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1、(10)申请公布号 CN 102860159 A (43)申请公布日 2013.01.09 CN 102860159 A *CN102860159A* (21)申请号 201210382076.6 (22)申请日 2012.10.10 A01C 1/00(2006.01) A01G 7/00(2006.01) (71)申请人 江苏省农业科学院 地址 210014 江苏省南京市钟灵街 50 号 (72)发明人 颜伟 蔡士宾 许大光 杨欣 朱银 张仙义 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 张素卿 (54) 发明名称 一种大麦幼苗期耐盐鉴定方法 (57) 摘要 。
2、本发明涉及一种指示不同大麦品种资源幼苗 期耐盐程度的鉴定方法， 属于农业领域。 采用水培 方式人工模拟盐分环境， 通过测定不同处理的苗 高、 根长和整株鲜重， 调查待测样品在盐胁迫条件 下相对于空白对照条件所受到的盐害程度， 并依 据公式计算综合盐害指数， 最终确定品种的耐盐 性。本发明可广泛应用于植物抗逆种质资源筛选 与评价， 特别适合用于大麦耐盐种质资源的筛选 以及耐盐 QTL 遗传解析、 耐盐基因定位和耐盐大 麦品种的选育。本发明的优点是， 方法简单， 易于 掌握 ； 结果可靠， 整个耐盐鉴定过程都在可控条 件下， 受环境影响较小 ； 设备要求较低， 只需要一 台普通光照培养箱。 (51。
3、)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种指示不同大麦品种资源幼苗期耐盐程度的鉴定方法， 其特征是， 1） 材料准备 种子干燥 ： 将待测样品的种子置于种子干燥箱， 干燥 24 小时， 37 2， 通风 ； 种子表面灭菌 ： 每份样品选取无病无损健康籽粒 200 粒， 首先用质量百分比 1% NaClO 溶液浸泡 10 分钟， 进行表面灭菌， 然后用纯净水冲洗 3 次 ； 种子催芽 ： 将种子平铺于垫有 2 层滤纸的培养皿中， 使种子。
4、 1/2 浸没在水中， 将装有种 子的培养皿置于培养箱催芽 24 小时， 条件为 25 2， 黑暗 ； 2） 盐分胁迫处理 种植材料 ： 非胁迫条件空白对照 ： 1/2 浓度 Hoagland 营养液 盐胁迫处理液 ： 1/2 浓度 Hoagland ， 200 m mol/L NaCl 将已发芽胚根露出 1020mm 的大麦种子用软性聚氨酯海绵轻轻裹住， 分别放于盛有 “1/2 浓度 Hoagland 营养液” 和 “200 mmol/L NaCl 盐胁迫溶液” 离心管中 ； 生长培养 ： 将载有样品的离心管置于光照培养箱， 环境设置， 白天 ： 6:0020:00， 光照 5000LX， 。
5、温度 20 ； 黑夜 ： 20:00 次日 6:00， 黑暗， 温度 10 ； 3） 调查评价 性状调查 ： 10 天以后分别测定每份材料的苗高、 根长和鲜重 ； 苗高 ： 茎基部至苗最长叶的叶尖的长度， 单位 cm， 精确到小数点后 1 位 ； 根长 ： 最长根的长度， 单位 cm， 精确到小数点后 1 位 ； 鲜重 ： 样品整株称重， 单位 mg， 保留整数位 ； 耐盐性评价 ： 利用公式计算各材料的综合盐害指数， 确定其耐盐性 ； 相对盐害率 ： 盐害指数 ： 公式中 ：RSji为i材料j性状的相对盐害率，Xji为在盐胁迫处理条件下i材料j性状 的测定值的平均数，Xji为非胁迫条件下i材。
6、料j性状的测定值平均数，Yi为i材料的盐害 指数 ； 4） 结果判定 ：Yi值越大， 材料受到盐害的伤害越大，Yi值越小， 品种的耐盐性越强， 根据 盐害指数， 按照以下标准， 划分耐盐等级 ： 盐害指数 0 Yi 20% 时定为耐盐等级 1 级， 高耐盐 ； 盐害指数 20% Yi 40% 时定为耐盐等级 2 级， 耐盐 ； 盐害指数 40% Yi 60% 时定为耐盐等级 3 级， 中耐盐 ； 盐害指数 60% Yi 80% 时定为耐盐等级 4 级， 对盐敏感 ； 盐害指数 80% Yi 100% 时定为耐盐等级 5 级， 对盐极敏感。 权 利 要 求 书 CN 102860159 A 2 。
7、1/7 页 3 一种大麦幼苗期耐盐鉴定方法 1、 技术领域 0001 本发明属于农业领域中的品种评价技术， 涉及一种大麦幼苗期耐盐鉴定方法。本 发明适合用于大麦耐盐种质资源的筛选与评价以及耐盐 QTL 遗传解析、 耐盐基因定位和耐 盐大麦品种的选育。 2、 背景技术 0002 随着人口的增长和城市化、 工业化的推进， 农业耕地资源变得越来越宝贵。 大面积 的沿海滩涂为我国农业发展提供了重要的耕地储备。随着化肥的大量使用， 土壤次生盐渍 化也逐渐成为影响农业生产和作物产量提高的制约因素。开发滩涂发展农业， 减轻土壤盐 渍化危害的一项关键技术是培育耐盐品种。大麦是耐盐性较强的作物， 在我国有很大的。
8、种 植面积。 但不同的大麦品种耐盐性差异较大， 发掘、 鉴定大麦耐盐种质资源和筛选优良耐盐 品系都需要对众多材料进行耐盐性鉴定比较。 耐盐性鉴定是大麦耐盐遗传育种工作中一项 基本技术。 现有大麦耐盐鉴定方法多采用含盐土壤实地种植鉴定， 虽然较为直观， 但受其他 环境因子的影响较大， 耗费成本较高， 试验周期较长。本方法利用实验室条件， 创造相对均 一的环境， 鉴定材料的耐盐性差异。方法较为简单， 试验周期短， 适合大规模材料的鉴定筛 选。 0003 目前， 已知的大麦耐盐鉴定方法是将大麦幼苗移栽在含有一定盐分的土壤里， 根 据其不同反应进行分级定性评价。虽然能够区分不同材料耐盐性， 但容易收到。
9、外界环境的 影响， 年度间、 地点间变化较大， 稳定性较差。 一般鉴定方法不能有效规避气温、 光照、 风力、 降水， 以及土壤盐分不均对鉴定结果的影响， 容易产生错误的结论。 3、 发明内容 0004 技术问题 0005 为了克服现有鉴定方法不能有效规避外部环境影响的不足， 本发明提供一种鉴定 方法能在较短的时间 （10天） 测出被测材料的幼苗期的耐盐性， 由于处理的整个过程都在光 照培养箱内进行， 因此能有效排除外界环境对测试结果的影响， 鉴定结果稳定可靠。 0006 技术方案 ： 0007 一种指示不同大麦品种资源幼苗期耐盐程度的鉴定方法， 其特征是， 0008 1） 材料预处理 0009。
10、 种子干燥 ： 将待测样品的种子置于种子干燥箱， 干燥 24 小时， 37 2， 通风 ； 0010 种子表面灭菌 ： 每份样品选取无病无损健康籽粒 200 粒， 首先用质量百分比 1%NaClO 溶液浸泡 10 分钟， 进行表面灭菌， 然后用纯净水冲洗 3 次 ； 0011 种子催芽 ： 将种子平铺于垫有 2 层滤纸的培养皿中， 使种子 1/2 浸没在水中， 将装 有种 子的培养皿置于培养箱催芽 24 小时， 条件为 25 2， 黑暗 ； 0012 2） 盐分胁迫处理 0013 种植材料 ： 将空白对照 ：“1/2 浓度 Hoagland 营养液” 和盐胁迫处理 ：“盐胁迫溶 说 明 书 C。
11、N 102860159 A 3 2/7 页 4 液” 分别注入 15ml 离心管， 每管 10ml， 分别以 “0” 和 “2” 做好标记 ； 将胚根露出 10 20mm 的大麦种子用软性聚氨酯海绵轻轻裹住， 放于盛有 “1/2 浓度 Hoagland 营养液” 和 “盐胁迫 溶液” 的离心管中， 胚芽朝上， 胚根朝下， 种子中部与液面相齐。每份材料 3 次重复， 胁迫处 理、 空白对照各 20 管。 0014 生长培养 ： 将载有样品的离心管置于光照培养箱中培育， 环境设置， 白天 ： 6:00 20:00， 光照 5000LX， 温度 20； 黑夜 ： 20:00 次日 6:00， 黑暗，。
12、 温度 10； 每天下午用注射 器重新置换相应培养液， 并按次序调整试管架在培养箱中的位置。 0015 3） 调查评价 0016 性状调查 ： 10 天以后分别测定每份材料的苗高、 根长和鲜重 ； 0017 苗高 ： 茎基部至苗最长叶的叶尖的长度， 单位 cm， 精确到小数点后 1 位 ； 0018 根长 ： 最长根的长度， 单位 cm， 精确到小数点后 1 位 ； 0019 鲜重 ： 样品整株称重， 单位 mg， 保留整数位 ； 0020 耐盐性评价 ： 利用公式计算各材料的综合盐害指数， 确定其耐盐性。 0021 相对盐害率 ： 0022 盐害指数 ： 0023 公式中 ： RSji为i材。
13、料j性状的相对盐害率， Xji为在盐胁迫处理条件下i材料j性 状的测定值的平均数， 为非胁迫条件下 i 材料 j 性状的测定值平均数， Yi为 i 材料的盐 害指数 ； 0024 4） 结果判定 ： Yi值越大， 材料受到盐害的伤害越大， Yi值越小， 品种的耐盐性越强。 根据盐害指数， 按照以下标准， 划分耐盐等级。 0025 盐害指数 0 Yi 20% 时定为耐盐等级 1 级， 高耐盐 ； 0026 盐害指数 20% Yi 40% 时定为耐盐等级 2 级， 耐盐 ； 0027 盐害指数 40% Yi 60% 时定为耐盐等级 3 级， 中耐盐 ； 0028 盐害指数 60% Yi 80% 时。
14、定为耐盐等级 4 级， 对盐敏感 ； 0029 盐害指数 80% Yi 100% 时定为耐盐等级 5 级， 对盐极敏感。 0030 有益效果 0031 本发明依据的原理 ： 盐分胁迫对植物的生长发育具有严重影响， 对其光合作用、 物质运输等生理过程产生不利影响， 有害物质在植株体内大量结集， 导致生长缓慢、 叶片卷 曲， 根系发育缓慢、 停滞， 甚至枯萎死亡。本发明所采用的技术方案是通过人工模拟盐分环 境， 测定待测样品在盐胁迫条件下相对于空白对照条件下， 苗高、 根长和整株鲜重所受到的 影响， 上述性状指标下降越严重说明其受到的盐害越重， 其耐盐性越差。通过综合其在苗 高、 根长和整株鲜重三。
15、个性状上的总体表现， 计算盐害指数， 最终确定品种的耐盐性。 0032 本发明的优点是， 方法简单， 易于掌握 ； 结果可靠， 整个耐盐鉴定过程都在可控条 件下， 受环境影响较小 ； 设备要求较低， 只需要一台普通光照培养箱 ； 鉴定周期短， 整个过 程两星期完成。 附图说明 0033 图 1 为催芽后待处理的大麦幼芽。 说 明 书 CN 102860159 A 4 3/7 页 5 0034 图 2 为将刚刚萌芽的大麦种子用软性聚氨酯海绵轻轻裹住， 用镊子轻轻夹住放于 离心管中 10ml 刻度处。 0035 图 3 为不同盐分浓度处理对幼苗生长的影响比较。 具体实施方式 0036 本方法主要包。
16、括 “材料前处理” ，“盐分胁迫处理” 和 “调查评价” 三个步骤。具体 方案如下。 0037 材料准备 ： 15ml塑料离心管若干， 根据实验规模确定数量 ； 15ml试管架若干 ； 中等 强度聚氨酯泡沫海绵 （硬度 35） ， 用裁纸刀削成 20mm10mm5mm 小片若干 ； 配制 “1/2 浓度 Hoagland 营养液” 10L，“盐胁迫溶液” 10L， 盐胁迫溶液 NaCl 浓度为 200mmol/L（1.15%） ， 刘友良等 （1 刘宛， 刘友良 . 大麦幼苗的 NaCl 胁迫和叶片耐 C l- 量 . 南京农业大学学报， 1993， 16(3):15-19 ； 2 龚明， 刘。
17、友良， 丁念诚等 . 大麦不同生育期的耐盐性差异 . 西北植物 学报， 1994， 14(1):1-7 ； 3 赵檀方， 段友臣， 刘爱峰等 . 大麦品种 ( 系 ) 间耐盐性的比较研 究 . 山东农业科学， 1999， (6):19-21 ； 4 李磊， 赵檀方， 胡延吉等 . 大麦苗期耐盐性鉴定指标 的研究 . 莱阳农学院学报， 1998， 15(4):253-257） 研究表明， 大麦盐害的阈值相当于土壤含 盐量为 0.51%， 当盐浓度为 1.15% 时， 大麦将减产 50%。故设定 200mmol/L 为胁迫浓度。盐 胁迫溶液配制方法 ： 取 “Hoagland 营养液” 和 “40。
18、0mmol/LNaCl 溶液” 1 1 混合搅匀。 0038 Hoagland 营养液配方如下 ： 0039 硝酸钙 945mg/L 0040 硝酸钾 607mg/L 0041 磷酸铵 115mg/L 0042 硫酸镁 493mg/L 0043 * 铁盐溶液 2.5ml/L 0044 * 微量元素 5ml/L 0045 pH=6.0（用 1mol/L HCl 和 1mol/L NaOH 调节） 0046 * 铁盐溶液 ： 七水硫酸亚铁 2.78g 0047 乙二胺四乙酸二钠 （EDTA.Na） 3.73g 0048 蒸馏水 500ml 0049 pH=5.5（用 1mol/L HCl 和 1m。
19、ol/L NaOH 调节） 0050 * 微量元素液 ： 碘化钾 0.83mg/l 0051 硼酸 6.2mg/L 0052 硫酸锰 22.3mg/L 0053 硫酸锌 8.6mg/L 0054 钼酸钠 0.25mg/L 0055 硫酸铜 0.025mg/L 0056 氯化钴 0.025mg/L 0057 蒸馏水配制 0058 1、 材料预处理 0059 供试材料均来自江苏省农业种质资源中期库 （http:/ 说 明 书 CN 102860159 A 5 4/7 页 6 crop.aspx） ， 种质编号如下 ： 0060 表 1 试验品种资源名称及来源编号 0061 0062 *“C2118。
20、” 耐盐性较好，“苏啤 3 号” 耐盐性一般 5 乔海龙， 陈和， 陈健等 . 盐分胁 迫对不同大麦品种萌发及生长的影响 . 江西农业学报， 2008， 20(4) ： 10-13 ； 6 申玉香， 乔海 龙， 陈和等 . 几个大麦品种 ( 系 ) 的耐盐性评价 . 核农学报 .2009， 23(5) ： 752-757。 0063 *“扬饲麦 1 号” 苗期耐盐性较强 7 李国生， 许如根， 缪丽霞等 . 大麦发芽期的耐 盐性研究 . 大麦科学， 2004， (4) ： 28-30。 0064 种子干燥 ： 将待测样品置于种子干燥箱， 干燥 24 小时 （37 2， 通风） ； 0065 种。
21、子表面灭菌 ： 每份样品选取无病无损健康籽粒200粒， 首先用1%NaClO溶液浸泡 10 分钟， 进行表面灭菌， 然后用纯净水冲洗 3 次。 0066 种子催芽 ： 将种子平铺于垫有 2 层滤纸的培养皿 （直径 60mm） 中， 适量加纯净水， 使 种子 1/2 浸没在水中， 将装有种子的培养皿置于培养箱 （25 2， 黑暗） 催芽 24 小时。 0067 2、 盐分胁迫处理 0068 种植材料 ： 将 “1/2 浓度 Hoagland 营养液 （空白对照） ” 和 “盐胁迫溶液 （盐胁迫处 理） ” 分别注入 15ml 离心管， 每管 10ml， 分别以 “0” 和 “2” 做好标记 ； 。
22、将刚刚萌芽 （胚根露 出 5 10mm） 的大麦种子用软性聚氨酯海绵轻轻裹住， 用镊子轻轻夹住放于盛有 “1/2 浓度 说 明 书 CN 102860159 A 6 5/7 页 7 Hoagland 营养液” 和 “盐胁迫溶液” 离心管中， 种子中部齐 10ml 刻度处， 用记号笔在管上注 明材料编号 “0-*-#” 或 “2-*-#” ，“0” 、“2” 为不同处理编号，“*” 为品种编号， “#” 为株号 ； 同一品种， 盐水胁迫处理和空白对照在试管架上间隔排放。 0069 生长培养 ： 将载有样品的离心管置于试管架上， 放入光照培养箱。 环境设置， 白天 ： 6:00 20:00， 光照。
23、 5000LX， 温度 20； 黑夜 ： 20:00 次日 6:00， 黑暗， 温度 10。每天下 午用注射器重新置换相应培养液， 并按次序调整试管架在培养箱中的位置。 0070 3、 性状调查分析 0071 性状调查 ： 10 天以后分别测定每份材料的苗高、 根长和鲜重。 0072 苗高 ： 茎基部至苗最长叶的叶尖的长度， 单位 cm， 精确到小数点后 1 位。 0073 根长 ： 最长根的长度， 单位 cm， 精确到小数点后 1 位。 0074 鲜重 ： 样品整株称重， 单位 g， 精确到小数点后 2 位。 0075 耐盐性评价 ： 利用公式计算各材料的综合盐害指数， 确定其耐盐性。 00。
24、76 相对盐害率 ： 0077 盐害指数 ： 0078 公式中 ： RSji为i材料j性状的相对盐害率， Xji为在盐胁迫处理条件下i材料j性 状的测定值的平均数， 为非胁迫条件下 i 材料 j 性状的测定值平均数， Yi为 i 材料的盐 害指数。Yi值越大， 材料受到盐害的伤害越大， Yi值越小， 品种的耐盐性越强。本技术发明 旨在区分材料的苗期耐盐性。鉴定结果如下 ： 0079 表 2 盐害胁迫处理对不同品种幼苗生长的影响 0080 0081 说 明 书 CN 102860159 A 7 6/7 页 8 0082 表 3 双因素方差分析 0083 0084 表 3 方差分析显示， 在幼苗鲜。
25、重、 苗长、 根长 3 个性状上，“处理” 间都存在极显著差 异， 表明NaCl胁迫处理对大麦幼苗生长存在明显抑制作用，“品种” 间显著差异性表明， 不同 品种在上述性状上存在遗传差异，“品种处理” 互作显著性表明不同品种在耐盐性上存在 差异。 0085 4、 耐盐性评价 ： 0086 利用公式计算各材料的综合盐害指数， 确定其耐盐性。 0087 相对盐害率 ： 0088 盐害指数 ： 0089 公式中 ： RSji为i材料j性状的相对盐害率， Xji为在盐胁迫处理条件下i材料j性 状的测定值的平均数， 为非胁迫条件下 i 材料 j 性状的测定值平均数， Yi为 i 材料的盐 害指数 ； 说 。
26、明 书 CN 102860159 A 8 7/7 页 9 0090 评价结果判定 ： Yi值越大， 材料受到盐害的伤害越大， Yi值越小， 品种的耐盐性越 强， 根据盐害指数， 按照以下标准， 划分耐盐等级 ： 0091 盐害指数 0 Yi 20% 时定为耐盐等级 1 级， 高耐盐 ； 0092 盐害指数 20% Yi 40% 时定为耐盐等级 2 级， 耐盐 ； 0093 盐害指数 40% Yi 60% 时定为耐盐等级 3 级， 中耐盐 ； 0094 盐害指数 60% Yi 80% 时定为耐盐等级 4 级， 对盐敏感 ； 0095 盐害指数 80% Yi 100% 时定为耐盐等级 5 级， 对。
27、盐极敏感。 0096 根据本鉴定方法进一步计算盐害指数， 进行耐盐性评价。 0097 表 4 不同大麦品种耐盐性差异及评价 0098 0099 计算结果显示 （表 4） ， 盐害指数范围在 20.9 72.2 之间， 平均盐害指数 43.9， 根 据盐害指数的大小可以区分品种的耐盐性， 按盐害指数由小到大排序， 耐盐性由强到弱依 次为 ： 野生皮大麦 -3、 扬饲麦 1 号、 拜泉皮 1 号、 盐选一号、 C2118、 临海老来红、 宽颖大麦、 九 州二条 9 号、 加拿大 110、 如东 91-305、 东阳三月黄、 美 97-1338、 九州二条、 宽颖裸麦、 苏啤 3 号、 龙中蓝、 旱地兰。 0100 其中野生皮大麦 -3、 扬饲麦 1 号、 拜泉皮 1 号、 盐选一号、 C2118、 临海老来红 6 个 品种鉴定为耐盐等级2级， 较为耐盐， 也是我们多年鉴定耐盐种质 ； 苏啤3号等10个品种鉴 定为耐盐等级 3 级， 耐盐性一般 ； 旱地兰鉴定为耐盐等级 4 级， 对盐害敏感。 说 明 书 CN 102860159 A 9 1/2 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102860159 A 10 2/2 页 11 图 3 说 明 书 附 图 CN 102860159 A 11 。