抗人CD133单克隆抗体及其制备和应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102827813 A (43)申请公布日 2012.12.19 CN 102827813 A *CN102827813A* (21)申请号 201210373519.5 (22)申请日 2012.09.30 CGMCC No. 6095 2012.05.09 C12N 5/20(2006.01) C12N 5/09(2010.01) C07K 16/28(2006.01) G01N 33/577(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61P 35/02(2006.01) C12R 1/91(2006.01) (71)申请人 苏州大学 地址 2。

2、15123 江苏省苏州市苏州工业园区仁 爱路 199 号 (72)发明人 张学光 陈旭勤 居颂光 (74)专利代理机构 苏州创元专利商标事务所有 限公司 32103 代理人 陶海锋 (54) 发明名称 抗人 CD133 单克隆抗体及其制备和应用 (57) 摘要 本发明公开了抗人 CD133 单克隆抗体及其制 备和应用， 具体涉及一种单克隆抗体， 所述单克隆 抗体由杂交瘤细胞株分泌， 所述杂交瘤细胞株为 分泌小鼠抗人 CD133 分子单克隆抗体杂交瘤细胞 株 14D7， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心 (CGMCC)， 保藏地址是北京市朝 阳区北辰西路 1 号院 3 号， 保。

3、藏日期是 2012 年 5 月9日， 保藏号为CGMCCNo.6095。 本发明所述抗人 CD133单克隆抗体14D7可作为生物学检测指标应 用在肿瘤细胞检测中 ； 并且， 通过体外实验发现， 本发明所述抗人 CD133 单克隆抗体对肿瘤细胞具 有增殖抑制作用。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 2 页 附图 12 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 2 页 附图 12 页 1/1 页 2 1. 一种杂交瘤细胞株， 所述杂交瘤细胞株为分泌小鼠抗人 CD133 分子单克。

4、隆抗体杂交 瘤细胞株 14D7， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)， 保藏地 址是北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 保藏日期是 2012 年 5 月 9 日， 保藏号为 CGMCC No. 6095。 2. 权利要求 1 所述杂交瘤细胞株的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 1） 构建高表达人 CD133 的转基因细胞 ： 将 CD133 基因克隆入真核表达载体， 转染小鼠 成纤维细胞L929细胞， 获得转基因细胞L929/CD133 ； 用转基因细胞L929/CD133免疫BALB/ C 小鼠 ； 2） 获取融合细胞生长克隆 ： 从免疫合格小鼠。

5、无菌取其脾细胞作为抗原致敏的 B 细胞， 按常规方法， 将 B 细胞与骨髓瘤细胞 SP2/0 株融合， 然后利用常规的融合细胞 HAT 筛选方法 进行筛选， 进而获取融合细胞生长克隆 ； 3） 应用流式细胞术法筛选和鉴定后， 挑选出具有高抗体分泌水平的杂交瘤细胞株， 所 述杂交瘤细胞株为权利要求 1 所述的杂交瘤细胞株。 3. 一种抗人 CD133 单克隆抗体， 其特征在于， 所述抗人 CD133 单克隆抗体为保藏编号 CGMCC No. 6095 的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。 4.权利要求3所述抗人CD133单克隆抗体作为生物学检测指标在肿瘤细胞检测中的应 用。 5.权利要求3所述抗人C。

6、D133单克隆抗体在抑制人单核细胞白血病细胞系SHI-1的体 外增殖中的应用。 6. 一种抑制白血病细胞的药物， 其特征在于， 所述药物的主要成分为权利要求 3 所述 抗人 CD133 单克隆抗体。 权 利 要 求 书 CN 102827813 A 2 1/7 页 3 抗人 CD133 单克隆抗体及其制备和应用 技术领域 0001 本发明涉及一种单克隆抗体， 具体涉及抗人 CD133 单克隆抗体及其制备方法， 以 及所述单克隆抗体在人单核细胞白血病细胞系 SHI-1 的体外增殖中的应用。 背景技术 0002 已知有许多受体 - 配体相互作用都参与诱导、 建立和调节抗原特异性免疫反应。 为了有效。

7、地激活 T 细胞反应， 通常至少需要两个信号。其中除 T 细胞抗原受体 （TCR） 识别抗 原提呈细胞 （APC） 上的 MHC- 抗原复合物以提供第一信号即抗原特异性信号外， 还必须获得 T 细胞与 APC 表达的共刺激分子相互作用后产生的非抗原特异性、 非 MHC 限制性的第二信 号。第二信号即为共刺激信号或协同刺激信号。如果仅有抗原特异性信号而缺失共刺激信 号， T细胞将表现为无反应或免疫耐受状态， 甚至导致凋亡。 可见， 共刺激信号是T细胞克隆 扩增、 分化和发挥生物效应所必不可少的。因此可以认为， 第一信号决定了 T 细胞活化的特 异性， 而第二信号则决定T细胞介导的免疫应答能否有效。

8、进行 （Noelle RJ, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:6550, 1992; Allen RC et al., Science. 259:990,1993） 。 0003 近年来， 分子生物学技术广泛应用于免疫学研究， 共刺激分子被不断发现。 根据其 结构， 这些共刺激分子可分为两类 ： 一类是肿瘤坏死因子肿瘤坏死因子受体 （TNF/TNFR） 超家族， 包括 CD40/CD154、 CD27/CD27L、 CD30/CD30L、 4-1BB/4-1BBL 和 Fas/FasL 等。另一 类是免疫球蛋白超家族， 如 B7-CD28/CTLA。

9、4、 LAF1-ICAM-1/ICAM-2/ICAM-3、 ICOS-GL50、 CD2/ LFA-3 等 （Korthauer U et al., Nature, 361:539, 1993） 。这些共刺激分子以受体和配 体相互作用的方式传导信号。受体和配体一般表达在不同的细胞表面， 通常一个为持续性 表达， 一个是诱导性表达。 在免疫应答的不同阶段， 这些分子以各自独特而又相关联的方式 参与信号传导， 共同调控机体的免疫应答。 0004 人 CD133(prominin-1) 是一种局限性分布于胞浆膜的突出处， 如上皮微绒毛、 附 睾导管上皮的硬纤毛处的糖蛋白， 因此根据拉丁文 promi。

10、nere, 取名为 prominin. 1997 年， Yin 等首次报道了一个新的造血干 / 祖细胞 （HSPC） 表面抗原 AC133 并制备了该抗原 的单克隆抗体， 2000 年 6 月由国际白细胞分化抗原工作组会议 （ILDAW） 命名为 CD133。 CD133 分子在蛋白结构上不同于 4 次跨膜 （4-TM） 和 7 次跨膜 （7-TM） 受体家族成员， 它是 5 次跨膜 （5-TM） 受体家族中的第一个成员， 分子量约为 120kDa， 其分子转录由 5 个不同的 启动子控制。CD133 分子具有胞外的氨基末端和胞内的羧基末端， 以及胞外的 8 个一样的 N- 糖基化位点。CD1。

11、33 的分子结构和蛋白表达的特点提示它可能是作为生长因子受体发挥 生物学作用。此外， 有 12 个不同氨基酸序列的 prominin-1 剪接体相继在啮齿类和灵长类 被发现。 0005 CD133 分子在干 / 祖细胞表达并随细胞分化快速下调， 该特点使之成为内皮、 脑、 骨髓、 肝脏、 肾脏、 前列腺、 胰腺和包皮等组织检测和分离干 / 祖细胞的标记分子。此外， 除 了在正常组织表达外， 在白血病细胞、 脑胶质瘤、 结肠癌、 前列腺癌、 肝癌和胰腺癌中也能检 测到 CD133 分子的表达。已有的研究结果表明 CD133+ 肿瘤细胞具有很强的自我更新、 增 说 明 书 CN 102827813。

12、 A 3 2/7 页 4 殖能力强和多向分化的潜能， 提示 CD133 是研究肿瘤干细胞的重要靶分子之一。同时还有 研究显示 CD133 分子可能在肿瘤免疫逃逸、 药物耐受以及放疗抵抗中发挥了重要作用。 人 CD133 有 2 种亚型， 继 Yin 克隆并鉴定了 CD133-1 后 Yu 等克隆出 CD133-2， 并发现与 CD133-1 仅在胎脑和骨骼肌中呈优势表达特性不同， CD133-2 在许多胎儿组织和成熟组织 中呈优势性表达， 并在一些肺癌、 前列腺癌、 结肠癌和乳腺癌细胞株中也有表达。两种异构 体的表达谱不同， 它们的功能是否有差异目前尚不清楚。 0006 虽然， 自 CD133。

13、 分子发现后的 10 多年来一直为广大科研工作者所关注， 但研究 CD133 分子的手段尚缺乏， 特别是与其相互作用的分子尚未克隆， CD133 的生物学功能及 参与的信号通路至今尚不清楚。 目前使用的商品化抗 CD133 抗体 （293C3, AC133, AC141, Miltenyi Biotec） 在运用中存在一定的局限性 （主要针对该分子的糖基化位点， 故糖基化 水平的变化影响直接影响了 CD133 检测到的表达水平） 。因此， 研制抗人 CD133 功能性单 克隆抗体将有助于揭示 CD133 的生物学功能， 研究该分子在肿瘤发生、 发展中作用机制， 也为肿瘤干细胞的研究提供了一种新。

14、的手段。 发明内容 0007 本发明的发明目的是提供一种抗人 CD133 单克隆抗体以及能产生所述抗人 CD133 单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 0008 为达到上述发明目的， 本发明采用的技术方案是 ： 一种杂交瘤细胞株， 所述杂交瘤 细胞株的制备方法包括以下步骤 ： 1） 构建高表达人 CD133 的转基因细胞 ： 将 CD133 基因克隆入真核表达载体， 转染小鼠 成纤维细胞L929细胞， 获得转基因细胞L929/CD133 ； 用转基因细胞L929/CD133免疫BALB/ C 小鼠 ； 2） 获取融合细胞生长克隆 ： 从免疫合格小鼠无菌取其脾细胞作为抗原致敏的 B 细胞， 按常规方法，。

15、 将 B 细胞与骨髓瘤细胞 SP2/0 株融合， 然后利用常规的融合细胞 HAT 筛选方法 进行筛选， 进而获取融合细胞生长克隆 ； 3） 应用流式细胞术法筛选后， 挑选出具有高抗体分泌水平的杂交瘤细胞株， 所述杂交 瘤细胞株为保藏在中国普通微生物保藏管理中心 (CGMCC) 的保藏编号为 CGMCC No. 6095 的杂交瘤细胞株。 0009 上述杂交瘤细胞株的保藏信息为 ： 保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心(CGMCC)， 保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 保藏日期是2012年 5 月 9 日， 保藏号为 CGMCC No. 6095， 其描述为分泌小鼠抗。

16、人 CD133 分子单克隆抗体杂交瘤 细胞株 14D7。 0010 上述技术方案中， 步骤 1） 中高表达人 CD133 分子的转基因细胞 L929/CD133 具有 较强的免疫原性， 并且所表达的抗原分子的空间构型能以自然状态暴露于细胞膜表面， 从 而可更有效地激发机体的免疫反应。另外， 由于 L929 细胞是鼠源性的成纤维细胞， 细胞表 面其他分子具有相对较弱的抗原性， 因此用该细胞作为免疫原将会减少非特异性抗体的产 生， 使单克隆抗体的筛选更为方便。 0011 上述技术方案中， 步骤 1） 中， 制备 L929/CD133 细胞的方法可以按照本领域技术人 员熟知的 DNA 操作技术 （例。

17、如参见 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory 说 明 书 CN 102827813 A 4 3/7 页 5 Manual, Cold Spring Harbour， 1989） 进行基因的分离、 核苷酸片段的切割与连接、 克隆和 表达载体的构建及扩增、 核苷酸序列的分析与鉴定、 细胞的转化和培养。 0012 上述技术方案中， 制备抗人 CD133 单克隆抗体的方法可以按照本领域已知的 常规方法 （Kohler and Milstein,Nature 265:495 -497,1975） 。也可以按照美国专利 5,585,089 中所述。

18、的方法制备相应的人源化形式的抗单克隆抗体。 0013 采用上述杂交瘤细胞株制备单克隆抗体的方法有以下两种 ： 1） 在杂交瘤培养液中接种上述杂交瘤细胞， 培养后培养液中分离纯化所需单克隆抗 体 ； 2） 在动物腹腔内接种上述杂交瘤细胞， 动物腹水液中分离和纯化所需单克隆抗体。 0014 流式细胞仪分析结果显示， 所述抗人CD133单克隆抗体14D7能识别多种肿瘤细胞 和儿童髓母细胞瘤上表达的CD133分子， 可制备用于识别人CD133的检测抗体， 亦可能成为 检测肿瘤干细胞的重要标志。 0015 因此， 本发明同时要求保护上述抗人 CD133 单克隆抗体作为生物学检测指标， 在 肿瘤细胞检测中。

19、的应用。 0016 本发明同时要求保护上述抗人 CD133 单克隆抗体在人单核细胞白血病细胞系 SHI-1 的体外增殖中的应用。 0017 进一步的技术方案中， 本发明同时提供一种抑制白血病细胞的药物， 所述药物的 主要成分为上述抗人 CD133 单克隆抗体 14D7。 0018 由于上述技术方案运用， 本发明与现有技术相比具有下列优点 ： 本发明所述抗人 CD133 单克隆抗体 14D7 识别 PD-L1 分子抗原结合位点 ； 并且， 通过体 外实验发现， 本发明所述抗人 CD133 单克隆抗体对肿瘤细胞具有增殖抑制作用， 更具体的 分析表明， 本发明所述抗人 CD133 单克隆抗体阻滞了肿。

20、瘤细胞从 G1 期向 S 期的转化进程 ； 诱导肿瘤细胞凋亡 ； 上调肿瘤细胞 CD95/CD95L 的表达 ； 可改变肿瘤细胞表型。 附图说明 0019 图 1 为实施例一中以流式细胞术分析抗人 CD133 单克隆抗体对转基因细胞上 CD133 分子的识别 ； 图 2 为实施例一中 14D7 杂交瘤细胞株染色体的核型分析 （1000 倍） 及亚类鉴定结果 图 ； 图 3 为实施例一中以流式细胞术分析单克隆抗体 14D7 识别的抗原位点的结果图 ； 图 4 为实施例一中以流式细胞术分析单抗 14D7 识别的抗原位点的竞争性抑制的结果 图 ； 图 5 为实施例一中以流式细胞术分析 14D7 对人。

21、外周血淋巴细胞上的 CD133 分子的识 别结果图 ； 图 6 为以流式细胞术分析 14D7 对人骨髓细胞上的 CD133 分子的识别结果图 ； 图 7 为实施例一中以流式细胞术分析单抗 14D7 对多种肿瘤细胞株上 CD133 分子的识 别结果图 ； 图 8 为实施例一中以免疫组化方法分析单抗 14D7 对新鲜组织上 CD133 分子的识别结 果图 ； 说 明 书 CN 102827813 A 5 4/7 页 6 图 9 为实施例二中不同剂量 14D7 对 SHI-1 体外增殖的抑制作用 （A 48h, B 72h） ； 图 10 为实施例二中不同剂量 14D7 对 SHI-1 细胞周期分布。

22、的作用 （A 48h, B 72h） ； 图 11 为实施例二中不同剂量 14D7 对 SHI-1 作用 24h 后对 SHI-1 凋亡的作用 ； 图 12 为实施例二中单抗 14D7 上调 SHI-1 细胞 CD95/CD95L 的表达 ； 图 13-14 为实施例二中单抗 14D7 对 SHI-1 细胞表型的改变。 0020 具体实施方式 0021 下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述 ： 实施例一 ： 抗人 CD133 单克隆抗体的制备 本实施例描述本发明的抗人 CD133 单克隆抗体 14D7 的制备。 0022 （1） 转基因细胞 L929/CD133 和 L929/mock 的。

23、建立 （a） 人 CD133 基因的克隆 ： 以 AC133-2 为模板， 分别以 2 对引物 ( 表 1) 进行分段 PCR 扩增， 反应条件为 94变性 60s， 58退火 60s， 72延伸 1-3 min， 共 35 个循环后， 再于 72延伸 10 min， 得到 A 和 B 两个片段。 PCR 产物经试剂盒纯化后， 以 133A（SEQ ID NO:1） 和 133B（SEQ ID NO:4） 为 引物， 反应条件为 94变性 60s， 58退火 60s， 72延伸 3 min15s， 共 33 个循环后， 再于 72延伸 10 min， 得到全长 CD133-1 基因产物， PC。

24、R 产物经试剂盒纯化后， 在 T4 DNA 连接酶 的作用下与 pMD18-T 载体连接， 并转化感受态细菌 Top10。 用含氨苄青霉素平板筛选阳性 菌落， 扩增后抽提质粒， 经PCR鉴定后， 送上海英骏公司测序验证。 结果显示， 所获得的cDNA 序列与 GenBank 中注册的人 CD133 cDNA 序列 (AF027208) 完全一致。 0023 表 1 扩增引物 。 0024 （b） 重组逆转录病毒载体的构建 ： 分别用核酸内切酶 Hind 和 BamHI 消化测序正 确的 pMD18-T/CD133 质粒和逆转录病毒载体 pIRES2-EGFP， 回收含目的基因的片段， 并用连 。

25、说 明 书 CN 102827813 A 6 5/7 页 7 接产物转化感受态细菌。用上述方法鉴定证实后， 将所获得的重组逆转录病毒载体定名为 pIRES2-EGFP/CD133。 0025 （c） 稳定表达人 CD133 的 L929 转基因细胞的构建 ： 将重组载体 pIRES2-EGFP/CD133 用脂质体法转染预铺于 6 孔板中的 L929 细胞， 整个过程按试剂盒 Lipofectamine(TM) 2000 操作手册进行。37 C 转染 6-8h 后添加 15%FCS 的 1640 培养基至 2ml/孔， 继续 37C、 CO2培养箱培养， 18-48h 后用流式细胞术 检测 G。

26、FP 或 CD133 基因瞬时表达。24h 后收集经基因转染的 L929 细胞， 按适当比例稀释， 将其置于含 G418（800 mg/L） 的选择性培养基中， 筛选培养， 待抗性单克隆长至足够大， 挑 取单克隆集落， 进行扩大培养。 同时制备阴性对照的基因转染细胞 L929/mock。 收集L929/ CD133 和 L929/mock 基因转染细胞， 用流式细胞术检测绿色荧光蛋白 （GFP） 报告基因的表 达。 进一步以商品化的抗人CD133-2 单抗 （AC141） 用流式细胞仪检测CD133 蛋白在细胞膜 上的表达。流式细胞仪检测显示， L929/CD133 细胞膜上人 CD133 蛋。

27、白的表达率约为 97%。 0026 （2） 抗人 CD133 单克隆抗体的制备 使用如上得到的高表达 CD133 分子的转基因细胞 （L929/CD133） 作为免疫原， 三次免疫 接种 Balb/c 小鼠 （107/500 l/ 只） （间隔 3 周） 。末次免疫后第四天， 取小鼠脾脏细胞与 SP2/0 骨髓瘤细胞株进行细胞融合 （共 20 块 96 孔板） 。以高表达 CD133 分子的 L929/CD133 为阳性对照及表达 CD133 分子的 L929/mock 为阴性对照， 用间接免疫荧光法对杂交瘤培养 物上清进行初步筛选、 蛋白鉴定及 Ig 亚类鉴定 （参见图 1， 图 1 显示以。

28、流式细胞术分析抗人 CD133 单克隆抗体 14D7 对转基因细胞上 CD133 分子的识别。其中灰色峰为阴性对照， 一抗 为小鼠IgG， 二抗为荧光素PE标记的羊抗鼠IgG。 透明峰显示转基因细胞与抗人CD133单抗 反应的结果， 其中第一抗体分别本是发明的抗人 CD133 单抗 14D7 及商品化抗人单抗 AC141 （阳性对照） ， 第二抗体是荧光素 PE 标记的羊抗鼠 IgG） 。阳性克隆经 3 次有限稀释后， 克隆 的阳性率达到约 95%。经复筛及亚克隆后获得稳定地分泌特异性鼠抗人 CD133 的杂交瘤细 胞株， 并被命名为 14D7 （保藏号为 CGMCC No. 6095） 。这。

29、些杂交瘤细胞经体外持续传代 （40 代） 后， 仍能稳定地分泌特异性抗体。对杂交瘤细胞株 14D7 的染色体分析显示， 这三株杂交 瘤细胞的染色体数目为 80-110（参见图 2） 。 0027 （3） 抗人 CD133 单克隆抗体的生产与特性鉴定 （a） 采用本室建立的腹水体内诱生方法生产单克隆抗体。取 6-8 周龄的雌性 Balb/c 小 鼠， 腹腔内注入 Pristane （0.5ml/ 只） 。一周后腹腔内接种杂交瘤细胞 （1107/ 只） ， 同时 再次腹腔内注射 Pristane 与福氏不完全佐剂的等体积混合物 （0.2ml/ 只） 。5-10 天后收获 腹水， 并离心取上清于 -。

30、80保存。 0028 （b） 腹水型单抗的纯化和定量。腹水液经去除纤维蛋白和盐析处理后， 以蛋白 G 亲和柱层析法纯化。收集蛋白峰流出液， 对磷酸盐缓冲液 （PBS） 透析后用 751 紫外分光光 度计测定抗体蛋白浓度为0.810mg/ml。 间接免疫荧光法分析结果表明， 纯化的单克隆抗体 的效价在 1:1000 以上。 0029 （c） Ig 亚类鉴定。采用试纸快速测定 （Argen 公司） 法鉴定 Ig 亚类， 结果显示 14D7 为小鼠 IgG2 型抗体。 0030 （d） 抗体识别抗原位点的竞争性抑制试验 ： 在 L929/CD133 细胞 （5105/ 管） 悬液 分别加入单克隆抗体。

31、 （每管 2g） ， 4孵育 45 分钟。洗细胞后依次加入生物素标记的单抗， 说 明 书 CN 102827813 A 7 6/7 页 8 和链霉菌抗生物素蛋白 - 过氧化物酶溶液 （Streptavidine-PE） ， 并分别 4孵育 30 分钟。 再次洗涤后用流式细胞仪分析， 同时设阳性和阴性对照， 得图 3 ； 图 3 表示 14D7 对 AC141 与 CD133 的结合不产生竞争作用。 0031 以流式细胞术分析单抗 14D7 识别的抗原位点的竞争性抑制 ： L929/CD133 细胞 （5105/ 管） 用 PBS 洗涤后， 依次加入单克隆抗体 （每管 2g） 、 生物素标记的单。

32、抗、 链霉菌 抗生物素蛋白 - 过氧化物酶溶液， 并洗涤和温育后用流式细胞仪分析， 同时设阳性和阴性 对照组。抗体 14D7 竞争结合抗体 10G11 所识别的 CD133 位点。黑色峰为阴性对照， 其中 一抗为生物素标记的小鼠 IgG， 二抗为 Streptavidin-PE。透明实线峰和透明虚线峰显 示 10G11 与 14D7 对位点的竞争性。将 10G11 加入 L929/CD133 反应后， 再与生物素标记 的 10G11( 透明实线峰 ) 或 14D7( 透明虚线峰 ) 作用， 最后加入藻红蛋白标记的链亲和素 （Streptavidin-PE） ， 流式细胞仪进行检测， 结果见图 。

33、4。 0032 （e） 以流式细胞术分析14D7对人外周血淋巴细胞及人骨髓细胞上的CD133分子的 识别情况 ： 常规分离健康人外周血单个核细胞 (PBMCs)， 细胞均分成数管后将 CD133 单抗与 新鲜分离的 PBMCs 4反应 30 分钟， 离心洗净未结合到细胞膜上的抗体后加入 PE 标记的 羊抗鼠二抗， 4避光反应 30 分钟。与此同时与 PE 标记的商品化抗体 AC141 及同型对照鼠 IgG4避光反应 30 分钟。离心洗涤后， 以流式细胞技术检测 CD133 在外周血淋巴细胞上的 表达 （图 5） 。按照上述方法收集检测人骨髓细胞上 CD133 的表达 （图 6） 。 0033 。

34、从图 5 和图 6 可得知， 免疫荧光标记和流式分析显示， 正常人 BM 有 CD133 的低表 达， PBMCs 不表达 CD133。 0034 （f） 按照常规技术， 以流式细胞术分析单抗 14D7 对多种肿瘤细胞株上 CD133 分子 的识别情况， 得图7， 其中灰色峰为阴性对照， 一抗为鼠IgG， 二抗为荧光素PE标记的羊抗鼠 IgG。透明峰显示肿瘤细胞与鼠抗人 CD133 单抗反应的结果， 其中第一抗体分别是兔抗人 CD133 单抗 14D7， 第二抗体是荧光素 PE 标记的羊抗鼠 IgG。 0035 从图 7 可得知 ： 白血病来源的细胞株 U937、 SHI-1、 肠上皮来源的 。

35、Caco-2、 视网 膜母细胞瘤 WERI-RB- 、 Y79 表达 CD133 分子， 而其它肿瘤细胞株微弱表达或不表达 CD133 分子。 0036 （g） 以免疫组化方法分析单抗 14D7 对新鲜组织上 CD133 分子的识别情况 ： 取样本 组织， 常规制备石蜡切片 （4m） 。切片经脱蜡和修复抗原后， 用蒸馏水洗涤并加入 0.3% 过 氧化氢 - 甲醇以阻断内源过氧化物酶， 于室温下孵育 30 分钟。 再次洗涤后， 每张切片依次 滴加入 10% 正常羊血清、 特异性鼠抗人 CD133 抗体 14D7（10ug/ml， 作为一抗） 、 生物素标记 的兔抗鼠 IgG（第二抗体） 、 链霉。

36、菌抗生物素蛋白 - 过氧化物酶溶液。每次加如试剂前均用 PBS 洗细胞并于 37 孵育 40 60 分钟。反应后， 加入 0.04%DAB+ 0.03%HO2显色， 并用 苏木素衬染。水洗、 脱水并透明处理后封片。酒精脱水， 二甲苯透明， 中性树胶封片。观片， 显微摄影。 以鼠IgG2 来代替一抗作为阴性对照。 最后的 CD133 显色结果根据在细胞浆及 细胞膜上是否有显著的棕色而分别定为阳性或阴性， 若样本组织的阳性细胞数大于 10% 则 该样本为阳性， 不然则为阴性。 结果见图8， 为免疫组化方法分析14D7对儿童髓母细胞瘤中 CD133 分子的识别结果， 免疫组化方法检测人的髓母细胞瘤的。

37、 CD133 抗原表达结果显示， 在髓母细胞瘤中， 与鼠 IgG 对照相比较， 14D7 能检测到 CD133 抗原的表达。 0037 实施例二 ： 单抗 14D7 对 SHI-1 细胞的体外生物学效应 说 明 书 CN 102827813 A 8 7/7 页 9 1） 单抗 14D7 对 SHI-1 细胞体外的增殖抑制作用 ： SHI-1 细胞在按上述方法分别采用 抗 CD133 单抗 14D7 按 0.5g/ml 和 5g/ml 不同浓度抗体作用下， 在 14D7 一定浓度 范围内抑制 SHI-1 细胞增殖 ( 分别与鼠 IgG 组比较， p 苏州大学 抗人 CD133 单克隆抗体及其制备。

38、和应用 4 PatentIn version 3.5 1 27 DNA 人工合成 1 cacctgcaga ccatggccct cgtactc 27 2 68 DNA 人工合成 2 ccctgcttca tagtagacaa tctttagacc taagattaca gtttctggct tgtcataatc 60 aattttgg 68 3 68 DNA 人工合成 3 ccaaaattga ttatgacaag ccagaaactg taatcttagg tctaaagatt gtctactatg 60 aagcaggg 68 4 26 DNA 人工合成 序 列 表 CN 1028278。

39、13 A 10 2/2 页 11 4 gtgattcctt tccactttga gtatcc 26 序 列 表 CN 102827813 A 11 1/12 页 12 图 1 说 明 书 附 图 CN 102827813 A 12 2/12 页 13 图 2 说 明 书 附 图 CN 102827813 A 13 3/12 页 14 图 3 说 明 书 附 图 CN 102827813 A 14 4/12 页 15 图 4 说 明 书 附 图 CN 102827813 A 15 5/12 页 16 图 5 说 明 书 附 图 CN 102827813 A 16 6/12 页 17 图 6 说 明 书 附 图 CN 102827813 A 17 7/12 页 18 图 7 说 明 书 附 图 CN 102827813 A 18 8/12 页 19 图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 102827813 A 19 9/12 页 20 图 10 说 明 书 附 图 CN 102827813 A 20 10/12 页 21 图 11 说 明 书 附 图 CN 102827813 A 21 11/12 页 22 图 12 说 明 书 附 图 CN 102827813 A 22 12/12 页 23 图 13 图 14 说 明 书 附 图 CN 102827813 A 23 。