卵巢癌原发化疗敏感性测评试剂盒及其应用 【技术领域】
本发明涉及一种用于测评卵巢癌化疗敏感性的试剂盒及其在原发化疗敏感 / 耐 药测评、 肿瘤患者甄别、 及原发化疗药物耐受性评估中的应用。背景技术
上皮性卵巢癌 (Epithelial Ovarian Cancer， EOC) 是女性生殖器官常见的肿瘤之 一， 是女性肿瘤中的首要杀手。其中浆液性癌最为常见， 在西方国家占所有卵巢癌的 80 ～ 85％， 分为晚期和早期， 其中晚期占绝大多数， 早期非常少见约占所有卵巢的＜ 5％。 现在认 为早、 晚期浆液性癌是卵巢癌的两种不同类型， 其形态学的差别实际上反映了肿瘤生物学 差异， 归根到底为基因水平的差异。 该病早期不易诊断， 晚期就诊时病人已错过了最佳治疗 时机。由于卵巢癌晚期病人有不同程度的扩散， 因此病人术后必须立刻进行化疗。目前国 际上对卵巢癌术后病人的化疗方案主要分为 ： 首期辅助性 (adjuvant ； 以铂为基础的顺铂 或卡铂 / 紫杉醇 ) 和后期抢救性 (salvage ； 多种化疗药物配伍 ) 治疗。由于病人的基因调 节不同， 其分子表达水平也不同， 故对原发化疗药物的敏感性各异， 因而以铂为基础的首期 辅助性化疗对 40 ～ 50％病人的症状来说未有任何缓解， 也称原发耐药， 由于治疗没有针对 性， 耽搁了最佳化疗时期， 是导致病人快速死亡的原因之一。因此， 化疗前预测病人对原发 化疗药物的敏感性， 对延长卵巢癌患者的生命至关重要。 另一方面， 长期以来按照组织形态分类的方法将上皮性卵巢癌分为四个不同的病 理类型， 即： 浆液性， 子宫内膜样， 粘液性和透明细胞性， 其中又以浆液性最为常见。但临床 实践发现， 仅仅按照传统组织形态分类标准对卵巢癌进行分类， 对进一步研究其病理特征 以及指导临床诊断和治疗多有不足， 因此也迫切地需要一种方法对传统分类学项下的肿瘤 进行进一步的甄别和分类。
再者， 如前所述， 临床用于治疗卵巢癌的药物对相当一部分病人的症状未有任何 缓解， 但这需要经过相当长的一段临床时期才能被发现， 往往会导致延误治疗机会， 增加病 人痛苦。 因此， 药物研究开发中也需要一种快速而有效的高通量筛选方法， 来针对性地评估 目标的原发化疗药物在临床治疗卵巢癌中的可能的耐受性风险。
发明内容
本申请的发明人研究中发现， ERCC2 的蛋白表达量在敏感细胞中比耐药细胞高 2 倍以上， 结合此发现， 发明人利用我国卵巢癌病人标本， 采用简单易行的免疫组织化学方 法， 定性的确认了 ERCC2 在卵巢癌化疗病人的生物标记物作用。
基于上述研究结果， 本发明的目的之一在于提供一种卵巢癌化疗敏感性测评试剂 盒， 所述的试剂盒包括 ： 由 5％山羊血清、 1％ BSA、 0.01％聚乙二醇辛基苯基醚和 pH7.4 的磷 酸缓冲液组成的封闭液， 由 ERCC2 抗体 (1 ∶ 1000)、 生物素化二抗工作液和封闭液组成的 抗原抗体反应系统， 由辣根酶标记链霉卵白素工作液和 DAB 试剂缓冲液组成的抗生物素蛋 白 - 氧化物酶反应系统， 以及作为复染剂的苏木精。优选的实施方案中， 所述的试剂盒还包括由 0.01M 柠檬酸盐缓冲液和磷酸缓冲液 组成的抗原修复系统， 以及由 3％过氧化氢和磷酸缓冲液组成的消除内源性过氧化物酶系 统。所述试剂盒可针对性地适用于石蜡包埋的卵巢癌组织样本。
本发明的目的之二在于提供一种测评卵巢癌组织样品对原发化疗药物敏感性的 方法， 其特征在于使用权利要求 1 所述的试剂盒， 包括如下步骤 ： 使用封闭液处理待测样品 后， 分别使用 ERCC2 抗体和生物素化二抗工作液进行一抗和二抗反应， 然后使用辣根酶标 记链霉卵白素工作液处理样品， 最后进行 DAB 显色和苏木精复染 ； 根据样品染色情况判定 对原发化疗药物的敏感性 ： 呈褐色阳性反应的样品判定为对原发化疗药物敏感的卵巢癌组 织； 呈兰色阴性反应的样品判定为对原发化疗药物耐受的卵巢癌组织。
上述测评卵巢癌组织样品对原发化疗药物敏感性的方法更具体地包括如下步 骤：
①封闭 ： 在待处理样品的组织上加 200μl 封闭液， 室温孵育 60 分钟 ；
②抗原抗体反应 ：
(1) 一抗孵育 ： 在组织上加 150μl 按照 1 ∶ 100 比例稀释的 ERCC2 抗体， 以封口 膜覆盖组织， 于 4℃孵育过夜， 然后以 PBS 清洗 3 次， 每次 10 分钟 ；
设阴性对照组， 用同体积封闭液代替 ERCC2 抗体。
(2) 二抗孵育 ： 在组织上加 150μl 生物素化二抗工作液， 室温孵育 60 分钟， PBS 清 洗 3 次， 每次 10 分钟 ；
③在组织上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液 (S-A/HRP)， 室温孵育 60 分钟， PBS 清洗 3 次， 每次 10 分钟 ；
④ DAB 显色 ：
(1) 制备底物混合液 ： 在 1ml pH 值＝ 7.0 的双蒸水中， 加入一滴试剂 A， 混合均匀 后， 将试剂 B 和试剂 C 各一滴加入其中， 混合均匀得底物混合液 ；
(2) 显色 ： 将 150μl 底物混合液滴加在组织上， 室温显色 3 ～ 10 分钟， 充分显色 后自来水冲洗终止反应 ；
⑤染色、 脱水、 透明、 封片 ： 将组织切片浸入苏木精染液 2 次， 每次 2 秒 ； 然后用蒸 馏水处理 3 次， 每次 5 分钟 ； 再依次以 50％乙醇、 70％乙醇、 90％乙醇各处理 1 次， 每次 1 分 钟； 再以无水乙醇处理 2 次， 每次 2 分钟， 二甲苯与无水乙醇 1 ∶ 1 混合物处理 1 次， 2 分钟， l00％二甲苯处理 2 次， 每次 2 分钟 ； 最后用树胶封片， 保存 ；
⑥根据样品染色情况判定对原发化疗药物的敏感性 ： 呈褐色阳性反应的样品判定 为对原发化疗药物敏感的卵巢癌组织 ； 呈兰色阴性反应的样品判定为对原发化疗药物耐受 的卵巢癌组织。
上述本发明的测评卵巢癌组织样品对原发化疗药物敏感性的方法理论上适用于 任何类型的离体肿瘤组织或细胞样本， 包括新鲜采集的卵巢癌组织、 福尔马林固定石蜡包 埋卵巢癌组织、 OCT 包埋的冷冻卵巢癌组织， 液氮保存的新鲜无固定卵巢癌组织等。无论应 用于哪种类型的生物样本， 本领域的技术人员可以根据现有技术信息确定样品的前处理方 法， 已使处理后的样品适用于本发明所述及的免疫组化检测。几种典型的样本及其处理方 法分别是 ：
(1) 所述测评卵巢癌组织样品对原发化疗药物敏感性的方法应用于卵巢癌福尔马林固定石蜡包埋组织的测评时， 对样品的预处理包括如下步骤 ：
a. 脱蜡 ： 卵巢癌福尔马林固定石蜡包埋组织常规切片， 厚度 4 ～ 5μm 的石蜡组织 切片依次经过 100％二甲苯脱蜡 3 次， 每次 5 分钟 ； 无水乙醇脱蜡 3 次， 每次 2 分钟 ； 95％乙 醇、 90％乙醇、 70％乙醇、 50％乙醇各脱蜡 1 次， 2 分钟 ；
b. 抗原修复 ： 以 0.01M 柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复， 然后以 PBS 清洗 3 次， 每次 5 分钟 ；
c. 消除内源性过氧化物酶 ： 将组织切片置于 3％过氧化氢中， 室温孵育 30 分钟， 用 PBS 清洗 3 次， 每次 5 分钟。
处理所得样品直接用于检测。
(2) 所述测评卵巢癌组织样品对原发化疗药物敏感性的方法应用于 OCT 包埋的冷 冻保存的卵巢癌组织的测评时， 对样品的预处理包括如下步骤 ：
a. 组织固定 ： 将卵巢癌病人手术时切除的新鲜肿瘤组织约 2x2cm3 立即置入 4％多 聚甲醛中， 4℃， 固定 24 小时 ；
b.PBS 清洗 3 次， 每次 10 分钟 ；
c. 将组织浸入 30％蔗糖， 4℃过夜 ； d.OCT 混合物 (opti-mum cutting temperature compound) 包埋， 放置在干冰上 ；
e. 待 OCT 混合物凝固后， 恒冷箱冰冻切片 7 ～ 10um ；
所述测评卵巢癌组织样品对原发化疗药物敏感性的方法应用于液氮保存的新鲜 无固定卵巢癌组织时， 对样品的预处理包括如下步骤 ：
a. 将卵巢癌病人手术切除的新鲜肿瘤组织迅速置入液氮中， 待用 ；
b. 用时首先将组织浸入 4％多聚甲醛中， 4℃， 固定 24 小时 ；
根据用户所具有的实验室设备， 可行上述两种方法中的任何一种 ： 即石蜡包埋或 OCT 包埋过程后， 处理所得样品直接用于检测。
本发明的另一方面的目的是提供一种筛选对原发化疗药物敏感的卵巢癌患者的 方法， 该方法也需要使用上述本发明所述的卵巢癌化疗敏感性测评试剂盒， 包括如下步骤 ： 以卵巢癌患者离体肿瘤组织为检测样品， 使用封闭液处理待测样品后， 分别使用 ERCC2 抗 体和生物素化二抗工作液进行一抗和二抗反应， 然后使用辣根酶标记链霉卵白素工作液处 理样品， 最后进行 DAB 显色和苏木精复染 ； 根据样品染色情况判定样品来源的卵巢癌患者 对原发化疗药物敏感性 ： 呈褐色阳性反应的样品判定为对原发化疗药物敏感的卵巢癌组 织， 样品来源的卵巢癌患者对原发化疗药物敏感 ； 呈兰色阴性反应的样品判定为对原发化 疗药物耐受的卵巢癌组织， 样品来源的卵巢癌患者对原发化疗药物耐受。
本发明再一方面的目的是提供一种用于指导卵巢癌术后病人首期化疗用药的方 法， 包括临床采集患者卵巢癌组织、 进行免疫组化检测及判断、 根据判断结果确定用药方案 等步骤， 具体地为 ：
I. 样品采集
II. 样品免疫组化检测及结果判断
①封闭 ： 在待处理样品的组织上加 200μl 封闭液， 室温孵育 60 分钟 ；
②抗原抗体反应 ：
(1) 一抗孵育 ： 在组织上加 150μl 按照 1 ∶ 100 比例稀释的 ERCC2 抗体， 以封口
膜覆盖组织， 于 4℃孵育过夜， 然后以 PBS 清洗 3 次， 每次 10 分钟 ；
设阴性对照组， 用同体积封闭液代替 ERCC2 抗体。
(2) 二抗孵育 ： 在组织上加 150μl 生物素化二抗工作液， 室温孵育 60 分钟， PBS 清 洗 3 次， 每次 10 分钟 ；
③在组织上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液 (S-A/HRP)， 室温孵育 60 分钟， PBS 清洗 3 次， 每次 10 分钟 ；
④ DAB 显色 ：
(1) 制备底物混合液 ： 在 1ml pH 值＝ 7.0 的双蒸水中， 加入一滴试剂 A， 混合均匀 后， 将试剂 B 和试剂 C 各一滴加入其中， 混合均匀得底物混合液 ；
(2) 显色 ： 将 150μl 底物混合液滴加在组织上， 室温显色 3 ～ 10 分钟， 充分显色 后自来水冲洗终止反应 ；
⑤染色、 脱水、 透明、 封片 ： 将组织切片浸入苏木精染液 2 次， 每次 2 秒 ； 然后用蒸 馏水处理 3 次， 每次 5 分钟 ； 再依次以 50％乙醇、 70％乙醇、 90％乙醇各处理 1 次， 每次 1 分 钟； 再以无水乙醇处理 2 次， 每次 2 分钟， 二甲苯与无水乙醇 1 ∶ 1 混合物处理 1 次， 2 分钟， 100％二甲苯处理 2 次， 每次 2 分钟 ； 最后用树胶封片， 保存 ； ⑥根据样品染色情况判定对原发化疗药物的敏感性 ： 呈褐色阳性反应的样品判定 为对原发化疗药物敏感的卵巢癌组织 ； 呈兰色阴性反应的样品判定为对原发化疗药物耐受 的卵巢癌组织。
III. 结果分析及用药指导方案的确定
根据步骤 II 的检测结果， 可以初步判定阳性反应的卵巢癌组织的来源患者对术 后原发化疗药物治疗敏感几率高 ； 阴性反应的卵巢癌组织的来源患者对术后原发化疗药物 治疗耐受几率高。对于后者， 需要根据患者生理病理特性及其临床症状表现来确定合适的 术后化疗方案。
本发明的上述所有方法中所述及的原发化疗药物是指用于卵巢癌术后病人在实 施化疗的首期化疗药物， 临床实践中这类药物包括铂类、 紫杉醇或二者的组合。
本发明的上述技术方案中所述及的卵巢癌或肿瘤是指浆液性卵巢癌晚期。
本申请的发明人发现了肿瘤细胞、 尤其是浆液性卵巢癌细胞 / 组织中 ERCC2 的表 达量与细胞、 组织或作为宿主的肿瘤患者对原发化疗药物敏感性之间的关联性。尽管现有 技术中已有关于 ERCC2 免疫组化检测方法的记载， 但上述的二者之间的确定关系是现有技 术中所不曾公开的、 也未曾有过任何技术启示。 基于此发现， 本申请提供一系列用于判断原 发化疗药物耐受性的方法， 以及相关的试剂组合。这些方法可以应用于多种样本， 冰冻组 织、 石蜡包埋组织、 新鲜离体组织等， 可提供多层次的检测信息， 可为卵巢癌的研究提供支 持， 也为临床诊断和指导用药提供可依赖的检测指标。 本发明所述的方法简单准确， 对样品 的要求不高， 可用于大规模筛查或追溯性研究。 用于临床诊断和用药指导时， 采集手术后病 人的离体癌症组织进行检测， 无创、 无痛、 无侵入性的检测， 病人极易接受。 并且结果直观易 见、 快速灵敏， 经济实用。合理地应用于临床用药的选择还有助于延长病人的生命， 缓解病 人的化疗痛苦， 改善病人术后生活质量。
附图说明本发明附图 4 幅 ：
图 1 本发明实施例 1 待检测组织染色结果示例， 其中 a， e ＝ 100× ； b， f ＝ 200× ； c， g ＝ 400× ； d， h ＝ 1000× ；
是 ERCC2 在晚期浆液性卵巢癌术后耐药与敏感的首期化疗病人的表达情况图 ： 化 疗敏感病人的癌组织上皮呈现黄褐色阳性反应 ( 箭头所示 ) ； 化疗耐药病人的癌组织上皮 呈现兰色阴性反应 ( 箭头所示 )。CR ＝化疗敏感病人 ； IR ＝化疗耐药病人 ； 放大倍数 ： a， e ＝ 100X ； b， f ＝ 200X ； c， g ＝ 400X ； d， h ＝ 1000X ；
图 2 和图 3 是实施例 2 中卵巢癌敏感细胞 OV2008 与卵巢癌耐药细胞 C13 中 ERCC2 的蛋白表达量的凝胶电泳图及统计分析结果。
图 4 是实施例 2 中卵巢癌敏感细胞 OV2008 与卵巢癌耐药细胞 C13 的免疫荧光检 测 (b， e) 和免疫组化反应 (c， f) 检测结果图。 具体实施方式
如无特殊说明， 本发明中所述的溶剂配制方法为 ：
0.01M 柠檬酸盐缓冲液 ： 将 0.885g 柠檬酸盐溶入 300ml 蒸馏水中， 加 94.5μl 冰醋酸调 pH 值至 6.0 ； 其中， 柠檬酸盐购自天津市科密欧化学试剂有限公司， 产品批号 ： 20070621 ； 磷酸缓冲液 (PBS) ： 将 8g 氯化钠， 0.2g 氯化钾， 3.62g 磷酸氢二钠 (12H2O) 及 0.24g 磷酸二氢钾溶入 800ml 蒸馏水中， 稀盐酸调 pH 值至 7.4， 定容 1L ；
封闭缓冲液 ： 5％山羊血清， 1％牛血清蛋白， pH 7.4 磷酸缓冲液， 0.01％聚乙二醇 辛基苯基醚 (tirtonX-100) ；
5％山羊血清购自美国 ZYMED 公司， 1091950 ；
1％ BSA 购自美国 ROCHE， 10735078001 ；
0.01％聚乙二醇辛基苯基醚 (tirtonX-100) 购自美国 ROCHE， 0694 ；
ERCC2 一抗购自美国 Protein Tech Group， Inc.， 10818-AP ；
生物素化二抗工作液、 辣根酶标记链霉卵白素工作液、 试剂 A( 浓缩缓冲液 20x)、 试剂 B( 浓缩 DAB 缓冲液 20x) 和试剂 C( 浓缩过氧化氢缓冲液 20x) 均来源于免疫组化试剂 盒， 购自美国 ZYMED 公司， SP-9000 ；
聚乙二醇辛基苯基醚 (Triton-X 100) 购自 Amersco， Cat#0694 ；
牛血清蛋白 (BSA) 购自 Roche， Cat#10735078001 ；
其它药品或试剂均为分析纯级。
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明， 但不以 任何方式限制本发明。
实施例 1
I. 标本采集
采集 71 例由大连市妇产医院病理科保存的浆液性卵巢癌组织石蜡样本， 这些样 本源自在该医院进行根治性切除手术浆液性卵巢癌病人， 样本保存前经临床常规组织处 理： 即 10％福尔马林固定， 石蜡包埋， 室温保存。
II. 样本预处理， 包括如下步骤 ：
a. 脱蜡 ： 卵巢癌福尔马林固定石蜡包埋组织常规切片， 厚度 4 ～ 5μm 的石蜡组织 切片依次经过 100％二甲苯脱蜡 3 次， 每次 5 分钟 ； 无水乙醇脱蜡 3 次， 每次 2 分钟 ； 95％乙 醇、 90％乙醇、 70％乙醇、 50％乙醇各脱蜡 1 次， 2 分钟 ；
b. 抗原修复 ： 以 0.01M 柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复， 然后以 PBS 清洗 3 次， 每次 5 分钟 ；
c. 消除内源性过氧化物酶 ： 将组织切片置于 3％过氧化氢中， 室温孵育 30 分钟， 用 PBS 清洗 3 次， 每次 5 分钟。
III. 免疫组化检测
①封闭 ： 在待处理样品的组织上加 200μl 封闭液， 室温孵育 60 分钟 ；
②抗原抗体反应 ：
(1) 一抗孵育 ： 在组织上加 150μl 按照 1 ∶ 100 比例稀释的 ERCC2 抗体， 以封口 膜覆盖组织， 于 4℃孵育过夜， 然后以 PBS 清洗 3 次， 每次 10 分钟 ；
设阴性对照组， 用同体积封闭液代替 ERCC2 抗体。
(2) 二抗孵育 ： 在组织上加 150μl 生物素化二抗工作液， 室温孵育 60 分钟， PBS 清 洗 3 次， 每次 10 分钟 ；
③在组织上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液 (S-A/HRP)， 室温孵育 60 分钟， PBS 清洗 3 次， 每次 10 分钟 ；
④ DAB 显色 ：
(1) 制备底物混合液 ： 在 1ml pH 值＝ 7.0 的双蒸水中， 加入一滴试剂 A， 混合均匀 后， 将试剂 B 和试剂 C 各一滴加入其中， 混合均匀得底物混合液 ；
(2) 显色 ： 将 150μl 底物混合液滴加在组织上， 室温显色 3 ～ 10 分钟， 充分显色 后自来水冲洗终止反应 ；
⑤染色、 脱水、 透明、 封片 ： 将组织切片浸入苏木精染液 2 次， 每次 2 秒 ； 然后用蒸 馏水处理 3 次， 每次 5 分钟 ； 再依次以 50％乙醇、 70％乙醇、 90％乙醇各处理 1 次， 每次 1 分 钟； 再以无水乙醇处理 2 次， 每次 2 分钟， 二甲苯与无水乙醇 1 ∶ 1 混合物处理 1 次， 2 分钟， 100％二甲苯处理 2 次， 每次 2 分钟 ； 最后用树胶封片， 保存 ；
IV. 根据样品染色情况判定对原发化疗药物的敏感性 ： 呈褐色阳性反应 ( 即 IHC 染色阳性 ) 的样品判定为对原发化疗药物敏感的卵巢癌组织， 呈兰色阴性反应 ( 即 IHC 染 色阴性 ) 的样品判定为对原发化疗药物耐受的卵巢癌组织。附图 1a ～ d 是具有典型阳性 反应的组织染色结果照片， 可见组织上皮呈现明显黄褐色 ； 附图 1e ～ h 是具有典型阴性反 应的组织染色结果照片， 可见组织上皮呈现明显蓝色。
将根据常规临床诊治指标所得判断结果与 IHC 染色结果对照， 统计分析本发明方 法的有效性， 如 V。
V. 检测结果及分析 ：
根据卵巢癌病人化疗预后的常规临床诊治指标， 71 例病人样品中， 44 例样品判定 为原发化疗药物敏感型， 27 例判定为对原发化疗药物耐受型。判定具体方法如下 ：
对上述 71 例样品来源的肿瘤患者进行信息统计， 根据患者术后 6 个月时血清 CA125 的检测水平， 结合化疗随访的情况， 比如是否 6 个月内还有新的肿物出现， 肿物直径 大小， 是否存在持续性腹胀、 腹痛、 食欲不振、 消瘦、 乏力等显示病程仍在进展的临床症状，将病人分为两类 ：
①化疗敏感型 ： 所有可预测和评估的疾病症状消失， 或者病人化疗 6 个月内 CA125 3 检测水平低于＜ 30U/ml)， 新的肿物小于 3cm 。
②化疗耐药型 ： 6 个月化疗后， CA125 检测仍然高于 30U/ml， 并且伴有显示病程仍 3 在进展的临床症状， 新的肿物大于 3cm 。
上述常规临床指标判断为化疗敏感型的 44 例样品中， 34 例 ( 占检测标本的 73.3％ ) 样品判定为 IHC 染色阳性 ( 对原发化疗药物敏感 )， 11 例 ( 占检测标本的 26.7％ ) 显示 IHC 染色阴性。
上述常规临床指标判断为化疗耐受型的 27 例样品中， 19 例 ( 占检测标本的 70.4％ ) 样品判定为 IHC 染色阴性 ( 对原发化疗药物耐受 )， 8 例 ( 占检测标本的 29.6％ ) 显示 IHC 染色阳性。
经过统计分析表明， IHC 染色判断的结果与对照方法判断结果无显著性差异， 说明 以本发明的方法， 即上述的 IHC 染色方法可以对卵巢癌肿瘤患者进行准确的原发化疗药物 耐药 / 敏感的分型。
实施例 2 利用美国 NCI(National Cancer Institute) 公认的卵巢癌病人原发化疗敏感细 胞 (OV2008) 和耐药细胞 (C13)(Yamamoto K， 等： Heat shock protein 27wasup-regulated in cisplatin resistant human ovarian tumor cell line and associated with the cisplatin resistance.Cancer Lett.2001， 168 ： 173-181 ； Xu G， 等： Nodal Induces Apoptosis and Inhibits Proliferation in Human Epithelial Ovarian Cancer Cells via Activin Receptor-Like Kinase 7.The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 2004.89(11) ： 5523-5534)， 采用免疫荧光检测 (immunofluorescence IF)， 免 疫组织化学反应 (IHC) 以及 Western Blotting 改良法 (Lee B 等 .Perlecan domain V is neuroprotective and proangiogenic following ischemic stroke in rodents.J Clin Invest.2011Jul 11.pii ： 46358.doi ： 10.1172/JCI46358)， 验证了 ERCC2 在卵巢癌病人原 发化疗敏感细胞 (OV2008) 和耐药细胞 (C13) 中的不同表达， 和 ERCC2 蛋白含量在敏感细胞 中比耐药细胞高 2.49 倍。获得了 ERCC2 在化疗敏感和耐药病人切片中完全一致的结果。
I. 标本采集
采集国际妇科肿瘤界认可的卵巢癌原发化疗敏感细胞 OV2008 和卵巢癌原发化疗 耐药细胞 C13。 OV2008 细胞源于上皮浆液性卵巢癌病人 (Andrews et al， Cancer Res 1985， 45(12 Pt 1) ： 6250-6253 ； Andrews et al ： Cancer Chemother Pharmacol 1987， 19(2) ： 149-154)， 而 OV2008/C13 化疗敏感和耐药细胞源自 OV2008 细胞上百次的 1uM 顺铂的体外 多个月的培养和筛选 (Andrews et al， Cancer Res 1985， 45(12Pt 1) ： 6250-6253)， 这些细 胞获赠于加拿大 Chun Peng 博士 (York University， Toronto Canada)， 细胞保存前常规体 外细胞处理 ： 即细胞培养， 蛋白提纯， -20℃保存。
II. 样本预处理， 包括如下步骤 ：
①细胞培养 ：
(1) 取前一天换液的一瓶细胞， 用 0.25 的胰酶消化， 镜下观察细胞变圆后， 加入含 10％胎牛血清的 1640 培养基 1ml 终止胰酶的作用， 并用毛细滴管吹打， 将细胞制成悬液 ；
(2) 取少量细胞用 0.4％的胎盘蓝计数， 然后将细胞悬液稀释成 2×104 个细胞 /ml ； (3) 将稀释好的细胞悬液接种于 6 孔板中， 每孔 2ml ；
(4) 置入 37℃ 5％ CO2 孵箱中培养 48 小时。
②蛋白提纯 ：
(1) 细胞数量 ： 6 孔细胞培养板， 每组二个平行孔细胞提取蛋白 ；
(2) 细胞裂解 ： 以 50mM Tris-HCL PH6.8， 2％ SDS， 10％甘油， 1mM PMSF( 现用现加 ) 裂解液， 每孔加 40μl 裂解液冰上充分裂解 10 ～ 30min ；
(3)14000rpm 离心 10min 吸上清 ；
(4)BCA 试剂盒测定蛋白浓度， 并以 30ug 分装于 Ep 管中， -70℃保存。
III.Western Blot 检测
① SDS-PAGE 电泳 ： 5％浓缩胶 100V， 10％分离胶 120V 电泳 ；
②采用 NC 膜， BIO-RAD 转膜仪湿转 200 ～ 250mA 45min ；
③ 5％奶粉室温封闭 1 小时 ；
④抗体孵育 ： 一抗 (ERCC21 ∶ 500， β-actin 1 ∶ 1000)4℃过夜 ； 预冷 PBST( 含 0.5‰ tween-20) 洗 10min×3 ； 二抗 1 ∶ 5000 室温 1h ； 预冷 PBST( 含 0.5‰ tween-20) 洗 10min×3 ；
⑤ ECL 化学发光 ： 发光试剂 A、 B 液等量 (0.125ml/cm2 膜 ) 混合， 加在膜上室温孵育 5min， 5min 后吸去多余液体， 用保鲜膜包好， 放入 X 光暗盒中曝光 ( 曝光时间根据显影后条 带强弱而定 )， 显影液中显出明显条带后， 自来水清洗， 定影液定影 2 ～ 3min， 自来水冲洗， 室温晾干胶片。
⑥凝胶图象分析 ： 将胶片进行数码拍照， 经 Lab works 4.6 软件进行分析处理， 以 内参基因 β-actin 为基准分析各条带的相对密度值。其结果如附图 2.A 和图 2.B 所示 ：
从图 2.A 可以看出 ： 对照标志蛋白 β-actin 在两组细胞中的成像灰度相似， 但卵 巢癌敏感细胞 OV2008 比卵巢癌耐药细胞 C13 的成像灰度强， 厚度宽， 表明 ERCC2 的蛋白含 量在卵巢癌敏感细胞中高于耐药细胞。
应用 Excel 和 SPSS 10.0 软件进行作图及统计分析， 图 2.B 显示分析结果证明 ： ERCC2 的蛋白含量在卵巢癌敏感细胞 (OV2008) 中高于卵巢癌耐药细胞 (C13)2.49 倍。
IV. 免疫荧光检测 ：
①溶剂与配制方法
I抗： ERCC2(ProteinTech， Catalog No ： 101818-1-AP)
荧光 II 抗 ： FITC 标记山羊抗兔 IgG( 中杉金桥， Catalog No ： ZF-0311)
OLYMPUS 倒置相差荧光显微镜 ( 日本， OLYMPUS IX71)
②免疫荧光反应
(1) 将 OV2008 和 C13 细胞用 0.25％胰酶消化， 稀释成 2×104 个 /ml 接种于六孔 板， 每孔 2ml 细胞悬液 ；
(2) 待细胞 24 小时贴壁后， 用 4％ PFA( 多聚甲醛 ) 固定 10 分钟 ；
(3)PBS 洗 5min×3 ；
(4) 封闭液 ( 含 10％羊血清、 30％血清白蛋白 ) 封闭 1h ；
(5) 封闭液配制的 I 抗 (ERCC21 ∶ 150 ； ProteinTech， Catalog No ： 101818-1-AP)4 度孵育过夜 ；
(6)PBS 洗 5min×3 ；
(7)FITC 标记 II 抗 [1 ∶ 50 ； FITC 标记山羊抗兔 IgG( 中杉金桥， Catalog No ： ZF-0311)] 避光孵育 1h ；
(8)PBS 洗 5min×3 ；
(9)OLYMPUS 倒置相差荧光显微镜 ( 日本， OLYMPUS IX71) 观察、 摄片。
V. 免疫组织化学检测 ：
①溶剂与配制方法
本方法所述的溶剂配制方法与实施例 1 所述溶剂及其配制方法完全相同。
②免疫组织化学反应
(1) 将 OV2008 和 C13 细胞用 0.25％胰酶消化， 稀释成 2×104 个 /ml 接种于六孔 板， 每孔 2ml 细胞悬液 ；
(2) 待细胞 24 小时贴壁后， 用 4％ PFA( 多聚甲醛 ) 固定 10 分钟 ；
(3)PBS 洗 5min×3 ； (4) 封闭液 ( 含 10％羊血清、 30％血清白蛋白 ) 封闭 1h ；
(5) 抗原抗体反应 ：
i. 一抗孵育 ： 在培养的细胞上加 150μl 按照 1 ∶ 100 比例稀释的 ERCC2 抗体， 于 4℃孵育过夜， 然后以 PBS 清洗 3 次， 每次 10 分钟 ；
ii 二抗孵育 ： 在培养的细胞上加 150μl 生物素化二抗工作液， 室温孵育 60 分钟， PBS 清洗 3 次， 每次 10 分钟 ；
(6) 在细胞上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液 (S-A/HRP)， 室温孵育 60 分钟， PBS 清洗 3 次， 每次 10 分钟 ；
(7)DAB 显色 ：
i. 制备底物混合液 ： 在 1ml pH 值＝ 7.0 的双蒸水中， 加入一滴试剂 A， 混合均匀 后， 将试剂 B 和试剂 C 各一滴加入其中， 混合均匀得底物混合液 ；
ii 显色 ： 将 150μl 底物混合液滴加在细胞上， 室温显色 3 ～ 10 分钟， 充分显色后 自来水冲洗终止反应 ；
(8) 染色、 脱水、 透明、 封片 ： 将组织切片浸入苏木精染液 2 次， 每次 2 秒 ； 然后用蒸 馏水处理 3 次， 每次 5 分钟 ； 再依次以 50％乙醇、 70％乙醇、 90％乙醇各处理 1 次， 每次 1 分 钟； 再以无水乙醇处理 2 次， 每次 2 分钟， 二甲苯与无水乙醇 1 ∶ 1 混合物处理 1 次， 2 分钟， 100％二甲苯处理 2 次， 每次 2 分钟 ； 最后用树胶封片， 保存 ；
(9)OLYMPUS 倒置相差荧光显微镜观察、 摄片 ；
(10) 免疫荧光与免疫组织化学检测结果 ( 如附图 4 所示 )
图 4-a， d 是未经任何染色的卵巢癌培养细胞 ； 图 4-b， e 是经免疫组织化学荧光染 色的卵巢癌培养细胞， 显示 ： ERCC2 在原发化疗敏感细胞 (OV2008) 的表达明显增强， 呈强绿 色， 而在原发化疗耐药细胞 (C13) 的表达很弱， 呈暗绿色。图 4-c， f 是经免疫组织化学染色 的卵巢癌培养细胞， 显示 ： ERCC2 在原发化疗敏感细胞 (OV2008) 的表达呈深褐色， 明显强于 在原发化疗耐药细胞 (C13) 的表达， 呈浅褐色。此结果与 ERCC2 在化疗敏感和耐药病人切
片中所获结果完全一致。