快速无损伤性检测肝肿瘤标志物的方法以及采用的试纸条.pdf

本发明提供了一种快速无损伤性检测肝肿瘤标志物的方法以及采用的试纸条。采用的试纸条的金标垫是吸附有胶体金标记的单克隆抗体GP73-1的玻璃纤维；硝酸纤维素膜上依次标识有检测带T1和质控线C；其中，所述检测带T1固化有单克隆抗体GP73-2，质控线C固化有兔抗鼠多克隆抗体Ig。检测方法为：取唾液样本，将该免疫层析试纸条的样品垫一端插入唾液样本中，10~15分钟后唾液样本出现在NC膜上；将试纸条取出，观察检测带以及质控线显色状态，即得到检测结果。本发明通过取唾液样本作为检测对象，较之于血清样本以及其他可能的体液样本，本发明更易于采集样本，无创，检测准确、安全简便、成本低且易于保存。

权利要求书针对唾液样本检测肝肿瘤标志物的免疫层析试纸条，包括沿层析方向依次设置的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、以及用于吸收检测样品中多余液体的吸水垫，样品垫上粘附标有指示线的胶带；其特征在于：
所述金标垫是吸附有胶体金标记的单克隆抗体GP73‑1的玻璃纤维；硝酸纤维素膜上依次标识有检测带T1和质控线C；其中，所述检测带T1固化有单克隆抗体GP73‑2，质控线C固化有兔抗鼠多克隆抗体Ig。
根据权利要求1所述的免疫层析试纸条，其特征在于：作为金标垫的玻璃纤维，还吸附有胶体金标记的CEA‑1；在检测带T1与质控线C之间还标识有检测带T2，检测带T2固化有单克隆抗体CEA‑2。
根据权利要求2所述的免疫层析试纸条，其特征在于：检测带T1、检测带T2、质控线C依次相隔2毫米、4毫米。
根据权利要求3所述的免疫层析试纸条，其特征在于：以质量计，胶体金标记的单克隆抗体CEA‑1在金标垫上的含量与胶体金标记的单克隆抗体GP73‑1的含量相同，固化于检测带T1上的单克隆抗体GP73‑2与固化于检测带T2上的单克隆抗体CEA‑2的含量相同。
根据权利要求1或2所述的免疫层析试纸条，其特征在于：
胶体金标记的单克隆抗体在金标垫上的含量按照以下方式限定：所述金标垫是将玻璃纤维充分浸泡于浓度为4～10倍浓缩度的胶体金标记单克隆抗体溶液所得；
所述浓缩度的倍数按照以下方式确定：120μg的单克隆抗体与胶体金溶液反应，最终得到的胶体金标记的单克隆抗体溶于1mL的PBS溶液中，设其为10倍浓缩度的胶体金标记单克隆抗体溶液，较低浓缩度的胶体金标记单克隆抗体溶液是采用相同的PBS按照体积比对其稀释得到；
固化于检测带上的单克隆抗体含量按照以下方式限定：单克隆抗体用0.01mol/L pH7.2的PBS稀释至浓度为1～4mg/mL，在硝酸纤维素膜上划线形成检测带。
根据权利要求5所述的免疫层析试纸条，其特征在于：所述金标垫是将玻璃纤维充分浸泡于浓度为5倍浓缩度的胶体金标记单克隆抗体溶液所得；单克隆抗体用0.01mol/L pH7.2的PBS稀释至浓度为2mg/mL，在硝酸纤维素膜上划线形成检测带。
制备如权利要求6所述免疫层析试纸条的方法，包括以下环节：
（1）胶体金制备
采用氯金酸溶液制备得到胶体金溶液；
（2）胶体金标记
将胶体金溶液的pH值调节至8.0，加入单克隆抗体GP73‑1和CEA‑1各60μg混匀，两种单克隆抗体的总浓度为12μg/mL；反应后，2000rpm离心，去沉淀，对上清液12000rpm离心，然后弃上清，沉淀溶于1mL的含0.2%BSA的0.01mol/L pH8.0的PBS溶液中，即为10倍浓缩度的胶体金标记单克隆抗体溶液，然后用PBS将其稀释为5倍浓缩度的胶体金标记单克隆抗体溶液，将玻璃纤维在此胶体金标记单克隆抗体溶液中充分浸泡后取出，冷冻干燥，得到备用的金标垫；
（3）抗体包被
单克隆抗体GP73‑2和CEA‑2分别用0.01mol/L pH7.2的PBS稀释至浓度为2mg/mL各5mL；分别依次在NC膜上划线，使单克隆抗体固化在硝酸纤维素膜上；膜干燥后完全浸泡于含1%BSA的0.01mol/L pH7.2的PBS中；然后取出硝酸纤维素膜用PBS清洗，干燥后得到备用的硝酸纤维素膜；
（4）试纸条的组装
样品垫采用吸水玻璃纤维，吸水垫采用吸水滤纸；将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫组装构成试纸条，并将整个试纸条贴附于PVC板中央，裁切为适用宽度；然后密封干燥保存备用。
快速无损伤性检测肝肿瘤标志物的方法，是取唾液样本，将权利要求1所述的免疫层析试纸条的样品垫一端插入唾液样本中，10~15分钟后唾液样本出现在NC膜上；将试纸条取出，观察检测带以及质控线显色状态，得到以下三种检测结果之一：
（1）检测带T1以及质控线C均显现，呈紫红色；则表明唾液样本中含有高尔基体蛋白73；
（2）仅质控线C显现，呈紫红色；则表明唾液样本中不含高尔基体蛋白73；
（3）无紫红色条带显现；则表明试纸条失效，该检测过程无效。
快速无损伤性检测肝肿瘤标志物的方法，是取唾液样本，将权利要求2所述的免疫层析试纸条的样品垫一端插入唾液样本中，10~15分钟后唾液样本出现在NC膜上；将试纸条取出，观察检测带以及质控线显色状态，得到以下四种检测结果之一：
（1）检测带T1和检测带T2以及质控线C均显现，呈紫红色；则表明唾液样本中含有高尔基体蛋白73和癌胚抗原相关细胞粘附因子8；
（2）检测带T2以及质控线C均显现，呈紫红色；则表明唾液样本中含有癌胚抗原相关细胞粘附因子8；
（3）仅质控线C显现，呈紫红色；则表明唾液样本中不含高尔基体蛋白73和癌胚抗原相关细胞粘附因子8；
（4）无紫红色条带显现或者检测带T1显现而检测带T2不显现；则该次检测无效。

说明书快速无损伤性检测肝肿瘤标志物的方法以及采用的试纸条
技术领域
本发明涉及一种检测肝肿瘤标志物的方法及其采用的检测工具。
背景技术
原发性肝癌，尤其是肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）长时间居于世界最重要的癌症之一。其患病率在我国呈逐年上升趋势，该病手术切除率低，5年生存率不到5%，现居我国癌症死因的第2位。肝癌通常进展缓慢，在早期阶段无症状。目前，结合血清甲胎蛋白（AFP）检测和肝脏的超声检查是监测和筛查肝癌的标准方法。然而，这些方法的敏感性和特异性有限。许多研究表明，AFP检测的敏感性较低（仅50~60%）且其诊断准确性不能令人满意。而肝脏的超声检测则对操作者依赖较高且当肿瘤直径小于2cm时假阴性率较高。
蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰，在许多细胞过程如蛋白构象、折叠、转运与稳定中都起着重要作用。与此同时，细胞生长、分化，细胞‑细胞间信号传递、免疫应答，病原微生物的发病机制及许多其他生物学过程也受糖基化的影响。更重要的是，现有研究已确定，在多种疾病中糖蛋白的糖基化发生了异常改变，可作为疾病诊断及预后的生物标志物。
高尔基体蛋白73（Golgi Protein73，GP73）是存在于高尔基体主要在上皮细胞表达的一种跨膜蛋白。在正常肝脏中，GP73主要由胆管上皮细胞表达，在肝细胞中很少表达或几乎不表达。但是，在病毒性和非病毒性肝病中，GP73的表达剧烈上调。一项近期的研究在人类血清中检测到了GP73，并且在肝癌土拨鼠模型中发现GP73表达量在肝癌土拨鼠模型的血清和组织中均上调。Marreo等的研究表明GP73可用于肝癌早期诊断的参考，且其诊断敏感性高于AFP，此研究包括352个样本：与肝硬化患者相比，肝癌患者的血清GP73水平显著上升，若以10个相对单位为临界值，则GP73在肝癌诊断中的特异性为75%，敏感性为69%。此外，作为早期肝癌的诊断参考，GP73的效果优于AFP。因此，GP73是对肝癌诊断非常有价值的生物标志物，GP73联合AFP检测可提高肝癌的早期诊断率。
癌胚抗原相关细胞粘附因8(Carcinoembryonic antigen‑related cell adhesion molecule8,CEA)是一种具有人类胚胎抗原特异性决定簇的富含多糖的酸性糖蛋白,1965年首次在正常胎儿消化道及结肠癌组织中被发现，属于非器官特异性肿瘤相关抗原。现有研究显示，CEA是一种广泛的人类肿瘤相关抗原。在结肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、子宫癌等患者血清中，CEA浓度呈现不同程度的升高，这可能是因为分泌CEA的肿瘤多数位于空腔脏器（如胃肠道，呼吸道，泌尿道等）而正常情况下CEA直接经胃肠道得到代谢，只有在肿瘤状态时CEA通过血液和淋巴循环使得血清CEA浓度上升。CEA是目前最常用的肿瘤标志物之一，对于B超，CT等影像学方法难以诊断的恶性肿瘤，测定血清CEA浓度发挥了其潜在的优势。CEA的阈值因不同方法而略有不同，但其含量无明显性别差异，仅随年龄增大略有升高。据报道，联合使用AFP和CEA作为肿瘤标志物进行血清浓度检测有利于肝癌的早期诊断，也可用于原发性肝癌的鉴别。
然而，虽然血液中的一些因子能够随体液循环到达唾液腺，或随唾液分泌进入口腔或导致唾液中的基因转录谱发生改变，引起某些蛋白质的丰度或种类改变，从而反映出血液中部分蛋白质水平的变化。但目前研究发现，人唾液中有1939种蛋白质，人血浆中有3020种蛋白质，仅有27%的唾液蛋白质组与血浆蛋白质组重合。血浆蛋白质组学发现的177个与心血管疾病相关的潜在生物标志物的蛋白质中，也仅有40%的蛋白质出现在唾液蛋白质组中；在已列出的1058个潜在癌症相关生物标志物的蛋白质中，仅有34%的蛋白质出现在唾液蛋白质组中。
这表明许多血液循环中的生物标志物并非能够在唾液中得到鉴定。另外，即使是同一的蛋白，较之于血清，其在唾液中的含量通常明显较低。因此在实践中，两者没有必然的联系，往往需要研究人员经过大量的实验和分析，并做针对性的检测环节的调整改变，才能判断是否有蛋白质组重合的可能性。
综上所述，可以预期，若采用检测血清样本中生物标志物的方法，则取样不便、检测过程复杂、存在感染一些疾病的风险。
发明内容
本发明提供一种快速无损伤性检测肝肿瘤标志物的方法，并设计了针对唾液样本的免疫层析试纸条，从而真正实现无创，安全简便地检测肝肿瘤标志物。
本发明的试纸条的基本技术方案如下：
针对唾液样本检测肝肿瘤标志物的免疫层析试纸条，包括沿层析方向依次设置的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、以及用于吸收检测样品中多余液体的吸水垫，样品垫上粘附标有指示线的胶带；其特殊之处在于：
所述金标垫是吸附有胶体金标记的单克隆抗体GP73‑1的玻璃纤维；硝酸纤维素膜上依次标识有检测带T1和质控线C；其中，所述检测带T1固化有单克隆抗体GP73‑2，质控线C固化有兔抗鼠多克隆抗体Ig。
基于以上基本技术方案，还可以对该试纸条进行以下优化改进：
作为金标垫的玻璃纤维，还吸附有胶体金标记的CEA‑1；在检测带T1与质控线C之间还标识有检测带T2，检测带T2固化有单克隆抗体CEA‑2。
检测带T1、检测带T2、质控线C依次相隔2毫米、4毫米。
以质量计，胶体金标记的单克隆抗体CEA‑1在金标垫上的含量与胶体金标记的单克隆抗体GP73‑1的含量相同，固化于检测带T1上的单克隆抗体GP73‑2与固化于检测带T2上的单克隆抗体CEA‑2的含量相同。
对于上述基本形式和改进形式（检测区增加了检测带T2）的试纸条，胶体金标记的单克隆抗体在金标垫上的含量均可以按照以下方式优化限定：所述金标垫是将玻璃纤维充分浸泡于浓度为4～10倍浓缩度的胶体金标记单克隆抗体溶液所得；所述浓缩度的倍数按照以下方式确定：120μg的单克隆抗体与胶体金溶液反应（（对于GP73‑1和CEA‑1两种共同作用的情况，可以各取60μg与胶体金溶液反应）），最终得到的胶体金标记的单克隆抗体溶于1mL的PBS溶液（PBS溶液的较佳选择：0.01mol/L pH8.0，并含0.2%BSA）中，设其为10倍浓缩度的胶体金标记单克隆抗体溶液，较低浓缩度的胶体金标记单克隆抗体溶液是采用相同的PBS按照体积比对其稀释得到；
固化于检测带上的单克隆抗体含量按照以下方式限定：单克隆抗体用0.01mol/L pH7.2的PBS稀释至浓度为1～4mg/mL，在硝酸纤维素膜上划线形成检测带。
上述金标垫最好是将玻璃纤维充分浸泡于浓度为5倍浓缩度的胶体金标记单克隆抗体溶液所得；单克隆抗体最好用0.01mol/L pH7.2的PBS稀释至浓度为2mg/mL，在硝酸纤维素膜上划线形成检测带。
以上关于对胶体金标记的单克隆抗体在金标垫上的含量和固化于检测带上的单克隆抗体含量的限定，本申请采用了本领域惯常的描述方式，较之于其他限定方式，这种限定对于本领域技术人员（包括试纸条的使用者）不仅是清楚的，而且在明确该试纸条的成分和效果方面更有意义。
制备上述一种免疫层析试纸条的方法，包括以下环节：
（1）胶体金制备
采用氯金酸溶液制备得到胶体金溶液；
（2）胶体金标记
将胶体金溶液的pH值调节至8.0，加入单克隆抗体GP73‑1和CEA‑1各60μg混匀，两种单克隆抗体的总浓度为12μg/mL；反应后，2000rpm离心，去沉淀，对上清液12000rpm离心，然后弃上清，沉淀溶于1mL的含0.2%BSA的0.01mol/L pH8.0的PBS溶液中，即为10倍浓缩度的胶体金标记单克隆抗体溶液，然后用PBS将其稀释为5倍浓缩度的胶体金标记单克隆抗体溶液，将玻璃纤维在此胶体金标记单克隆抗体溶液中充分浸泡后取出，冷冻干燥，得到备用的金标垫；
（3）抗体包被
单克隆抗体GP73‑2和CEA‑2分别用0.01mol/L pH7.2的PBS稀释至浓度为2mg/mL各5mL；分别依次在NC膜上划线，使单克隆抗体固化在硝酸纤维素膜上；膜干燥后完全浸泡于含1%BSA的0.01mol/L pH7.2的PBS中；然后取出硝酸纤维素膜用PBS清洗，干燥后得到备用的硝酸纤维素膜；
（4）试纸条的组装
样品垫采用吸水玻璃纤维，吸水垫采用吸水滤纸；将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫组装构成试纸条，并将整个试纸条贴附于PVC板中央，裁切为适用宽度；然后密封干燥保存备用。
采用上述基本形式的试纸条（检测区设置有检测带T1和质控线C）,实现快速无损伤性检测肝肿瘤标志物的方法，是取唾液样本，将该免疫层析试纸条的样品垫一端插入唾液样本中，10~15分钟后唾液样本出现在NC膜上；将试纸条取出，观察检测带以及质控线显色状态，得到以下三种检测结果之一：
（1）检测带T1以及质控线C均显现，呈紫红色；则表明唾液样本中含有高尔基体蛋白73；
（2）仅质控线C显现，呈紫红色；则表明唾液样本中不含高尔基体蛋白73；
（3）无紫红色条带显现；则表明试纸条失效，该检测过程无效。
采用上述改进形式的试纸条（检测区设置有检测带T1、检测带T2和质控线C）,实现快速无损伤性检测肝肿瘤标志物的方法，是取唾液样本，将该免疫层析试纸条的样品垫一端插入唾液样本中，10~15分钟后唾液样本出现在NC膜上；将试纸条取出，观察检测带以及质控线显色状态，得到以下四种检测结果之一：
（1）检测带T1和检测带T2以及质控线C均显现，呈紫红色；则表明唾液样本中含有高尔基体蛋白73和癌胚抗原相关细胞粘附因子8；
（2）检测带T2以及质控线C均显现，呈紫红色；则表明唾液样本中含有癌胚抗原相关细胞粘附因子8；
（3）仅质控线C显现，呈紫红色；则表明唾液样本中不含高尔基体蛋白73和癌胚抗原相关细胞粘附因子8；
（4）无紫红色条带显现或者检测带T1显现而检测带T2不显现；则该次检测无效。
本发明具有以下优点：
本发明通过取唾液样本作为检测对象，具有科学性和可行性，并具有非损伤性检测的优势。较之于血清样本以及其他可能的体液样本（如脑脊液、尿液等），本发明更易于采集样本，无创，检测准确（实际上更准确）、安全简便、成本低且易于保存。检测GP73得出的定性结论即可作为早期诊断的参考。
附图说明
图1为针对唾液样本检测肝肿瘤标志物的免疫层析试纸条的结构示意图。
具体实施方式
唾液检测的难度在于：首先唾液中98%以上的组分都是水，蛋白质和盐类及一些酶组分仅占非常小的比例。因此对于唾液中蛋白质组尤其是糖蛋白质组的鉴定存在较大困难。其次，可用于检测的生物标志物蛋白往往属于低丰度蛋白，即便在血浆中也存在一定鉴定难度。而利用唾液进行检测进一步增加了该鉴定的难度。往往需要研究人员经过大量的实验和分析，并做针对性的检测环节的调整改变才能得到有效的鉴定结果。
本发明通过进行以下检测肝肿瘤标志物的实验方法（其中的浓缩换液、酶解和除盐、富集唾液N‑糖肽的环节尤其进行了针对性的设计），也证实了相应的唾液样本中存在肝肿瘤标志物高尔基体蛋白73（GP73），另外，发现还存在癌胚抗原相关细胞粘附因子8(CEA)。
（1）处理唾液样本
将采集到的唾液样本在4℃条件下的离心12000rpm1h，收集上清并使用0.45μm针头式滤器进行过滤；向过滤后的唾液样本中加入蛋白酶抑制剂（每10mL加入1μL蛋白酶抑制剂），使用BCA试剂盒进行蛋白定量，计算唾液样本中的蛋白含量，并将唾液样本储存于‑80℃冰箱备用。
（2）唾液蛋白的浓缩换液
取包含0.5mg蛋白的唾液样本，通过Amicon Ultra‑10K离心超滤器进行浓缩，采用变性缓冲液稀释唾液样品至蛋白终浓度4g/L得到唾液蛋白溶液；所述变性缓冲液的pH=8.38，含有8M尿素或者0.4M NH4HCO3或者0.1%（体积分数）SDS。
（3）唾液蛋白的Trypsin酶解和除盐
取0.5mg唾液蛋白溶液，加入3.125μL_DTT溶液（200mM，用0.1M NH4HCO3溶液配制），于60℃孵育60min；然后加入12.5μL碘乙酰胺溶液（200mM，用0.1M NH4HCO3溶液配制），20℃孵育60min并避光；再次加入3.125μLDTT溶液（200mM，使用0.1M NH4HCO3溶液配制），60℃孵育60min，去除未反应的碘乙酰胺；采用0.1M NH4HCO3溶液稀释唾液蛋白溶液至尿素浓度小于2M，留存1μg的蛋白用于SDS‑PAGE的检测；以50mM盐酸溶液活化Trypsin，取10μg活化的Trypsin与蛋白样本进行反应，37℃轻摇过夜；最后12,000g离心10min除掉未被消化的物质；
用TFA调节酶解后多肽溶液pH至小于3；使用Sep‑Pak1cc C18柱对多肽混合物进行除盐。
DTT即二硫苏糖醇，该步骤中分步加入的二硫苏糖醇：碘乙酰胺：二硫苏糖醇=1:2:1（摩尔比）。
（4）富集唾液N‑糖肽
对经过酶解和除盐后的样品进行高碘酸氧化处理，再进行除盐处理，即：每个样品中加入22.5μL100mM高碘酸钠储液，在避光条件下于4℃反应60min；然后加入1.8ml0.1%TFA溶液稀释乙腈浓度并调节pH；使用Sep‑PakC18柱去除未反应的NaIO4，最终经0.2mL80%ACN/0.1%TFA洗脱两次，获得样品溶液；
采用以下两种方法之一进行富集唾液N‑糖肽：
（4.1）酰肼化学方法富集唾液N‑糖肽
每1mg样品溶液使用50μL50%的酰肼树脂悬液。首先将树脂于3000rpm离心30s除去溶液；然后用去离子水清洗树脂2~3次，每次1mL，完成树脂的预处理。接着将氧化后的多肽样品溶液与酰肼树脂混合，室温轻摇反应4h或过夜，使糖肽与树脂偶联得到富集。最后用50%ACN/0.1%TFA,1.5M NaCl,水和0.1M NH4HCO3溶液各清洗树脂3次，共清洗12次以去除非共价粘附于树脂的非糖肽，而糖肽在酰肼树脂表面得到特异性富集；
以50μL25mM NH4HCO3缓冲溶液重悬酰肼树脂，加入3μL500U/μL的PNGase F（每1毫克样品使用50μL50%的酰肼树脂悬液，6μLPNGase F），37℃轻摇过夜。3000rpm离心收集上清，然后用100μL超纯水清洗树脂两次，合并清洗液和上清，使用Speed Vac冻干，然后用20μL0.1%甲酸溶液重溶样品，‑20℃保存或直接进行LC‑MS/MS分析；
或者（4.2）亲水亲和方法富集唾液N‑糖肽
每1mg样品溶液使用150μL50%的凝胶粒子（Sepharose CL‑4B树脂）。首先将凝胶粒子8000rpm离心5min，去除溶液；然后分别用1mL的去离子水和平衡液（正丁醇：乙醇：水=5:1:1）各清洗树脂2遍，完成树脂预处理。将除盐后多肽冻干，以平衡液重新溶解多肽，将其与Sepharose CL‑4B粒子混合，室温下轻摇反应1.5h，使糖肽偶联于树脂上；使用平衡液清洗凝胶粒子3次，10min/次。最后用200μL洗脱液(乙醇：水=1：1)洗脱两次，每次30min。合并洗脱液，使用Speed Vac冻干，用PNGase F进行酶解，再次冻干；然后用20μL0.1%甲酸溶液重溶后，‑20℃保存或直接进行下一步的LC‑MS/MS分析。
（6）LC‑MS/MS鉴定
每次取8μl样品进行LC‑MS/MS分析。对于步骤（5）的两种富集唾液N‑糖肽的方式，也可以综合两种方式得到的样品进行LC‑MS/MS分析，从而更加准确。本实验中使用安捷伦Q‑TOF质谱仪(Agilent6530)进行LC‑MS/MS分析。
（7）数据库检索和糖基化位点分析
经LC‑MS/MS分析得到的LC‑MS/MS质谱数据通过Mascot V2.3.02软件在IPI_human_v3.74数据库中进行检索，从而检测出唾液样本中是否含有高尔基体蛋白73。多肽鉴定结果筛选标准：单个多肽得分高于25，P值小于0.01。将每个去糖基化样品的三次LC‑MS/MS结果合并为该次鉴定的总糖肽，三次重复糖肽富集试验中鉴定到2次以上的多肽可认为是该组样本(肝癌/正常)中鉴定到得多肽。为降低假阳性率，仅将鉴定到含有（N‑X‑S/T）保守序列且其天冬酰胺(N)转变为天冬氨酸(D)的多肽认定为N‑糖肽,脱氨基的天冬酰胺为N‑糖基化位点。
对于以上实验过程，我们按照对比实验的一般操作规程进行全唾液的采集：
样本选取：样本分为肝癌患者和健康志愿者两组。由于肝癌患者中老年人居多，故选取老年健康志愿者作为对照组。唾液样本共采自58名志愿者，经放射免疫分析法确诊的肝癌患者共27人，从西安市某医院肝癌患者中随机抽取；老年健康志愿者31人，从西安市某敬老院健康老人中随机抽取。
唾液采集：所有唾液均在非刺激状态下采集。志愿者在早饭至少2小时以后，首先用生理盐水漱口，然后以舌抵上腭，使唾液自然分泌并收集于灭菌后的离心管中。每位志愿者至少采集2mL唾液，采集后的唾液立即置于冰上保存，并将同组（肝癌或健康）样本的唾液进行等体积混合，以降低个体差异对实验的影响；并且在2小时内，将收集到的唾液进行步骤（1）的初步处理。
检测结果统计如下表1所示。
表1

在以上实验中,我们仅在肝癌组唾液中检测到GP73，而在正常对照组中没有检测到GP73，这说明健康志愿者唾液中无GP73或含量极低。该实验结果进说明GP73不仅在在肝癌患者血清、组织中表达上调，在肝癌患者唾液中表达也上调，从而证明了唾液样本用于肝癌诊断的可行性。
在以上实验中,我们仅在肝癌组唾液中鉴定到CEA，而在正常对照组中没有检测到CEA，这说明健康志愿者唾液中无CEA或其含量极低。此结果与CEA在肝癌患者血清中浓度升高的报道一致，进一步说明了唾液作为肝癌诊断的潜在应用价值。
CEA的多肽链由349个氨基酸组成，根据已有文献报道CEA在104、111、115、152、173、197、224、256、274、288、309这十一个位点存在潜在N‑糖基化，其中位于第288位的糖基化已通过实验验证。在我们的实验中，除验证了第288位的N‑糖基化外，还鉴定到了处于第104位的潜在N‑糖基化位点，为关于CEA的研究提供了新的数据支持。
结合理论分析，同时也经大量实验表明，可以仅以高尔基体蛋白73作为肝肿瘤标志物，再检测癌胚抗原相关细胞粘附因子8能够起到进一步的佐证。
基于以上分析以及实验结论，本发明设计了一种针对唾液样本的免疫层析试纸条，设计和制备过程如下：
该免疫层析试纸条用两株针对GP73分子上不同抗原决定簇的单克隆抗体（GP73‑1和GP73‑2）和两株针对CEA分子上不同抗原决定簇的单克隆抗体（CEA‑1和CEA‑2）分别标记胶体金颗粒和包被微孔硝酸纤维素膜（NC膜），利用层析原理，建立检测唾液GP73和CEA的双抗体夹心法胶体金免疫层析分析试纸条。
【GP73‑1（货号TA306987）和GP73‑2（货号TA504111）是Amsbio公司的两个不同的单克隆抗体。CEA‑1（货号LS‑C123092）和CEA‑2（货号LS‑C85029）是Lifespan Biosciences公司的两个不同的单克隆抗体】
1 胶体金制备：氯金酸(HAuCl4)配成%1的氯金酸溶液，取1mL%加入99mL去离子水,加热至沸腾立即加入2mL%1的枸掾酸钠溶液，迅速搅拌均匀，继续加热10分钟，冷却至室温，补充去离子水至100mL。
2 确定最佳标记pH值:用0.1%mol/L的碳酸钾溶液将胶体金溶液的pH值分别调节到6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0，各取1mL加入20μg单克隆抗体（GP73‑1的单克隆抗体和CEA‑1的单克隆抗体），混合均匀，室温反应10分钟，静置2小时，观察溶液颜色变化。然后，12000rpm离心10分钟,去掉上清,加入含1%BSA的PBS溶解沉淀,以沉淀完全溶解呈均匀的透明紫红色溶液管的pH值为最佳。结果显示胶体金标记的最佳pH都为8.0。
3 确定最佳标记单克隆抗体浓度：将胶体金溶液的pH调节到最佳值，在5支试管中各加入1mL胶体金溶液，分别加入2.5～40μg单克隆抗体（GP73‑1或CEA‑1），反应10分钟后，各管加入10%氯化钠溶液100μL，静置2小时，观察各管颜色变化。然后，12000rpm离心20分钟，去掉上清，加入含1%BSAdePBS溶解沉淀，以沉淀完全溶解呈均匀的紫红色溶液管的最低蛋白浓度加20%的误差为最佳蛋白浓度。结果显示，10μg/mL以后各管沉淀完全溶解，故最佳标记单克隆抗体浓度为12μg/mL。
4 胶体金标记：将10mL制备好的胶体金溶液的pH值调节到最佳值，加入单克隆抗体GP73‑1和CEA‑1各60μg混匀，室温反应10分钟，4℃2000rpm离心20分钟，去沉淀。上清液4℃12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀溶于1mL的含0.2%BSA的0.01mol/L pH8.0的PBS中，即为10倍浓缩度的胶体金标记单克隆抗体溶液，然后用PBS将其稀释为5或4倍浓缩度的胶体金标记单克隆抗体溶液，将玻璃纤维浸泡于10或5或4倍浓缩度的胶体金标记单克隆抗体溶液中（5倍浓缩度最佳），充分浸泡后取出，冷冻干燥6小时以上，作为金标垫。
5 抗体包被：单克隆抗体GP73‑2和CEA‑2分别用0.01mol/L的PBS(pH7.2)稀释至浓度为1～4mg/mL各5mL（以2mg/mL为最佳）。分别在NC膜上划线，使单克隆抗体固化在NC膜上。先用GP73‑2划线（作为检测线T1），在离GP73‑2划线2毫米处用CEA‑2另划一条线（作为检测线T2），在离CEA‑2划线4毫米处用4mg/mL的兔抗鼠多克隆抗体Ig再划一条线（作为质控线C）。膜干燥后完全浸泡于含1%BSA的pH7.2的PBS中，4℃1小时。然后取出NC膜用PBS洗涤3次，悬挂于室温中干燥3小时以上，再放于30℃通风干燥箱内通风干燥1小时。
6 试纸条的组装（如图1）。
试纸条由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和样品吸水垫组成。上段为手持部位（吸水垫：为吸水滤纸吸收检测样品中多余液体）；中段为检测区和质控区，是在硝酸纤维素膜（NC膜）上设置用以判读结果的检测带（即图中“测试线”）T1和T2以及质控线（即图中“控制线”）C；在中下段之间放置吸附有胶体金标记的单克隆抗体GP73‑1和CEA‑1的金标垫；下段为样品区（吸水玻璃纤维接触待检测样品），样品区粘附标有“Marker”指示线的胶带。整个试纸条贴附于PVC板中央。裁切成4mm宽的条形带。密封干燥保存备用。
7 试纸条的使用方法：将含有吸水玻璃纤维（标有“Marker”指示线）端插入待测唾液样品中，待10~15分钟样品出现在NC膜上时，将试纸条取出，平放在桌面上，以便于观察结果，观察检测线颜色深浅的变化。
8 结果判断：检测结果可能有四种情形，（1）阳性结果：在检测区出现二条紫红色的条带（检测带T1和T2），在质控区出现一条紫红色的条带（质控线C），则表明唾液样本中含有高尔基体蛋白73和癌胚抗原相关细胞粘附因子8；（2）在检测区出现一条紫红色的条带（检测带T2），在质控区出现一条紫红色的条带（质控线C），则表明唾液样本中含有癌胚抗原相关细胞粘附因子8；（3）阴性结果：在质控区只出现一条紫红色的条带（质控线C），则表明唾液样本中不含高尔基体蛋白73和癌胚抗原相关细胞粘附因子8；（4）无效结果：在检测区和质控区均无紫红色条带出现，则表明试纸条失效，该检测过程无效。
另外，基于以上的分析和研究，本领域技术人员应当能够确定，在针对唾液样本检测时，固化于检测带T2上的单克隆抗体CEA‑2不会对检测带T1产生干扰。而且，针对同一唾液样本的检测，若检测带T1显色，则检测带T2通常也一定显色；而仅仅检测带T2显色，则表明可能对应于其它肿瘤标志物。若检测带T1显现而检测带T2不显现，则可能是检测过程出现不当操作或试纸条失效，该次检测应当视为无效。
9 对照血清样本的结论证实：
取唾液样本共78份，其中，对相应的血清样本经结合血清甲胎蛋白（AFP）检测获知，AFP含量在100～400μg/L之间的血清样本有35份，AFP含量小于20μg/L的血清样本有43份。
采用该本发明的免疫层析试纸条检测该78份唾液样本，结果显示：
唾液样本共有37份同时含有GP73和CEA（其中34份相应的血清样本中AFP含量在100~400μg/L之间，3份相应的血清样本中AFP小于20μg/L）；另有2份仅含有CEA（这2份相应的血清样本中AFP小于20μg/L）；
唾液样本共有39份不含GP73或CEA（其中38份相应的血清样本中AFP含量小于20μg/L,1份相应的血清样本中AFP含量为100μg/L）。由此可以证实，采用本发明对唾液样本检测的方法与传统的血清检测方法得出的结论基本一致。
以上实施例对本发明方案以具体实验操作过程示例详述，其中的实验条件和设定参数仅作为最佳操作方式的参考，而不应视为对本发明基本技术方案的局限。