非交叉反应性抗IGG抗体.pdf

摘要
申请专利号：	CN201080047203.6	申请日：	2010.10.18
公开号：	CN102656460A	公开日：	2012.09.05
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/68申请日:20101018\|\|\|公开
IPC分类号：	G01N33/68; C07K16/42	主分类号：	G01N33/68
申请人：	弗·哈夫曼-拉罗切有限公司
发明人：	U·埃西格; S·克洛斯特曼; F·科瓦莱夫斯基; K-G·施图本拉赫; R·福格尔; U·韦塞尔斯
地址：	瑞士巴塞尔
优先权：	2009.10.19 EP 09013144.2
专利代理机构：	北京市中咨律师事务所 11247	代理人：	黄革生;林柏楠
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内容摘要

本发明报导了细胞系DSM？ACC3006，DSM？ACC3007和DSM？ACC3008，以及从所述细胞系得到的抗体，和从所述细胞系得到的抗体在免疫测定中的用途。还报导了结合人或黑猩猩IgG但不结合犬和绒猴IgG的抗体，和特异性结合包含κ轻链恒定结构域的IgG1的抗体。

权利要求书

1：细胞系 DSM ACC3006，或 DSM ACC3007，或 DSM ACC3008。
2：从根据权利要求 1 的细胞系之一得到的抗体。
3：根据权利要求 2 的抗体在免疫测定中的用途。
4：试剂盒，其包含 a) 从细胞系 DSM ACC2708，或 DSM ACC3006，或 DSM ACC3007，或 DSM ACC3008 得到的抗体作为捕获试剂， b) 从细胞系 DSM ACC2708，或 DSM ACC3006，或 DSM ACC3007，或 DSM ACC3008 得到的抗体作为检测试剂。
5：检测从实验动物得到的样品中的治疗抗体的方法，其包括以下步骤 a) 提供待分析的样品， b) 将所述样品与和根据权利要求 2 的抗体结合相同表位的抗体进行孵育， c) 任选地将所述样品与适于选择性检测总治疗抗体、活性治疗抗体或抗原结合的治疗抗体的试剂孵育，和 d) 将在 (b) 或 (c) 中形成的复合物与所述治疗抗体的浓度相关联。
6：使用抗原桥连免疫测定对从实验动物得到的样品中的治疗抗体进行免疫学测定的方法，所述抗原桥连免疫测定包含捕获抗体和示踪抗体，特征在于所述捕获抗体和所述示踪抗体都独立地选自和根据权利要求 2 的抗体结合相同表位的抗体。
7：根据权利要求 6 的方法，其特征在于所述免疫测定是夹心免疫测定。
8：根据权利要求 6 或 7 中任一项的方法，其特征在于所述捕获抗体与生物素缀合，并通过固定的抗生物素蛋白或链霉抗生物素进行固定。
9：根据权利要求 6 至 8 中任一项的方法，其特征在于所述示踪抗体与地高辛缀合，并通过针对地高辛的抗体进行与可检测的标记物的连接。
10：根据权利要求 5 至 9 中任一项的方法，其特征在于所述治疗抗体是 Fab。
11：根据权利要求 5 至 10 中任一项的方法，其特征在于所述实验动物选自绒猴和绢毛猴、旧大陆猴、侏儒狐猴和鼠狐猴 (dwarf and mouse lemur)、长臂猿和小猿 (lesser ape)、美狐猴家族的成员，以及其杂种。
12：根据权利要求 5 至 11 中任一项的方法，其特征在于所述治疗抗体是人或人源化抗体。
13：结合治疗抗体但不结合实验动物的免疫球蛋白的抗体在测定从实验动物获得的样品中的总治疗抗体、活性治疗抗体或抗原结合的治疗抗体的浓度中的用途，其中所述抗体和根据权利要求 2 的抗体结合相同的表位。
14：抗体组合物，其特征在于包含由细胞系 DSM ACC3006，细胞系 DSM ACC3007，细胞系 DSM ACC3008 产生的抗体的混合物。
15：根据权利要求 14 的抗体组合物在根据权利要求 5 至 12 中任一项的方法中的用途。
16：结合人或黑猩猩 IgG 但不结合犬和绒猴 IgG 的抗体。
17：根据权利要求 16 的抗体，其特征在于所述抗体不结合犬、恒河猴、绒猴、狒狒和食蟹猴 IgG。
18：根据权利要求 16 或 17 中任一项的抗体，其特征在于结合人或黑猩猩 IgG 的 KD 值 -9 是 10 mol/l 或更低，且结合犬、恒河猴、绒猴、狒狒和食蟹猴 IgG 的 KD 值是 10-6mol/l 或更 2 高。
19：根据权利要求 16 至 18 中任一项的抗体，其特征在于所述抗体是单克隆抗体。
20：特异性结合包含 κ 轻链恒定结构域的 IgG1 的抗体。
21：根据权利要求 20 的抗体，其特征在于所述抗体还结合 IgG2。
22：根据权利要求 20 至 21 中任一项的抗体，其特征在于所述抗体还结合 IgG4。
23：根据权利要求 20 至 22 中任一项的抗体，其特征在于所述抗体不结合 IgG3。
24：根据权利要求 20 至 23 中任一项的抗体，其特征在于所述抗体不结合包含 λ 轻链恒定结构域的 IgG1。
25：根据权利要求 20 至 24 中任一项的抗体，其特征在于所述抗体是单克隆抗体。
26：根据权利要求 16 至 25 中任一项的抗体在根据权利要求 5 至 12 中任一项的方法中的用途。

说明书

非交叉反应性抗 IgG 抗体
    本发明报导了特异性结合人和黑猩猩 IgG 类抗体的 IgG-Fab 片段的恒定区的抗体及其在免疫测定中的用途。
     发明背景
     自从 Koehler 和 Milstein 在 1974 年开发了首例单克隆抗体以来，进行了许多努力以开发适用于治疗人的抗体。首例可获得的单克隆抗体已在小鼠和大鼠中被开发。在过去 10 年中，越来越多的人单克隆抗体或人源化单克隆抗体已进入市场。熟知的实例包括例如来自 F.Hoffmann-La Roche AG， Basel 的 Herceptin 和 MabThera
     极大量的人或人源化抗体正在调查研究中，并在能够考虑进入人体进行初步试验以前需要在实验动物中研究。必须研究如生物可用性和抗体清除等 ( 只提到其中 2 种 ) 的重要标准。许多这些研究需要在实验动物自身抗体的背景下定量治疗抗体。在大多数情况下使用哺乳动物作为实验动物。通常最先在啮齿类如小鼠或大鼠中评估毒理学。在更高级的药物开发阶段，特别是在药物进入人体以前，甚至必须将猴子包括在这样的临床前研究中。
     哺乳动物循环中通常具有约 10 至约 30 毫克 /ml 之间的抗体。治疗单克隆抗体一般必须以范围从约 1 纳克 /ml 至约 100 毫克 /ml 之间的血清水平进行检测。因此，必须在实验动物抗体的背景下检测治疗抗体，所述实验动物抗体为约 100 倍至 1 千万倍过量。
     在实验动物抗体的背景下检测人或人源化治疗抗体是对药理学家的极为严峻的任务。检测动物与智人的亲缘关系越近，人或人源化抗体的检测就变得越来越困难。
     在 WO 2008/031532 中报导了一种抗药物抗体测定。在 WO 2006/066912 中报导了在实验动物中检测治疗抗体。在 US 5,332,665 中报导了物种特异性、高亲和力的单克隆抗体。
     发明概述
     本发明首先报导了在人和黑猩猩的 G 型免疫球蛋白的抗体上的构象表位，其不存在于通常使用的实验动物中。其次报导了与此表位结合的非交叉反应性抗人 IgG 抗体和抗黑猩猩 IgG 抗体。第三，报导了使用这些抗体的测定。
     本发明报导的一个方面是结合人或黑猩猩 IgG(G 亚类的免疫球蛋白 ) 但不结合犬和绒猴 (marmoset)IgG 的抗体。
     在一个实施方案中，所述抗体不结合犬、恒河猴 (Rhesus-monkey)、绒猴、狒狒和食蟹猴 (cynomolgus)IgG。在另一个实施方案中，所述抗体特异性结合人和黑猩猩 IgG。在另外的实施方案中，通过表面等离子共振测定的结合人或黑猩猩 IgG 的 KD 值是 10-9mol/l 或更低，结合犬、恒河猴、绒猴、狒狒和食蟹猴 IgG 的 KD 值是 10-6mol/l 或更高。在一个实施方结合案中，结合人或黑猩猩 IgG 的 KD 值是 10-9mol/l 至 10-13mol/l。在另一个实施方案中，犬、恒河猴、绒猴、狒狒和食蟹猴 IgG 的 KD 值不能通过表面等离子共振测定。在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。
     本发明报导的另一个方面是特异性结合包含 κ 轻链恒定结构域的 IgG1(G1 亚类的免疫球蛋白 ) 的抗体。
     在一个实施方案中，所述抗体还结合 IgG2。在另一个实施方案中，所述抗体还结合 IgG4。在另一个实施方案中，所述抗体不结合 IgG3。在一个实施方案中，所述抗体不结合包含 λ 轻链恒定结构域的 IgG1。在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。
     本发明报导的从细胞系 DSM ACC3006(M-1.3.2)， DSM ACC3007(M-1.5.8) 和 DSM ACC3008(M-1.7.10) 得到的抗体与例如细胞系 DSM ACC2708 产生的抗体 M-R10Z8E9 比较时显示了降低的交叉反应性，它们结合 Fab 区中的不同表位，不受邻近的糖基化位点的影响，并可在免疫测定中混合用于测定 Fab 治疗抗体，因为每种抗体的结合位点在 Fab 片段中仅出现 1 次。
     本发明报导的各方面是细胞系 DSM ACC3006， DSM ACC3007 和 DSM ACC3008，以及从所述细胞系得到的各个抗体和这些抗体在免疫测定中的用途。
     另一个方面是一种试剂盒，其包含
     a) 从 DSM ACC3006，或 DSM ACC3007，或 DSM ACC3008，或 DSM ACC2708 得到的抗体的生物素化形式，
     b) 从 DSM ACC3006，或 DSM ACC3007，或 DSM ACC3008，或 DSM ACC2708 得到的抗体的地高辛化 (digoxygenylated) 形式。本发明报导的另一个方面是检测从实验动物得到的样品中的治疗抗体的方法，其包括以下步骤
     a) 提供待分析的样品，
     b) 将所述样品与和本发明报导的抗体结合相同表位的抗体孵育，
     c) 任选地将所述样品与适于选择性检测总治疗抗体、活性治疗抗体或结合抗原的治疗抗体的试剂孵育，和
     d) 任选地通过校准曲线将在 (b) 或 (c) 中形成的复合物与治疗抗体的浓度相关联。
     本发明报导的另一个方面是使用包含捕获抗体和示踪抗体的抗原桥连免疫测定，进行免疫学测定从实验动物得到的样品中的治疗抗体的方法，其中所述捕获抗体和示踪抗体都独立地选自和本发明报导的抗体结合相同表位的抗体。
     在一个实施方案中，所述免疫测定是夹心免疫测定。在另一个实施方案中，抗体与其缀合配偶体的缀合通过经由抗体的氨基酸骨架的 N- 端和 / 或 ε- 氨基 ( 赖氨酸 )、不同赖氨酸的 ε- 氨基、羧基、巯基、羟基和 / 或酚官能团，和 / 或抗体的碳水化合物结构的糖醇基的化学结合进行。在另外的实施方案中，捕获抗体通过特异性结合对固定。在一个实施方案中，捕获抗体与生物素缀合并通过固定化的抗生物素蛋白或链霉抗生物素进行固定。在另一个实施方案中，示踪抗体通过特异性结合对与可检测的标记物缀合。在一个实施方案中，示踪抗体与地高辛缀合并通过针对地高辛的抗体进行与可检测的标记物的连接。在另一个实施方案中，治疗抗体是 Fab。在一个实施方案中，实验动物选自绒猴和绢毛猴 (tamarin)、旧大陆猴 (old world monkey)、侏儒狐猴和鼠狐猴 (dwarf and mouse lemur)、长臂猿和小猿 (lesser ape)、美狐猴 (true lemur) 家族的成员，以及其杂种。在一个实施方案中，实验动物选自狗、恒河猴、绒猴、狒狒和食蟹猴。在一个实施方案中，实验动物是猕猴 (Macaca monkey)。在另一个实施方案中，结合治疗抗体但不结合实验动物的免疫球蛋白的抗体是本发明报导的抗体。在一个实施方案中，治疗抗体是人或人源化抗体。在另一个实施方案中，
     人或人源化抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，检测总治疗抗体，在另一个实施方案中检测活性治疗抗体，在另一个实施方案中检测与其抗原结合的治疗抗体。
     本发明报导的另一个方面是结合治疗抗体但不结合实验动物的免疫球蛋白的抗体在测定从实验动物获得的样品中的总治疗抗体、活性治疗抗体或抗原结合的治疗抗体的浓度中的用途，其中所述抗体和本发明报导的抗体结合相同的表位。在一个实施方案中，所述抗体是本发明报导的抗体。
     本发明报导的另一个方面是抗体组合物，其包含由细胞系 DSM ACC3006、细胞系 DSM ACC3007、细胞系 DSM ACC3008 和 / 或细胞系 DSM ACC2708 产生的抗体的混合物。
     另一个方面是本发明报导的抗体组合物在本发明报导的方法中的用途。
     发明详述
     名为 M-R10Z8E9 的非交叉反应性抗人 IgG 抗体 ( 从细胞系 DSM ACC2708 中获得 ) 结合 G 型人免疫球蛋白的 CH2 结构域中的靠近糖基化位点 Asn297 的表位。本发明报导的抗体 M-1.3.2， M-1.5.8 和 M-1.7.10 与抗体 M-R10Z8E9 相比显示了降低的交叉反应性，结合 Fab 区中的不同表位，不受邻近的糖基化位点的影响，且可在免疫测定中混合用于测定治疗抗体，特别是 Fab 治疗抗体，因为每种抗体的结合位点都在 Fab 片段中存在。
     术语 “治疗抗体” 表示在临床研究中检测的被批准用作人治疗剂的抗体，且其可对个体施用用于治疗疾病。在一个实施方案中，治疗抗体是单克隆抗体。在另一个实施方案中，治疗抗体选自从类人猿 (great ape) 得到的抗体，从用人抗体基因座转化的动物得到的抗体，人单克隆抗体，或人源化单克隆抗体。在一个实施方案中，治疗抗体是人单克隆抗体。在另一个实施方案中，治疗抗体是人源化单克隆抗体。治疗抗体被广泛用于多种疾病的治疗，例如肿瘤疾病 ( 例如血液和实体恶性肿瘤，包括非何杰金氏淋巴瘤、乳腺癌和结肠直肠癌 )，免疫疾病，中枢神经疾病，血管疾病或传染病。这样的抗体为，例如，针对 CD20， CD22， HLA-DR， CD33， CD52， EGFR， G250， GD3， HER2， PSMA， CD56， VEGF， VEGF2， CEA， Levis Y 抗原， IL-6 受体 (IL6R) 或 IGF-1 受体 (IGF1R) 的抗体。
     术语 “抗体”包含抗体结构的多种形式，包括整个抗体和抗体片段。本发明报导的抗体在一个实施方案中是人抗体，人源化抗体，嵌合抗体，或 T 细胞抗原耗尽的抗体 (T-cell antigen depleted antibody)。例如在 Morrison， S.L.，等人， Proc.Natl. Acad Sci.USA 81(1984)6851-6855 ； US 5,202,238 和 US 5,204,244 ； Riechmann， L.，等人， Nature 332(1988)323-327 ； Neuberger， M.S.，等人， Nature 314(1985)268-270 ； Lonberg， N.， Nat.Biotechnol.23(2005)1117-1125 中描述了抗体的基因工程。
     非人 ( 例如啮齿类 ) 抗体的 “人源化” 形式是包含来源于非人抗体和来源于人抗体的部分序列的嵌合抗体。大部分人源化抗体来源于人抗体 ( 接受体抗体 )，其中高变区的残基被具有期望的特异性和亲和力的非人物种，例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的的高变区 ( 供体抗体 ) 的残基替换。有时候，人抗体的框架区 (FR) 残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含另外的修饰，例如在接受体抗体或供体抗体中不存在的氨基酸残基。这样的修饰导致这样的接受体或供体抗体的变体，其与相应的亲本序列同源但不同一。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。
     大体上，人源化抗体将包含至少一个、通常 2 个可变结构域的基本全部，其中高变环对应非人供体抗体的高变环， FR 的全部或基本全部是人接受体抗体的 FR。人源化抗体任选地也包含至少一部分抗体恒定区，通常是人抗体恒定区的一部分。
     人源化非人抗体的方法已在领域中描述。在一个实施方案中，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为 “输入” 残基，其一般来自 “输入” 可变结构域。可基本上遵照 Winter 及其同事的方法，通过将高变区序列取代为相应的非人抗体的序列进行人源化。因此，这样的 “人源化” 抗体是嵌合抗体，其中实质上少于完整的人可变结构域的序列被来自非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体一般是人抗体，其中一些高变区残基和可能有一些框架区残基被来自啮齿类或非人灵长类抗体的类似位点中的残基取代。
     本发明使用的术语 “单克隆抗体” 指从基本均质的抗体群体中得到的抗体，即组成群体的个体抗体是同一的，除了可能以少量存在的可能天然发生的突变以外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与包含针对不同抗原位点 ( 决定簇或表位 ) 的不同抗体的多克隆抗体制品相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个抗原位点。除了其特异性以外，单克隆抗体的优势在于其合成可不被其他抗体污染。修饰语 “单克隆” 表示抗体的特征是从基本均质的抗体群体中获得，而不应被视为需要通过任何特定方法产生所述抗体。本发明使用的术语 “实验动物”表示以下灵长目的各科成员，即包含绒猴和绢毛猴 ( 绒猴 (Callitrichidae) 科 )，新大陆猴 ( 卷尾猴 (Cebidae) 科 )，旧大陆猴 ( 猕猴 (Cercopithecidae) 科，例如猕猴 (Macaca monkey))，侏儒狐猴和鼠狐猴 ( 鼠狐猴 (Cheirogaleidae) 科 )，指狐猴 (aye-aye)( 指猴 (Daubentoniidae) 科 )，婴猴 (bushbaby) 和夜猴 (galago)( 婴猴 (Galagonidae) 科 )，长臂猿和小猿 ( 长臂猿 (Hylobatidae) 科 )，马达加斯加大狐猴 (indris)，马达加斯加狐猴 (sifaka)，和其亲属 ( 大狐猴 (Indridae) 科 )，美狐猴 ( 狐猴 (Lemuridae) 科 )，懒猴 (lorise)( 懒猴 (Loridae) 科 )，嬉猴 (sportive lemur)( 嬉猴 (Megaladapidae) 科 )，眼镜猴 (tarsier)( 眼镜猴 (Tarsiidae) 科 )，及其杂种。
     在一个实施方案中，实验动物选自绒猴和绢毛猴、旧大陆猴、侏儒狐猴和鼠狐猴、长臂猿和小猿、美狐猴各科的成员，及其杂种。在此实施方案中，排除了离人类最近的亲属，类人猿，特别是黑猩猩、倭黑猩猩 (bonobo)、大猩猩 (gorilla) 和猩猩 (orangutan) 的组。
     术语 “样品” 表示从实验动物移取的任意组织或液体样品。在一个实施方案中，样品可为液体样品如唾液、尿、全血、血浆或血清。在另一个实施方案中，样品将为全血、血浆或血清。
     “结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体” 将以至少 10-9mol/l 的解离常数 ( ＝ KDiss)，在另一个实施方案中以至少 10-10mol/l 的 KDiss 结合治疗抗体。同时通过 10-7mol/ l 或更差的 KDiss 确保不结合实验动物抗体的性能。在另一个实施方案中，结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体在分别针对实验动物的 G 型免疫球蛋白和针对人或黑猩猩的 G 型免疫球蛋白的反应性之间将具有至少 100 倍的 KDiss 差距。
     大体上，术语 “结合” 表示抗体以 10-9mol/l 或更低的解离常数 ( ＝ KD ＝ KDiss.)，在 -10 另一个实施方案中以至少 10 mol/l 的 KD 结合其抗原或相应的抗体受体 ( 看相应的上下文而定 )。同时通过 10-7mol/l 或更高 ( 例如 10-5mol/l) 的 KD 确保不结合的性能。在另一个实施方案中，结合第一抗体但不结合第二抗体的抗体在分别针对第一种 G 型免疫球蛋白和
     针对第二种 G 型免疫球蛋白的反应性之间将具有至少 100 倍的 KD 差距。
     在一个实施方案中通过在 BIAcore 仪器上的表面等离子共振评估抗体的结合性能，特别是 KDiss。在此方法中，通过表面等离子共振 (SPR) 的变化评估结合性能。可便利地将研究中的抗体与固相 ( 称为芯片 ) 结合并用于评估单克隆抗体、多克隆抗体或甚至包含 IgG 的血清与此包被的芯片的结合。
     研究中的结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体可为单克隆抗体，这样的抗体的片段，以及包含这样的抗体的结合结构域的基因构建体。可使用保留上述结合治疗抗体但不结合实验动物的抗体的标准的任意抗体片段。
     可能必须在临床前研究期间评估与治疗抗体在实验动物中的应用相关的多个方面。在特定设置下，可能与分析存在的治疗抗体的总量相关，或分析治疗抗体的特定片段，或治疗抗体的特定修饰，或与抗原结合的治疗抗体的浓度，或仍然能够结合抗原的治疗抗体的部分 (fraction) 可能是重要的。在一个实施方案中，本发明报导的抗体和方法可用于分别检测总治疗抗体、活性治疗抗体或结合抗原的治疗抗体。
     术语 “总治疗抗体” 表示检测的任意抗体，与抗体是否有活性 ( 即仍然可与其抗原反应 )、无活性和 / 或结合抗原无关。术语 “活性治疗抗体” 表示在实验动物中存在的仍然能够结合其抗原的治疗抗体。例如，这样的抗体在其抗原结合位点上还未结合其抗原或任意其他分子。
     术语 “结合抗原的治疗抗体” 表示在实验动物的循环中存在的与其抗原结合的治疗抗体。
     可使用本发明报导的抗体和方法直接检测如上定义的总治疗抗体、活性治疗抗体或结合抗原的治疗抗体。另外，可以检测无活性的治疗抗体的其他形式，例如被抗药物抗体或抗个体基因型抗体或特别是中和抗药物抗体结合的治疗抗体。
     另外，也可以间接评估任意 “无活性的治疗抗体” 。这样的无活性的治疗抗体可为，例如与其抗原结合的治疗抗体，或与交叉反应性抗原结合的治疗抗体，或被针对治疗抗体的自身或抗个体基因型抗体阻断的治疗抗体。如果总抗体量大于活性抗体和结合抗原的抗体的和，将存在包含未与其相应抗原结合的无活性抗体的另外一部分抗体。
     可在例如所谓的竞争免疫测定系统或在所谓的夹心型测定系统中检测总治疗抗体。这样的测定可在一个不含洗涤步骤的实施方案 ( 均质免疫测定 ) 中进行，或在含有洗涤步骤的另一个实施方案 ( 异质免疫测定 ) 中进行。
     在一个实施方案中，在夹心型免疫测定中检测总治疗抗体，其中结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体在这样的夹心测定的两侧使用。在这样的夹心的一侧使用的抗体与固相结合或能够与固相结合 ( 通常被称为捕获抗体 )，而在这样的夹心的另一侧的抗体以便于直接或间接检测的方式被标记 ( 所谓的检测抗体 )。在这样的夹心测定程序中结合的检测抗体的量与所研究的样品中的治疗抗体的量直接相关。
     可通过方便的现有技术程序实现样品中的活性治疗抗体的检测。然而，总治疗抗体或与其抗原结合的治疗抗体的部分的检测相当复杂，并且需要相当不同的测定设置，特别是需要定制的试剂用于每个不同的测定。使用本发明报导的结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体，可以在彼此类似的检测系统中评估活性治疗抗体、总治疗抗体或结合抗原的治疗抗体的部分。当在这些治疗抗体的不同部分之间进行定量比较时，此类总治疗抗
     体、活性治疗抗体或结合抗原的治疗抗体的比较测定应当具有优势。
     在一个实施方案中，设置夹心型测定形式用于检测活性治疗抗体。在另一个实施方案中，结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体被用作捕获抗体，且这样的夹心测定的检测侧使用标记形式的抗原，或在结合抗原后使用不结合或不竞争结合治疗抗体识别的表位的第二抗体，其中所述第二抗体是可特异性检测的和 / 或以便于直接或间接检测的方式被标记。
     在一个实施方案中以夹心型测定的形式检测结合抗原的治疗抗体，使用结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体作为捕获试剂。在一个实施方案中在检测中使用在不与治疗抗体的表位竞争的表位上结合抗原的第二抗体。在一个实施方案中以便于直接或间接检测的方式标记第二抗体。
     为了直接检测，标记组可选自任意已知的可检测的标记组，例如染料、发光标记组如化学发光组，例如吖啶酯或二氧杂环丁烷 (dioxetane)，或荧光染料，例如荧光素、香豆素、罗丹明、嗪、试卤灵 (resorufin)、青色素及其衍生物。标记组的另外实例是发光金属复合物，例如钌或铕复合物，酶，例如用于 ELISA 或用于 CEDIA( 克隆酶供体免疫测定 )，和放射性同位素。在信号发射组的一个实施方案中也使用可通过电子化学发光检测的金属螯合物作为可检测的标记物，特别优选钌螯合物。在一个实施方案中，标记组是钌 ( 联吡啶 )32+ 螯合物。间接检测系统包含，例如检测试剂，例如用结合对的第一配偶体标记的检测抗体。合适的结合对的实例是半抗原或抗原 / 抗体，生物素或生物素类似物例如氨基生物素、亚氨基生物素 (iminobiotin) 或脱硫生物素 / 抗生物素蛋白或链霉抗生物素，糖 / 凝集素，核酸或核酸类似物 / 互补核酸，和受体 / 配体，例如类固醇激素受体 / 类固醇激素。在一个实施方案中，第一结合对成员选自半抗原、抗原和激素。在一个实施方案中，半抗原选自地高辛和生物素及其类似物。这样的结合对的第二配偶体，例如抗体、链霉抗生物素等通常被标记以允许直接检测，例如通过如上所述的标记物标记。
     在所有上述免疫检测方法中，选择允许使用的试剂结合的试剂条件，例如用于抗体与其相应抗原的结合。熟练技术人员使用术语复合物表示这样的结合的结果。通过现有技术程序将在本发明报导的测定方法中形成的复合物与治疗抗体的相应浓度相关联。可通过例如使用本发明报导的方法在相应的复合物的稀释系列中制备和测定复合物，并将得到的结果与各个复合物成分的浓度相关联进行这样的关联。取决于使用的检测试剂，此关联步骤将得到总治疗抗体、活性治疗抗体或结合抗原的治疗抗体的浓度。
     熟练技术人员将理解，本发明报导的方法将不仅仅显示总治疗抗体、结合抗原的治疗抗体、活性治疗抗体或甚至无活性治疗抗体的浓度。由于使用一种相同试剂，即结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体，在不同测定中得到的值可容易地彼此比较并甚至评估其比率。在另一个实施方案中，本发明涉及活性治疗抗体与总治疗抗体的比率。此比率将作为治疗抗体效力的指示。
     在实验过程中发现，在所有类型的人和黑猩猩 G 型抗体上存在的一个或多个表位在任何实验动物的抗体上都不存在。此表位的特征在于，其结合由保藏的细胞系 DSM ACC3006， DSM ACC3007， DSM ACC3008 产生的抗体。因此，本发明报导的一个方面是由细胞系 DSM ACC3006， DSM ACC3007 或 DSM ACC3008 产生的抗体。
     由于 3 种保藏的细胞系识别的表位在抗体的 Fab 区中是唯一的，本发明报导的另一个方面是与从保藏的细胞系 DSM ACC3006， DSM ACC3007， DSM ACC3008 得到的抗体结合的表位。在本发明报导的一个方面中，结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体的特征在于，所述抗体是与由细胞系 DSM ACC3006， DSM ACC3007， DSM ACC3008 产生的抗体之一结合相同表位的抗体。
     例如，可使用如下方法，其中在竞争检测系统的帮助下测定结合相同靶抗原的 2 种抗体的表位重叠。为此，例如在酶免疫测定的帮助下，检测研究中的抗体与已知抗体竞争结合固定的靶抗原的程度，例如使用由本发明报导的细胞系之一产生的抗体。为此，适当固定的靶抗原与标记形式的已知抗体和过量的所检测的抗体孵育。通过检测结合的标记可容易地确定所研究的抗体可在多大程度上置换结合的已知抗体。如果在相同的浓度下存在超过 20％的置换，在另一个实施方案中超过 30％的置换，或在更高的浓度下，在一个实施方 3 5 案中在研究中的抗体相对已知抗体过量 10 -10 - 倍的情况下，存在超过 70％的置换，在另一个实施方案中超过 80％的置换，则存在表位重叠且两种抗体结合相同的表位或相同表位的重叠部分。
     可在使用各个抗体的生物素化和地高辛化变体和来自不同物种的血清的夹心 ELISA 中显示从保藏的细胞系 DSM ACC3006， DSM ACC3007，和 DSM ACC3008 得到的抗体的特异性。在测定中 ( 见图 1)，从相同的细胞系得到结合同一表位的捕获和检测抗体。为了作为通用测定用于检测和定量实验动物血清中的人 IgG，这样的测定需要抗人 IgG 抗体，其结合位点独立于任何次级抗体修饰，例如糖基化或脱酰胺。否则，必须对每种待检测和定量的治疗抗体优化测定。此外，本发明报导的每种抗人 IgG 抗体也不同于分析的治疗抗体并可被用作参考标准和阳性对照。用此测定得到的特异性结果显示在图 2 中。
     可以看到，本发明报导的抗体对人和黑猩猩 G 型免疫球蛋白的免疫球蛋白高度特异，并显示了比抗体 M-R10Z8E9 更好的特异性，且不结合实验动物的 G 型免疫球蛋白。实验动物的所有值都远低于用不存在过氧化物酶的 ABTS 得到的空白值。
     也可在使用 BIAcore 技术的表面等离子共振实验中显示本发明报导的抗体的特异性。在图 3a) 至 c) 中显示了抗体 M-1.7.10( 从 DSM ACC3008 得到 )、 M-1.3.2( 从 DSM ACC3006 得到 ) 和 M-1.5.8( 从 DSM ACC3007 得到 ) 的 BIAcore 图表，从中可以看出抗体对人和黑猩猩 G 型免疫球蛋白是特异的。
     通过使用点印迹实验显示，本发明报导的抗体结合的表位是构象表位，因为在变性的人免疫球蛋白上结合消失 ( 图 4)。
     本发明报导的另一个方面是用于定量从实验动物获得的样品中的人抗体或其衍生物例如 Fab 片段的测定，所述测定包括本发明报导的生物素化抗体作为捕获抗体和本发明报导的地高辛化抗体作为示踪抗体。在图 5 中，显示了使用本发明报导的代表性抗体的此测定的图解测定设置和校准曲线 ( 捕获抗体：生物素化 M-1.7.10，分析物：人抗 IL13Rα1 抗体的 Fab 片段，示踪抗体：地高辛化 M-1.3.2)。此测定需要在 2 个不同的表位上结合人 IgG 的 Fab 片段的捕获和示踪抗体。本发明报导的抗体至少部分结合人或黑猩猩的 G 型免疫球蛋白抗体的轻链恒定区，并因此适用于此测定。
     本发明报导的另一个方面是一种测定，其包括特异性结合人 IgG 的不同结构域上的表位的捕获和示踪抗体。在此测定中，只有完整的治疗抗体将导致阳性测定结果和可检测的信号。在一个实施方案中，捕获抗体和示踪抗体一方面独立地选自本发明报导的抗体，另一方面独立地选自抗体 M-R10Z8E9。在根据用于证明在实验动物中的人 IgG 的结构完整性的此方面的代表性测定中，使用生物素化 M-R10Z8E9 作为捕获抗体，抗 IL13Rα1 抗体作为分析物，地高辛化 M-1.3.2 作为示踪抗体 ( 在图 6 中显示了此测定的图解测定设置和校准曲线 )。
     本发明报导的另一个方面是一种测定，其中使用抗人 IgG 抗体作为参考标准和 / 或阳性对照，以模拟抗药物抗体 (ADA)。这在找出最佳测定条件和检测测定的稳健性，即用不同的标准试剂 / 阳性对照检查测定性能的测定开发中可能有用。考虑到 ADA 将是多克隆的并可能针对 Fab 片段和 Fc 部分二者的事实，此设置特别有利。
     在本发明报导的另一个方面，在本发明报导的方法中使用从细胞系 DSM ACC3006， DSM ACC3007 和 DSM ACC3008 得到的抗体之一作为结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体。
     本发明报导的另一个方面涉及结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体在测定从实验动物获得的样品中的总治疗抗体、活性治疗抗体或结合抗原的治疗抗体的浓度中的用途。在一个实施方案中，在这样的方法中使用的抗体结合选自与从细胞系 DSM ACC3006， DSM ACC3007 或 DSM ACC3008 得到的抗体之一所识别的相同表位或重叠的表位。本发明报导的另一个方面涉及 2 种都结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体在测定从实验动物获得的样品中的总治疗抗体、活性治疗抗体或结合抗原的治疗抗体的浓度中的用途，其中一种抗体是捕获抗体，另一种抗体是示踪抗体。在一个实施方案中，治疗抗体是 Fab 片段。
     可选地，本发明报导的抗体可在包含单个免疫球蛋白类型的参考免疫球蛋白作为一部分的缀合物中使用。参考免疫球蛋白提供免疫球蛋白类型特异性恒定区，其可被抗免疫球蛋白类型抗体，例如抗人免疫球蛋白 G 抗体特异性结合。因此，参考免疫球蛋白提供了例如具有免疫球蛋白类型特异性标签的缀合物，其可被标签特异性抗体特异性识别。例如，如果标签是免疫球蛋白 G 恒定区，标签特异性抗体则是抗免疫球蛋白 G 抗体。这样的缀合物可在免疫测定中用作标准物或在免疫测定中用作阳性对照。
     在本发明报导的方法中，也可使用不同的捕获分子，例如完整抗体、 F(ab’ )2 片段、 Fab 片段或甚至单链抗体。
     本发明报导的分别表达抗体 M-1.3.2， M-1.5.8 和 M-1.7.10 的优选的杂交瘤细胞系 MAKM-1.3.2， MAKM-1.5.8， MAKM-1.7.10 在用于专利程序目的的国际认可的微生物保藏的布达佩斯条约下保藏在德意志微生物保藏中心 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)， Germany) ：
     细胞系 MABM-R10Z8E9 MAKM-1.3.2 保藏号 DSM ACC2708 DSM ACC3006 保藏日期 22.12.2004 24.09.200911CN 102656460 A MAKM-1.5.8 MAKM-1.7.10
     说明书24.09.2009 24.09.20099/16 页DSM ACC3007 DSM ACC3008细胞系和从所述细胞系得到的抗体是本发明报导的方面。
     如 WO 2006/072564 中报导的针对 IL13 受体 α1 蛋白的抗体 ( 抗 IL13Rα1 抗体 )，如 WO 2005/023872 中报导的针对 IL-1R 受体的抗体 ( 抗 IL-1R 抗体 )，如 WO 2003/070760 或 US 2005/0169925 中报导的针对淀粉样蛋白 β-A4 肽的抗体 ( 抗 Aβ 抗体 )，如 WO 2005/100402 或 US 2005/0226876 中报导的针对人 P- 选择素糖蛋白的抗体 ( 抗 P- 选择素抗体 )，如 WO 2004/096274 报导的针对 IL-6 受体的抗体 ( 抗 IL6R 受体 )，和如 WO 2004/087756 或 WO 2005/005635 中报导的针对 IGF-1 受体的抗体 ( 抗 IGF-1R 抗体 )( 都引入本发明作为参考 ) 示例了本发明报导的方法。
     提供了以下实施例和图以帮助理解本发明，本发明的真实范围在随附的权利要求书中陈述。应当理解，可以在陈述的程序中进行修改而不背离本发明的精神。
     附图描述
     图 1 定量实验动物中的人抗体 ( 人 IgG) 的完全通用测定： a) 测定形式； b) 捕获和检测试剂：抗体 M-R10Z8E9 ； c) 捕获和检测试剂抗体 M-1.7.10 ；治疗抗体：空心三角形：抗 IL13Rα1 抗体，空心方块：抗 Aβ 抗体，实心方块：抗 IL1R 抗体，实心三角形：抗 IL6R 抗体。
     图 2 使用本发明报导的抗体的测定得到的结果：使用的抗体从左到右为： M-R10Z8E9， M-1.3.2， M-1.5.8， M-1.7.10。
     图 3 本发明报导的抗体 a)M-1.3.2， b)M-1.5.8，和 c)M-1.7.10 的代表性表面等离子共振图。
     图 4 抗人 IgG 抗体的点印迹；选择针对 P- 选择素的抗体作为代表性参考抗体；在硝酸纤维素膜上点上天然 ( 左栏 ) 和变性形式 ( 右栏 ) 的参考抗体并通过相应的地高辛化抗 - 人 IgG 抗体检测； a)M-R10Z8E9， b)M-1.3.2， c)M-1.5.8， d)M-1.7.10。
     图 5 定量从实验动物获得的样品中的人抗体衍生物的测定： a) 图解测定设置， b) 校准曲线。
     图 6 用于证明在实验动物中的人 IgG 的结构完整性的测定： a) 图解测定设置， b) 校准曲线。
     图 7 选择对食蟹猴血清无可检测的交叉反应性的抗体。
     实施例 1
     人 IgG 的 F(ab’ )2 片段 ( 免疫原 ) 的制备
     将在 100mM 柠檬酸钠缓冲液， pH 3.7 中的全长人 G 型抗体 ( 人 IgG) 与胃蛋白酶孵育 (1μg 胃蛋白酶 /mg IgG)。通过分析型凝胶过滤分析片段化并在 90 分钟后通过加入磷酸钾将 pH 值调节为 6.5 终止反应。将混合物对 10mM 含 10mM 氯化钠的柠檬酸钠缓冲液， pH 5.5 透析后，将溶液应用于 SP- 琼脂糖层析柱，并通过分析型凝胶过滤分别分析在盐梯度中洗脱的分离的组分。将包含抗体 F(ab’ )2 片段的合并组分应用于具有固定的针对人 Fcγ 的多克隆抗体的亲和基质，以去除痕量 Fcγ 片段。合并流出液，浓缩至约 16mg/ml 和最终应用于凝胶过滤柱 (Superdex 200)。
     实施例 2单克隆抗人 IgG 抗体的产生
     a) 小鼠的免疫
     用混合 CFA( 完全弗氏佐剂 ) 的根据实施例 1 制备的 100μg 抗体 F(ab’ )2 片段腹膜内分别初次免疫 8-12 周龄的雌性 NMRI 小鼠。在 6 和 10 周后进行另外 2 次腹膜内免疫步骤，每次使用混合 IFA( 不完全弗氏佐剂 ) 的 100μg 抗体 F(ab’ )2 片段 / 小鼠。之后，在融合前 3 天进行静脉内加强免疫，每次使用 50μg 在 PBS( 磷酸缓冲液 ) 中的抗体 F(ab’ )2 片段。
     b) 融合和克隆
     根据 G a l f r é 和 M i l s t e i n ( G a l f r é ，G . 和 M i l s t e i n ，C ，M e t h o d s Enzymol.73(1981)3-46) 融合根据 a) 免疫的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞。将约 2.1x108 脾细胞与 4.2x107 骨髓瘤细胞 (P3x63-Ag8.653， ATCC CRL1580) 混合并离心 (300xg 和 4 ℃ 下 10 分钟 )。然后用不含 FCS( 胎牛血清 ) 的 RPMI 1640 培养基洗 1 次细胞，然后在 50ml 尖底瓶中以 400xg 再次离心。然后，加入 1ml PEG( 聚乙二醇，分子量 4,000g/mol)，通过吹吸进行混合。在 37 ℃水浴 1 分钟后，逐滴加入 5ml 不含 FCS 的 RPMI1640，混合悬浮液，加入含有 10 ％ (v/v)FCS 的 RPMI 1640 至 50ml 的终体积，然后离心。在含有 10 ％ FCS 的 RPMI 1640 中重悬沉淀的细胞，然后置于含有生长因子重组鼠白介素 6(Peprotech， 0.5ng/ ml) 的次黄嘌呤 - 重氮丝氨酸选择培养基 (100mmol/l 次黄嘌呤， 1μg/ml 重氮丝氨酸，在含有 10％ FCS 的 RPMI 1640 中 ) 中。11 天后，测定原代培养物的特异性抗体合成 ( 见实施例 3)。通过使用流式细胞仪 (FACSAria， BD Biosciences) 在含有生长因子重组鼠白介素 6(Peprotech， 0.5ng/ml) 的培养基中将单细胞置于 96 孔细胞培养板中将展示结合生物素化抗体 F(ab′ )2 片段以及生物素化人正常 IgG 的原代培养物个体化。按照此方案，得到细胞系 DSM ACC3006， DSM ACC3007 和 DSM ACC3008。抗体 M-1.7.10 是 IgG2a 类，抗体 M-1.5.8 和 M-1.3.2 是 IgG1 类。
     c) 免疫球蛋白的产生
     以 1.0x105 和 2.2x105 细胞 /ml 的初始细胞密度 ( 活细胞 ) 在补充 10 ％ FCS 和通常使用的补充物的 RPMI 1640 中接种在 b) 中得到的杂交瘤细胞系，并在细胞培养瓶 (T-flask)(Celline， IBS) 中扩增约 3 周的时间。在收获的培养上清中得到浓度在 0.7mg/ ml 和 1.5mg/ml 之间的单克隆抗体。根据标准蛋白质化学方法，例如在 Bruck， C.，等人， Methods Enzymol.121(1986)587-596 中报导的方法从培养上清中进行抗体的纯化。
     实施例 3
     用于检测抗人 IgG 抗体的筛选测定
     a) 初次筛选与人 IgG 结合的抗体
     为了测定杂交瘤细胞培养上清中的抗体的特异性，分别用在补充 1％ (w/v)BSA II 的 PBS 中生物素化人源化 IgG( 用于免疫过程， 250ng/ml) 或生物素化人 IgG(250ng/ml) 包被用重组链霉抗生物素 (MicroCoat， Bernried， lot MC 1098) 预包被的 MTP( 微滴定板 ) (100μl/ 孔，在室温孵育 60 分钟，同时摇晃 )，随后用 0.9％ (w/v)NaCl/0.05％ Tween 20 洗三次。下一步，每孔加入 100μl 待测定的抗体溶液 ( 培养上清 )，并在室温孵育 60 分钟，同时摇晃。在每孔用 0.9 ％ (w/v)NaCl/0.05 ％ Tween 20 洗三次的步骤后，加入 100μl 辣根过氧化物酶标记的多克隆绵羊抗小鼠 Fcγ 抗体的 F(ab′ )2 片段以检测结合的样品抗体，并在室温孵育 60 分钟，同时摇晃。之后，如上进行洗涤。最后，每孔加入 100μl ABTS (Roche Diagnostics GmbH， Mannheim， Germany ；货号 1684302)。在室温孵育 30 分钟后，在市售的微滴定板 ELISA 读取器中在 405 和 492nm[405/492] 处测量消光 (OD)。此筛选得到与人源化 IgG 以及人 IgG 结合良好的抗体的选择。对这样选择的抗体进一步进行测定 b)。
     b) 选择对其他物种的 IgG 具有最低交叉反应性的抗体
     第一步，使生物素化人 IgG 结合用链霉抗生物素包被的微滴定板 (SA-MTP) 的孔。通过洗涤去除过量的未结合的抗体。然后在缓冲液和 10％食蟹猴血清中稀释样品和参考标准 ( 例如，实施例 2 中得到的抗人 IgG 抗体 )。将稀释的样品加入板并在室温孵育 60 分钟，同时摇晃。在洗去未结合的物质后，对板中的孔加入地高辛形式的第一步中的人 IgG 并再孵育 60 分钟。在洗涤后，用抗地高辛抗体 -HRP 缀合物检测结合的地高辛化抗体。抗体 - 酶缀合物的 HRP( 辣根过氧化物酶 ) 催化 ABTS 底物的显色反应。通过 ELISA 读取器在 405nm 波长处测量信号 ( 参考波长： 490nm)。一式三份测定每种血清样品的吸光度值。
     选择了在食蟹猴血清和缓冲液中具有高测定反应的抗体 ( 见图 7)。此第二次筛选得到对其他物种的 IgG 具有最低交叉反应性的与人 IgG 结合良好的抗体的选择。
     实施例 4
     通过表面等离子共振评估抗体结合 / 特异性用 BIAcore T100 仪器使用 CM5 芯片进行所有测量。通过标准胺偶联实现抗体对此芯片的包被。除非另外指出，在 HBS 缓冲液 (HEPES， NaCl， pH 7.4) 中在 25℃下进行所有孵育。通过胺偶联在 CM-5 芯片的一个流动池上固定饱和量的多克隆山羊抗小鼠 Fcγ 抗体。随后，以 30μl/ 分钟的流速注入不同的针对人 IgG 的单克隆小鼠抗体 60 秒并与抗小鼠 Fc 抗体结合。在 HBS 缓冲液中稀释所有动物血清。通过以 30μl/ 分钟的流速注入 1 ∶ 100 稀释的血清并孵育 60 秒分析结合。通过用 HBS 缓冲液洗涤芯片表面 180 秒测量解离。使用来自 BIAcore 的 BIA 评估软件用 1 ∶ 1 的 Langmuir 拟合模型计算解离常数值 ( ＝ KD)。用于所有动物血清，此计算基于 IgG 水平是 15mg/ml 的假设。选择开始注入检测抗体后 80 秒的信号值用于比较结合的 IgG 的量 ( 见表 1)。
     表1：动物血清结合不同单克隆抗人 IgG 抗体的结合信号 [RU] 和 KD 值
     表 1 显示， 3 种抗人 IgG 抗体不与除了黑猩猩以外的其他物种的血清交叉反应。相反地，对 M-R10Z8E9 检测到与狗和绒猴的另外的相互作用。
     实施例 5
     a) 小鼠单克隆抗人 IgG 抗体的纯化
     将在实施例 2 中得到的细胞系的发酵上清浓缩约 10 倍并转移至含有 20mM TRIS， 1M 硫酸铵， pH 9.0 的缓冲液中，然后应用于蛋白质 A- 琼脂糖凝胶层析柱。用 0.2M 柠檬酸钠， 0.2M 硫酸铵在 pH5.0 得到的洗脱液针对磷酸缓冲液， pH7.5 透析。使用针对牛 IgG 的固
     定的抗体通过免疫吸附分离牛 IgG 污染物 ( 来自发酵液中的 FCS)。
     b) 生物素化抗人 IgG 抗体的制备
     将在磷酸缓冲液， pH 8.5 中的 a) 中得到的抗人 IgG 抗体调整为约 5mg/ml 的蛋白质浓度。在 DMSO 中溶解 D- 生物素 - 氨基己酸 -N- 羟基琥珀酰亚胺并以 1 ∶ 5 的摩尔比例加入抗体溶液。在 60 分钟后通过加入 L- 赖氨酸终止反应，并通过对 50mM 具有 150mM NaCl 的 pH7.5 的磷酸钾缓冲液透析去除过剩的标记试剂。
     c) 地高辛化抗人 IgG 抗体的制备
     将在磷酸缓冲液， pH 8.5 中的 a) 中得到的抗人 IgG 抗体调整为约 5mg/ml 的蛋白质浓度。在 DMSO 中溶解地高辛 3-O- 甲基羰基 -ε- 氨基己酸 -N- 羟基琥珀酰亚胺并以 1 ∶ 4 的摩尔比例加入抗体溶液。在 60 分钟后通过加入 L- 赖氨酸终止反应，并通过对 50mM 具有 150mM NaCl 的 pH7.5 的磷酸钾缓冲液透析去除过剩的标记试剂。
     实施例 6
     用于定量来自实验动物的样品中的人抗体 ( 人 IgG) 的完全通用测定
     在第一步中，生物素化抗体 M-R10Z8E9( 板 1) 或抗体 M-1.7.10( 板 2) 与链霉抗生物素包被的微滴定板 (SA-MTP) 结合。通过洗涤去除过量的未结合抗体。对板加入浓度系列的掺在食蟹猴血清中的样品 / 标准物，例如抗 IL1R 抗体、抗 IL13Rα1 抗体、抗 Aβ 抗体和抗 -IL6R 抗体并在室温下孵育 60 分钟，同时摇晃。在洗掉未结合的抗体后，对板加入 100μl 地高辛化抗体 M-R10Z8E9( 板 1) 或抗体 M-1.7.10( 板 2)。洗涤后，用抗地高辛抗体 -HRP 缀合物检测结合的地高辛化抗体。一式三份测定每种血清样品的吸光度值 ( 见图 1)。
     表2：捕获和检测试剂抗体 M-R10Z8E9 的 OD 数据
     表3：捕获和检测试剂抗体 M-1.7.10 的 OD 数据
     实施例 7 用于定量来自实验动物的样品中的人抗体衍生物 ( 例如 Fab 片段 ) 的测定在第一步中，生物素化抗体 M-1.7.10 与链霉抗生物素包被的微滴定板 (SA-MTP) 结合。通过洗涤去除过量的未结合抗体。对孔加入掺在食蟹猴血清中的样品 / 标准物，例如抗 IGF1R 抗体 Fab 片段并在室温下孵育 60 分钟，同时摇晃。在洗掉未结合的抗体后，对板的每个孔加入 100μl 地高辛化抗体 M-1.3.2。洗涤后，用抗地高辛抗体 -HRP 缀合物检测结合的地高辛化抗体。一式三份测定每种血清样品的吸光度值 ( 见图 5)。
     表4： OD 数据
     ng/ml 0.00 1.56 3.13 6.25 12.50 25.00 50.00 100.00
     OD 405nm 0.042 0.047 0.057 0.103 0.247 0.694 1.535 1.882 SD 0.000 0.000 0.002 0.001 0.016 0.007 0.043 0.013实施例 8 证明来自实验动物的样品中的人 IgG 的结构完整性的测定在第一步中，针对人 Fc 的生物素化抗体 M-R10Z8E9 与链霉抗生物素包被的微滴定板 (SA-MTP) 结合。通过洗涤去除过量的未结合抗体。对板加入掺在食蟹猴血清中的样品 / 标准物，例如抗 IL13Rα1 抗体，并在室温下孵育 60 分钟，同时摇晃。在洗掉未结合的抗体后，对板加入 100μl 地高辛化抗体 M-1.3.2。洗涤后，用抗地高辛抗体 -HRP 缀合物检测结合的地高辛化抗体。一式三份测定每种血清样品的吸光度值 ( 见图 3)。
     表5： OD 数据
     实施例 9
     用于定量来自实验动物的样品中的人抗体 ( 人 IgG) 的测定，使用 Fc 融合蛋白 ( 抗原 ) 组合本发明报导的抗人 IgG 抗体
     人受体 X 的可溶性胞外结构域与人 IgG1 型的 Fc 片段融合。在第一步中，生物素化融合蛋白 (Bi-X-Fc) 与链霉抗生物素包被的微滴定板 (SA-MTP) 结合。通过洗涤去除过量的未结合受体。之后，掺在食蟹猴血清中的抗 X 抗体与固定的人受体 X 结合。在洗掉未结合的物质后，用 a) 针对人 Fc 片段的地高辛化的单克隆抗体 ( 抗体 M-R10Z8E9) 或用 b) 针对人 Fab 片段的地高辛化的单克隆抗体 ( 抗体 M-1.7.10) 检测结合的抗 X 抗体，然后与辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体孵育。一式三份测定每种血清样品的吸光度值。
     实施例 10
     点印迹——构象对线性表位
     为了测定抗人 IgG 抗体检测的是构象表位还是线性表位，进行了点印迹分析。
     在此试验中，将天然或变性形式的抗原 - 蛋白 ( 人 IgG) 点在硝酸纤维素膜上。为了得到变性形式，在振动器上在 37℃下过夜孵育抗原 - 蛋白与 SDS。将 2 种形式以浓度系列点在膜上。在膜完全干燥后，用封闭缓冲液 (Roti-Block， Roth， Germany) 在室温封闭表面 60 分钟，同时摇晃。在洗涤膜后，将其与包含地高辛化抗体 M-R10Z8E9 或 3 种不同抗体 M-1.3.2， M-1.5.8 或 M-1.7.10 之一的溶液孵育。洗涤后，用抗地高辛抗体 -HRP 缀合物检测结合的地高辛化抗体。抗体 - 酶缀合物的 HRP 催化 BM-BLUE 底物的显色反应。可直接目测控制信号并用扫描仪捕获。
     实施例 11
     通过桥连 ELISA 测定评估抗体结合 / 特异性
     为了测定研究的抗人抗体结合的是哪类人 IgG 亚类，进行桥连 ELISA 分析。
     在第一步中，生物素化抗体 M-R10Z8E9， M-1.3.2， M-1.5.8 和 M-1.7.10 与链霉抗生物素微滴定板结合。在第二步中，孵育不同亚类的人 IgG 抗体。制备稀释系列的人 IgG1κ ；人 IgG1λ ；人 IgG4 ；嵌合人 IgG1 ；人 IgG2( 多克隆纯化的人 IgG2) 和人 IgG3( 多克隆纯化的人 IgG3)，并在用生物素化抗人抗体包被的链霉抗生物素微滴定板上孵育。在洗涤步骤后，以地高辛化形式使用用于包被的相同抗体作为检测抗体。这表示使用相同的抗人抗体克隆用于包被和检测。例如，用 M-1.7.10Bi 包被一块板并使用 M-1.7.10Dig 检测。在孵育和洗涤步骤后，此步骤之后是与辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体孵育。一式三份测定每种血清样品的吸光度值。
     表6：桥连 ELISA 分析的总结
     发明背景
     自从 Koehler 和 Milstein 在 1974 年开发了首例单克隆抗体以来，进行了许多努力以开发适用于治疗人的抗体。首例可获得的单克隆抗体已在小鼠和大鼠中被开发。在过去 10 年中，越来越多的人单克隆抗体或人源化单克隆抗体已进入市场。熟知的实例包括例如来自 F.Hoffmann-La Roche AG， Basel 的 Herceptin 和 MabThera
     极大量的人或人源化抗体正在调查研究中，并在能够考虑进入人体进行初步试验以前需要在实验动物中研究。必须研究如生物可用性和抗体清除等 ( 只提到其中 2 种 ) 的重要标准。许多这些研究需要在实验动物自身抗体的背景下定量治疗抗体。在大多数情况下使用哺乳动物作为实验动物。通常最先在啮齿类如小鼠或大鼠中评估毒理学。在更高级的药物开发阶段，特别是在药物进入人体以前，甚至必须将猴子包括在这样的临床前研究中。
     哺乳动物循环中通常具有约 10 至约 30 毫克 /ml 之间的抗体。治疗单克隆抗体一般必须以范围从约 1 纳克 /ml 至约 100 毫克 /ml 之间的血清水平进行检测。因此，必须在实验动物抗体的背景下检测治疗抗体，所述实验动物抗体为约 100 倍至 1 千万倍过量。
     在实验动物抗体的背景下检测人或人源化治疗抗体是对药理学家的极为严峻的任务。检测动物与智人的亲缘关系越近，人或人源化抗体的检测就变得越来越困难。
     在 WO 2008/031532 中报导了一种抗药物抗体测定。在 WO 2006/066912 中报导了在实验动物中检测治疗抗体。在 US 5,332,665 中报导了物种特异性、高亲和力的单克隆抗体。
     发明概述
     本发明首先报导了在人和黑猩猩的 G 型免疫球蛋白的抗体上的构象表位，其不存在于通常使用的实验动物中。其次报导了与此表位结合的非交叉反应性抗人 IgG 抗体和抗黑猩猩 IgG 抗体。第三，报导了使用这些抗体的测定。
     本发明报导的一个方面是结合人或黑猩猩 IgG(G 亚类的免疫球蛋白 ) 但不结合犬和绒猴 (marmoset)IgG 的抗体。
     在一个实施方案中，所述抗体不结合犬、恒河猴 (Rhesus-monkey)、绒猴、狒狒和食蟹猴 (cynomolgus)IgG。在另一个实施方案中，所述抗体特异性结合人和黑猩猩 IgG。在另外的实施方案中，通过表面等离子共振测定的结合人或黑猩猩 IgG 的 KD 值是 10-9mol/l 或更低，结合犬、恒河猴、绒猴、狒狒和食蟹猴 IgG 的 KD 值是 10-6mol/l 或更高。在一个实施方结合案中，结合人或黑猩猩 IgG 的 KD 值是 10-9mol/l 至 10-13mol/l。在另一个实施方案中，犬、恒河猴、绒猴、狒狒和食蟹猴 IgG 的 KD 值不能通过表面等离子共振测定。在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。
     本发明报导的另一个方面是特异性结合包含 κ 轻链恒定结构域的 IgG1(G1 亚类的免疫球蛋白 ) 的抗体。
     在一个实施方案中，所述抗体还结合 IgG2。在另一个实施方案中，所述抗体还结合 IgG4。在另一个实施方案中，所述抗体不结合 IgG3。在一个实施方案中，所述抗体不结合包含 λ 轻链恒定结构域的 IgG1。在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。
     本发明报导的从细胞系 DSM ACC3006(M-1.3.2)， DSM ACC3007(M-1.5.8) 和 DSM ACC3008(M-1.7.10) 得到的抗体与例如细胞系 DSM ACC2708 产生的抗体 M-R10Z8E9 比较时显示了降低的交叉反应性，它们结合 Fab 区中的不同表位，不受邻近的糖基化位点的影响，并可在免疫测定中混合用于测定 Fab 治疗抗体，因为每种抗体的结合位点在 Fab 片段中仅出现 1 次。
     本发明报导的各方面是细胞系 DSM ACC3006， DSM ACC3007 和 DSM ACC3008，以及从所述细胞系得到的各个抗体和这些抗体在免疫测定中的用途。
     另一个方面是一种试剂盒，其包含
     a) 从 DSM ACC3006，或 DSM ACC3007，或 DSM ACC3008，或 DSM ACC2708 得到的抗体的生物素化形式，
     b) 从 DSM ACC3006，或 DSM ACC3007，或 DSM ACC3008，或 DSM ACC2708 得到的抗体的地高辛化 (digoxygenylated) 形式。本发明报导的另一个方面是检测从实验动物得到的样品中的治疗抗体的方法，其包括以下步骤
     a) 提供待分析的样品，
     b) 将所述样品与和本发明报导的抗体结合相同表位的抗体孵育，
     c) 任选地将所述样品与适于选择性检测总治疗抗体、活性治疗抗体或结合抗原的治疗抗体的试剂孵育，和
     d) 任选地通过校准曲线将在 (b) 或 (c) 中形成的复合物与治疗抗体的浓度相关联。
     本发明报导的另一个方面是使用包含捕获抗体和示踪抗体的抗原桥连免疫测定，进行免疫学测定从实验动物得到的样品中的治疗抗体的方法，其中所述捕获抗体和示踪抗体都独立地选自和本发明报导的抗体结合相同表位的抗体。
     在一个实施方案中，所述免疫测定是夹心免疫测定。在另一个实施方案中，抗体与其缀合配偶体的缀合通过经由抗体的氨基酸骨架的 N- 端和 / 或 ε- 氨基 ( 赖氨酸 )、不同赖氨酸的 ε- 氨基、羧基、巯基、羟基和 / 或酚官能团，和 / 或抗体的碳水化合物结构的糖醇基的化学结合进行。在另外的实施方案中，捕获抗体通过特异性结合对固定。在一个实施方案中，捕获抗体与生物素缀合并通过固定化的抗生物素蛋白或链霉抗生物素进行固定。在另一个实施方案中，示踪抗体通过特异性结合对与可检测的标记物缀合。在一个实施方案中，示踪抗体与地高辛缀合并通过针对地高辛的抗体进行与可检测的标记物的连接。在另一个实施方案中，治疗抗体是 Fab。在一个实施方案中，实验动物选自绒猴和绢毛猴 (tamarin)、旧大陆猴 (old world monkey)、侏儒狐猴和鼠狐猴 (dwarf and mouse lemur)、长臂猿和小猿 (lesser ape)、美狐猴 (true lemur) 家族的成员，以及其杂种。在一个实施方案中，实验动物选自狗、恒河猴、绒猴、狒狒和食蟹猴。在一个实施方案中，实验动物是猕猴 (Macaca monkey)。在另一个实施方案中，结合治疗抗体但不结合实验动物的免疫球蛋白的抗体是本发明报导的抗体。在一个实施方案中，治疗抗体是人或人源化抗体。在另一个实施方案中，
     人或人源化抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，检测总治疗抗体，在另一个实施方案中检测活性治疗抗体，在另一个实施方案中检测与其抗原结合的治疗抗体。
     本发明报导的另一个方面是结合治疗抗体但不结合实验动物的免疫球蛋白的抗体在测定从实验动物获得的样品中的总治疗抗体、活性治疗抗体或抗原结合的治疗抗体的浓度中的用途，其中所述抗体和本发明报导的抗体结合相同的表位。在一个实施方案中，所述抗体是本发明报导的抗体。
     本发明报导的另一个方面是抗体组合物，其包含由细胞系 DSM ACC3006、细胞系 DSM ACC3007、细胞系 DSM ACC3008 和 / 或细胞系 DSM ACC2708 产生的抗体的混合物。
     另一个方面是本发明报导的抗体组合物在本发明报导的方法中的用途。
     发明详述
     名为 M-R10Z8E9 的非交叉反应性抗人 IgG 抗体 ( 从细胞系 DSM ACC2708 中获得 ) 结合 G 型人免疫球蛋白的 CH2 结构域中的靠近糖基化位点 Asn297 的表位。本发明报导的抗体 M-1.3.2， M-1.5.8 和 M-1.7.10 与抗体 M-R10Z8E9 相比显示了降低的交叉反应性，结合 Fab 区中的不同表位，不受邻近的糖基化位点的影响，且可在免疫测定中混合用于测定治疗抗体，特别是 Fab 治疗抗体，因为每种抗体的结合位点都在 Fab 片段中存在。
     术语 “治疗抗体” 表示在临床研究中检测的被批准用作人治疗剂的抗体，且其可对个体施用用于治疗疾病。在一个实施方案中，治疗抗体是单克隆抗体。在另一个实施方案中，治疗抗体选自从类人猿 (great ape) 得到的抗体，从用人抗体基因座转化的动物得到的抗体，人单克隆抗体，或人源化单克隆抗体。在一个实施方案中，治疗抗体是人单克隆抗体。在另一个实施方案中，治疗抗体是人源化单克隆抗体。治疗抗体被广泛用于多种疾病的治疗，例如肿瘤疾病 ( 例如血液和实体恶性肿瘤，包括非何杰金氏淋巴瘤、乳腺癌和结肠直肠癌 )，免疫疾病，中枢神经疾病，血管疾病或传染病。这样的抗体为，例如，针对 CD20， CD22， HLA-DR， CD33， CD52， EGFR， G250， GD3， HER2， PSMA， CD56， VEGF， VEGF2， CEA， Levis Y 抗原， IL-6 受体 (IL6R) 或 IGF-1 受体 (IGF1R) 的抗体。
     术语 “抗体”包含抗体结构的多种形式，包括整个抗体和抗体片段。本发明报导的抗体在一个实施方案中是人抗体，人源化抗体，嵌合抗体，或 T 细胞抗原耗尽的抗体 (T-cell antigen depleted antibody)。例如在 Morrison， S.L.，等人， Proc.Natl. Acad Sci.USA 81(1984)6851-6855 ； US 5,202,238 和 US 5,204,244 ； Riechmann， L.，等人， Nature 332(1988)323-327 ； Neuberger， M.S.，等人， Nature 314(1985)268-270 ； Lonberg， N.， Nat.Biotechnol.23(2005)1117-1125 中描述了抗体的基因工程。
     非人 ( 例如啮齿类 ) 抗体的 “人源化” 形式是包含来源于非人抗体和来源于人抗体的部分序列的嵌合抗体。大部分人源化抗体来源于人抗体 ( 接受体抗体 )，其中高变区的残基被具有期望的特异性和亲和力的非人物种，例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的的高变区 ( 供体抗体 ) 的残基替换。有时候，人抗体的框架区 (FR) 残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含另外的修饰，例如在接受体抗体或供体抗体中不存在的氨基酸残基。这样的修饰导致这样的接受体或供体抗体的变体，其与相应的亲本序列同源但不同一。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。
     大体上，人源化抗体将包含至少一个、通常 2 个可变结构域的基本全部，其中高变环对应非人供体抗体的高变环， FR 的全部或基本全部是人接受体抗体的 FR。人源化抗体任选地也包含至少一部分抗体恒定区，通常是人抗体恒定区的一部分。
     人源化非人抗体的方法已在领域中描述。在一个实施方案中，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为 “输入” 残基，其一般来自 “输入” 可变结构域。可基本上遵照 Winter 及其同事的方法，通过将高变区序列取代为相应的非人抗体的序列进行人源化。因此，这样的 “人源化” 抗体是嵌合抗体，其中实质上少于完整的人可变结构域的序列被来自非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体一般是人抗体，其中一些高变区残基和可能有一些框架区残基被来自啮齿类或非人灵长类抗体的类似位点中的残基取代。
     本发明使用的术语 “单克隆抗体” 指从基本均质的抗体群体中得到的抗体，即组成群体的个体抗体是同一的，除了可能以少量存在的可能天然发生的突变以外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与包含针对不同抗原位点 ( 决定簇或表位 ) 的不同抗体的多克隆抗体制品相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个抗原位点。除了其特异性以外，单克隆抗体的优势在于其合成可不被其他抗体污染。修饰语 “单克隆” 表示抗体的特征是从基本均质的抗体群体中获得，而不应被视为需要通过任何特定方法产生所述抗体。本发明使用的术语 “实验动物”表示以下灵长目的各科成员，即包含绒猴和绢毛猴 ( 绒猴 (Callitrichidae) 科 )，新大陆猴 ( 卷尾猴 (Cebidae) 科 )，旧大陆猴 ( 猕猴 (Cercopithecidae) 科，例如猕猴 (Macaca monkey))，侏儒狐猴和鼠狐猴 ( 鼠狐猴 (Cheirogaleidae) 科 )，指狐猴 (aye-aye)( 指猴 (Daubentoniidae) 科 )，婴猴 (bushbaby) 和夜猴 (galago)( 婴猴 (Galagonidae) 科 )，长臂猿和小猿 ( 长臂猿 (Hylobatidae) 科 )，马达加斯加大狐猴 (indris)，马达加斯加狐猴 (sifaka)，和其亲属 ( 大狐猴 (Indridae) 科 )，美狐猴 ( 狐猴 (Lemuridae) 科 )，懒猴 (lorise)( 懒猴 (Loridae) 科 )，嬉猴 (sportive lemur)( 嬉猴 (Megaladapidae) 科 )，眼镜猴 (tarsier)( 眼镜猴 (Tarsiidae) 科 )，及其杂种。
     在一个实施方案中，实验动物选自绒猴和绢毛猴、旧大陆猴、侏儒狐猴和鼠狐猴、长臂猿和小猿、美狐猴各科的成员，及其杂种。在此实施方案中，排除了离人类最近的亲属，类人猿，特别是黑猩猩、倭黑猩猩 (bonobo)、大猩猩 (gorilla) 和猩猩 (orangutan) 的组。
     术语 “样品” 表示从实验动物移取的任意组织或液体样品。在一个实施方案中，样品可为液体样品如唾液、尿、全血、血浆或血清。在另一个实施方案中，样品将为全血、血浆或血清。
     “结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体” 将以至少 10-9mol/l 的解离常数 ( ＝ KDiss)，在另一个实施方案中以至少 10-10mol/l 的 KDiss 结合治疗抗体。同时通过 10-7mol/ l 或更差的 KDiss 确保不结合实验动物抗体的性能。在另一个实施方案中，结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体在分别针对实验动物的 G 型免疫球蛋白和针对人或黑猩猩的 G 型免疫球蛋白的反应性之间将具有至少 100 倍的 KDiss 差距。
     大体上，术语 “结合” 表示抗体以 10-9mol/l 或更低的解离常数 ( ＝ KD ＝ KDiss.)，在 -10 另一个实施方案中以至少 10 mol/l 的 KD 结合其抗原或相应的抗体受体 ( 看相应的上下文而定 )。同时通过 10-7mol/l 或更高 ( 例如 10-5mol/l) 的 KD 确保不结合的性能。在另一个实施方案中，结合第一抗体但不结合第二抗体的抗体在分别针对第一种 G 型免疫球蛋白和
     针对第二种 G 型免疫球蛋白的反应性之间将具有至少 100 倍的 KD 差距。
     在一个实施方案中通过在 BIAcore 仪器上的表面等离子共振评估抗体的结合性能，特别是 KDiss。在此方法中，通过表面等离子共振 (SPR) 的变化评估结合性能。可便利地将研究中的抗体与固相 ( 称为芯片 ) 结合并用于评估单克隆抗体、多克隆抗体或甚至包含 IgG 的血清与此包被的芯片的结合。
     研究中的结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体可为单克隆抗体，这样的抗体的片段，以及包含这样的抗体的结合结构域的基因构建体。可使用保留上述结合治疗抗体但不结合实验动物的抗体的标准的任意抗体片段。
     可能必须在临床前研究期间评估与治疗抗体在实验动物中的应用相关的多个方面。在特定设置下，可能与分析存在的治疗抗体的总量相关，或分析治疗抗体的特定片段，或治疗抗体的特定修饰，或与抗原结合的治疗抗体的浓度，或仍然能够结合抗原的治疗抗体的部分 (fraction) 可能是重要的。在一个实施方案中，本发明报导的抗体和方法可用于分别检测总治疗抗体、活性治疗抗体或结合抗原的治疗抗体。
     术语 “总治疗抗体” 表示检测的任意抗体，与抗体是否有活性 ( 即仍然可与其抗原反应 )、无活性和 / 或结合抗原无关。术语 “活性治疗抗体” 表示在实验动物中存在的仍然能够结合其抗原的治疗抗体。例如，这样的抗体在其抗原结合位点上还未结合其抗原或任意其他分子。
     术语 “结合抗原的治疗抗体” 表示在实验动物的循环中存在的与其抗原结合的治疗抗体。
     可使用本发明报导的抗体和方法直接检测如上定义的总治疗抗体、活性治疗抗体或结合抗原的治疗抗体。另外，可以检测无活性的治疗抗体的其他形式，例如被抗药物抗体或抗个体基因型抗体或特别是中和抗药物抗体结合的治疗抗体。
     另外，也可以间接评估任意 “无活性的治疗抗体” 。这样的无活性的治疗抗体可为，例如与其抗原结合的治疗抗体，或与交叉反应性抗原结合的治疗抗体，或被针对治疗抗体的自身或抗个体基因型抗体阻断的治疗抗体。如果总抗体量大于活性抗体和结合抗原的抗体的和，将存在包含未与其相应抗原结合的无活性抗体的另外一部分抗体。
     可在例如所谓的竞争免疫测定系统或在所谓的夹心型测定系统中检测总治疗抗体。这样的测定可在一个不含洗涤步骤的实施方案 ( 均质免疫测定 ) 中进行，或在含有洗涤步骤的另一个实施方案 ( 异质免疫测定 ) 中进行。
     在一个实施方案中，在夹心型免疫测定中检测总治疗抗体，其中结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体在这样的夹心测定的两侧使用。在这样的夹心的一侧使用的抗体与固相结合或能够与固相结合 ( 通常被称为捕获抗体 )，而在这样的夹心的另一侧的抗体以便于直接或间接检测的方式被标记 ( 所谓的检测抗体 )。在这样的夹心测定程序中结合的检测抗体的量与所研究的样品中的治疗抗体的量直接相关。
     可通过方便的现有技术程序实现样品中的活性治疗抗体的检测。然而，总治疗抗体或与其抗原结合的治疗抗体的部分的检测相当复杂，并且需要相当不同的测定设置，特别是需要定制的试剂用于每个不同的测定。使用本发明报导的结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体，可以在彼此类似的检测系统中评估活性治疗抗体、总治疗抗体或结合抗原的治疗抗体的部分。当在这些治疗抗体的不同部分之间进行定量比较时，此类总治疗抗
     体、活性治疗抗体或结合抗原的治疗抗体的比较测定应当具有优势。
     在一个实施方案中，设置夹心型测定形式用于检测活性治疗抗体。在另一个实施方案中，结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体被用作捕获抗体，且这样的夹心测定的检测侧使用标记形式的抗原，或在结合抗原后使用不结合或不竞争结合治疗抗体识别的表位的第二抗体，其中所述第二抗体是可特异性检测的和 / 或以便于直接或间接检测的方式被标记。
     在一个实施方案中以夹心型测定的形式检测结合抗原的治疗抗体，使用结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体作为捕获试剂。在一个实施方案中在检测中使用在不与治疗抗体的表位竞争的表位上结合抗原的第二抗体。在一个实施方案中以便于直接或间接检测的方式标记第二抗体。
     为了直接检测，标记组可选自任意已知的可检测的标记组，例如染料、发光标记组如化学发光组，例如吖啶酯或二氧杂环丁烷 (dioxetane)，或荧光染料，例如荧光素、香豆素、罗丹明、嗪、试卤灵 (resorufin)、青色素及其衍生物。标记组的另外实例是发光金属复合物，例如钌或铕复合物，酶，例如用于 ELISA 或用于 CEDIA( 克隆酶供体免疫测定 )，和放射性同位素。在信号发射组的一个实施方案中也使用可通过电子化学发光检测的金属螯合物作为可检测的标记物，特别优选钌螯合物。在一个实施方案中，标记组是钌 ( 联吡啶 )32+ 螯合物。间接检测系统包含，例如检测试剂，例如用结合对的第一配偶体标记的检测抗体。合适的结合对的实例是半抗原或抗原 / 抗体，生物素或生物素类似物例如氨基生物素、亚氨基生物素 (iminobiotin) 或脱硫生物素 / 抗生物素蛋白或链霉抗生物素，糖 / 凝集素，核酸或核酸类似物 / 互补核酸，和受体 / 配体，例如类固醇激素受体 / 类固醇激素。在一个实施方案中，第一结合对成员选自半抗原、抗原和激素。在一个实施方案中，半抗原选自地高辛和生物素及其类似物。这样的结合对的第二配偶体，例如抗体、链霉抗生物素等通常被标记以允许直接检测，例如通过如上所述的标记物标记。
     在所有上述免疫检测方法中，选择允许使用的试剂结合的试剂条件，例如用于抗体与其相应抗原的结合。熟练技术人员使用术语复合物表示这样的结合的结果。通过现有技术程序将在本发明报导的测定方法中形成的复合物与治疗抗体的相应浓度相关联。可通过例如使用本发明报导的方法在相应的复合物的稀释系列中制备和测定复合物，并将得到的结果与各个复合物成分的浓度相关联进行这样的关联。取决于使用的检测试剂，此关联步骤将得到总治疗抗体、活性治疗抗体或结合抗原的治疗抗体的浓度。
     熟练技术人员将理解，本发明报导的方法将不仅仅显示总治疗抗体、结合抗原的治疗抗体、活性治疗抗体或甚至无活性治疗抗体的浓度。由于使用一种相同试剂，即结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体，在不同测定中得到的值可容易地彼此比较并甚至评估其比率。在另一个实施方案中，本发明涉及活性治疗抗体与总治疗抗体的比率。此比率将作为治疗抗体效力的指示。
     在实验过程中发现，在所有类型的人和黑猩猩 G 型抗体上存在的一个或多个表位在任何实验动物的抗体上都不存在。此表位的特征在于，其结合由保藏的细胞系 DSM ACC3006， DSM ACC3007， DSM ACC3008 产生的抗体。因此，本发明报导的一个方面是由细胞系 DSM ACC3006， DSM ACC3007 或 DSM ACC3008 产生的抗体。
     由于 3 种保藏的细胞系识别的表位在抗体的 Fab 区中是唯一的，本发明报导的另一个方面是与从保藏的细胞系 DSM ACC3006， DSM ACC3007， DSM ACC3008 得到的抗体结合的表位。在本发明报导的一个方面中，结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体的特征在于，所述抗体是与由细胞系 DSM ACC3006， DSM ACC3007， DSM ACC3008 产生的抗体之一结合相同表位的抗体。
     例如，可使用如下方法，其中在竞争检测系统的帮助下测定结合相同靶抗原的 2 种抗体的表位重叠。为此，例如在酶免疫测定的帮助下，检测研究中的抗体与已知抗体竞争结合固定的靶抗原的程度，例如使用由本发明报导的细胞系之一产生的抗体。为此，适当固定的靶抗原与标记形式的已知抗体和过量的所检测的抗体孵育。通过检测结合的标记可容易地确定所研究的抗体可在多大程度上置换结合的已知抗体。如果在相同的浓度下存在超过 20％的置换，在另一个实施方案中超过 30％的置换，或在更高的浓度下，在一个实施方 3 5 案中在研究中的抗体相对已知抗体过量 10 -10 - 倍的情况下，存在超过 70％的置换，在另一个实施方案中超过 80％的置换，则存在表位重叠且两种抗体结合相同的表位或相同表位的重叠部分。
     可在使用各个抗体的生物素化和地高辛化变体和来自不同物种的血清的夹心 ELISA 中显示从保藏的细胞系 DSM ACC3006， DSM ACC3007，和 DSM ACC3008 得到的抗体的特异性。在测定中 ( 见图 1)，从相同的细胞系得到结合同一表位的捕获和检测抗体。为了作为通用测定用于检测和定量实验动物血清中的人 IgG，这样的测定需要抗人 IgG 抗体，其结合位点独立于任何次级抗体修饰，例如糖基化或脱酰胺。否则，必须对每种待检测和定量的治疗抗体优化测定。此外，本发明报导的每种抗人 IgG 抗体也不同于分析的治疗抗体并可被用作参考标准和阳性对照。用此测定得到的特异性结果显示在图 2 中。
     可以看到，本发明报导的抗体对人和黑猩猩 G 型免疫球蛋白的免疫球蛋白高度特异，并显示了比抗体 M-R10Z8E9 更好的特异性，且不结合实验动物的 G 型免疫球蛋白。实验动物的所有值都远低于用不存在过氧化物酶的 ABTS 得到的空白值。
     也可在使用 BIAcore 技术的表面等离子共振实验中显示本发明报导的抗体的特异性。在图 3a) 至 c) 中显示了抗体 M-1.7.10( 从 DSM ACC3008 得到 )、 M-1.3.2( 从 DSM ACC3006 得到 ) 和 M-1.5.8( 从 DSM ACC3007 得到 ) 的 BIAcore 图表，从中可以看出抗体对人和黑猩猩 G 型免疫球蛋白是特异的。
     通过使用点印迹实验显示，本发明报导的抗体结合的表位是构象表位，因为在变性的人免疫球蛋白上结合消失 ( 图 4)。
     本发明报导的另一个方面是用于定量从实验动物获得的样品中的人抗体或其衍生物例如 Fab 片段的测定，所述测定包括本发明报导的生物素化抗体作为捕获抗体和本发明报导的地高辛化抗体作为示踪抗体。在图 5 中，显示了使用本发明报导的代表性抗体的此测定的图解测定设置和校准曲线 ( 捕获抗体：生物素化 M-1.7.10，分析物：人抗 IL13Rα1 抗体的 Fab 片段，示踪抗体：地高辛化 M-1.3.2)。此测定需要在 2 个不同的表位上结合人 IgG 的 Fab 片段的捕获和示踪抗体。本发明报导的抗体至少部分结合人或黑猩猩的 G 型免疫球蛋白抗体的轻链恒定区，并因此适用于此测定。
     本发明报导的另一个方面是一种测定，其包括特异性结合人 IgG 的不同结构域上的表位的捕获和示踪抗体。在此测定中，只有完整的治疗抗体将导致阳性测定结果和可检测的信号。在一个实施方案中，捕获抗体和示踪抗体一方面独立地选自本发明报导的抗体，另一方面独立地选自抗体 M-R10Z8E9。在根据用于证明在实验动物中的人 IgG 的结构完整性的此方面的代表性测定中，使用生物素化 M-R10Z8E9 作为捕获抗体，抗 IL13Rα1 抗体作为分析物，地高辛化 M-1.3.2 作为示踪抗体 ( 在图 6 中显示了此测定的图解测定设置和校准曲线 )。
     本发明报导的另一个方面是一种测定，其中使用抗人 IgG 抗体作为参考标准和 / 或阳性对照，以模拟抗药物抗体 (ADA)。这在找出最佳测定条件和检测测定的稳健性，即用不同的标准试剂 / 阳性对照检查测定性能的测定开发中可能有用。考虑到 ADA 将是多克隆的并可能针对 Fab 片段和 Fc 部分二者的事实，此设置特别有利。
     在本发明报导的另一个方面，在本发明报导的方法中使用从细胞系 DSM ACC3006， DSM ACC3007 和 DSM ACC3008 得到的抗体之一作为结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体。
     本发明报导的另一个方面涉及结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体在测定从实验动物获得的样品中的总治疗抗体、活性治疗抗体或结合抗原的治疗抗体的浓度中的用途。在一个实施方案中，在这样的方法中使用的抗体结合选自与从细胞系 DSM ACC3006， DSM ACC3007 或 DSM ACC3008 得到的抗体之一所识别的相同表位或重叠的表位。本发明报导的另一个方面涉及 2 种都结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体在测定从实验动物获得的样品中的总治疗抗体、活性治疗抗体或结合抗原的治疗抗体的浓度中的用途，其中一种抗体是捕获抗体，另一种抗体是示踪抗体。在一个实施方案中，治疗抗体是 Fab 片段。
     可选地，本发明报导的抗体可在包含单个免疫球蛋白类型的参考免疫球蛋白作为一部分的缀合物中使用。参考免疫球蛋白提供免疫球蛋白类型特异性恒定区，其可被抗免疫球蛋白类型抗体，例如抗人免疫球蛋白 G 抗体特异性结合。因此，参考免疫球蛋白提供了例如具有免疫球蛋白类型特异性标签的缀合物，其可被标签特异性抗体特异性识别。例如，如果标签是免疫球蛋白 G 恒定区，标签特异性抗体则是抗免疫球蛋白 G 抗体。这样的缀合物可在免疫测定中用作标准物或在免疫测定中用作阳性对照。
     在本发明报导的方法中，也可使用不同的捕获分子，例如完整抗体、 F(ab’ )2 片段、 Fab 片段或甚至单链抗体。
     本发明报导的分别表达抗体 M-1.3.2， M-1.5.8 和 M-1.7.10 的优选的杂交瘤细胞系 MAKM-1.3.2， MAKM-1.5.8， MAKM-1.7.10 在用于专利程序目的的国际认可的微生物保藏的布达佩斯条约下保藏在德意志微生物保藏中心 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)， Germany) ：

     细胞系 MABM-R10Z8E9 MAKM-1.3.2 保藏号 DSM ACC2708 DSM ACC3006 保藏日期 22.12.2004 24.09.200911CN 102656460 A MAKM-1.5.8 MAKM-1.7.10
    说明书24.09.2009 24.09.20099/16 页DSM ACC3007 DSM ACC3008细胞系和从所述细胞系得到的抗体是本发明报导的方面。
     如 WO 2006/072564 中报导的针对 IL13 受体 α1 蛋白的抗体 ( 抗 IL13Rα1 抗体 )，如 WO 2005/023872 中报导的针对 IL-1R 受体的抗体 ( 抗 IL-1R 抗体 )，如 WO 2003/070760 或 US 2005/0169925 中报导的针对淀粉样蛋白 β-A4 肽的抗体 ( 抗 Aβ 抗体 )，如 WO 2005/100402 或 US 2005/0226876 中报导的针对人 P- 选择素糖蛋白的抗体 ( 抗 P- 选择素抗体 )，如 WO 2004/096274 报导的针对 IL-6 受体的抗体 ( 抗 IL6R 受体 )，和如 WO 2004/087756 或 WO 2005/005635 中报导的针对 IGF-1 受体的抗体 ( 抗 IGF-1R 抗体 )( 都引入本发明作为参考 ) 示例了本发明报导的方法。
     提供了以下实施例和图以帮助理解本发明，本发明的真实范围在随附的权利要求书中陈述。应当理解，可以在陈述的程序中进行修改而不背离本发明的精神。
     附图描述
     图 1 定量实验动物中的人抗体 ( 人 IgG) 的完全通用测定： a) 测定形式； b) 捕获和检测试剂：抗体 M-R10Z8E9 ； c) 捕获和检测试剂抗体 M-1.7.10 ；治疗抗体：空心三角形：抗 IL13Rα1 抗体，空心方块：抗 Aβ 抗体，实心方块：抗 IL1R 抗体，实心三角形：抗 IL6R 抗体。
     图 2 使用本发明报导的抗体的测定得到的结果：使用的抗体从左到右为： M-R10Z8E9， M-1.3.2， M-1.5.8， M-1.7.10。
     图 3 本发明报导的抗体 a)M-1.3.2， b)M-1.5.8，和 c)M-1.7.10 的代表性表面等离子共振图。
     图 4 抗人 IgG 抗体的点印迹；选择针对 P- 选择素的抗体作为代表性参考抗体；在硝酸纤维素膜上点上天然 ( 左栏 ) 和变性形式 ( 右栏 ) 的参考抗体并通过相应的地高辛化抗 - 人 IgG 抗体检测； a)M-R10Z8E9， b)M-1.3.2， c)M-1.5.8， d)M-1.7.10。
     图 5 定量从实验动物获得的样品中的人抗体衍生物的测定： a) 图解测定设置， b) 校准曲线。
     图 6 用于证明在实验动物中的人 IgG 的结构完整性的测定： a) 图解测定设置， b) 校准曲线。
     图 7 选择对食蟹猴血清无可检测的交叉反应性的抗体。
     实施例 1
     人 IgG 的 F(ab’ )2 片段 ( 免疫原 ) 的制备
     将在 100mM 柠檬酸钠缓冲液， pH 3.7 中的全长人 G 型抗体 ( 人 IgG) 与胃蛋白酶孵育 (1μg 胃蛋白酶 /mg IgG)。通过分析型凝胶过滤分析片段化并在 90 分钟后通过加入磷酸钾将 pH 值调节为 6.5 终止反应。将混合物对 10mM 含 10mM 氯化钠的柠檬酸钠缓冲液， pH 5.5 透析后，将溶液应用于 SP- 琼脂糖层析柱，并通过分析型凝胶过滤分别分析在盐梯度中洗脱的分离的组分。将包含抗体 F(ab’ )2 片段的合并组分应用于具有固定的针对人 Fcγ 的多克隆抗体的亲和基质，以去除痕量 Fcγ 片段。合并流出液，浓缩至约 16mg/ml 和最终应用于凝胶过滤柱 (Superdex 200)。
     实施例 2单克隆抗人 IgG 抗体的产生
     a) 小鼠的免疫
     用混合 CFA( 完全弗氏佐剂 ) 的根据实施例 1 制备的 100μg 抗体 F(ab’ )2 片段腹膜内分别初次免疫 8-12 周龄的雌性 NMRI 小鼠。在 6 和 10 周后进行另外 2 次腹膜内免疫步骤，每次使用混合 IFA( 不完全弗氏佐剂 ) 的 100μg 抗体 F(ab’ )2 片段 / 小鼠。之后，在融合前 3 天进行静脉内加强免疫，每次使用 50μg 在 PBS( 磷酸缓冲液 ) 中的抗体 F(ab’ )2 片段。
     b) 融合和克隆
     根据 G a l f r é 和 M i l s t e i n ( G a l f r é ，G . 和 M i l s t e i n ，C ，M e t h o d s Enzymol.73(1981)3-46) 融合根据 a) 免疫的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞。将约 2.1x108 脾细胞与 4.2x107 骨髓瘤细胞 (P3x63-Ag8.653， ATCC CRL1580) 混合并离心 (300xg 和 4 ℃ 下 10 分钟 )。然后用不含 FCS( 胎牛血清 ) 的 RPMI 1640 培养基洗 1 次细胞，然后在 50ml 尖底瓶中以 400xg 再次离心。然后，加入 1ml PEG( 聚乙二醇，分子量 4,000g/mol)，通过吹吸进行混合。在 37 ℃水浴 1 分钟后，逐滴加入 5ml 不含 FCS 的 RPMI1640，混合悬浮液，加入含有 10 ％ (v/v)FCS 的 RPMI 1640 至 50ml 的终体积，然后离心。在含有 10 ％ FCS 的 RPMI 1640 中重悬沉淀的细胞，然后置于含有生长因子重组鼠白介素 6(Peprotech， 0.5ng/ ml) 的次黄嘌呤 - 重氮丝氨酸选择培养基 (100mmol/l 次黄嘌呤， 1μg/ml 重氮丝氨酸，在含有 10％ FCS 的 RPMI 1640 中 ) 中。11 天后，测定原代培养物的特异性抗体合成 ( 见实施例 3)。通过使用流式细胞仪 (FACSAria， BD Biosciences) 在含有生长因子重组鼠白介素 6(Peprotech， 0.5ng/ml) 的培养基中将单细胞置于 96 孔细胞培养板中将展示结合生物素化抗体 F(ab′ )2 片段以及生物素化人正常 IgG 的原代培养物个体化。按照此方案，得到细胞系 DSM ACC3006， DSM ACC3007 和 DSM ACC3008。抗体 M-1.7.10 是 IgG2a 类，抗体 M-1.5.8 和 M-1.3.2 是 IgG1 类。
     c) 免疫球蛋白的产生
     以 1.0x105 和 2.2x105 细胞 /ml 的初始细胞密度 ( 活细胞 ) 在补充 10 ％ FCS 和通常使用的补充物的 RPMI 1640 中接种在 b) 中得到的杂交瘤细胞系，并在细胞培养瓶 (T-flask)(Celline， IBS) 中扩增约 3 周的时间。在收获的培养上清中得到浓度在 0.7mg/ ml 和 1.5mg/ml 之间的单克隆抗体。根据标准蛋白质化学方法，例如在 Bruck， C.，等人， Methods Enzymol.121(1986)587-596 中报导的方法从培养上清中进行抗体的纯化。
     实施例 3
     用于检测抗人 IgG 抗体的筛选测定
     a) 初次筛选与人 IgG 结合的抗体
     为了测定杂交瘤细胞培养上清中的抗体的特异性，分别用在补充 1％ (w/v)BSA II 的 PBS 中生物素化人源化 IgG( 用于免疫过程， 250ng/ml) 或生物素化人 IgG(250ng/ml) 包被用重组链霉抗生物素 (MicroCoat， Bernried， lot MC 1098) 预包被的 MTP( 微滴定板 ) (100μl/ 孔，在室温孵育 60 分钟，同时摇晃 )，随后用 0.9％ (w/v)NaCl/0.05％ Tween 20 洗三次。下一步，每孔加入 100μl 待测定的抗体溶液 ( 培养上清 )，并在室温孵育 60 分钟，同时摇晃。在每孔用 0.9 ％ (w/v)NaCl/0.05 ％ Tween 20 洗三次的步骤后，加入 100μl 辣根过氧化物酶标记的多克隆绵羊抗小鼠 Fcγ 抗体的 F(ab′ )2 片段以检测结合的样品抗体，并在室温孵育 60 分钟，同时摇晃。之后，如上进行洗涤。最后，每孔加入 100μl ABTS (Roche Diagnostics GmbH， Mannheim， Germany ；货号 1684302)。在室温孵育 30 分钟后，在市售的微滴定板 ELISA 读取器中在 405 和 492nm[405/492] 处测量消光 (OD)。此筛选得到与人源化 IgG 以及人 IgG 结合良好的抗体的选择。对这样选择的抗体进一步进行测定 b)。
     b) 选择对其他物种的 IgG 具有最低交叉反应性的抗体
     第一步，使生物素化人 IgG 结合用链霉抗生物素包被的微滴定板 (SA-MTP) 的孔。通过洗涤去除过量的未结合的抗体。然后在缓冲液和 10％食蟹猴血清中稀释样品和参考标准 ( 例如，实施例 2 中得到的抗人 IgG 抗体 )。将稀释的样品加入板并在室温孵育 60 分钟，同时摇晃。在洗去未结合的物质后，对板中的孔加入地高辛形式的第一步中的人 IgG 并再孵育 60 分钟。在洗涤后，用抗地高辛抗体 -HRP 缀合物检测结合的地高辛化抗体。抗体 - 酶缀合物的 HRP( 辣根过氧化物酶 ) 催化 ABTS 底物的显色反应。通过 ELISA 读取器在 405nm 波长处测量信号 ( 参考波长： 490nm)。一式三份测定每种血清样品的吸光度值。
     选择了在食蟹猴血清和缓冲液中具有高测定反应的抗体 ( 见图 7)。此第二次筛选得到对其他物种的 IgG 具有最低交叉反应性的与人 IgG 结合良好的抗体的选择。
     实施例 4

    通过表面等离子共振评估抗体结合 / 特异性用 BIAcore T100 仪器使用 CM5 芯片进行所有测量。通过标准胺偶联实现抗体对此芯片的包被。除非另外指出，在 HBS 缓冲液 (HEPES， NaCl， pH 7.4) 中在 25℃下进行所有孵育。通过胺偶联在 CM-5 芯片的一个流动池上固定饱和量的多克隆山羊抗小鼠 Fcγ 抗体。随后，以 30μl/ 分钟的流速注入不同的针对人 IgG 的单克隆小鼠抗体 60 秒并与抗小鼠 Fc 抗体结合。在 HBS 缓冲液中稀释所有动物血清。通过以 30μl/ 分钟的流速注入 1 ∶ 100 稀释的血清并孵育 60 秒分析结合。通过用 HBS 缓冲液洗涤芯片表面 180 秒测量解离。使用来自 BIAcore 的 BIA 评估软件用 1 ∶ 1 的 Langmuir 拟合模型计算解离常数值 ( ＝ KD)。用于所有动物血清，此计算基于 IgG 水平是 15mg/ml 的假设。选择开始注入检测抗体后 80 秒的信号值用于比较结合的 IgG 的量 ( 见表 1)。
     表1：动物血清结合不同单克隆抗人 IgG 抗体的结合信号 [RU] 和 KD 值
    表 1 显示， 3 种抗人 IgG 抗体不与除了黑猩猩以外的其他物种的血清交叉反应。相反地，对 M-R10Z8E9 检测到与狗和绒猴的另外的相互作用。
     实施例 5
     a) 小鼠单克隆抗人 IgG 抗体的纯化
     将在实施例 2 中得到的细胞系的发酵上清浓缩约 10 倍并转移至含有 20mM TRIS， 1M 硫酸铵， pH 9.0 的缓冲液中，然后应用于蛋白质 A- 琼脂糖凝胶层析柱。用 0.2M 柠檬酸钠， 0.2M 硫酸铵在 pH5.0 得到的洗脱液针对磷酸缓冲液， pH7.5 透析。使用针对牛 IgG 的固
     定的抗体通过免疫吸附分离牛 IgG 污染物 ( 来自发酵液中的 FCS)。
     b) 生物素化抗人 IgG 抗体的制备
     将在磷酸缓冲液， pH 8.5 中的 a) 中得到的抗人 IgG 抗体调整为约 5mg/ml 的蛋白质浓度。在 DMSO 中溶解 D- 生物素 - 氨基己酸 -N- 羟基琥珀酰亚胺并以 1 ∶ 5 的摩尔比例加入抗体溶液。在 60 分钟后通过加入 L- 赖氨酸终止反应，并通过对 50mM 具有 150mM NaCl 的 pH7.5 的磷酸钾缓冲液透析去除过剩的标记试剂。
     c) 地高辛化抗人 IgG 抗体的制备
     将在磷酸缓冲液， pH 8.5 中的 a) 中得到的抗人 IgG 抗体调整为约 5mg/ml 的蛋白质浓度。在 DMSO 中溶解地高辛 3-O- 甲基羰基 -ε- 氨基己酸 -N- 羟基琥珀酰亚胺并以 1 ∶ 4 的摩尔比例加入抗体溶液。在 60 分钟后通过加入 L- 赖氨酸终止反应，并通过对 50mM 具有 150mM NaCl 的 pH7.5 的磷酸钾缓冲液透析去除过剩的标记试剂。
     实施例 6
     用于定量来自实验动物的样品中的人抗体 ( 人 IgG) 的完全通用测定
     在第一步中，生物素化抗体 M-R10Z8E9( 板 1) 或抗体 M-1.7.10( 板 2) 与链霉抗生物素包被的微滴定板 (SA-MTP) 结合。通过洗涤去除过量的未结合抗体。对板加入浓度系列的掺在食蟹猴血清中的样品 / 标准物，例如抗 IL1R 抗体、抗 IL13Rα1 抗体、抗 Aβ 抗体和抗 -IL6R 抗体并在室温下孵育 60 分钟，同时摇晃。在洗掉未结合的抗体后，对板加入 100μl 地高辛化抗体 M-R10Z8E9( 板 1) 或抗体 M-1.7.10( 板 2)。洗涤后，用抗地高辛抗体 -HRP 缀合物检测结合的地高辛化抗体。一式三份测定每种血清样品的吸光度值 ( 见图 1)。

    表2：捕获和检测试剂抗体 M-R10Z8E9 的 OD 数据

    表3：捕获和检测试剂抗体 M-1.7.10 的 OD 数据


    实施例 7 用于定量来自实验动物的样品中的人抗体衍生物 ( 例如 Fab 片段 ) 的测定在第一步中，生物素化抗体 M-1.7.10 与链霉抗生物素包被的微滴定板 (SA-MTP) 结合。通过洗涤去除过量的未结合抗体。对孔加入掺在食蟹猴血清中的样品 / 标准物，例如抗 IGF1R 抗体 Fab 片段并在室温下孵育 60 分钟，同时摇晃。在洗掉未结合的抗体后，对板的每个孔加入 100μl 地高辛化抗体 M-1.3.2。洗涤后，用抗地高辛抗体 -HRP 缀合物检测结合的地高辛化抗体。一式三份测定每种血清样品的吸光度值 ( 见图 5)。
     表4： OD 数据
     ng/ml 0.00 1.56 3.13 6.25 12.50 25.00 50.00 100.00

     OD 405nm 0.042 0.047 0.057 0.103 0.247 0.694 1.535 1.882 SD 0.000 0.000 0.002 0.001 0.016 0.007 0.043 0.013实施例 8 证明来自实验动物的样品中的人 IgG 的结构完整性的测定在第一步中，针对人 Fc 的生物素化抗体 M-R10Z8E9 与链霉抗生物素包被的微滴定板 (SA-MTP) 结合。通过洗涤去除过量的未结合抗体。对板加入掺在食蟹猴血清中的样品 / 标准物，例如抗 IL13Rα1 抗体，并在室温下孵育 60 分钟，同时摇晃。在洗掉未结合的抗体后，对板加入 100μl 地高辛化抗体 M-1.3.2。洗涤后，用抗地高辛抗体 -HRP 缀合物检测结合的地高辛化抗体。一式三份测定每种血清样品的吸光度值 ( 见图 3)。
     表5： OD 数据
    实施例 9
     用于定量来自实验动物的样品中的人抗体 ( 人 IgG) 的测定，使用 Fc 融合蛋白 ( 抗原 ) 组合本发明报导的抗人 IgG 抗体
     人受体 X 的可溶性胞外结构域与人 IgG1 型的 Fc 片段融合。在第一步中，生物素化融合蛋白 (Bi-X-Fc) 与链霉抗生物素包被的微滴定板 (SA-MTP) 结合。通过洗涤去除过量的未结合受体。之后，掺在食蟹猴血清中的抗 X 抗体与固定的人受体 X 结合。在洗掉未结合的物质后，用 a) 针对人 Fc 片段的地高辛化的单克隆抗体 ( 抗体 M-R10Z8E9) 或用 b) 针对人 Fab 片段的地高辛化的单克隆抗体 ( 抗体 M-1.7.10) 检测结合的抗 X 抗体，然后与辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体孵育。一式三份测定每种血清样品的吸光度值。
     实施例 10
     点印迹——构象对线性表位
     为了测定抗人 IgG 抗体检测的是构象表位还是线性表位，进行了点印迹分析。
     在此试验中，将天然或变性形式的抗原 - 蛋白 ( 人 IgG) 点在硝酸纤维素膜上。为了得到变性形式，在振动器上在 37℃下过夜孵育抗原 - 蛋白与 SDS。将 2 种形式以浓度系列点在膜上。在膜完全干燥后，用封闭缓冲液 (Roti-Block， Roth， Germany) 在室温封闭表面 60 分钟，同时摇晃。在洗涤膜后，将其与包含地高辛化抗体 M-R10Z8E9 或 3 种不同抗体 M-1.3.2， M-1.5.8 或 M-1.7.10 之一的溶液孵育。洗涤后，用抗地高辛抗体 -HRP 缀合物检测结合的地高辛化抗体。抗体 - 酶缀合物的 HRP 催化 BM-BLUE 底物的显色反应。可直接目测控制信号并用扫描仪捕获。
     实施例 11
     通过桥连 ELISA 测定评估抗体结合 / 特异性
     为了测定研究的抗人抗体结合的是哪类人 IgG 亚类，进行桥连 ELISA 分析。
     在第一步中，生物素化抗体 M-R10Z8E9， M-1.3.2， M-1.5.8 和 M-1.7.10 与链霉抗生物素微滴定板结合。在第二步中，孵育不同亚类的人 IgG 抗体。制备稀释系列的人 IgG1κ ；人 IgG1λ ；人 IgG4 ；嵌合人 IgG1 ；人 IgG2( 多克隆纯化的人 IgG2) 和人 IgG3( 多克隆纯化的人 IgG3)，并在用生物素化抗人抗体包被的链霉抗生物素微滴定板上孵育。在洗涤步骤后，以地高辛化形式使用用于包被的相同抗体作为检测抗体。这表示使用相同的抗人抗体克隆用于包被和检测。例如，用 M-1.7.10Bi 包被一块板并使用 M-1.7.10Dig 检测。在孵育和洗涤步骤后，此步骤之后是与辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体孵育。一式三份测定每种血清样品的吸光度值。
     表6：桥连 ELISA 分析的总结
    19CN 102656460 A
    PCT/RO/134表1/4 页
    20CN 102656460 APCT/RO/134表2/4 页
    21CN 102656460 APCT/RO/134表3/4 页
    22CN 102656460 APCT/RO/134表4/4 页

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1、(10)申请公布号 CN 102656460 A (43)申请公布日 2012.09.05 CN 102656460 A *CN102656460A* (21)申请号 201080047203.6 (22)申请日 2010.10.18 DSM ACC2708 2004.12.22 DSM ACC3006 2009.09.24 DSM ACC3007 2009.09.24 DSM ACC3008 2009.09.24 09013144.2 2009.10.19 EP G01N 33/68(2006.01) C07K 16/42(2006.01) (71)申请人弗哈夫曼 - 拉罗切有限公司地址。

2、瑞士巴塞尔 (72)发明人 U埃西格 S克洛斯特曼 F科瓦莱夫斯基 K-G施图本拉赫 R福格尔 U韦塞尔斯 (74)专利代理机构北京市中咨律师事务所 11247 代理人黄革生林柏楠 (54) 发明名称非交叉反应性抗 IgG 抗体 (57) 摘要本发明报导了细胞系 DSM ACC3006， DSM ACC3007 和 DSM ACC3008，以及从所述细胞系得到的抗体，和从所述细胞系得到的抗体在免疫测定中的用途。还报导了结合人或黑猩猩 IgG 但不结合犬和绒猴 IgG 的抗体，和特异性结合包含轻链恒定结构域的 IgG1 的抗体。 (30)优先权数据 (。

3、85)PCT申请进入国家阶段日 2012.04.19 (86)PCT申请的申请数据 PCT/EP2010/065617 2010.10.18 (87)PCT申请的公布数据 WO2011/048043 EN 2011.04.28 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页说明书 16 页 PCT/RO/134 表 4 页附图 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 2 页说明书 16 页 PCT/RO/134表 4 页附图 6 页 1/2 页 2 1. 细胞系 DSM ACC3006，或 DSM ACC3007，或 DSM。

4、 ACC3008。 2. 从根据权利要求 1 的细胞系之一得到的抗体。 3. 根据权利要求 2 的抗体在免疫测定中的用途。 4. 试剂盒，其包含 a) 从细胞系 DSM ACC2708，或 DSM ACC3006，或 DSM ACC3007，或 DSM ACC3008 得到的抗体作为捕获试剂， b) 从细胞系 DSM ACC2708，或 DSM ACC3006，或 DSM ACC3007，或 DSM ACC3008 得到的抗体作为检测试剂。 5. 检测从实验动物得到的样品中的治疗抗体的方法，其包括以下步骤 a) 提供待分析的样品， b) 将所述样品与和根据权利要求 2 的抗。

5、体结合相同表位的抗体进行孵育， c) 任选地将所述样品与适于选择性检测总治疗抗体、活性治疗抗体或抗原结合的治疗抗体的试剂孵育，和 d) 将在 (b) 或 (c) 中形成的复合物与所述治疗抗体的浓度相关联。 6. 使用抗原桥连免疫测定对从实验动物得到的样品中的治疗抗体进行免疫学测定的方法，所述抗原桥连免疫测定包含捕获抗体和示踪抗体，特征在于所述捕获抗体和所述示踪抗体都独立地选自和根据权利要求 2 的抗体结合相同表位的抗体。 7. 根据权利要求 6 的方法，其特征在于所述免疫测定是夹心免疫测定。 8.根据权利要求6或7中任一项的方法，其特征在于所述捕获抗体与生物素缀合，并通过。

6、固定的抗生物素蛋白或链霉抗生物素进行固定。 9.根据权利要求6至8中任一项的方法，其特征在于所述示踪抗体与地高辛缀合，并通过针对地高辛的抗体进行与可检测的标记物的连接。 10. 根据权利要求 5 至 9 中任一项的方法，其特征在于所述治疗抗体是 Fab。 11. 根据权利要求 5 至 10 中任一项的方法，其特征在于所述实验动物选自绒猴和绢毛猴、旧大陆猴、侏儒狐猴和鼠狐猴(dwarf and mouse lemur)、长臂猿和小猿(lesser ape)、美狐猴家族的成员，以及其杂种。 12. 根据权利要求 5 至 11 中任一项的方法，其特征在于所述治疗抗体是人或人源。

7、化抗体。 13. 结合治疗抗体但不结合实验动物的免疫球蛋白的抗体在测定从实验动物获得的样品中的总治疗抗体、活性治疗抗体或抗原结合的治疗抗体的浓度中的用途，其中所述抗体和根据权利要求 2 的抗体结合相同的表位。 14. 抗体组合物，其特征在于包含由细胞系 DSM ACC3006，细胞系 DSM ACC3007，细胞系 DSM ACC3008 产生的抗体的混合物。 15.根据权利要求14的抗体组合物在根据权利要求5至12中任一项的方法中的用途。 16. 结合人或黑猩猩 IgG 但不结合犬和绒猴 IgG 的抗体。 17. 根据权利要求 16 的抗体，其特征在于所述抗体不结合犬、恒。

8、河猴、绒猴、狒狒和食蟹猴 IgG。 18. 根据权利要求 16 或 17 中任一项的抗体，其特征在于结合人或黑猩猩 IgG 的 KD值是 10-9mol/l 或更低，且结合犬、恒河猴、绒猴、狒狒和食蟹猴 IgG 的 KD值是 10-6mol/l 或更权利要求书 CN 102656460 A 2 2/2 页 3 高。 19. 根据权利要求 16 至 18 中任一项的抗体，其特征在于所述抗体是单克隆抗体。 20. 特异性结合包含轻链恒定结构域的 IgG1 的抗体。 21. 根据权利要求 20 的抗体，其特征在于所述抗体还结合 IgG2。 22. 根据权利要求 20。

9、至 21 中任一项的抗体，其特征在于所述抗体还结合 IgG4。 23. 根据权利要求 20 至 22 中任一项的抗体，其特征在于所述抗体不结合 IgG3。 24. 根据权利要求 20 至 23 中任一项的抗体，其特征在于所述抗体不结合包含轻链恒定结构域的 IgG1。 25. 根据权利要求 20 至 24 中任一项的抗体，其特征在于所述抗体是单克隆抗体。 26.根据权利要求16至25中任一项的抗体在根据权利要求5至12中任一项的方法中的用途。权利要求书 CN 102656460 A 3 1/16 页 4 非交叉反应性抗 IgG 抗体 0001 本发明报导了特异性结合人和。

10、黑猩猩IgG类抗体的IgG-Fab片段的恒定区的抗体及其在免疫测定中的用途。 0002 发明背景 0003 自从 Koehler 和 Milstein 在 1974 年开发了首例单克隆抗体以来，进行了许多努力以开发适用于治疗人的抗体。首例可获得的单克隆抗体已在小鼠和大鼠中被开发。在过去 10 年中，越来越多的人单克隆抗体或人源化单克隆抗体已进入市场。熟知的实例包括例如来自 F.Hoffmann-La Roche AG， Basel 的 Herceptin和 MabThera 0004 极大量的人或人源化抗体正在调查研究中，并在能够考虑进入人体进行初步试验以前需要在实验动物中研究。

11、。必须研究如生物可用性和抗体清除等 ( 只提到其中 2 种 ) 的重要标准。许多这些研究需要在实验动物自身抗体的背景下定量治疗抗体。在大多数情况下使用哺乳动物作为实验动物。通常最先在啮齿类如小鼠或大鼠中评估毒理学。在更高级的药物开发阶段，特别是在药物进入人体以前，甚至必须将猴子包括在这样的临床前研究中。 0005 哺乳动物循环中通常具有约 10 至约 30 毫克 /ml 之间的抗体。治疗单克隆抗体一般必须以范围从约 1 纳克 /ml 至约 100 毫克 /ml 之间的血清水平进行检测。因此，必须在实验动物抗体的背景下检测治疗抗体，所述实验动物抗体为约 100 倍至 1 千万。

12、倍过量。 0006 在实验动物抗体的背景下检测人或人源化治疗抗体是对药理学家的极为严峻的任务。检测动物与智人的亲缘关系越近，人或人源化抗体的检测就变得越来越困难。 0007 在 WO 2008/031532 中报导了一种抗药物抗体测定。在 WO 2006/066912 中报导了在实验动物中检测治疗抗体。在 US 5,332,665 中报导了物种特异性、高亲和力的单克隆抗体。 0008 发明概述 0009 本发明首先报导了在人和黑猩猩的 G 型免疫球蛋白的抗体上的构象表位，其不存在于通常使用的实验动物中。其次报导了与此表位结合的非交叉反应性抗人 IgG 抗体和抗黑猩猩 IgG 抗。

13、体。第三，报导了使用这些抗体的测定。 0010 本发明报导的一个方面是结合人或黑猩猩IgG(G亚类的免疫球蛋白)但不结合犬和绒猴 (marmoset)IgG 的抗体。 0011 在一个实施方案中，所述抗体不结合犬、恒河猴 (Rhesus-monkey)、绒猴、狒狒和食蟹猴 (cynomolgus)IgG。在另一个实施方案中，所述抗体特异性结合人和黑猩猩 IgG。在另外的实施方案中，通过表面等离子共振测定的结合人或黑猩猩 IgG 的 KD值是 10-9mol/l 或更低，结合犬、恒河猴、绒猴、狒狒和食蟹猴 IgG 的 KD值是 10-6mol/l 或更高。在一个实施。

14、方案中，结合人或黑猩猩 IgG 的 KD值是 10-9mol/l 至 10-13mol/l。在另一个实施方案中，结合犬、恒河猴、绒猴、狒狒和食蟹猴 IgG 的 KD值不能通过表面等离子共振测定。在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。 0012 本发明报导的另一个方面是特异性结合包含轻链恒定结构域的 IgG1(G1 亚类的免疫球蛋白 ) 的抗体。说明书 CN 102656460 A 4 2/16 页 5 0013 在一个实施方案中，所述抗体还结合 IgG2。在另一个实施方案中，所述抗体还结合 IgG4。在另一个实施方案中，所述抗体不结合 IgG3。在一个实施。

15、方案中，所述抗体不结合包含轻链恒定结构域的 IgG1。在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。 0014 本发明报导的从细胞系 DSM ACC3006(M-1.3.2)， DSM ACC3007(M-1.5.8) 和 DSM ACC3008(M-1.7.10) 得到的抗体与例如细胞系 DSM ACC2708 产生的抗体 M-R10Z8E9 比较时显示了降低的交叉反应性，它们结合 Fab 区中的不同表位，不受邻近的糖基化位点的影响，并可在免疫测定中混合用于测定 Fab 治疗抗体，因为每种抗体的结合位点在 Fab 片段中仅出现 1 次。 0015 本发明报导的各方面是细胞系 D。

16、SM ACC3006， DSM ACC3007 和 DSM ACC3008，以及从所述细胞系得到的各个抗体和这些抗体在免疫测定中的用途。 0016 另一个方面是一种试剂盒，其包含 0017 a) 从 DSM ACC3006，或 DSM ACC3007，或 DSM ACC3008，或 DSM ACC2708 得到的抗体的生物素化形式， 0018 b) 从 DSM ACC3006，或 DSM ACC3007，或 DSM ACC3008，或 DSM ACC2708 得到的抗体的地高辛化 (digoxygenylated) 形式。 0019 本发明报导的另一个方面是检测从实验动物。

17、得到的样品中的治疗抗体的方法，其包括以下步骤 0020 a) 提供待分析的样品， 0021 b) 将所述样品与和本发明报导的抗体结合相同表位的抗体孵育， 0022 c) 任选地将所述样品与适于选择性检测总治疗抗体、活性治疗抗体或结合抗原的治疗抗体的试剂孵育，和 0023 d) 任选地通过校准曲线将在 (b) 或 (c) 中形成的复合物与治疗抗体的浓度相关联。 0024 本发明报导的另一个方面是使用包含捕获抗体和示踪抗体的抗原桥连免疫测定，进行免疫学测定从实验动物得到的样品中的治疗抗体的方法，其中所述捕获抗体和示踪抗体都独立地选自和本发明报导的抗体结合相同表位的抗体。 0025。

18、在一个实施方案中，所述免疫测定是夹心免疫测定。在另一个实施方案中，抗体与其缀合配偶体的缀合通过经由抗体的氨基酸骨架的N-端和/或-氨基(赖氨酸)、不同赖氨酸的 - 氨基、羧基、巯基、羟基和 / 或酚官能团，和 / 或抗体的碳水化合物结构的糖醇基的化学结合进行。在另外的实施方案中，捕获抗体通过特异性结合对固定。在一个实施方案中，捕获抗体与生物素缀合并通过固定化的抗生物素蛋白或链霉抗生物素进行固定。在另一个实施方案中，示踪抗体通过特异性结合对与可检测的标记物缀合。在一个实施方案中，示踪抗体与地高辛缀合并通过针对地高辛的抗体进行与可检测的标记物的连接。在另。

19、一个实施方案中，治疗抗体是 Fab。在一个实施方案中，实验动物选自绒猴和绢毛猴 (tamarin)、旧大陆猴(old world monkey)、侏儒狐猴和鼠狐猴(dwarf and mouse lemur)、长臂猿和小猿 (lesser ape)、美狐猴 (true lemur) 家族的成员，以及其杂种。在一个实施方案中，实验动物选自狗、恒河猴、绒猴、狒狒和食蟹猴。在一个实施方案中，实验动物是猕猴 (Macaca monkey)。在另一个实施方案中，结合治疗抗体但不结合实验动物的免疫球蛋白的抗体是本发明报导的抗体。在一个实施方案中，治疗抗体是人或人源化抗。

20、体。在另一个实施方案中，说明书 CN 102656460 A 5 3/16 页 6 人或人源化抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，检测总治疗抗体，在另一个实施方案中检测活性治疗抗体，在另一个实施方案中检测与其抗原结合的治疗抗体。 0026 本发明报导的另一个方面是结合治疗抗体但不结合实验动物的免疫球蛋白的抗体在测定从实验动物获得的样品中的总治疗抗体、活性治疗抗体或抗原结合的治疗抗体的浓度中的用途，其中所述抗体和本发明报导的抗体结合相同的表位。在一个实施方案中，所述抗体是本发明报导的抗体。 0027 本发明报导的另一个方面是抗体组合物，其包含由细胞系 DSM AC。

21、C3006、细胞系 DSM ACC3007、细胞系 DSM ACC3008 和 / 或细胞系 DSM ACC2708 产生的抗体的混合物。 0028 另一个方面是本发明报导的抗体组合物在本发明报导的方法中的用途。 0029 发明详述 0030 名为 M-R10Z8E9 的非交叉反应性抗人 IgG 抗体 ( 从细胞系 DSM ACC2708 中获得 ) 结合 G 型人免疫球蛋白的 CH2 结构域中的靠近糖基化位点 Asn297 的表位。本发明报导的抗体 M-1.3.2， M-1.5.8 和 M-1.7.10 与抗体 M-R10Z8E9 相比显示了降低的交叉反应性，结合 Fab 区中的不同。

22、表位，不受邻近的糖基化位点的影响，且可在免疫测定中混合用于测定治疗抗体，特别是 Fab 治疗抗体，因为每种抗体的结合位点都在 Fab 片段中存在。 0031 术语 “治疗抗体” 表示在临床研究中检测的被批准用作人治疗剂的抗体，且其可对个体施用用于治疗疾病。在一个实施方案中，治疗抗体是单克隆抗体。在另一个实施方案中，治疗抗体选自从类人猿(great ape)得到的抗体，从用人抗体基因座转化的动物得到的抗体，人单克隆抗体，或人源化单克隆抗体。在一个实施方案中，治疗抗体是人单克隆抗体。在另一个实施方案中，治疗抗体是人源化单克隆抗体。治疗抗体被广泛用于多种疾病的治。

23、疗，例如肿瘤疾病 ( 例如血液和实体恶性肿瘤，包括非何杰金氏淋巴瘤、乳腺癌和结肠直肠癌 )，免疫疾病，中枢神经疾病，血管疾病或传染病。这样的抗体为，例如，针对 CD20， CD22， HLA-DR， CD33， CD52， EGFR， G250， GD3， HER2， PSMA， CD56， VEGF， VEGF2， CEA， Levis Y 抗原， IL-6 受体 (IL6R) 或 IGF-1 受体 (IGF1R) 的抗体。 0032 术语 “抗体”包含抗体结构的多种形式，包括整个抗体和抗体片段。本发明报导的抗体在一个实施方案中是人抗体，人源化抗体，嵌合抗体，或。

24、T 细胞抗原耗尽的抗体 (T-cell antigen depleted antibody)。例如在 Morrison， S.L.，等人， Proc.Natl. Acad Sci.USA 81(1984)6851-6855 ； US 5,202,238 和 US 5,204,244 ； Riechmann， L.，等人， Nature 332(1988)323-327 ； Neuberger， M.S.，等人， Nature 314(1985)268-270 ； Lonberg， N.， Nat.Biotechnol.23(2005)1117-1125 中描述了抗体的基因工程。 003。

25、3 非人(例如啮齿类)抗体的 “人源化” 形式是包含来源于非人抗体和来源于人抗体的部分序列的嵌合抗体。大部分人源化抗体来源于人抗体(接受体抗体)，其中高变区的残基被具有期望的特异性和亲和力的非人物种，例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的的高变区 ( 供体抗体 ) 的残基替换。有时候，人抗体的框架区 (FR) 残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含另外的修饰，例如在接受体抗体或供体抗体中不存在的氨基酸残基。这样的修饰导致这样的接受体或供体抗体的变体，其与相应的亲本序列同源但不同一。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。 0034 大体上，人源化抗体将包含至少一个、。

26、通常 2 个可变结构域的基本全部，其中高变环对应非人供体抗体的高变环， FR 的全部或基本全部是人接受体抗体的 FR。人源化抗体任说明书 CN 102656460 A 6 4/16 页 7 选地也包含至少一部分抗体恒定区，通常是人抗体恒定区的一部分。 0035 人源化非人抗体的方法已在领域中描述。在一个实施方案中，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为 “输入” 残基，其一般来自 “输入” 可变结构域。可基本上遵照 Winter 及其同事的方法，通过将高变区序列取代为相应的非人抗体的序列进行人源化。因此，这样的 “人源化” 。

27、抗体是嵌合抗体，其中实质上少于完整的人可变结构域的序列被来自非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体一般是人抗体，其中一些高变区残基和可能有一些框架区残基被来自啮齿类或非人灵长类抗体的类似位点中的残基取代。 0036 本发明使用的术语 “单克隆抗体” 指从基本均质的抗体群体中得到的抗体，即组成群体的个体抗体是同一的，除了可能以少量存在的可能天然发生的突变以外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与包含针对不同抗原位点 ( 决定簇或表位 ) 的不同抗体的多克隆抗体制品相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个抗原位点。除了其特异性以外，单克隆抗体的优势在。

28、于其合成可不被其他抗体污染。修饰语 “单克隆” 表示抗体的特征是从基本均质的抗体群体中获得，而不应被视为需要通过任何特定方法产生所述抗体。 0037 本发明使用的术语 “实验动物”表示以下灵长目的各科成员，即包含绒猴和绢毛猴 ( 绒猴 (Callitrichidae) 科 )，新大陆猴 ( 卷尾猴 (Cebidae) 科 )，旧大陆猴 ( 猕猴 (Cercopithecidae) 科，例如猕猴 (Macaca monkey)，侏儒狐猴和鼠狐猴 ( 鼠狐猴 (Cheirogaleidae) 科 )，指狐猴 (aye-aye)( 指猴 (Daubentoniidae) 科 )。

29、，婴猴 (bushbaby) 和夜猴 (galago)( 婴猴 (Galagonidae) 科 )，长臂猿和小猿 ( 长臂猿 (Hylobatidae) 科 )，马达加斯加大狐猴 (indris)，马达加斯加狐猴 (sifaka)，和其亲属 ( 大狐猴 (Indridae) 科)，美狐猴(狐猴(Lemuridae)科)，懒猴(lorise)(懒猴(Loridae)科)，嬉猴(sportive lemur)( 嬉猴 (Megaladapidae) 科 )，眼镜猴 (tarsier)( 眼镜猴 (Tarsiidae) 科 )，及其杂种。 0038 在一个实施方案中，实验动物。

30、选自绒猴和绢毛猴、旧大陆猴、侏儒狐猴和鼠狐猴、长臂猿和小猿、美狐猴各科的成员，及其杂种。在此实施方案中，排除了离人类最近的亲属，类人猿，特别是黑猩猩、倭黑猩猩 (bonobo)、大猩猩 (gorilla) 和猩猩 (orangutan) 的组。 0039 术语 “样品” 表示从实验动物移取的任意组织或液体样品。在一个实施方案中，样品可为液体样品如唾液、尿、全血、血浆或血清。在另一个实施方案中，样品将为全血、血浆或血清。 0040 “结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体” 将以至少 10-9mol/l 的解离常数 (KDiss)，在另一个实施方案中以至少。

31、10-10mol/l的KDiss结合治疗抗体。同时通过10-7mol/ l 或更差的 KDiss确保不结合实验动物抗体的性能。在另一个实施方案中，结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体在分别针对实验动物的 G 型免疫球蛋白和针对人或黑猩猩的 G 型免疫球蛋白的反应性之间将具有至少 100 倍的 KDiss差距。 0041 大体上，术语 “结合” 表示抗体以 10-9mol/l 或更低的解离常数 ( KD KDiss.)，在另一个实施方案中以至少10-10mol/l的KD结合其抗原或相应的抗体受体(看相应的上下文而定 )。同时通过 10-7mol/l 或更高 ( 例如 10-5mo。

32、l/l) 的 KD确保不结合的性能。在另一个实施方案中，结合第一抗体但不结合第二抗体的抗体在分别针对第一种 G 型免疫球蛋白和说明书 CN 102656460 A 7 5/16 页 8 针对第二种 G 型免疫球蛋白的反应性之间将具有至少 100 倍的 KD差距。 0042 在一个实施方案中通过在BIAcore仪器上的表面等离子共振评估抗体的结合性能，特别是 KDiss。在此方法中，通过表面等离子共振 (SPR) 的变化评估结合性能。可便利地将研究中的抗体与固相 ( 称为芯片 ) 结合并用于评估单克隆抗体、多克隆抗体或甚至包含 IgG 的血清与此包被的芯片的结合。 0043 。

33、研究中的结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体可为单克隆抗体，这样的抗体的片段，以及包含这样的抗体的结合结构域的基因构建体。可使用保留上述结合治疗抗体但不结合实验动物的抗体的标准的任意抗体片段。 0044 可能必须在临床前研究期间评估与治疗抗体在实验动物中的应用相关的多个方面。在特定设置下，可能与分析存在的治疗抗体的总量相关，或分析治疗抗体的特定片段，或治疗抗体的特定修饰，或与抗原结合的治疗抗体的浓度，或仍然能够结合抗原的治疗抗体的部分 (fraction) 可能是重要的。在一个实施方案中，本发明报导的抗体和方法可用于分别检测总治疗抗体、活性治疗抗体或结合抗原的治疗。

34、抗体。 0045 术语 “总治疗抗体” 表示检测的任意抗体，与抗体是否有活性 ( 即仍然可与其抗原反应 )、无活性和 / 或结合抗原无关。 0046 术语 “活性治疗抗体” 表示在实验动物中存在的仍然能够结合其抗原的治疗抗体。例如，这样的抗体在其抗原结合位点上还未结合其抗原或任意其他分子。 0047 术语 “结合抗原的治疗抗体” 表示在实验动物的循环中存在的与其抗原结合的治疗抗体。 0048 可使用本发明报导的抗体和方法直接检测如上定义的总治疗抗体、活性治疗抗体或结合抗原的治疗抗体。另外，可以检测无活性的治疗抗体的其他形式，例如被抗药物抗体或抗个体基因型抗体或特别是中和。

35、抗药物抗体结合的治疗抗体。 0049 另外，也可以间接评估任意 “无活性的治疗抗体” 。这样的无活性的治疗抗体可为，例如与其抗原结合的治疗抗体，或与交叉反应性抗原结合的治疗抗体，或被针对治疗抗体的自身或抗个体基因型抗体阻断的治疗抗体。如果总抗体量大于活性抗体和结合抗原的抗体的和，将存在包含未与其相应抗原结合的无活性抗体的另外一部分抗体。 0050 可在例如所谓的竞争免疫测定系统或在所谓的夹心型测定系统中检测总治疗抗体。这样的测定可在一个不含洗涤步骤的实施方案 ( 均质免疫测定 ) 中进行，或在含有洗涤步骤的另一个实施方案 ( 异质免疫测定 ) 中进行。 0051 在一个。

36、实施方案中，在夹心型免疫测定中检测总治疗抗体，其中结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体在这样的夹心测定的两侧使用。在这样的夹心的一侧使用的抗体与固相结合或能够与固相结合 ( 通常被称为捕获抗体 )，而在这样的夹心的另一侧的抗体以便于直接或间接检测的方式被标记 ( 所谓的检测抗体 )。在这样的夹心测定程序中结合的检测抗体的量与所研究的样品中的治疗抗体的量直接相关。 0052 可通过方便的现有技术程序实现样品中的活性治疗抗体的检测。然而，总治疗抗体或与其抗原结合的治疗抗体的部分的检测相当复杂，并且需要相当不同的测定设置，特别是需要定制的试剂用于每个不同的测定。使用本发。

37、明报导的结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体，可以在彼此类似的检测系统中评估活性治疗抗体、总治疗抗体或结合抗原的治疗抗体的部分。当在这些治疗抗体的不同部分之间进行定量比较时，此类总治疗抗说明书 CN 102656460 A 8 6/16 页 9 体、活性治疗抗体或结合抗原的治疗抗体的比较测定应当具有优势。 0053 在一个实施方案中，设置夹心型测定形式用于检测活性治疗抗体。在另一个实施方案中，结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体被用作捕获抗体，且这样的夹心测定的检测侧使用标记形式的抗原，或在结合抗原后使用不结合或不竞争结合治疗抗体识别的表位的第二抗体，其中。

38、所述第二抗体是可特异性检测的和 / 或以便于直接或间接检测的方式被标记。 0054 在一个实施方案中以夹心型测定的形式检测结合抗原的治疗抗体，使用结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体作为捕获试剂。在一个实施方案中在检测中使用在不与治疗抗体的表位竞争的表位上结合抗原的第二抗体。在一个实施方案中以便于直接或间接检测的方式标记第二抗体。 0055 为了直接检测，标记组可选自任意已知的可检测的标记组，例如染料、发光标记组如化学发光组，例如吖啶酯或二氧杂环丁烷 (dioxetane)，或荧光染料，例如荧光素、香豆素、罗丹明、嗪、试卤灵 (resorufin)、青。

39、色素及其衍生物。标记组的另外实例是发光金属复合物，例如钌或铕复合物，酶，例如用于ELISA或用于CEDIA(克隆酶供体免疫测定)，和放射性同位素。在信号发射组的一个实施方案中也使用可通过电子化学发光检测的金属螯合物作为可检测的标记物，特别优选钌螯合物。在一个实施方案中，标记组是钌 ( 联吡啶 )32+螯合物。 0056 间接检测系统包含，例如检测试剂，例如用结合对的第一配偶体标记的检测抗体。合适的结合对的实例是半抗原或抗原 / 抗体，生物素或生物素类似物例如氨基生物素、亚氨基生物素 (iminobiotin) 或脱硫生物素 / 抗生物素蛋白或链霉抗生物素，糖。

40、 / 凝集素，核酸或核酸类似物 / 互补核酸，和受体 / 配体，例如类固醇激素受体 / 类固醇激素。在一个实施方案中，第一结合对成员选自半抗原、抗原和激素。在一个实施方案中，半抗原选自地高辛和生物素及其类似物。这样的结合对的第二配偶体，例如抗体、链霉抗生物素等通常被标记以允许直接检测，例如通过如上所述的标记物标记。 0057 在所有上述免疫检测方法中，选择允许使用的试剂结合的试剂条件，例如用于抗体与其相应抗原的结合。熟练技术人员使用术语复合物表示这样的结合的结果。通过现有技术程序将在本发明报导的测定方法中形成的复合物与治疗抗体的相应浓度相关联。可通过例如。

41、使用本发明报导的方法在相应的复合物的稀释系列中制备和测定复合物，并将得到的结果与各个复合物成分的浓度相关联进行这样的关联。取决于使用的检测试剂，此关联步骤将得到总治疗抗体、活性治疗抗体或结合抗原的治疗抗体的浓度。 0058 熟练技术人员将理解，本发明报导的方法将不仅仅显示总治疗抗体、结合抗原的治疗抗体、活性治疗抗体或甚至无活性治疗抗体的浓度。由于使用一种相同试剂，即结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体，在不同测定中得到的值可容易地彼此比较并甚至评估其比率。在另一个实施方案中，本发明涉及活性治疗抗体与总治疗抗体的比率。此比率将作为治疗抗体效力的指示。 0059 。

42、在实验过程中发现，在所有类型的人和黑猩猩 G 型抗体上存在的一个或多个表位在任何实验动物的抗体上都不存在。此表位的特征在于，其结合由保藏的细胞系 DSM ACC3006， DSM ACC3007， DSM ACC3008 产生的抗体。因此，本发明报导的一个方面是由细胞系 DSM ACC3006， DSM ACC3007 或 DSM ACC3008 产生的抗体。说明书 CN 102656460 A 9 7/16 页 10 0060 由于 3 种保藏的细胞系识别的表位在抗体的 Fab 区中是唯一的，本发明报导的另一个方面是与从保藏的细胞系DSM ACC3006， DSM ACC。

43、3007， DSM ACC3008得到的抗体结合的表位。在本发明报导的一个方面中，结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体的特征在于，所述抗体是与由细胞系 DSM ACC3006， DSM ACC3007， DSM ACC3008 产生的抗体之一结合相同表位的抗体。 0061 例如，可使用如下方法，其中在竞争检测系统的帮助下测定结合相同靶抗原的 2 种抗体的表位重叠。为此，例如在酶免疫测定的帮助下，检测研究中的抗体与已知抗体竞争结合固定的靶抗原的程度，例如使用由本发明报导的细胞系之一产生的抗体。为此，适当固定的靶抗原与标记形式的已知抗体和过量的所检测的抗体孵育。通。

44、过检测结合的标记可容易地确定所研究的抗体可在多大程度上置换结合的已知抗体。如果在相同的浓度下存在超过 20的置换，在另一个实施方案中超过 30的置换，或在更高的浓度下，在一个实施方案中在研究中的抗体相对已知抗体过量 103-105- 倍的情况下，存在超过 70的置换，在另一个实施方案中超过 80的置换，则存在表位重叠且两种抗体结合相同的表位或相同表位的重叠部分。 0062 可在使用各个抗体的生物素化和地高辛化变体和来自不同物种的血清的夹心 ELISA中显示从保藏的细胞系DSM ACC3006， DSM ACC3007，和DSM ACC3008得到的抗体的特异性。在测。

45、定中 ( 见图 1)，从相同的细胞系得到结合同一表位的捕获和检测抗体。为了作为通用测定用于检测和定量实验动物血清中的人 IgG，这样的测定需要抗人 IgG 抗体，其结合位点独立于任何次级抗体修饰，例如糖基化或脱酰胺。否则，必须对每种待检测和定量的治疗抗体优化测定。此外，本发明报导的每种抗人 IgG 抗体也不同于分析的治疗抗体并可被用作参考标准和阳性对照。用此测定得到的特异性结果显示在图 2 中。 0063 可以看到，本发明报导的抗体对人和黑猩猩 G 型免疫球蛋白的免疫球蛋白高度特异，并显示了比抗体 M-R10Z8E9 更好的特异性，且不结合实验动物的 G 型免疫球。

46、蛋白。实验动物的所有值都远低于用不存在过氧化物酶的 ABTS 得到的空白值。 0064 也可在使用 BIAcore 技术的表面等离子共振实验中显示本发明报导的抗体的特异性。在图 3a) 至 c) 中显示了抗体 M-1.7.10( 从 DSM ACC3008 得到 )、 M-1.3.2( 从 DSM ACC3006 得到 ) 和 M-1.5.8( 从 DSM ACC3007 得到 ) 的 BIAcore 图表，从中可以看出抗体对人和黑猩猩 G 型免疫球蛋白是特异的。 0065 通过使用点印迹实验显示，本发明报导的抗体结合的表位是构象表位，因为在变性的人免疫球蛋白上结合消失 ( 图。

47、4)。 0066 本发明报导的另一个方面是用于定量从实验动物获得的样品中的人抗体或其衍生物例如 Fab 片段的测定，所述测定包括本发明报导的生物素化抗体作为捕获抗体和本发明报导的地高辛化抗体作为示踪抗体。在图 5 中，显示了使用本发明报导的代表性抗体的此测定的图解测定设置和校准曲线 ( 捕获抗体：生物素化 M-1.7.10，分析物：人抗 IL13R1 抗体的 Fab 片段，示踪抗体：地高辛化 M-1.3.2)。此测定需要在 2 个不同的表位上结合人 IgG 的 Fab 片段的捕获和示踪抗体。本发明报导的抗体至少部分结合人或黑猩猩的 G 型免疫球蛋白抗体的轻链恒定区。

48、，并因此适用于此测定。 0067 本发明报导的另一个方面是一种测定，其包括特异性结合人 IgG 的不同结构域上的表位的捕获和示踪抗体。在此测定中，只有完整的治疗抗体将导致阳性测定结果和可检说明书 CN 102656460 A 10 8/16 页 11 测的信号。在一个实施方案中，捕获抗体和示踪抗体一方面独立地选自本发明报导的抗体，另一方面独立地选自抗体 M-R10Z8E9。在根据用于证明在实验动物中的人 IgG 的结构完整性的此方面的代表性测定中，使用生物素化 M-R10Z8E9 作为捕获抗体，抗 IL13R1 抗体作为分析物，地高辛化 M-1.3.2 作为示踪抗。

49、体 ( 在图 6 中显示了此测定的图解测定设置和校准曲线 )。 0068 本发明报导的另一个方面是一种测定，其中使用抗人 IgG 抗体作为参考标准和 / 或阳性对照，以模拟抗药物抗体 (ADA)。这在找出最佳测定条件和检测测定的稳健性，即用不同的标准试剂 / 阳性对照检查测定性能的测定开发中可能有用。考虑到 ADA 将是多克隆的并可能针对 Fab 片段和 Fc 部分二者的事实，此设置特别有利。 0069 在本发明报导的另一个方面，在本发明报导的方法中使用从细胞系 DSM ACC3006， DSM ACC3007 和 DSM ACC3008 得到的抗体之一作为结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体。 0070 本发明报导的另一个方面涉及结合治疗抗体但不结合实验动物抗体的抗体在测定从实验动物获得的样品中的总治疗抗体、活性治疗抗体或结合抗原的治疗抗体的浓度中的用途。在一个实施方案中，在这样的方法中使用的抗体结合选自与从细胞系 D。

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