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1、(10)申请公布号 CN 104262307 A (43)申请公布日 2015.01.07 CN 104262307 A (21)申请号 201410417861.X (22)申请日 2014.08.22 C07D 309/32(2006.01) C07C 59/11(2006.01) C07C 51/42(2006.01) (71)申请人 海南医学院 地址 571199 海南省海口市学院路 3 号 (72)发明人 董琳 刘明生 张小坡 (74)专利代理机构 沈阳晨创科技专利代理有限 责任公司 21001 代理人 张晨 (54) 发明名称 一类 3,4- 裂环半日花烷型二萜类化合物、 其 制备。
2、方法及应用 (57) 摘要 一类 3,4- 裂环半日花烷型二萜类化合物、 其 制备方法及应用， 该化合物的结构如式、 所 示 ：该化合物 用于制备抑制炎症， 预防和 / 或治疗妇科炎症、 急 性传染性肝炎的药物或保健品。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书7页 附图5页 (10)申请公布号 CN 104262307 A CN 104262307 A 1/2 页 2 1. 一类 3,4- 裂环半日花烷型二萜类化合物， 其特征在于 ： 该化合物的结构如式、 所示 ： 2. 权利。
3、要求 1 所述 3,4- 裂环半日花烷型二萜类化合物的制备方法， 其特征在于 ： 其具 体步骤如下 ： (1) 水回流提取裸花紫珠， 浓缩提取液， 得到浸膏 ； 将所得的浸膏悬浮于水中， 用氯仿 萃取， 得到氯仿萃取物 ； 取氯仿萃取物上样至硅胶色谱柱， 用石油醚和丙酮混合溶液进行梯 度洗脱， 按照所使用的不同梯度的洗脱液收集流份 ； (2) 将步骤 (1) 中石油醚和丙酮体积比为 100 ： 15 得到的流份上样至硅胶色谱柱上， 然 后用石油醚和二氯甲烷体积比为 (100 ： 100:100) 的混合溶液进行梯度洗脱， 将石油醚和 二氯甲烷体积比为 1:1 洗脱下来的流份经半制备 HPLC 。
4、分离， 用甲醇和水体积比为 71:29 的 混合溶液进行洗脱， 得到化合物 ； (3) 将步骤 (1) 中石油醚和丙酮体积比为 100 ： 20 得到的流份上样至 ODS 色谱柱上， 用 甲醇和水混合溶液进行梯度洗脱， 按照所使用的不同梯度的洗脱液收集流份 ； (4) 将步骤 (3) 中使用甲醇和水体积比为 40 ： 60 得到的流份经半制备 HPLC 分离， 用乙 腈-水(61:39)洗脱， 洗脱下来的流份再经半制备HPLC分离， 用甲醇-0.4甲酸水(64:36) 进行洗脱， 得到化合物。 3. 权利要求 1 所述 3,4- 裂环半日花烷型二萜类化合物的制备方法， 其特征在于 ： 其具 体。
5、步骤如下 ： (1) 水回流提取裸花紫珠， 浓缩提取液， 提取液经 HPD100 大孔树脂吸附色谱柱分离， 依 次用 H2O、 不同浓度梯度的乙醇溶液洗脱， 收集 90乙醇洗脱部分上硅胶柱色谱， 用石油醚 和丙酮混合溶液进行梯度洗脱， 按照所使用的不同梯度的洗脱液收集流份 ； (2) 将步骤 (1) 中石油醚和丙酮体积比为 100 ： 12 得到的流份上样至硅胶色谱柱上， 然 后用石油醚和二氯甲烷体积比为 (100 ： 100:100) 的混合溶液进行梯度洗脱， 将石油醚和 二氯甲烷体积比为 1:1 洗脱下来的流份经半制备 HPLC 分离， 用甲醇和水体积比为 71:29 的 混合溶液为进行洗。
6、脱， 得到化合物 ； (3) 将步骤 (1) 中石油醚和丙酮体积比为 100 ： 15 得到的流份上样至 ODS 色谱柱上， 用 甲醇和水混合溶液进行梯度洗脱， 按照所使用的不同梯度的洗脱液收集流份 ； 权 利 要 求 书 CN 104262307 A 2 2/2 页 3 (4) 将步骤 (3) 中使用甲醇和水积比为 40 ： 60 得到的流份经半制备 HPLC 分离， 用乙 腈-水(61:39)洗脱， 洗脱下来的流份再经半制备HPLC分离， 用甲醇-0.4甲酸水(64:36) 进行洗脱， 得到化合物。 4.按照权利要求2或3所述3,4-裂环半日花烷型二萜类化合物的制备方法， 其特征在 于 ：。
7、 所述步骤(1)中石油醚和丙酮混合溶液的体积比例依次为200 ： 1、 100:1、 100:2、 100:3、 100:4、 100:5、 100:8、 100:10、 100:12、 100:15、 100:20、 100 ： 25、 100 ： 30、 100 ： 40、 100 ： 50、 100 ： 100、 0 ： 100。 5.按照权利要求2或3所述3,4-裂环半日花烷型二萜类化合物的制备方法， 其特征在 于 ： 所述步骤 (1) 中溶剂水的加入量与裸花紫珠质量的配比为 (8-15)L ： 1kg。 6. 按照权利要求 3 所述 3,4- 裂环半日花烷型二萜类化合物的制备方法， 。
8、其特征在于 ： 所述步骤 (1) 中不同浓度梯度的乙醇溶液体积比为 30、 60、 90。 7. 一种用于抗炎的组合物， 其含有至少一种权利要求 1 的化合物。 8. 权利要求 1 所述化合物的应用， 其特征在于 ： 该化合物用于制备抑制炎症， 预防和 / 或治疗妇科炎症、 急性传染性肝炎的药物或保健品。 权 利 要 求 书 CN 104262307 A 3 1/7 页 4 一类 3,4- 裂环半日花烷型二萜类化合物、 其制备方法及应 用 技术领域 0001 本发明属于生物化学医药领域， 涉及一类 3,4- 裂环半日花烷型二萜类化合物、 其 制备方法及应用。 背景技术 0002 炎症是具有血管。
9、系统的机体对损伤因子所发生的复杂的防御反应。 外源性和内源 性损伤因子可引起机体细胞和组织各种各样的损伤性变化 , 与此同时机体局部和全身也 发生的一系列复杂的反应 , 以局限和消灭损伤因子 , 清除和吸收坏死组织和细胞 , 并修复 损伤 , 这种综合的机体防御反应称为炎症。 0003 一氧化氮 (NO) 是具有生物活性的气体分子， 是细胞间信息传递的重要调节因子， 并有介导细胞免疫和炎症毒性的功能。NO 的过量生成与炎症密切相关， 在急性炎症部位 , 致炎物质和炎症介质可诱导或增加 NO 的合成和释放， NO 本身具有细胞毒性 , 还能与游离 基团反应生成如 ONOO- 等的分子， 导致毒性。
10、增加， 从而促进炎症部位渗出和水肿。体外实验 常通过考察被测物对 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞释放 NO 的影响反应其抗炎活性。 0004 裸花紫珠 Callicarpa nudiflora Hook.Et Arn. 为马鞭草科紫珠属植物， 黎药名 为补阀， 主产于海南、 广东和广西， 枝叶可入药， 是海南黎族地区常用药之一， 有抗菌止血、 消炎解毒、 散瘀消肿、 驱风祛湿之功效， 主治化脓性炎症、 急性传染性肝炎、 呼吸道及消化道 出血、 创伤出血等症， 外用治烧、 烫伤及外伤出血等。其成药裸花紫珠片是海南省著名的黎 药品种之一， 临床上用于治疗各种炎症和出血等， 具有疗效确切和毒。
11、副作用小等特点 ； 并被 列为国家中药保护品种。但是其中的活性成分尚未明确。因此在制药领域中需要知道该药 的活性成分， 从而对急性传染性肝炎及妇科炎症等的治疗研究产生积极的推动作用。 发明内容 0005 为解决上述问题， 本发明的目的是提供一类 3,4- 裂环半日花烷型二萜类化合物、 其制备方法及应用， 该类化合物为新化合物。 0006 本发明提供了一类 3,4- 裂环半日花烷型二萜类化合物， 该化合物的结构如式、 所示 ： 0007 说 明 书 CN 104262307 A 4 2/7 页 5 0008 本发明还提供了 3,4- 裂环半日花烷型二萜类化合物的制备方法之一， 其具体步 骤如下 。
12、： 0009 (1) 水回流提取裸花紫珠， 浓缩提取液， 得到浸膏 ； 将所得的浸膏悬浮于水中， 用 氯仿萃取， 得到氯仿萃取物 ； 取氯仿萃取物上样至硅胶色谱柱， 用石油醚和丙酮混合溶液进 行梯度洗脱， 按照所使用的不同梯度的洗脱液收集流份 ； 0010 (2) 将步骤 (1) 中石油醚和丙酮体积比为 100 ： 15 得到的流份上样至硅胶色谱柱 上， 然后用石油醚和二氯甲烷体积比为 (100 ： 100:100) 的混合溶液进行梯度洗脱， 将石 油醚和二氯甲烷体积比为 1:1 洗脱下来的流份经半制备 HPLC 分离， 用甲醇和水体积比为 71:29 的混合溶液进行洗脱， 得到化合物 ； 0。
13、011 (3) 将步骤 (1) 中石油醚和丙酮体积比为 100 ： 20 得到的流份上样至 ODS 色谱柱 上， 用甲醇和水混合溶液进行梯度洗脱， 按照所使用的不同梯度的洗脱液收集流份 ； 0012 (4) 将步骤 (3) 中使用甲醇和水积比为 40 ： 60 得到的流份经半制备 HPLC 分离， 用乙腈 - 水 (61:39) 洗脱， 洗脱下来的流份再经半制备 HPLC 分离， 用甲醇 -0.4甲酸水 (64:36) 进行洗脱， 得到化合物。 0013 本发明还提供了 3,4- 裂环半日花烷型二萜类化合物的制备方法之二， 其具体步 骤如下 ： 0014 (1) 水回流提取裸花紫珠， 浓缩提取。
14、液， 提取液经 HPD100 大孔树脂吸附色谱柱分 离， 依次用 H2O、 不同浓度梯度的乙醇溶液洗脱， 收集 90乙醇洗脱部分上硅胶柱色谱， 用石 油醚和丙酮混合溶液进行梯度洗脱， 按照所使用的不同梯度的洗脱液收集流份 ； 0015 (2) 将步骤 (1) 中石油醚和丙酮体积比为 100 ： 12 得到的流份上样至硅胶色谱柱 上， 然后用石油醚和二氯甲烷体积比为 (100 ： 100:100) 的混合溶液进行梯度洗脱， 将石 油醚和二氯甲烷体积比为 1:1 洗脱下来的流份经半制备 HPLC 分离， 用甲醇和水体积比为 71:29 的混合溶液为进行洗脱， 得到化合物 ； 0016 (3) 将步。
15、骤 (1) 中石油醚和丙酮体积比为 100 ： 15 得到的流份上样至 ODS 色谱柱 上， 用甲醇和水混合溶液进行梯度洗脱， 按照所使用的不同梯度的洗脱液收集流份 ； 0017 (4) 将步骤 (3) 中使用甲醇和水积比为 40 ： 60 得到的流份经半制备 HPLC 分离， 用乙腈 - 水 (61:39) 洗脱， 洗脱下来的流份再经半制备 HPLC 分离， 用甲醇 -0.4甲酸水 (64:36) 进行洗脱， 得到化合物。 说 明 书 CN 104262307 A 5 3/7 页 6 0018 本发明提供的 3,4- 裂环半日花烷型二萜类化合物的制备方法之一和之二， 所述 步骤 (1) 中石。
16、油醚和丙酮混合溶液的体积比例依次为 200 ： 1、 100:1、 100:2、 100:3、 100:4、 100:5、 100:8、 100:10、 100:12、 100:15、 100:20、 100 ： 25、 100 ： 30、 100 ： 40、 100 ： 50、 100 ： 100、 0 ： 100。 0019 本发明提供的 3,4- 裂环半日花烷型二萜类化合物的制备方法之一和之二， 所述 步骤 (1) 中溶剂水的加入量与裸花紫珠质量的配比为 (8-15)L ： 1kg。 0020 本发明提供的 3,4- 裂环半日花烷型二萜类化合物的制备方法之二， 所述步骤 (1) 中不同浓。
17、度梯度的乙醇溶液体积比为 30、 60、 90。 0021 本发明还提供了一种用于抗炎的组合物， 其含有至少一种本发明的化合物。 0022 本发明提供的化合物的应用， 该化合物用于制备抑制炎症， 预防和 / 或治疗妇科 炎症、 急性传染性肝炎的药物或保健品。 0023 本发明中治疗妇科炎症、 急性传染性肝炎的药物均可通过注射、 喷射、 滴鼻、 滴眼、 渗透、 吸收、 物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、 皮内、 皮下、 静脉、 粘膜组织 ； 或是被其 他物质混合或包裹后导入机体。 0024 需要的时候 , 在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载 体包括药学领域常规的稀释剂、。
18、 赋形剂、 填充剂、 粘合剂、 湿润剂、 崩解剂、 吸收促进剂、 表面 活性剂、 吸附载体、 润滑剂等。 0025 上述药物可以制成注射液、 片剂、 粉剂、 颗粒剂、 胶囊、 口服液、 膏剂、 霜剂等多种形 式。以上各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。 0026 本发明的优点 ： 本发明的发明人从临床疗效确切和毒副作用小的传统黎药裸花 紫珠中分离得到式、 一类新的 3,4- 裂环半日花烷型二萜类化合物， 并经过药理实验证 明 : 此类化合物具有显著的抑制炎症的活性 , 可用于制备预防和 / 或治疗妇科炎症、 急性 传染性肝炎的药物或保健品。因此其具有较高的临床应用价值和开发前景。 。
19、附图说明 0027 图 1 化合物的结构图 ； 0028 图 2 化合物的结构图 ； 0029 图 3 化合物的 1H-NMR 谱图 ； 0030 图 4 化合物的 13C-NMR 谱图 ； 0031 图 5 化合物的 1H-NMR 谱图 ； 0032 图 6 化合物的 13C-NMR 谱图。 具体实施方式 0033 下面的实施例将对本发明予以进一步的说明， 但并不因此而限制本发明。 0034 下述实施例中所述实验方法 , 如无特殊说明 , 均为常规方法 ； 所述试剂和生物材 料 , 如无特殊说明 , 均可从商业途径获得。 0035 实施例 1 本发明化合物、 的提取与鉴定 ( 方法 1) 0。
20、036 将裸花紫珠叶 (12.5kg) 粉碎后用水加热回流提取 3-10 次， 所述溶剂的加入量与 裸花紫珠叶质量的配比为 (8-15)L:1kg ； 每次提取的时间为 3 小时， 减压回收溶剂将提取液 说 明 书 CN 104262307 A 6 4/7 页 7 浓缩， 将提取液合并， 过滤， 减压蒸干水分， 得到浸膏。将浸膏悬浮于 8000ml 蒸馏水中， 用氯 仿萃取 (3 次 )。将所得萃取液合并浓缩， 得到氯仿萃取物约 (50g)。a. 取氯仿萃取物上样 至硅胶色谱柱。使用不同梯度的石油醚 - 丙酮混合溶剂 ( 石油醚 : 丙酮200:1-0:100， v/v) 进行洗脱， 按照所用。
21、不同梯度的洗脱液收集流份。b. 将其中的 ( 石油醚 : 丙酮100 ： 15， v/v) 流份经过薄层色谱硅胶填装的柱色谱进行分离。使用不同梯度的石油醚 - 二氯甲 烷混合溶剂 ( 石油醚 : 二氯甲烷100:10-0:100， v/v) 进行洗脱， 按照所用不同梯度的洗 脱液收集细分流份。c. 将其中的 ( 石油醚 : 二氯甲烷1:1， v/v) 流份经半制备 HPLC 分 离， 用甲醇和水体积比为71:29的混合溶液为流动相(UV:210nm， 流速为2ml/min， 保留时间 为 51min)， 得到化合物。 0037 将步骤a中(石油醚:丙酮100:20， v/v)流份经ODS色谱柱。
22、分离， 用甲醇和水混 合溶液 (10:90-100:0) 进行梯度洗脱， 将甲醇和水体积比为 40:60 洗脱部分经半制备 HPLC 分离， 用乙腈和水体积比为61:39的混合溶液洗脱(UV:203nm， 流速为2ml/min， 保留时间为 20min)， 得到流份再经半制备 HPLC 分离， 用甲醇 - 水 (0.4甲酸 ) 体积比为 (64:36) 的混 合溶液为洗脱 (UV:203nm， 流速为 2ml/min， 保留时间为 44min)， 得到化合物。 0038 实施例 2 本发明化合物、 的提取与鉴定 ( 方法 2) 0039 将裸花紫珠叶 (12.5kg) 粉碎后用水加热回流提取 。
23、3-10 次， 所述溶剂的加入量与 裸花紫珠叶质量的配比为 (8-15)L:1kg ； 每次提取的时间为 3 小时， 减压回收溶剂将提取液 合并浓缩至 8000ml， 经 HPD100 大孔树脂吸附色谱柱分离， 依次用 H2O， 体积分数 30， 体积 分数 60， 体积分数 90乙醇溶液洗脱 ； a. 收集 90乙醇洗脱部分再经硅胶柱色谱纯化 时， 使用不同梯度的石油醚-丙酮混合溶剂(石油醚:丙酮200:1-0:100， v/v)进行洗脱， 按照所用不同梯度的洗脱液收集流份。b. 将其中的 ( 石油醚 : 丙酮100 ： 12， v/v) 流份经 过薄层色谱硅胶填装的柱色谱进行分离。使用不同。
24、梯度的石油醚 - 二氯甲烷混合溶剂 ( 石 油醚 : 二氯甲烷100:10-0:100， v/v) 进行洗脱， 按照所用不同梯度的洗脱液收集细分流 份。c. 将其中的 ( 石油醚 : 二氯甲烷1:1， v/v) 流份经半制备 HPLC 分离， 用甲醇和水体 积比为71:29的混合溶液为流动相(UV:210nm， 流速为2ml/min， 保留时间为51min)， 得到化 合物。 0040 将步骤a中(石油醚:丙酮100:15， v/v)流份经ODS色谱柱分离， 用甲醇和水混 合溶液 (10:90-100:0) 进行梯度洗脱， 将甲醇和水体积比为 40:60 洗脱部分经半制备 HPLC 分离， 用。
25、乙腈和水体积比为61:39的混合溶液为流动相(UV:210nm， 流速为2ml/min， 保留时 间为 20min)， 得到流份再经半制备 HPLC 分离， 用甲醇 - 水 (0.4甲酸 ) 体积比为 (64:36) 的混合溶液为流动相 (UV:210nm， 流速为 2ml/min， 保留时间为 44min)， 得到化合物。 0041 实施例 3 本发明化合物、 的表征 0042 经过测试化合物和的理化性质、 波谱数据， 确定了其结构(见图1和图2)。 化 合物和的核磁数据见表 1( 见图 3- 图 6)， 高分辨质谱数据见表 2。 0043 表 1 化合物和的核磁数据 a 0044 说 明 。
26、书 CN 104262307 A 7 5/7 页 8 0045 a.1H-NMR 测试条件为 600MHz， 化合物的打谱试剂为 CD3OD， 化合物的打谱试剂 为 Pyr-d ； 13C-NMR 测试条件为 150MHz， 化合物的打谱试剂为 CD 3OD， 化合物的打谱试剂 为 Pyr-d。 0046 表 2 化合物和的高分辨质谱数据 0047 样品名称质谱仪电离模式实测值理论值分子式 化合物HR-ESI-MSM+Na+355.1880355.1988C20H28O4 化合物HR-ESI-MSM-H265.1793265.1804C16H26O3 0048 实施例 4 本发明化合物和对 L。
27、PS 诱导的 RAW264.7 细胞释放 NO 的抑制作用 说 明 书 CN 104262307 A 8 6/7 页 9 0049 一氧化氮是一种可溶性气体， 是重要的炎症介质， 涉及炎症免疫多个方面。 内毒素 诱导的 RAW26417 小鼠巨噬细胞模型 , 被广泛用于研究炎症反应。巨噬细胞在外部细菌毒 素如脂多糖 (LPS) 等刺激时 , 可促使炎症介质如 NO 等的分泌。因此本实施例通过体外活 性测试， 对本发明的两个化合物对 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞释放 NO 的抑制作用进行评价， 考察其抗炎作用。 0050 1、 实验材料 0051 RAW264.7 小鼠单核巨噬细胞株，。
28、 购于中国医学科学院基础医学研究所基础医学细 胞。胎牛血清、 胰蛋白酶、 DMEM( 高糖 ) 干粉培养基均购自 CLARK 公司 ； 青霉素购自华北制 药有限公司 ( 批号 ： Y0905314) ； 链霉素购自大连美罗制药有限公司 ( 批号 ： 65081211) ； 二 甲基亚砜 (DMSO) 购自科密欧试剂有限公司 ； 甲基噻唑蓝 (MTT) 购自 Amresco 公司 ； 脂多糖 (LPS) 购自美国 Sigma 公司 ； N-1- 萘乙二胺盐酸盐购自天津纵横兴有限责任公司化工试剂 分公司 ； 磺胺购自天津博迪化工有限责任公司 ； 磷酸购自山东禹王实业有限公司化工分公 司。 0052。
29、 2、 实验仪器 0053 CO2培养箱(SANYO MCO-17AIC， 日本) ； 超净工作台(苏净SW-CJ-1FD， 苏州) ； 倒置 生物显微镜 ( 重庆广电 XDS-1B， 重庆 ) ； 分析天平 ( 奥豪斯 CPJ603 上海 ) ； 立式压力蒸汽灭 菌锅 ( 申安 LDZX-30FBS 上海 ) ； 低温冰箱 ( 中科美菱， 合肥 ) ； 立式压力蒸汽灭菌器 ( 申安 LDZX-30FBS， 上海) ； 液氮生物容器(航天新光YDS-30-80， 沈阳) ； 酶标仪(Thermo Fisher， 美国 ) ； 台式低速离心机 ( 飞鸽 TDL-40B， 上海安亭 ) ； 微量震。
30、荡仪 ( 宇力， 江苏 ) ； 涡旋混合 器 ( 新康 XK96-B， 江苏 ) ； 集热式恒温加热磁力搅拌器 ( 予华 DF-101 河南 )。 0054 3、 实验方法 0055 (1)MTT 法测定细胞存活率 0056 将 100l 对数期生长的 RAW264.7 细胞用含 10胎牛血清的 DMEM 高糖液 体培养基稀释为 1105 个 /ml 密度， 并接种于 96 孔板中， 5 CO2、 37恒温培养过 夜。药物组加入用无血清 DMEM 高糖培养液稀释的化合物溶液， 终浓度为 50M， 阳性药 Z,Z-6,6,7,3-Diligustilide终浓度为50M。 模型组与空白对照组加入。
31、等量无 血清培养液。待作用 1h 后， 模型组， 阳性药组与药物组加入 LPS( 终浓度 1g/mL)， 空白组 加入等量蒸馏水， 5 CO2、 37恒温培养 24h 后， 每空加入 10L MTT， 继续培养 4h。完全弃 去上清液， 加入 100L DMSO， 震荡 10min， 于 570nm 波长处测定吸光度 ( 结果见表 3)。 0057 (2) 对 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞释放 NO 的影响 0058 将 100l 对数期生长的 RAW264.7 细胞用含 10胎牛血清的 DMEM 高糖液体 培养基稀释为 1105 个 /ml 密度， 并接种于 96 孔板中， 5 C。
32、O2、 37恒温培养过夜。 药物组加入用无血清 DMEM 高糖培养液稀释的各化合物溶液， 终浓度为 50M， 阳性药 Z,Z-6,6,7,3-Diligustilide终浓度为50M。 模型组与空白对照组加入等量无 血清培养液。待作用 1h 后， 模型组， 阳性药组与药物组加入 LPS( 终浓度 1g/mL)， 空白组 加入等量蒸馏水， 5 CO2、 37恒温培养 24h 后， Griess 法测定上清中 NO2-的含量， 用以反 映 NO 水平。并利用 NO 标准曲线计算出 NO 的浓度， 实验重复 3 次。( 结果见表 3)(3) 数据 处理 ： 使用SPSS13.0统计软件进行数据处理，。
33、 实验数据采用xs表示， 用t-test进行显著 性检验。NO 含量标准曲线 ： Y 0.0011X+0.0314(X 为 OD 均值 ) 说 明 书 CN 104262307 A 9 7/7 页 10 0059 4、 实验结果 0060 结果表明， 与LPS模型组相比， 化合物和在50M时可以显著抑制一氧化氮的 产生 (P 0.01)， 实验结果见表 3。 0061 表 3 化合物和对 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞释放 NO 的抑制作用 0062 0063 a p0.01， 与 LPS 模型组相比， 有显著差异 0064 b 阳性对照药 说 明 书 CN 104262307 A 10 1/5 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104262307 A 11 2/5 页 12 图 3 说 明 书 附 图 CN 104262307 A 12 3/5 页 13 图 4 说 明 书 附 图 CN 104262307 A 13 4/5 页 14 图 5 说 明 书 附 图 CN 104262307 A 14 5/5 页 15 图 6 说 明 书 附 图 CN 104262307 A 15 。