人源抗人表皮生长因子受体抗体及其编码基因与应用.pdf

本发明提供了一种人源抗人表皮生长因子受体（EGFR）抗体及其编码基因与应用。本发明通过基因工程手段和噬菌体表面展示技术，从全合成单链人抗体库中筛选出抗人EGFR的基因工程单链抗体，并获得其抗体的可变区基因序列，在此基础上构建全人单克隆抗体，进一步获得高纯度抗体蛋白。本发明的抗体与人EGFR结合的亲和力不小于1nM，其突变体亲和力不小于10nM；并完成了抗体蛋白IgG的免疫活性和生物活性鉴定，证实抗体具有良好的抑制EGFR高表达细胞A431荷瘤模型小鼠肿瘤生长的生物学活性，本发明为针对EGFR靶标的抗肿瘤及其他疾病如炎症及自身免疫性疾病的预防和治疗提供了特异性抗体药物。

权利要求书一种人源抗人EGFR抗体，其特征在于，其轻链可变区含有如SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列。
如权利要求1所述的抗体，其特征在于，其轻链可变区含有如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
如权利要求1所述的抗体，其特征在于，其轻链可变区含有如SEQ ID NO 7所示的氨基酸序列。
如权利要求1~3任一所述的抗体，其特征在于，其重链可变区含有如SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列。
如权利要求1~3任一所述的抗体，其特征在于，其重链可变区含有如SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列。
如权利要求5所述的抗体，其特征在于，其重链可变区含有如SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列。
如权利要求5所述的抗体，其特征在于，其重链可变区含有如SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列。
如权利要求1所述的抗体，其特征在于，其轻链可变区含有如SEQ ID NO 7所示的氨基酸序列，其重链可变区含有如SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列。
如权利要求1~3或6~8任一所述的抗体，其特征在于，其为单链抗体、Fab、微型抗体、嵌合抗体或全抗体免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgA、IgE、IgM、IgG4、IgD。
编码权利要求1~9任一项所述抗体的基因。
如权利要求10所述的基因，其特征在于，编码轻链可变区的基因其核苷酸序列为：
1）如SEQ ID NO 9所示的DNA序列；
2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码所述轻链可变区的核苷酸序列；
3）与1）限定的DNA序列具有70％以上的同源性且编码所述轻链可变区的核苷酸序列。
如权利要求10所述的基因，其特征在于，编码重链可变区的基因其核苷酸序列为：
1）如SEQ ID NO 10所示的DNA序列；
2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码所述重链可变区的核苷酸序列；
3）与1）限定的DNA序列具有70％以上的同源性且编码所述重链可变区的核苷酸序列。
含有权利要求11和12所述基因的表达载体。
含有权利要求13所述表达载体的宿主菌、宿主细胞或表达盒。
如权利要求1~3或6~8任一所述的抗体，其特征在于，该抗体以至少约10‑8M的亲和力结合于人EGFR。
如权利要求1~3或6~8任一所述的抗体，其特征在于，该抗体抑制EGFR配体结合人EGFR。
如权利要求1~3或6~8任一所述的抗体，其特征在于，其结合于表达EGFR的细胞，但不诱导补体介导的细胞裂解；所述的细胞是人皮肤癌细胞、人肝癌细胞、人结肠癌细胞、人宫颈癌细胞、卵巢癌细胞、人肺癌细胞、膀胱癌细胞、乳腺癌细胞、肾癌细胞、前列腺癌细胞、头颈部肿瘤鳞状细胞、滑膜成纤维细胞或角质形成细胞。
制备权利要求1~9任一所述抗体的方法，其特征在于，利用噬菌体展示抗体库技术筛选抗EGFR特异性单链抗体，获得抗体轻链、重链可变区基因，并将其克隆入全抗体表达载体，通过哺乳动物表达系统或其他表达系统对其进行全抗体表达，获得其全抗体蛋白。
权利要求1~9任一所述抗体在制备以EGFR为靶标的疾病治疗药物中的应用。
如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述的药物为抗肿瘤药、抗炎药物或治疗自身免疫性疾病的药物。
含有权利要求1~9任一项所述抗体的药物或检测试剂。
一种免疫毒素，包含以各种形式连接于细胞毒性剂的权利要求1~9任一所述的抗体。
如权利要求22所述的免疫毒素，其特征在于，所述的各种连接形式为抗体被标记、体外交联或分子偶联。
如权利要求22所述的免疫毒素，其特征在于，所述的细胞毒性剂包括化学分子、放射性同位素、多肽、毒素及其他对细胞具有杀伤或诱导细胞死亡特性的物质。
一种双特异性或多特异性分子，其特征在于，包含权利要求1～9任一所述的抗体或抗体的抗原结合部位的分子。
一种抗体与其他蛋白或\和多肽的融合蛋白，其特征在于，包含权利要求1～9任一所述抗体和具有某种功能的其他蛋白或多肽分子的复合物。
如权利要求26所述的融合蛋白，其特征在于，将抗体基因与免疫毒素或细胞因子基因连接构建重组表达载体，通过哺乳动物细胞或其他表达系统获得重组融合蛋白分子。

说明书人源抗人表皮生长因子受体抗体及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及治疗用人源基因工程抗体的制备及应用，主要是涉及特异性针对人表皮生长因子受体（epidemic growth factor receptor，EGFR）的抗体及其编码基因与应用。
背景技术
表皮生长因子受体（EGFR）是表皮生长因子基因（erbB）家族的一员，在多种肿瘤如乳腺癌，结肠癌，头颈肿瘤，肾癌，肺癌，胰腺癌，前列腺癌的发展中均具有重要影响。国内外许多研究表明，针对EGFR的抗体可有效地在胞外通过阻断配体的结合来实现对EGFR信号转导途径的抑制，对多种由EGFR过度表达或/和突变所引起的人体肿瘤，尤其是头颈部鳞状细胞癌（80％～100%）、结直肠癌(25％～77%)、非小细胞型肺癌(40％～80%)等有较好的疗效。表皮生长因子受体是目前研究得较深入且倍受关注的肿瘤治疗靶点之一，应用基因工程手段研制抗EGFR的单克隆抗体，是目前肿瘤治疗的研究热点之一。
目前已经有2株抗EGFR的治疗性抗体获得美国FDA的批准，分别是针对EGFR的鼠‑人嵌合抗体西妥昔单抗（cetuximab，商品名为爱必妥）和全人抗体帕尼单抗（panitumumab），用于结直肠癌和头颈部肿瘤治疗。2005年，抗EGFR的人源化抗体尼莫珠单抗（nimotuzumab，商品名为泰欣生）获得了我国药监局（SFDA）批准的1类新药证书。针对该靶标的在研抗体包括人源化单抗pertuzumab、人源抗体zalutumumab和Necitumumab等。其结合的抗原表位不尽相同，但均能够发挥抑制EGFR介导的生物学功能。
人抗体是治疗性抗体发展的最终方向，临床上应用人抗体可最大限度减少抗体的免疫原性、延长抗体在体内的半衰期并可借助人免疫球蛋白Fc段介导免疫调理、ADCC及CDC效应，进而增强抗体的生物学效应。人抗体的主要研制手段包括抗体库技术和转基因小鼠技术。目前，大容量抗体库技术已经非常成熟，尤其是噬菌体展示抗体库技术已经成功实现了多株全人抗体的成功上市。在已构建的大容量抗体库中，CAT公司的半合成抗体库和Marphosys AG公司的全合成抗体库是最具代表性和最为成功的代表。尤其是通过Marphosys AG公司的HuCAL GOLD技术已经获得了数十株具有开发价值的候选抗体，目前进入临床阶段的有17个项目。该技术的最大优势在于可以通过合理设计对抗体库进行优化，同时，其抗体框架基因为可替换的盒式结构，便于后期的抗体优化和改造，基于这一优势，HuCAL库目前已经将其抗体库更新至第三代，库容量达到4.5×1010，从抗体库中可筛选到亲和力达到pM水平的高亲和力抗体。因此，目前在技术上利用抗体库技术获得治疗性人抗体已经非常成熟，被认为是目前最成功的开发治疗性抗体的技术手段之一。申请人通过技术优化和探索，发明了一种高效的DNA连接和转化的方法，并将其用于大容量噬菌体抗体库的构建，构建了库容量达到1.35×1010的大容量全合成噬菌体单链人抗体资源库（ZL.200910091261.8），并利用该抗体库筛选获得了多个针对不同靶标的特异性抗体。本发明所获得的抗体Ame55即为从抗体库中筛选获得。
发明内容
本发明提供了用于治疗和预防与EGFR表达相关的疾病，特别是表达EGFR的肿瘤和自身免疫性疾病的抗体治疗。
本发明的第一个目的在于提供一种人源抗EGFR抗体及其活性片段的氨基酸序列。
本发明的第二个目的在于提供编码上述抗体或其活性片段的基因。
本发明的第三个目的在于提供上述抗体及其活性片段在制备治疗高表达/过度表达EGFR的恶性肿瘤和自身免疫性疾病药物中的应用。
本发明运用噬菌体表面展示技术，从大容量全合成人源单链抗体库中，通过多轮的生物淘洗（bio‑panning），筛选获得特异性抗人EGFR的单链基因工程抗体(single chain variable fragment,scFv)。在本发明实施例中，将上述抗体轻重链可变区分别导入全抗体哺乳动物细胞瞬时表达载体pABL和pABG1中，通过共转染HEK 293T细胞进行瞬时分泌表达，得到全抗体Ame55。
本发明提供的抗体可变区氨基酸序列模式为FR1‑CDR1‑FR2‑CDR2‑FR3‑CDR3‑FR4。在此，FR1～4代表4个框架区域，CDR1～3代表3个高变区。FR1～4可以是从恒定区序列分离而来（比如人免疫球蛋白轻重链类、亚类或亚家族最常用的氨基酸），也可以是从个人抗体框架区分离而来或从不同的框架区基因组合而来。例如Kabat等库中收录的众多人抗体框架区序列。
其中，重链可变区为人免疫球蛋白亚群人重链VH V家族，轻链可变区为Lambda III家族。关于轻重链的CDR区，通过丙氨酸扫描及其他同类氨基酸突变，获得大量突变体，对轻链CDR1、CDR2和CDR3的突变体评价结果表明CDRL1序列为:SGDX1LGDKYX2X3(SEQ ID NO 1)在此，X1可以是Ala、Gly、Asn、Lys，优选为Lys和Gly；X2可以是Ala、Val和Ile，优选为Ala；X3可为Ser和Tyr，优选为Ser。CDR2L序列为：EDX1KRPS（SEQ ID NO 2），在此，X1可以是Ser、Thr、Ala和Gly，优选为Ser。CDRL3序列可以是：X1X2WDX3DWX4MP（SEQ ID NO 3），在此，X1为Ser、Ala、Gly、Leu、Asn、Tyr和Gln，优选为Ser；X2可以是Val、Ser、Ala和Leu，优选为Ser或Ala；X3可以是Gly、Ala和Pro，优选为Gly；X4可以是Gly和Ser，优选为Gly。对重链CDR2和CDR3的突变体评价结果表明：CDRH2序列为X1IIYPX2DSDTRYSPSFQ(SEQ ID NO 5)，在此，X1可以是Gly和Ser，优选为Gly；X2可以是Gly和Ser，优选是Gly。CDR3H序列为GIIYPSNVX1V（SEQ ID NO 6），在此，X1可以是Ala、Ser和Gly，优选为Ser或Ala。对该抗体的轻重链CDR区进行丙氨酸扫描，结果表明，轻重链CDR3及轻链CDR1和重链CDR2对抗体与EGFR的结合至关重要。仅单个氨基酸的变化可引起亲和力几倍至几十倍的改变，具体见实施例5。
本发明提供的人源抗人EGFR抗体，其轻链可变区含有如SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列。
进一步地，其轻链可变区含有如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
更进一步地，其轻链可变区含有如SEQ ID NO 7所示的氨基酸序列。
进一步地，本发明提供的人源抗人EGFR抗体，其重链可变区含有如SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列。
进一步地，其重链可变区还含有如SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列。
更进一步地，其重链可变区含有如SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列。
本发明提供的人源抗人EGFR抗体，其为单链抗体、Fab、微型抗体、嵌合抗体或全抗体免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgA、IgE、IgM、IgG4、IgD。
本发明提供的人源抗人EGFR抗体Ame55，其重链可变区来自VH5，其轻链可变区来自Vλ3，其抗体亚型为IgG1。
本发明提供的人源抗人EGFR抗体，其轻链可变区含有如SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列，其重链可变区含有如SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列。
本发明提供的人源抗人EGFR抗体，其轻链可变区含有如SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列，其重链可变区含有如SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列。
优选地，本发明提供的人源抗人EGFR抗体，其轻链可变区含有如SEQ ID NO 7所示的氨基酸序列，其重链可变区含有如SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列。
本发明提供的人源抗人EGFR抗体以至少约10‑8M的亲和力结合于人EGFR。该抗体抑制EGFR配体结合人EGFR。该抗体结合于表达EGFR的细胞，但不诱导补体介导的细胞裂解；所述的细胞是人皮肤癌细胞、人肝癌细胞、人结肠癌细胞、人宫颈癌细胞、卵巢癌细胞、人肺癌细胞、膀胱癌细胞、乳腺癌细胞、肾癌细胞、前列腺癌细胞、头颈部肿瘤鳞状细胞、滑膜成纤维细胞或角质形成细胞。
本发明提供了编码上述抗体的基因。
其中，编码轻链可变区的基因其核苷酸序列为：
1）如SEQ ID NO 9所示的DNA序列；
2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码所述轻链可变区的核苷酸序列；
3）与1）限定的DNA序列具有70％以上的同源性且编码所述轻链可变区的核苷酸序列。
在本发明中，“严格条件”是指：（1）在较低的离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃;或（2）杂交时加有变性剂，如50%（V/V）甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1Ficoll，42℃等；或（3）仅在两条序列之间的相同性至少在70%以上，较佳地至少80%以上，更佳地90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。
其中，编码重链可变区的基因其核苷酸序列为：
1）如SEQ ID NO 10所示的DNA序列；
2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码所述重链可变区的核苷酸序列；
3）与1）限定的DNA序列具有70％以上的同源性且编码所述重链可变区的核苷酸序列。
此外，考虑到密码子的简并性，编码本发明所述抗体的基因可以但不局限于SEQ ID NO 9和10，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，对编码上述抗体的基因序列进行修改，获得编码相同抗体的基因。本领域技术人员可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。
本发明还提供了含有上述基因的表达载体。
本发明提供了含有上述表达载体的宿主菌、宿主细胞或表达盒。
本发明提供了制备上述抗体的方法，包括利用噬菌体展示抗体库技术筛选抗EGFR特异性单链抗体，获得抗体轻链、重链可变区基因，并将其克隆入全抗体表达载体，通过哺乳动物表达系统或其他表达系统对其进行全抗体表达，获得其全抗体蛋白。
提供了上述抗体在制备以EGFR为靶标的疾病治疗药物中的应用。
所述的药物为抗肿瘤药、抗炎药物或治疗自身免疫性疾病的药物。
含有上述抗体的药物或检测试剂也属于本发明的保护范围。
本发明还提供一种免疫毒素，包含以各种形式连接于细胞毒性剂的上述人源抗人EGFR抗体。
所述的各种连接形式为抗体被标记、体外交联或分子偶联。
所述的细胞毒性剂包括化学分子、放射性同位素、多肽、毒素及其他对细胞具有杀伤或诱导细胞死亡特性的物质。
本发明提供的抗体为全抗体或各种其他形式的基因工程抗体。如，抗EGFR抗体可以是全抗体或抗体片段。抗体分子本身可用于治疗和诊断。抗体可以被标记、交联或偶联及与其他蛋白或多肽分子融合表达形成复合物（如细胞毒性物质、放射性毒素和\或化学分子等）用于诊断和治疗。
本发明更进一步提供：编码抗体的独立基因，表达载体，载体转染宿主细胞相关控制技术及宿主细胞，抗体表达流程及在细胞培养上清中回收抗体。本发明同样提供含有抗体的组分和药理学上可接受的递送分子或溶液。本治疗用组分为无菌，可低温冻干。
本发明提供一种抗EGFR的抗体，该抗体可以抑制EGFR所诱导的一种或多种生物学活性。本抗体通过阻碍EGFR与其配体结合发挥作用，也可以通过杀伤EGFR高表达的细胞发挥作用，或者通过与EGFR结合后复合物被内化从而消耗细胞表面的EGFR而发挥作用。EGFR拮抗剂所具有的所有干扰功能均应平等地视为本发明的目的。
此处所公开和要求保护的SEQ ID NO.1～8所示序列包括“保守序列修饰”，即不明显影响和改变所述抗体或含有所述氨基酸序列抗体的结合特征的核苷酸和氨基酸序列修饰。所述保守序列修饰包括核苷酸或氨基酸替换、添加或缺失。可以通过本领域的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变等将修饰导入SEQ ID NO.1～8中，如本发明实施例中通过对抗体CDR区进行丙氨酸扫描和对部分位点进行氨基酸突变，即为保守序列修饰的实例。保守氨基酸替换包括氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基或其他氨基酸残基代替。本领域中，已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸（如赖氨酸、精氨酸、组氨酸），具有酸性侧链的氨基酸（如天冬氨酸、谷氨酸），具有不带电的极性侧链的氨基酸（如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸），具有非极性侧链的氨基酸（如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸），具有β分支侧链的氨基酸（如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和具有芳香侧链的氨基酸（如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。因此，优选用来自于同一侧链家族的另一种氨基酸残基代替人抗EGFR抗体中的非必须氨基酸残基。
因此，此处公开的核苷酸序列编码的抗体或\和含有此处公开的氨基酸序列的抗体包括基本上由经保守序列修饰的相似序列编码的，或含有经保守序列修饰的相似序列的抗体，均应视为本发明的范畴。
本发明提供一种双特异性或多特异性分子，包含本发明提供的上述抗体或抗体的抗原结合部位的分子。
本发明提供一种抗体与其他蛋白或\和多肽的融合蛋白，包含本发明提供的上述抗体和具有某种功能的其他蛋白或多肽分子的复合物。
进一步地，所述的融合蛋白为将抗体基因与免疫毒素或细胞因子基因连接构建重组表达载体，通过哺乳动物细胞或其他表达系统获得重组融合蛋白分子。
本发明描述的抗体Ame55具有良好的治疗应用前景，主要表现为与重组人EGFR具有特异性结合活性，且与A431细胞表面的天然EGFR特异性结合。该抗体经ELISA和免疫组化实验证实特异性良好；Western Blot结果证实，其仅特异性结合非还原态EGFR，与还原态EGFR不结合。
采用Biacore系统对该抗体与不同形式的EGFR结合能力进行检测，结果表明，该抗体与重组的EGFR胞外区‑Fc融合蛋白的亲和力KD为0.23nM（Biacore3000）。流式细胞分析该抗体与A431细胞表面的EGFR结合的相对亲和力高于上市抗体泰欣生，与上市抗体爱必妥相当。本发明实施例显示本发明的EGFR抗体与人EGFR结合的亲和力不小于1nM，其突变体亲和力不小于10nM。
该抗体在体外能够抑制爱必妥与EGFR的结合，反之，爱必妥也可以抑制该抗体与EGFR的结合。提示该抗体可能与爱必妥表位在空间结构上有重叠。该抗体能够竞争抑制EGF与EGFR的结合。
该抗体可以明显抑制A431细胞的迁移活性。细胞划痕愈合实验结果提示，抗体在5‑50μg/ml浓度下能够显著抑制A431细胞的划痕愈合。同时该抗体对A431细胞生长具有明显的抑制作用。
该抗体对A431移植瘤肿瘤生长具有明显的抑制作用，当给予每只小鼠1mg/3d的剂量时，肿瘤的抑制率可以达到90%以上，给予每只0.2mg/3d剂量时，抑瘤率达60%以上。
对该抗体进行定向定点突变，获得了亲和力提高5倍以上的多株突变体抗体，突变体抗体的体内抑瘤活性进一步改善，部分抗体如AmeA2、AmeA2C3、AmeA2C3‑HI2、AmeA2C1、AmeA1C1在0.2mg/3d剂量时，抑瘤活性大于80%。
本发明通过大容量全合成抗体库技术筛选获得1株抗EGFR的全人源抗体和一系列亲和力保持不变或提高的突变体抗体，并证实所发明抗体均特异性与EGFR结合，并抑制其生物学功能。利用上述获得的全人源抗EGFR基因工程抗体可变区基因以及抗体基因特征下的全抗体基因，可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及任何重组系统中表达和生产此抗体，或以此为基础的改建后的含有此抗体基因的任何其它基因，获得具有抑制EGFR生物学活性的抗体产物，或利用体外标记或交联的方法获得的复合物，制成临床上用于治疗过度表达或突变表达EGFR的恶性肿瘤和\或自身免疫性疾病的特异性抗体药物。
附图说明
图1为Ame55噬菌体抗体特异性分析。
图2为Ame55经Protein A柱一步纯化后SDS‑PAGE电泳图，其中1:PrMarker；2:Erbitux（爱比妥）；3:Ame55；4:Nimotuzumab（泰欣生）。
图3为Western Blot鉴定Ame55与EGFR结合，1：非变性EGFR‑爱必妥；2：变性EGFR‑爱必妥；3：非变性EGFR‑Ame55；4：变性EGFR‑Ame55；5：非变性EGFR‑泰欣生；6：变性EGFR‑泰欣生。
图4为Ame55与A431细胞结合间接免疫荧光检测图，A:阿伐斯汀‑A431；B:Ame55‑A431；C:爱必妥‑A431；D:泰欣生‑A431。
图5为流式细胞分析Ame55与A431细胞表面EGFR结合情况图，图5A:抗体浓度：3μg/ml；图5B:抗体浓度：0.3μg/ml；图5C:抗体浓度：0.03μg/ml，1为抗体泰欣生;2为抗体Ame55，3为抗体爱必妥。
图6为Biacore测定Ame55与EGFR‑Fc亲和力结果图。
图7为:Ame55与Erbitux的相互竞争抑制作用，其中图7A:1：EGFR‑Fc结合；2：PBST洗涤；3：Ame55‑结合；4：PBST洗涤；图7B:1：EGFR‑Fc结合；2：PBST洗涤；3：爱必妥‑结合；4：PBST洗涤；图7C:1：EGFR‑Fc结合；2：PBST洗涤；3：爱必妥‑结合；4：PBST洗涤；图7D:1：EGFR‑Fc结合；2：PBST洗涤；3：Ame55‑结合；4：PBST洗涤；图7A和图7B固定相为Ame55，图7C和图7D固定相为爱必妥。
图8为Ame55对EGF与EGFR结合的竞争抑制作用图。1：空白对照；2：Ame55与EGFR摩尔比3:1；3：Ame55与EGFR摩尔比2:1；4：Ame55与EGFR摩尔比为1:1；5：Ame55；6：EGFR；7：爱必妥与EGFR摩尔比3:1；8：爱必妥与EGFR摩尔比为2:1；9：爱必妥与EGFR摩尔比为1:1；10：爱必妥；11：无关抗体对照与EGFR摩尔比为3:1；12：无关抗体与EGFR摩尔比为2:1；13：无关抗体与EGFR摩尔比为1:1；14：无关抗体对照。
图9为Ame55和爱必妥、泰欣生、阿达木单抗、空白对照对A431细胞迁移能力的抑制作用图。
图10为Ame55和爱必妥、泰欣生、PBS对照对A431细胞生长抑制作用图。
图11为Ame55对A431荷瘤小鼠肿瘤生长抑制作用图。
图12为Ame55对A431荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用图。
图13为Ame55对A431荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用图。
图14为Ame55及其突变体抗体何瘤小鼠肿瘤生长抑制活性比较图，A:瘤体积的动态观察；B：瘤重测量统计结果。1：Ame55；2：AmeA1C1；3：AmeA1C3；4：AmeA1C3‑HI2；5：AmeA2；6：AmeA2C1；7：AmeA2C3；8：AmeA2C3‑HI2；9：爱必妥；10：IgG对照。
图15为Ame55轻链与另一无关重链组合突变体Ame‑9B的亲和力测定图。其中1：Ame55；2：Ame‑9B。
图16为真核瞬时表达质粒pABL和pABG1的载体示意图。
具体实施方式
以下实施实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1大容量噬菌体抗体库的特异性抗体筛选
一、材料与方法：
1.材料：大容量全合成噬菌体单链抗体库由中国人民解放军军事医学科学院构建（ZL200910091261.8），库容量1.35×1010。筛选抗体库的抗原为构建的哺乳动物细胞表达纯化的EGFR‑Fc融合蛋白（浓度为1mg/ml），菌株为XL1‑Blue（美国Stratagene）；所用噬菌体为M13KO7（美国Invitrogene公司）。真核表达载体pABG1和pABL为本室保存，载体结构信息见见图16，哺乳动物细胞HEK293T细胞购自invitrogene公司。
2.方法
2.1EGFR‑Fc融合蛋白表达与纯化：
选取EGFR【购自北京义翘神州生物公司(NCBI序列:NM 005228.3)】胞外区全长为对象，设计上、下游引物EGFRF和EGFRR如SEQ ID NO 11和SEQ ID NO 12所示，PCR扩增获得胞外区全长基因，通过限制性内切酶位点EcoR Ⅰ和Nhe I克隆入pABG1真核表达载体中，构建的重组质粒经测序鉴定正确后提取质粒，转染HEK293T细胞进行瞬时表达，经ProteinA亲和层析柱对表达上清进行纯化，并对纯化产物通过Bradford法进行蛋白定量。
2.2EGFR‑his表达与纯化
在方法2.1的基础上完成。设计引物EGFRR1(SEQ ID NO 13)，利用引物EGFRF和EGFRR1扩增EGFR胞外区全长基因，通过限制性内切酶位点EcoR Ⅰ和BamH I克隆入pABG1真核表达载体中,构建的重组质粒经测序鉴定正确后提取质粒，转染HEK293T细胞进行瞬时表达，经Ni+亲和层析柱对表达上清进行纯化，并对纯化产物通过Bradford法进行蛋白定量。2.3噬菌体抗体库的呈现，参照Pharmacia公司的重组噬菌体筛选用户手册（Cat.NO.XY‑040‑00‑05）进行，但稍作修改，具体如下：
取冻存的抗体库，在200ml 2×YTCG（葡萄糖浓度为0.5%）培养基中37℃培养至OD600=0.5，按MOI=20∶1的比例加入辅助噬菌体M13KO7，室温静置20min。37℃，150rpm缓慢摇床培养1h，加入卡那霉素至终浓度为50μg/ml，并加IPTG至终浓度为0.1mmol/L，于30℃，220rpm摇床培养10~12h。次日，离心收取培养上清加入1/5体积的PEG8000buffer（20%PEG+2.5mol/L NaCl），混匀后于冰上放置45min，沉淀噬菌体。4℃，10000g离心20min，弃上清，沉淀重悬于5ml含2%BSA和15%甘油的PBS缓冲液中，‑70℃冻存备用。
2.4噬菌体滴度的测定
挑取宿主菌（XL1‑Blue）单克隆接种于LB培养基，37℃，摇床培养至对数生长期（OD600=0.5）。取50μl制备好的噬菌体悬液，用LB培养基进行系列10倍梯度稀释。向稀释到一定倍数的悬液中加入对数生长期的宿主菌，37℃，150~180rpm摇床培养1h。取培养后的菌液100或200μl涂布在LB平板上，37℃培养过夜，次日，计数菌落数，并计算滴度。2.3抗EGFR特异性抗体的淘选，参照Pharmacia公司的重组噬菌体筛选用户手册（Cat.NO.XY‑040‑00‑05）稍作改动，具体如下：
将重组蛋白抗原EGFR‑Fc用包被液稀释为20μg/ml包被免疫管，1ml/管，4℃包被过夜。次日，免疫管用PBS洗涤2遍，2min/遍，然后用2%BSA37℃封闭2h。将制备好的噬菌体抗体库用封闭液（2%BSA，0.1%吐温20）37°C封闭30min。将预封闭后的噬菌体抗体库加入封闭后的免疫管中，4℃作用过夜。弃免疫管中溶液，进行洗涤。第一轮PBST洗10次，5min/次，PBS洗5次，5min/次；第二轮PBST洗15次，5min/次，PBS洗10次，5min/次；第三轮PBST洗15次，5min/次，PBS+NaCl洗15次，5min/次。加入1ml 0.2mol/L的甘氨酸‑盐酸（pH2.2）洗脱，室温作用10min，立即用1mol/LTris中和至pH7.4。在第三轮筛选中，首先加入1ml 0.2mol/L的甘氨酸‑盐酸（pH4.5）洗脱，室温作用10min，弃去洗脱液，用PBS洗涤2次，3min/次。然后再按照常规洗脱。吸出中和后的洗脱液，向其中加入9ml对数生长期的大肠杆菌XL1‑Blue，37℃缓慢摇床培养1h；同时，将免疫管用PBS洗涤一次后，用1ml对数生长期的大肠杆菌XL1‑Blue直接感染，37℃，150rpm摇床培养1h，然后将从洗脱后的感染菌液和直接感染的菌液中各取1%涂2×YTCTG平板上，37℃培养至形成清晰的菌落，对克隆数进行统计，并计算投入产出比。同时将剩余菌液涂2×YTCTG平板，37℃培养过夜。用液体2×YTCTG培养基将菌落刮取下来，取适量菌液投入100ml2×YTCTG液体培养基中，37℃摇床培养至OD600=0.5时，按MOI=20∶1加入辅助噬菌体M13KO7，室温静置20min，30℃，150rpm摇床培养1h，加入等体积的2×YTCT培养基，并加入卡那霉素至终浓度为50μg/ml，IPTG至终浓度0.15mM，继续在30℃、200rpm摇床培养10h，离心收取培养上清加入1/5体积的PEG8000缓冲液（20%PEG+2.5mol/L NaCl），混匀后于冰上放置45min，沉淀噬菌体。4℃，10000g离心20min，弃上清，沉淀重悬于5ml含2%BSA的PBS缓冲液中，‑70℃冻存备用。将三份噬菌体测定滴度，按比例合并，投入下一轮筛选。
2.5噬菌体ELISA鉴定阳性克隆
挑取经筛选后的克隆于96孔深孔板中，每孔250μl 2×YTCTG培养基，37℃摇床培养至OD600=0.5，加入1×108cfu的辅助噬菌体，室温静置15min，37℃，150rpm摇床培养1h，加入等体积2×YTCTKI（卡那霉素50μg/ml，IPTG 0.2mmol/L），30℃摇床培养过夜。次日，离心收取上清，加入BSA至终浓度2%，加入吐温‑20至终浓度0.1%，37℃静置15min，备用。抗原（EGFR）用包被液稀释至1μg/ml，加入96孔酶联板，50μl/孔，4℃包被过夜。次日，弃包被液，酶联板用PBST洗2次，PBS洗一次，每次3min，用2%BSA+0.1%吐温‑20封闭，200μl/孔，37℃，2h。弃去封闭液，加入经封闭后的单克隆噬菌体抗体，50μl/孔，37℃，静置1h。弃去液体，用PBST洗2次，PBS洗一次，200μl/孔，每次5min。将HRP标记的鼠抗M13抗体用PBST稀释，稀释比例为1∶5000，同时加入终浓度2%的BSA，37℃预封闭15min。将预封闭后的鼠抗M13抗体加入酶联板，50μl/孔，37℃静置30min。弃去液体，酶联板用PBST洗2次，PBS洗一次，200μl/孔，每次5min。弃去洗涤液，加入OPD底物显色液，50μl/孔，室温静置显色。用2N H2SO4终止显色。酶标仪测定光吸收值。
包被缓冲液(pH 9.6)：Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，双蒸水加至1L；
封闭液：1×PBS＋2%BSA＋0.1%吐温20；洗涤液：1×PBS＋0.1%吐温20；
OPD底物液稀释液：0.2M Na2HPO4(28.4g/L)25.7ml，0.1M柠檬酸(19.2g/L)24.3ml,蒸馏水，50ml。
2.6噬菌体单链抗体转换为全抗体：
载体pABG1和pABL分别用于克隆抗体重链（如SEQ ID NO 10）和轻链(如SEQ ID NO 9)可变区基因，分别采用引物H5F（SEQ ID NO 14）和HR(SEQ ID NO 15)扩增VH5可变区基因；L3F（SEQ ID NO 16）和LR(SEQ ID NO 17)扩增Vλ3可变区基因。Vλ3可变区基因利用酶切位点Bsr GI和HindIII克隆入载体PABL，VH5可变区基因利用酶切位点Afl II和NheI克隆入载体pABG1。重组质粒转化大肠杆菌DH5α，通过对重组质粒进行菌液PCR及测序鉴定，获得构建正确的全抗体轻、重链表达载体。大提质粒后将抗体轻重链以摩尔比1：1转染HEK293T细胞，进行全抗体的瞬时表达，经ProteinA亲和层析柱对表达上清进行纯化，并对纯化后的全抗体进行电泳分析、亲和力和特异性测定等。
二、结果
1.Ame55噬菌体抗体的筛选鉴定
对第三轮筛选获得的单克隆进行鉴定，获得特异性噬菌体抗体，Ame55单链抗体的核苷酸和氨基酸序列如SEQ ID NO 18和SEQ ID NO 19所示。Ame55单链抗体的轻链可变区、重链可变区核苷酸序列分别如SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10所示。Ame55单链抗体的轻链可变区、重链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO 20和SEQ ID NO 21所示。
在噬菌体水平上对Ame55的特异性进行分析，以EGFR‑Fc为阳性抗原，CD4‑D2、AHC、TNF、VEGF、TTC、PBS为对照抗原，4℃过夜包被酶联板，加入噬菌体上清，以HRP标记抗M13抗体为二抗进行ELISA检测Ame55噬菌体上清的特异结合活性。结果表明，Ame55仅特异性结合EGFR‑Fc。（图1）
2.全抗体的表达纯化
将噬菌体抗体Ame55的轻重链可变区基因分别克隆入全抗体瞬时表达载体pABL和pABG1中，构建其全抗体重组表达载体，并通过HEK293T细胞瞬时表达系统实现了哺乳动物细胞瞬时分泌表达。经Protein A柱纯化后获得全抗体蛋白样品，分子量约为150KD。（图2）。
实施例2Ame55结合活性的检测
一、材料与方法：
1.材料：人表皮鳞状癌细胞A431购自中国科学院上海细胞库，爱必妥（CT）为德国默克制药公司产品；泰欣生(Hr‑3)为北京百泰生物制药公司上市的抗EGFR人源化抗体；阿伐斯汀（Avastin,bevacizumab,rhuMAb‑VEGF）购自德国罗氏公司；CM5芯片为GE公司产品，抗人免疫球蛋白Fc捕获传感器和链亲和素传感器均购自艾瑞生物技术（上海）有限公司。重组人表皮生长因子(EGF)购自上海欣百诺生物公司。FreeStyleTM293‑F细胞株、表达培养基及转染试剂均购自invitrogen公司。
2.方法
2.1抗体与A431细胞表面EGFR结合活性的免疫荧光检测
(1)A431细胞以每孔104种于96孔板。
(2)隔夜培养后，弃去培养基，PBS洗2遍。
(3)5%脱脂奶粉（PBS配置）37℃封闭1h后转入4°C放置。
(4)将待测一抗用5%脱脂奶粉（PBST配置）稀释至1μg/ml，37℃预封闭30min后转入4°C放置。以上市药物艾比妥（Ct）和泰欣生（Hr‑3）为阳性抗体对照，以阿伐斯汀(Avs)为阴性抗体对照。
(5)倒掉封闭液，加入封闭好的抗体4℃孵育1h。
(6)PBST洗3遍，240rpm，3min/次。
(7)弃上清，加入5%脱脂奶粉预封闭的FITC标记的山羊抗人IgG二抗，4℃结合30min。
(8)PBST洗3遍，240rpm，3min/次。
(9)于荧光显微镜下观察
2.2Western Blotting
(1)将EGFR‑his抗原进行还原与非还原SDS‑PAGE凝胶电泳，分离胶浓度分别为10%；
(2)半干转移法将蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素膜。电泳结束后，将电泳胶用半干电转法，200mA，转印2h。转膜后，5%脱脂牛奶37℃封闭2h；
(3)封闭后将膜剪开分别加入10μg/ml的Ct、hR‑3、Ame55，4℃结合过夜；
(4)TBST洗涤4次，每次10min；
(5)加入1:5000稀释于5%脱脂奶粉的HRP标记的羊抗人IgG（预先在37℃预封闭30min），37℃孵育40min；
(6)二抗孵育后TBST洗涤3次，每次10min；
(7)显色：加入ECL发光液，送暗室进行显影曝光。
2.3Biacore 3000系统测定抗体亲和力
配置pH4.0、pH4.5、pH5.0、pH5.5的10mM NaAC，按适当倍数稀释待测抗体，在CM5芯片上作预浓缩，选择最适pH值的NaAC作为包被稀释液，同时分析最适合包被的抗体稀释浓度。
包被：用最适pH值的NaAC稀释待测抗体，选择最适稀释度并选择CM5芯片上的一个通道用于耦联，耦联抗体目标值为2000RU，并选择另外一个通道作为对照。试验条件为25℃，流速20μL/min，缓冲液为HBS‑EP（pH7.4，Bia‑Certified）。芯片偶联抗体达到目标值后封闭芯片表面。
再生条件分析：100nM的EGFR‑Fc流经芯片表面，使之和芯片表面的抗体结合，稳定后pH3.5、pH2.5、pH2.0、pH1.5的10mM甘氨酸‑盐酸和pH8.5的硼酸盐缓冲液依次流经过芯片表面，直到获得最佳的再生效果，以确定最佳的再生条件。
抗体与抗原结合的动力学分析：Broford法测定抗原EGFR‑Fc的浓度，进而用HBS‑EP缓冲液稀释抗原样品，取不同浓度（0~100nM中取5个不同浓度）EGFR‑Fc流过待测抗体通道和对照抗体通道，流速20μL/min，结合时间3min，稳定时间1min，解离时间15min，每一个循环再生条件为10mM甘氨酸‑盐酸pH1.5和pH8.5的硼酸盐缓冲液，流速20μL/min，每种溶液再生30s。
亲和常数计算：所得传感图用Bia‑evaluation分析软件4进行1：1Langmuir结合模式拟合，计算抗原抗体结合的动力学常数。
2.4流式细胞分析
1)含EDTA胰酶消化生长状态良好的A431细胞，将其重悬于预冷的PBS中，洗涤后计数，将其配制为浓度6×106个/ml。1.5ml离心管分装，100μL/管，放于冰上。
2)将待测抗体用预冷的PBS稀释至150ug/ml、15ug/ml、1.5ug/ml、0.15ug/ml，分别取100μL与预冷的细胞混合。冰上孵育40min；
3)预冷的4°C离心机中4000rpm×8min离心，轻轻吸去上清；加1ml预冷的PBS溶液，洗涤3次；
4)每管加入1:100稀释的预封闭的FITC‑兔抗人IgG二抗，冰上孵育30min；
5)重复3步骤洗涤3次；
6)每管细胞加入500μL预冷的PBS溶液，轻轻吹打混匀，样品置冰上，在流式细胞仪上进行荧光分析。以不加待测抗体的样品为对照。
二、结果
1.抗体Ame55特异性结合非变性EGFR
将EGFR‑his进行还原与非还原SDS‑PAGE凝胶电泳，分别以10μg/ml的Ame55、爱必妥和泰欣生为一抗，以HRP标记的羊抗人IgG为二抗，进行Western blot检测，结果如图3所示。Amet55仅与非还原的EGFR特异性结合。
2.Ame55特异性结合A431细胞表面的EGFR
以高表达EGFR的A431细胞为抗原，分别以Amet55、无关抗体阿伐斯汀、对照抗体爱必妥及泰欣生为一抗，以FITC标记的羊抗人IgG为二抗，进行细胞免疫荧光检测，结果见图4。结果表明，Ame55（图4的B图）以及阳性对照抗体爱必妥（图4的C图）和泰欣生（图4的D图）可特异性结合A431细胞表面的EGFR，而阴性对照抗体阿伐斯汀（图4的A图）与之无结合。进一步采用流式细胞分析其与A431细胞的结合，结果表明，该抗体在一定的浓度范围内与A431细胞呈剂量依赖的结合。在浓度小于1μg/ml的情况下，其荧光强度介于对照抗体爱必妥与泰欣生之间（图5A、图5B、图5C）。
3.Biacore 3000测定Ame55与EGFR‑Fc亲和力
将Ame55包被在CM5芯片表面，以不同浓度EGFR‑Fc为流动相，采用Biacore 3000系统测定该抗体与EGFR‑Fc的亲和力，结果如图6所示，拟合后其亲和力KD为0.231nM，其中Ka=4.21×105，Kd=9.73×10‑5。
实施例3Ame55体外活性及表位分析
一、方法
1.抗体竞争结合抑制实验
以Ame55为固定相包被于CM5芯片上，包被和再生条件见实施例2的方法，以50nM的EGFR‑Fc为第一流动相流经样品通道，时间3min，经PBS‑T洗涤3min后，以1000nM的爱必妥为第二流动相流经样品通道，时间为3min，之后经PBST洗涤3min。另外，同样以1000nM的Ame55为第二流动相进行上述实验，作为自身竞争抑制对照。同样，以爱必妥为固定相重复上述实验。2.EGF与EGFR结合竞争抑制实验
EGF以1μg/孔包被于96孔板，4℃包被过夜。将Ame55和阳性对照抗体爱必妥及无关对照抗体（本发明筛选的抗IL‑6R的抗体）分别以摩尔比3:1、2:1和1:1与2.5μg/孔的EGFR‑Fc混合，37℃预封闭30min后，加至封闭后的包被了EGF的ELISA板中，37℃结合1h，PBST洗涤3遍，PBS洗涤1遍，5min/次，以预封闭的HRP标记的山羊抗人IgG为二抗，37℃作用30min，PBST及PBS洗涤后，加入OPD底物显色液进行显色，2N H2SO4终止反应后，测定OD450nm处的光吸收值。
3.A431细胞划痕愈合实验
将6孔板预先于底部划直线等分标记，每孔五等分。A431细胞种于标记好的6孔板，105/孔细胞。待细胞长至对数生长期时，使用200μL移液枪头垂直于直线标记，于细胞面上划线。划线后PBS冲洗两遍，每孔加入待测抗体Ame55、阳性对照抗体爱必妥、阴性对照抗体阿达木单抗（为美国Abbott公司产品）至终浓度25μg/ml，另设一空白孔为空白对照。分别取0h、12h、24h为观察时间点，以直线标记固定位置并动态过程拍照。
4.A431细胞生长抑制实验
1）接种细胞：胰酶消化A431细胞，充分吹散后计数；用含0.5%新生牛血清的1640培养基调至5000个/ml的细胞浓度，加入6块96孔板，每孔200μL（最终每孔800‑1000个细胞均匀分布），37℃5%CO2孵育24h至细胞完全伸展贴壁；
2）加入待测抗体后培养：96孔板弃上清，PBS洗一遍；配置爱必妥（CT）、泰欣生（hR3）、Ame55各200nM，PBS作为对照，以每孔200μl加入96孔板中，每种浓度3个复孔，5块96孔板平行加入，37℃5%CO2进行培养；分别在第3天和第5天分别换液。在第0、3、4、5、6、7天各随机取1块板进行染色。
3）结晶紫染色：除去96孔板中的培养基，PBS洗涤1次；每孔加入100μL的4%多聚甲醛，室温静置固定15min；弃去甲醛，加入PBS稀释的0.5%结晶紫溶液（用无水乙醇配置的5%结晶紫母液稀释10倍），100μL/孔，室温静置染色15min；弃去结晶紫溶液，用自来水浸没并冲洗数次；蒸馏水室温浸没，在560转/min的水平摇床洗涤15min；控干水分，空气中干燥过夜。
4）细胞密度检测：收集第0天至第7天的6块96孔板，同批次进行脱色和OD值检测；每孔加入200μL sorenson’s溶液，400转/min水平摇床30min脱色；每孔取100μL至新的96孔板，测定590nm的光吸收值，以630nm的光吸收值作为内参。绘制细胞生长曲线。
附sorenson’s溶液配置方法：A液：8.967克枸橼酸钠溶于305ml超纯水中；B液：195ml 0.1N HCl（1.6ml 38%HCl加入193.4ml超纯水中，“酸入水”）；C液：500ml 95%乙醇（475ml无水乙醇中加入25ml超纯水）；A+B+C混合至总体积1升。
二、结果
1.Ame55和爱必妥与EGFR结合的相互竞争抑制作用
以Ame55为固定相，以EGFR为第一流动相（1），经PBST洗涤一段时间（2），以Ame55(A)和爱必妥（B）为第二流动相（3），之后再用PBST洗涤（4）；反之，以爱必妥为固定相，以EGFR为第一流动相（1），经PBST洗涤一段时间（2），以Ame55(D)和爱必妥（C）为第二流动相（3），之后再用PBST洗涤（4），对两抗体的表位进行初步分析，结果表明（见图7A、图7B、图7C和图7D），与Ame55结合的EGFR不能进一步结合爱必妥（图7B，图7A为Ame55自身抑制对照），即Ame55可以抑制EGFR与爱必妥的结合，反之，EGFR与爱必妥结合后，也无法再与Ame55结合（图7D，图7C为爱必妥自身抑制对照），即爱必妥也可以抑制EGFR与Ame55的结合。该结果提示两抗体间可能存在抗原表位的相互竞争抑制作用，很可能两者抗原表位结构上极为接近或相同。
2.Ame55对EGF与EGFR结合的竞争抑制作用
采用竞争ELISA方法分析Ame55对EGF与EGFR结合的竞争抑制作用。结果表明，在EGFR与抗体的摩尔比为1:1、1:2和1:3的条件下Ame55明显抑制EGFR与EGF的结合，而阴性对照抗体没有抑制作用。Ame55抑制活性低于同浓度对照抗体爱必妥。（见图8）
3.Ame55对A431细胞迁移的抑制作用
按本实施例方法3所述，对25ug/ML实验抗体组的细胞划痕愈合情况进行24h固定位点的动态观察（图9），在抑制A431细胞迁移活性方面，Ame55表现出了与爱必妥同样的抑制活性。而另一阴性对照抗体阿达木单抗则对其迁移无抑制活性，阿达木单抗为上市的针对TNFα的抗体药物。该结果提示，Ame55的确具有抑制EGFR生物学活性的功能，提示其在临床转移瘤的治疗应用中可能具有较好的作用。
4.Ame55对A431细胞生长的抑制作用
A431等高表达EGFR的细胞通过自分泌的EGF作用于其EGFR受体，进而激活下游通路，导致去受体磷酸化，促进其细胞生长和迁移等。因此，进一步采用A431细胞增殖实验评价了Ame55对高表达EGFR的细胞生长的影响，连续观察细胞的生长趋势。按本实施例方法4所述进行实验，结果表明（图10），Ame55具有抑制A431细胞生长的作用，但抑制强度弱于对照抗体爱必妥，与另一株对照抗体泰欣生(Nimotuzumab)相当。
实施例4Ame55体内抑瘤活性测定
雌性裸鼠，20g左右，47只，背部皮下接种100μL浓度为5×107的A431细胞。待肿瘤长至50~150mm3时，称小鼠体重并量瘤后进行分组。共包括4组，分别为生理盐水组、爱必妥组、阿达木单抗组和Ame55组。其中爱必妥为上市抗EGFR单克隆抗体，设为阳性对照组，阿达木单抗为上市的针对TNFα的抗体药物，设为阴性对照，生理盐水设为荷瘤对照，抗体给药均为1mg/只，3天给药一次，每次给药前称量体重与测量肿瘤大小。肿瘤计算方法为：π/6*长径*短径2。36天后杀鼠取瘤，称量瘤重，并进行统计学分析。
以A431细胞移植瘤为研究对象，评价Ame55对何瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用。实验结果表明：Ame55在1mg/只的剂量下对A431移植瘤的生长具有明显的抑制作用（图11），连续给药6次，停药观察4周后的瘤重结果表明，对照组平均瘤重3.65g，Ame55组平均瘤重0.32g，其抑瘤率在90%以上（图12、13）。
实施例5Ame55轻重链可变区突变体评价方法
1.丙氨酸扫描
分别设计定点突变引物对CDRL1、CDRL3、CDRH2和CDRH3进行丙氨酸扫描，如果其在该位置是丙氨酸，则将其分别突变为Gly和Ser。方法采用质粒定点突变的方法进行，参照文献[王荣浩，陈瑞川，刘润忠。快速点突变的优化方法。厦门大学学报（自然科学版），2008,Vol 47，sup 2,282‑285]。
2.ForteBio QKe测定抗体亲和力
将EGFR‑Fc融合蛋白利用生物素试剂盒进行生物素化，将生物素化的EGFR‑Fc以PBS稀释至100nM的浓度，包被于链亲和素传感器表面，时间为20min，使用HEPES EP对传感器清洗5min，将待测突变体抗体和亲本抗体Ame55均以20nM的浓度放于检测孔中，并使其与清洗后的链亲和素传感器表面的EGFR‑Fc结合，结合时间为10min，待结合达到平衡态后将复合物在HEPES EP中进行解离，解离时间为20min。采用ForteBio软件包进行亲和力分析。
3.突变体与亲本抗体抑瘤活性比较
实验方法同实施例4，组别和剂量设置为：生理盐水对照、爱必妥对照、Ame55亲本抗体对照及Ame55的各突变体抗体（Ametumumabs）AmeA1C1、AmeA1C3、AmeA1C3‑HI2、AmeA2、AmeA2C1、AmeA2C3、AmeA2C3‑HI2，共10组，每组8只，给药剂量为0.2mg/只，3d/次，共给药6次，停药6天后杀瘤称重。
二、结果
1.突变体亲和力分析
在Ame55氨基酸序列基础上进行轻、重链可变区及框架区部分氨基酸的突变。采用丙氨酸扫描和定向突变的方法进行突变体设计。使用ForteBio QKe蛋白分子相互作用系统对突变体进行亲和力的进一步筛选评价。结果表明（表1），与亲本抗体Ame55相比，轻链CDR1、CDR3、重链CDR2和CDR3区多个氨基酸位点均对抗体维持与EGFR结合能力至关重要，其原因可能是该位点的氨基酸直接参与相互作用，也可能是该位点的氨基酸对于维持抗体的正确的整体空间结构至关重要。在这些氨基酸改造的位点中，最值得注意的是轻链第26位和89位氨基酸，重链第54位和107位氨基酸。在首先通过单点氨基酸的替换后，本发明发现将轻链的89位氨基酸由Val改造为Ala或Ser后，亲和力提高4倍以上，将其进一步组合轻链第26位的Gly或Lys后，亲和力进一步提高，较亲本抗体亲和力提高5倍以上；或者将重链的54位，107位氨基酸分别替换为Ser后，与轻链89A/S组合表达后，抗体的亲和力在89A/S的基础上均得到了不同程度的提高。为进一步证实亲和力的提高对抗体生物学活性的影响，进一步对其中的7株突变体抗体AmeA1C1（突变轻链第26位为Gly和第89位为Ser）、AmeA1C3（突变轻链第26位为Lys和第89位为Ser）、AmeA1C3‑HI2（突变轻链第26位为Lys和89位为Ser，同时突变重链第107位为Ser）、AmeA2（突变轻链第89位为Ala）、AmeA2C1（突变轻链第26位为Gly和第89位为Ala）、AmeA2C3（突变轻链第26位为Lys和第89位为Ala）、AmeA2C3‑HI2（突变轻链第26位为Lys和第89位为Ala，同时突变重链第107位为Ser）进行了进一步的体内活性评价。
2.突变体与Ame55抑瘤活性比较
为进一步评价突变体与亲本抗体活性的差别，将给药剂量降至0.2μg/只的较低剂量下，对几株亲和力不同程度提高的突变体与亲本抗体在移植瘤小鼠上进行抑瘤活性比较。结果表明：对照抗体组平均瘤重为1.854g，在0.2μg/只的给药剂量下，亲本抗体Ame55组（平均瘤重0.71g）的抑瘤活性降至约60%，而突变体抗体抑瘤活性明显好于亲本抗体，其抑瘤率达分别为67%~93%不等，部分抗体与商业化抗体爱必妥（抑瘤率91%）活性相当。该结果提示突变体亲和力的提高的确有益于其体内生物学活性的改善。不同组别肿瘤生长情况和瘤重统计分析见图14。
表1Ame55突变体亲和力变化情况统计表


注：突变体抗体与亲本抗体比较，亲本抗体亲和力为设为1，计算亲和力下降倍数。
实施例6Ame55轻链对EGFR的特异性结合能力检测
为验证单独Ame55轻链对EGFR是否具有特异性结合能力，本发明将Ame55单独的轻链（SEQ ID NO.20所述的氨基酸序列）与一条来自VH3胚系基因家族的抗体重链（序列如SEQ ID NO.22所示）进行组合，并在HEK293瞬时表达系统中进行了瞬时表达，通过Protein A柱纯化获得了另一株含有Ame55轻链的新抗体Ame‑9B。对Ame‑9B与EGFR的结合能力通过Fortebio蛋白相互作用系统进行检测，具体方法参照实施例5。，结果表明，尽管亲和力有所下降（约降低了6倍），Ame‑9B仍然保持了与EGFR的结合能力，见图15。