用于控制蛾的由PBAN1-33NH2衍生的肽片段及其类似物 本发明是关于由PBAN1-33NH2(PBAN＝信息素生物合成活化神经肽)的氨基酸顺序所衍生的肽片段及其类似物，它们在剂量相似于PBAN 1-33(10-100pmol)的剂量下显示出生物刺激与抑制活性。这些肽片段可作为杀虫剂的设计基础，目的在于阻断由PBAN1-33NH2及其衍生片段所控制的信息素的产生、黑化及其他活性。
所说的发明进一步涉及及一种用于控制成年雌蛾和昆虫的方法，该方法是应用上述肽链段或由其顺序衍生的肽模拟化合物于农业生产来抑控害虫信息素的产生。
神经肽类对调节昆虫的各种生理功能起着关键作用。这些内分泌信息涉及胚胎和胚胎后的发育过程(例如蜕皮、滞育和变态)，涉及体内平衡，渗透调节，利尿和消化作用。昆虫的神经肽已知还能控制重要的行为模式，例如迁移，交配和产卵。近年来，化学、生物化学及分子技术的进一步发展，使昆虫神经肽的鉴定容易了，其结果表现为已分离和表征了50多种化合物。
由于昆虫神经肽的研究实质上涉及各种生理过程，所以它们的研究已涉及对基本生命过程的深入了解，而生命过程地研究可作为比较神经内分泌研究的优良基础，以便最终了解基本生物现象的进化史。此外，昆虫神经肽可提供一些新的基于拢害虫的活动防治病虫害的目标。这种战略要求更好地了解与神经内分泌调节有关的一连串现象，亦即：靶器官的生物合成，释放，输送，结合和活化。迄今，我们对大多数昆虫神经肽的上述现象的了解，还很有限。本发明是致力于上述现象的某些方面，包括由PBAN衍生的某些肽片段的活性，已知PBAN可调节蛾的性信息素生物合成和黑化。
雄性与雌性蛾的性通信，主要是靠性信息素来调节。性信息素的合成和分泌，是由雌蛾信息素腺进行，信息素腺是位于第8与第9腹环节间的节间膜上。如果雌蛾不能产生性信息素，结果在于明显减少交配，因而便大大缩小了蛾的群体规模。由于其在交配方面的重要作用，故人们已经强化了性信息素的研究。在过去30年间，已分离和鉴定出了200多种性信息素。这些研究已揭示出蛾性信息素是由C10-C18脂肪化合物的混合物组成，其中大多数化合物具有一个或一个以上的双键。不同种类信息素间的差异性，决定于链长度、烯烃键的位置和构型以及官能团的化学性质等差别。大多数信息素是一些醛类、醇类或醋酸酯类。但是，某些可出现为环氧类、酮类及烃类。
现在对鳞翅目昆虫的性信息素的结构与行为方面已加强了研究，然而却对控制性信息素生物合成的内生机理尚未得到充分了解。在此过程中可能涉及大脑因素，这已由Riddiford and Williams于1971年首次提出(Biol.Bull.140：1-7)。在性信息素生物合成的调节作用中，涉及神经内分泌因子的直接证明，在13年后首次由Raina and Klan(Science 225：531-533，1984)在玉米螺纹蛾(Helicoverpa Zea)中首次得到演示。神经内分泌因子被命名为信息素生物合成活化神经肽(PBAN)，并在1984年后它的存在已在各种蛾种类中获得证明。自从它的发现之后，PBAN被表征鉴定为一种线性羟基未端酰胺化的肽，含有33个氨基酸。PBAN的一级结构，已在两种蛾玉米螺纹蛾(Helicoverpa Zea)和桑蚕蛾(Bombyxmrl)中作了充分的鉴定，其基因和cDNA已从这两种相同的昆虫克隆出。PBAN是在下食管神经节中合成的，然后通过血淋巴和/或腹神经索转移到它的靶器官上。PBAN是存在于雄性蛾和雌性蛾体中，其生物活性是由cAMP调解并决定于Ca++离子的存在。除其信息素趋向活性之外，PBAN和由其顺序衍生的片段，还能控制表皮的黑化、肌肉收缩以及滞育(综述文章见Altstein et al.，Arch.Insect.Biochcm.and Physiol.22：153-168，1993；Raina，Ann.Rev.Entomol.38：329-349，1993)。
虽然PBAN的研究几乎有10年了，但对其活性的了解还是十分有限的，大多数研究工作是集中于：A)它的释放和运移；B)其靶器官的核实；以及C)它的细胞活性。在与神经肽活性有关的各步骤中，用于抑制作用的最有效和特定的靶位，便是PBAN的结合部位。通过拮抗剂能够获得这样的抑制作用，拮抗剂是一些选用的抑制剂，能够锁闭神经肽的受体位，因而能防止内生肽结合于受体并发挥其生物活性。因此，PBAN拮抗剂是一种性信息素产生的特效抑制剂。由于神经肽是化学上不稳定的和容易受到酶的攻击，因而发展拮抗化合物的战略应是基于创造肽衍生的化合物(肽模拟化合物)，它们应是生物学上稳定的并表现出长期的拮抗活性。这种战略是新颖的，以前从未应用于虫害防治。
为了设计一些模拟肽的拮抗药物，PBAN的结构与活性关系必须予以揭示，也必须识别肽分子中活性与非活性顺序。此方面研究的主要成就如下：
(1)鉴定由Hez-PBAN顺序衍生的最短肽段(六个氨基酸)，正是它在与Hez-PBAN1-33NH2相同的剂量下激起玉米蛾Heliothis Peltigera体内信息素趋向活性，(Hez-PBAN1-33 NH2是基于分离自Helicoverpa zea的肽顺序合成的PBAN)。
(2)鉴定了一种由表现出部分拮抗活性的PBAN原顺序衍生的10个氨基酸片段。
这两种片段是短肽的发现，具有如下优点(重要意义)：
(1)在探索有效拮抗剂的过程中，需要筛选的可能的衍生物的数量，比之在大(分子)肽情况下需要筛选的数量，要低几个数量级。这会大大缩短探索主要拮抗药物的第一阶段时间。
(2)生产10个以下氨基酸肽，是基于可购得的设备和技术，并且是最有效的。
(3)这一发现符合了杀虫剂工业共同的实践经验，即杀虫剂类，特别是用于杀灭成年昆虫的杀虫剂，必须是低分子量的，以便渗透入昆虫的表皮内。
这些成就，使有可能应用类似于合理的药物设计战略，来探索肽模拟PBAN拮抗剂。
迄今就PBAN已提出了两份专利申请：
一份日本专利申请4-208300(Suzuki et al.，)，是关于由蚕提取的全33个氨基酸顺序的肽，以及它的某些片段。根据该专利申请，这些肽是能活化蚕体内的信息素生物合成。该日本专利申请不是关于利用这些肽作为设计主导化合物以及PBAN潜在兴奋剂(agonists)和拮抗剂(antagonists)的来源和基础。而且，在日本专利申请中，观察活性的实验生物条件和浓度，全部不同于本发明。在日本专利申请中，为获得活性的肽的浓度，比本申请中的浓度高出100倍。
另一份美国专利申请(U.S.Pat.Appl.No.5,032,576，Rainaet al.)是关于分离、表征和合成Helcoverpa Zea蛾体内的PBAN。该专利还提到利用全长度PBAN 1-33 NH2及其某些类似物(其中全部为33个氨基酸长度)作为控制雌蛾或其幼虫的方法。所说的美国专利，并未谈及由Hez-PBAN顺序衍生的较短片段的生物活性或其用作害虫治理的手段。
本发明提供了一些由Hez-PBAN(1-33)NH2的氨基酸顺序衍生的肽片段及其类似物，它们在使用剂量类似于PBAN 1-33(10-100pmol)的剂量下显示有刺激(兴奋)和抑制(拮抗)生物活性，作为设计杀虫剂的基础，目的在于阻断由PBAN 1-33 NH2及其衍生片段控制的信息素的产生、黑化及其它活性。
本发明进一步提供了一种方法，用于控制成年雌Heliothis蛾、各种蛾及害虫，该方法是应用上述肽段或衍生自这些顺序的肽模拟化合物于农业生产，来抑制害虫信息素的产生。更具体地说，根据本发明，优选的(最佳)肽片段如下：
a)R-酪氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸-脯氨酸-精氨酸-亮氨酸-NH2，其中R代表H，Ac，Bz，Bz1，Et，该肽片段在信息素生物试验中以剂量为10pmol和时间30-60分钟内显示出刺激活性。
b)H-脯氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸-甲硫氨酸-酪氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-天冬氨酸-COOH，该肽片段在PBAN 1-33 NH2存在下显示出抑制活性。
c)H-脯氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸-甲硫氨酸-酪氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-天冬氨酸-COOH，该肽片段在PBAN 1-33 NH2和/或衍生的肽存在下显示出抑制剂的活性，对雌性蛾类生产信息素的产生有抑制作用。
d)H-脯氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸-甲硫氨酸-酪氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-天冬氨酸-COOH，该肽片段在PBAN 1-33 NH2和/或衍生的肽存在下显示有抑制活性，对蛾幼虫黑化的产生有抑制作用。
结构活性的研究是通过考察合成Hez-PBAN(PBAN 1-33 NH2)和10个由其N-末端区域和C-末端区域衍生的较短片段的信息素趋向活性来进行的。活性测试是使用Gazit等人所述的生物检定法(Insect Biochem.，20：853-858，1990)对Heliothis Peltgera蛾进行的。这些结构如下：酰胺化肽类
H-亮氨酸1-丝氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-丙氨酸-苏氨酸-脯氨酸-丙氨酸10-天冬氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸-甲硫氨酸-酪氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-天冬氨酸-脯氨酸-谷氨酸20-谷氨酰胺-异亮氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-精氨酸-苏氨酸-赖氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸30-脯氨酸-精氨酸-亮氨酸33-NH2＝PBAN(1-33)NH2
H-脯氨酸-丙氨酸10-天冬氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸-甲硫氨酸-酪氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-天冬氨酸-脯氨酸-谷氨酸20-谷氨酰胺-异亮氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-精氨酸-苏氨酸-赖氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸30-脯氨酸-精氨酸-亮氨酸33-NH2＝PBAN(9-33)NH2
H-谷氨酸13-甲硫氨酸-酪氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-天冬氨酸-脯氨酸-谷氨酸20-谷氨酰胺-异亮氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-精氯酸-苏氨酸-赖氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸30-脯氨酸-精氨酸-亮氨酸33-NH2＝PBAN(13-33)NH2
H-谷氨酰胺17-天冬氨酸-脯氨酸-谷氨酸20-谷氨酰胺-异亮氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-精氯酸-苏氨酸-赖氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸30-脯氨酸-精氨酸-亮氨酸33-NH2＝PBAN(17-33)NH2
H-脯氨酸-谷氨酸20-谷氨酰胺-异亮氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-精氨酸-苏氨酸-赖氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸30-脯氨酸-精氨酸-亮氨酸33-NH2＝PBAN(19-33)NH2
H-苏氨酸-赖氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸30-脯氨酸-精氨酸-亮氨酸33-NH2＝PBAN(26-33)NH2
H-酪氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸30-脯氨酸-精氨酸-亮氨酸33-NH2＝PBAN(28-33)NH2游离酸肽类
H-亮氨酸1-丝氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-丙氨酸-苏氨酸-脯氨酸-丙氨酸10-天冬氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸-甲硫氨酸-酪氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-天冬氨酸-脯氨酸-谷氨酸20-谷氨酰胺-异亮氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-精氨酸-苏氨酸-赖氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸30-脯氨酸-精氨酸-亮氨酸33-COOH＝PBAN(1-33)COOH
H-脯氨酸-丙氨酸10-天冬氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸-甲硫氨酸-酪氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-天冬氨酸-脯氨酸-谷氨酸20-谷氨酰胺-异亮氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-精氯酸-苏氨酸-赖氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸30-脯氨酸-精氨酸-亮氨酸33-COOH＝PBAN(9-33)COOH
H-脯氨酸-谷氨酸20-谷氨酰胺-异亮氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-精氨酸-苏氨酸-赖氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸30-脯氨酸-精氨酸-亮氨酸33-COOH＝PBAN(19-33)COOH
H-脯氨酸-丙氨酸10-天冬氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸-甲硫氨酸-酪氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-天冬氨酸18-COOH＝PBAN(9-18)COOH
N-末端基对生物活性起动的作用是采用从其N-末端起计算分别缺少8个、12个、16个及18个氨基酸的一系列肽[PBAN(9-33)NH2，PBAN(13-33)NH2，PBAN(17-33)NH2以及PBAN(19-33)NH2]来考察的。对这些肽片段的考察是用1pmol的剂量(全长度分子显示出最大活性的剂量)。信息素含量是在注射后两小时检测的。结果(表1)显示，PBAN(9-33)NH2是有活性的，与PBAN(1-33)NH2一样。但是，其他的肽片段在这种剂量下是无活性的，PBAN(19-33)NH2除外，后者显示出低的活性(表1)。基于这些数据得到的结论是，对于起动信息素活性来说，前8个N-末端基氨基酸是不重要的，而在9-12个氨基酸之间的顺序是必要的。注射较高剂量(10pmol)的上述肽片段证明，从其N-末端起甚至缺少18个氨基酸的一些肽类，也是有活性的，正如全长度PBAN一样(表1)。这些结果暗示出这样的可能性，即神经肽的活性位是不包含在前18个N-末端基氨基酸之内；并且产生了这样可能性，即活性位是包含在C-末端基的区域内。N-末端基区域，有可能提供抗蛋白水解降解的稳定性，或者另一方面可能起着二级结构的作用。 表1 PBAN(1-33)NH2及其衍生肽的信息素趋向活性
信息素含量
Z11-16：醛，ng/腺±SE注入的肽 1pmol剂量下 10pmol剂量下PBAN(1-33)NH2 200.7±40.7a 225.2±51.4a′PBAN(9-33)NH2 143.7±29.6a 168.0±9.2a′PBAN(13-33)NH2 4.1±3.0d 180.2±47.3a′PBAN(17-33)NH2 24.1±5.7c 198.9±40.7a′PBAN(19-33)NH2 52.7±21.0b 133.8±15.7b′PBAN(26-33)NH2 8.9±3.5d 12.2±3.1c′PBAN(28-33)NH2 5.6±1.7d 12.7±4.9c′
通过注射肽测定了信息素趋向活性，肽是溶解在磷酸盐缓冲液中，注入到生长3.5-4.5天的雌幼虫体内，在白天经过2小时。信息素含量是以主要信息素组分Z11-16：醛(Ald)的量来表示。相同字母编号分类的数值没有重大差别。
使用PBAN的游离酸分子[PBAN(1-33)COOH]考察了C-末端基在生物活性中的作用。这种分子在剂量即使达到10pmol时也是完全无活性的(图1)，这指示出C-末端酰胺基的重要性。分子的酰胺基部分的重要性，也曾用C-末端直接抗血清YG-17(3)得到证实，是利用抗血清阻塞外源施行的PBAN和内生PBAN(图2)。为了检验PBAN的C-末端的酰胺基是具有抗蛋白水解的保护作用，还是仅为一种对PBAN接受体的构象需要，于是考察了在羟基肽酶抑制剂(aprotinin和PMSF)，以及其它蛋白酶抑制剂(TLCK，杆菌肽)混合物存在下的PBAN(1-33)COOH的生物活性。加入蛋白酶抑制剂，不能增强游离酸PBAN 1-33 COOH的生物活性，这说明C-末端上的酰胺基对接受体的激活是构象需要(图3)。同样的抑制剂混合物影响PBAN 1-33 NH2活性的分析，证明对其活性有重大刺激作用，说明处理的有效性(图3)。
进一步研究了C-末端区域在信息素趋向活性方面的作用，为此分析了两种C-末端衍生的肽片段：PBAN(26-33)NH2和PBAN(28-33)NH2。初步分析了这些肽在浓度范围为1-100pmol情况下的信息素趋向活性，结果显示它们仅在高剂量(100pmol)情况下，在注射2小时后测定，是有活性的(图4)。但是，在注射后很短时间内(15-30分钟)，PBAN(28-33)NH2的信息素趋向活性与全长度PBAN(1-33)NH2的活性相比，没有重大差别(图5)。基于这些结果，可得到结论：六肽(hexapeptide)是含有起动信息素活性所要求的必要顺序，而且在此顺序内C-末端上的酰胺基具有最重要的结构作用。因而，六肽可作为一种优良基础来设计PBAN的拮抗主导化合物。
对另外的由PBAN顺序衍生的C-末端游离酸肽片段(PBAN 9-33 COOH，PBAN 19-33 COOH及PBAN 9-18 COOH)的考察结果，表明这些肽在蛋白酶抑制剂存在下注射剂量达到10pmol经过2小时(表2)仍缺乏任何生物活性。表2 C-末端游离酸肽的信息素趋向活性注射的肽(10pmol) 信息素含量
Z11-16：醛(ng/腺)±SEPBAN(1-33)COOH 1.4±0.76PBAN(9-33)COOH ＜1PBAN(19-33)COOH ＜1PBAN(9-18)COOH ＜1
由于衍生自生物活性分子顺序的非活性肽类，常显示出抑制活性，我们曾经考察了它们对由PBAN(1-33)NH2所引起的信息素趋向活性的影响，结果PBAN(1-33)COOH，PBAN(9-33)COOH和PBAN(19-33)COOH在将它们与1pmolPBAN(1-33)NH2一起注射时，均未显示出任何抑制活性。PBAN(9-18)COOH封闭了全长度PBAN活性的35％(表3)。一起注入0.5pmolPBAN(1-33)NH2与100pmol的PBAN(9-18)COOH，结果证明对信息素趋向活性有40％的抑制作用(图6)。基于这些数据我们得出结论：PBAN(9-18)COOH是对PBAN的一种竞争性抑制剂，可作为对其活性的部分拮抗剂。这种顺序将可作为设计能完全抑制PBAN的信息素趋向活性的其他拮抗剂的基础。表3 在游离酸PBAN衍生片段存在下
PBAN(1-33)NH2的信息素趋向活性
注射的肽 信息素含量 抑制作用
Z11-16：醛(ng/腺)±SE (含量％)PBAN(1-33)NH2(对照样品) 165.0±21.0 -PBAN(1-33)NH2+ PBNAN(1-33)COOH 170.2±24.2 0PBAN(1-33)NH2+PBAN(9-33)COOH 154.7±22.2 7PBAN(1-33)NH2+ PBAN(19-33)COOH 120.4±29.2 27PBAN(1-33)NH2+PBAN(9-18)COOH 108.1±18.0 35PBAN(1-33)NH2的注射剂量为1pmol，C-末端游离酸肽片段的剂量为10pmol。
对合成Hez-PBAN的黑化趋向活性，也进行了结构活性研究。对其信息素趋向活性测试过的所有肽链段，还测试了它们的黑化趋向活性。研究是对海岸灰蝴蝶(SpodopteraLittoralis)幼虫进行的，是使用定量生物检定法(Altstein et.al.，Peptides，Submitted，1994)，该研究考察了PBAN片段对结扎(Ligated)幼虫诱导表皮黑化的能力。结扎的幼虫产生了比未处理的幼虫较少的黑色素(表4)，结果减少了蝴蝶幼虫的内生PBAN。在试验条件下，结扎引起了明显的，但不完全的，表皮黑化的减少。这种不完全的减少，也可能是由于在神经节中存在PBAN的结果，神经节中的PBAN不受结扎或另一种荷尔蒙或神经肽的存在所影响，而该荷尔蒙和神经肽却会影响黑素化过程。注射PBAN(1-33)NH2的结果在于大大增加了表皮的黑色素，而注射PBAN(9-18)COOH的结果在于大大减少了表皮黑色素，减少水平(量)超过了结扎或注射缓冲剂的结果(图4)。这些数据指出，PBAN(9-18)COOH对内生PBAN的活性有拮抗作用，在结扎的幼虫体内仍然存在内生PBAN。这种顺序将可作为设计能充分地抑制PBAN的黑化趋向活性的更多的拮抗药物的基础。表4 酰胺化和游离酸的PBAN 1-33的黑化趋向活性注射材料(10pmol) 着色区域 未着色区域无(未处理的对照试样) 93％ 7％缓冲剂(对照试样) 85％ 15％PBAN(1-33)NH2 96％ 4％PBAN(9-18)COOH 75％ 25％
着色区和未着色区的测定是采用Altstein等人所述的计算机化光密度扫描器(肽于1994年提交)。