 -28， 套袋收集的时间为 20h-24h ； 说 明 书 CN 103026901 A 3 2/4 页 4 （2） 担孢子保存 收集的赤芝担孢子放在信封内， 控制环境温度 20 -30、 相对湿度 50%-75%， 或放置 在 4冰箱 ； 但放置时间不超过 24h ； （3） 担孢子萌发 取收集的赤芝担孢子， 在无菌操作下用无菌水稀释至 100 倍显微镜视野中有 10-20 个 孢子即可涂布赤芝担孢子萌发培养基， 然后在 28生化培养箱中黑暗培养， 至担孢子萌发 ； 使用的赤芝担孢子萌发培养基为麦芽赤芝培养基， 其配方为 ： 麦芽汁 20。
11、0ml， 赤芝提取液 100 ml， 琼脂 20g， 水 700ml， 121灭菌 30 min ； 所述麦芽汁 ： 取干麦芽粉15-20g加入300ml水中， 在6070浸渍60min， 过滤取浸渍 液， 将残渣同样再浸渍、 过滤一次， 将两次浸渍液混合， 过滤去除残渣并加水定容至 1L ； 所述赤芝提取液 ： 取 120-200g 切碎的干赤芝， 加入 1L 水煮沸 30min， 过滤去除残渣并 加水定容至 1L。 0007 通过选择赤芝子实体时期， 采用套袋方法收集担孢子并控制收集担孢子时间， 在 麦芽赤芝培养基进行萌发， 使赤芝担孢子的萌发率在 1.0% 以上， 从而获得赤芝单孢菌株。。
12、 本方法解决了在实验室条件下赤芝担孢子不易萌发的难题， 从而为赤芝的单孢杂交育种打 下基础。 0008 担孢子是担子菌细胞核减数分裂的产物， 是进行杂交选育的基本材料。本发明简 单易行， 无需用到特殊的药品及仪器设备， 普通实验室即可通过本发明获得所需的单孢菌 株用于赤芝的杂交育种或用于赤芝的遗传分析。 由于通过担孢子萌发所获得的单核菌株多 样性丰富， 用于杂交育种其后代遗传性状稳定， 且有利于获得新的遗传性状， 克服了野生驯 化遗传变异小， 诱变育种不稳定的问题， 为赤芝的品种改良和新品种选育打下基础。 附图说明 0009 图 1 赤芝担孢子在培养基萌发形态。 0010 图 2 赤芝子实体生。
13、长中期， 此时收集的担孢子易萌发。 0011 图 3 赤芝子实体生长后期， 此时收集的担孢子不易萌发或不萌发。 0012 图 4 赤芝子实全生长成熟期， 此时收集的担孢子不萌发。 具体实施例 0013 本发明的一种赤芝担孢子萌发的方法， 包括以下步骤 ： 1. 担孢子收集时期及方法 赤芝孢子释放周期大约 30 天， 用于萌发的担孢子应选择前 10 天释放的。即待赤芝菌 盖分化形成， 菌盖边缘 1-2cm 呈白色生长圈时收集担孢子， 见图 2。若菌盖边缘的白色生长 圈小于 1cm 或消失时收集的担孢子不易萌发或不萌发， 见图 3 和图 4。 0014 孢子采集采用套袋收集的方法， 套袋材料选用无。
14、菌的白色信封和硫酸纸。将无菌 的硫酸纸光面向上放入信封， 再用信封将赤芝菌盖套住至菌柄， 使有放硫酸纸的一面对着 菌盖背面， 用橡皮筋将信封口固定在菌柄上。孢子收集期间控制空间相对湿度在 80%-90%， 温度 24 -28， 套袋收集的时间在 20h-24h 便可在硫酸纸收集到赤芝担孢子。收集时间 过短则收集的孢子量少， 若时间过长收集的担孢子则不易萌发或不萌发。 说 明 书 CN 103026901 A 4 3/4 页 5 0015 2. 担孢子保存 收集的赤芝担孢子放在无菌的信封内， 空间温度 20 -30、 相对湿度 50%-75%， 或放 置 4冰箱， 但放置时间不超过 24h， 若。
15、超过 24h 则不易萌发或不萌发。 0016 3. 担孢子萌发处理 取刚收集的赤芝孢子印， 在无菌操作下稀释至 100 倍显微镜视野中有 10-20 个孢子即 可涂布平板， 涂好的平板在 28生化培养箱中黑暗培养 48h 后开始观察， 至担孢子开始萌 发。使用的赤芝担孢子萌发培养基为麦芽赤芝培养基， 其配方为 ： 麦芽汁 200ml， 赤芝提取 液 100 ml， 琼脂 20g， 水 700ml， 121灭菌 30 min。 0017 麦芽汁 ： 取干麦芽粉15-20g加入300ml水中， 在6070浸渍60min， 过滤取浸渍 液， 将残渣同样再浸渍、 过滤一次， 将两次浸渍液混合， 过滤去。
16、除残渣并加水至 1L。 0018 赤芝提取液 ： 取 120-200g 切碎的干赤芝， 加入 1L 煮沸 30min， 过滤去除残渣并加 水至 1L。 0019 为了充分公开本发明的赤芝担孢子萌发的方法， 以下结合实施例加以说明。 0020 实施例 1 ： 一种赤芝担孢子萌发的方法 1. 亲本选择及岀芝 ： 选择生产性状良好的日本赤芝和赤芝 5.75 作为亲本， 在 PDA 斜面进行活化， 长满斜面 后转接到木屑菌袋中。具体种植方法参见文献 ： 曾振基， 古培总， 陈东标， 凌宏通， 何焕清 杂木屑栽培赤灵芝技术 J中国食用菌， 2004， 23（3） ： 41-42。 0021 2. 担孢子。
17、采集时期及方法 赤芝孢子释放周期大约 30 天， 用于萌发的担孢子应选择前 10 天释放的。即待赤芝菌 盖分化形成， 选择子实体生长至 3-4cm、 菌盖边缘 1-2cm 呈白色生长圈时收集担孢子。用无 菌的白色信封和硫酸纸采用套袋法收集孢子， 将无菌的硫酸纸光面向上放入信封， 再用信 封将赤芝菌盖套住至菌柄， 使有放硫酸纸的一面对着菌盖背面， 用橡皮筋将信封口固定在 菌柄上。孢子收集期间控制空间相对湿度在 85%-90%， 温度 26， 套袋收集的时间为 22h 便 可在硫酸纸收集到赤芝担孢子。收集时间过短则收集的孢子量少， 若时间过长收集的担孢 子则不易萌发或不萌发。 0022 3. 担孢。
18、子保存 将收集的赤芝担孢子装入无菌的信封内， 于室温下、 相对湿度 70% 放置 4h 后进行涂单 孢。 0023 4. 担担孢子萌发处理 取收集保存 4h 的赤芝孢子印， 在无菌操作下用无菌水稀释至 100 倍显微镜视野中有 10-20 个孢子即可涂布平板， 涂好的平板在 28生化培养箱中黑暗培养 4854h， 可观察到萌 发的赤芝担孢子。使用的赤芝担孢子萌发的平板培养基为麦芽赤芝汁琼脂培养基， 其配方 为 ： 麦芽汁 200ml， 赤芝提取液 100 ml， 琼脂 20g， 水 700ml， 121灭菌 30 min。 0024 麦芽汁 ： 取干麦芽粉15g加入300ml水中， 在6070。
19、浸渍60min， 过滤取浸渍液， 将残渣同样再浸渍、 过滤一次， 将两次浸渍液混合， 过滤去除残渣并加水至 1L。 0025 赤芝提取液 ： 取 120g 切碎的干赤芝， 加入 1L 水煮沸 30min， 过滤去除残渣并加水 至 1L。 0026 PDA 培养基配方 ： 200g 马铃薯 （浸提液） 、 20g 葡萄糖、 20g 琼脂、 pH 自然加水至 说 明 书 CN 103026901 A 5 4/4 页 6 1000mL。 0027 水琼脂培养基配方 ： 琼脂 20g， 水 1000ml。 0028 表 1 不同萌发处理 48h 赤芝孢子萌发率 备注 ：“” 代表未观察到孢子萌发 5.。
20、 单核菌株获得及检测 选取观察到有担孢子萌发的平板， 在 100 倍显微镜下观察寻找萌发出芽管的担孢子， 见图 1。用接种针无菌条件下连同培养基挑出萌发担孢子于 PDA 斜面培养基中， 28培养。 当菌落长到 1cm 左右时即可在显微镜下镜检观察是否有锁状联合， 无锁状联合的即为单核 菌株。通过纯化后， 共获得了日本赤芝单核菌株 43 根， 赤芝 5.75 单核菌株 45 根。 0029 6. 单核菌株交配型测定 以日本赤芝的一个单孢菌株记为 T1， 作为交配型测定的基准菌株， 其交配型定为 AxBx。 将余下 42 根日本赤芝单核菌株与 T1在 PDA 培养基上进行配对， 待两个单孢菌株的菌。
21、丝接 触 3d 后， 观察锁状联合， 出现锁状联合的表示与 T1发生亲和反应， 选出能与 T1发生亲和反 应的单孢菌株， 将其定为测交菌株 T2， 其交配型定为 AyBy。 0030 将所有不与 T1亲和的单孢分离菌株与 T2交配， 能与 T2发生亲和反应的单孢分离 菌株的交配型则为 AxBx。 0031 将既不与 T1发生亲和， 又不与 T2发生亲和的某一单孢菌株定为测交菌株 T3， 其交 配型定为 AxBy。将既不与 T1发生亲和， 又不与 T2发生亲和的所有其他单孢菌株均与 T3交 配， 交配中发生亲和的菌株的交配型为 AyBx， 而不亲和的菌株交配型为 AxBy。 0032 通过三轮交。
22、配反应， 可知43根日本赤芝单核菌株的交配型， 交配型为AxBx有15个 单孢菌株， 交配型为AyBy有18个单孢菌株， 交配型为AxBy有7个单孢菌株， 交配型为AyBx有 3 个单孢菌株。获得四种交配的单孢菌株。 0033 同样的方法测得 45 根赤芝 5.75 单核菌株的交配型， 交配型为 AxBx有 20 个单孢菌 株， 交配型为 AyBy有 19 个单孢菌株， 交配型为 AxBy有 6 个单孢菌株。获得三种交配型的单 孢菌株。 0034 这些单孢菌株为后续赤芝品种间的单孢杂交育种打下基础。 说 明 书 CN 103026901 A 6 1/2 页 7 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103026901 A 7 2/2 页 8 图 4 说 明 书 附 图 CN 103026901 A 8 。