生物菌剂及制备方法 本发明属于农业应用微生物技术领域，尤其涉及的是一种多株菌混合发酵制成的生物菌剂及制备方法。
现代农业依赖化肥，但化肥的利用率低于40％，更多的化肥经淋溶(损失约10％)、地面冲刷(损失约15％)、挥发(损失约20％)及反硝化脱氮(损失约15％)等进入土壤及周围环境，造成多种不良后果：一是给人类带来许多严重的污染问题；二是农作物特别是瓜果、蔬菜等品质显著下降；三是土壤板结，无机养分不易分解，造成地力下降。后者又迫使农民年复一年的加大化肥用量，不仅费用加大，而且加重了上述弊端，形成了恶性循环。
本发明的目的旨在提供一种防止土地板结，保护自然生态环境，促进农业大幅度增产，防止病虫害，为生产优质绿色食品创造条件的微生物肥料及制备方法。
本发明的技术方案是：制备方法中所使用的八株菌种均来自国家菌库，具体如下：
1、固 氮 菌 (AS.1.222 Azotobater)、
2、巨大芽孢杆菌 (AS.1.151 Bacillus megaterium de Bary)、
3、胶冻样芽孢杆菌(AS.1.153 Bacillus mucilaginosus)、
4、枯草芽孢杆菌 (AS.1.108 Bacillus subtilis)、
5、产黄纤维单胞菌(AS.1.102 Cellulomonas flaxigera)、
6、荧光假单胞菌 (AS.1.867 Pseudomonas fluorescens)、
7、恶臭假单胞菌 (AS.1.870 Pseudomonas putida)、
8、苏云金芽孢杆菌松躅亚种(AS.1.294 Bacillus thuringiensis)。
生产工艺路线：首先，八株菌种分别经原始菌种→斜面菌种→三角瓶摇床深层发酵三步工艺制成所需要的扩大菌种，其中，各种斜面培养基配比如下：
(1)固氮菌斜面培养基配比：KH2PO4 0.1—0.4克、K2HPO4 0.5—1.2克、MgSO4·7H2O 0.05—0.4克、CaSO4·2H2O 0.005—0.02克、FeCl3微量、Na2MoO4·2H2O微量、酵母膏0.2—0.8克、甘露醇15—25克、琼脂18—25克、葡萄糖2％、PH7.2的蒸馏水1升，灭菌121℃/30min，培养温度30℃。
(2)巨大芽孢杆菌斜面培养基配比：蛋白胨4—6克、牛肉膏2—4克、NaCl4—6克、琼脂18—25克、PH7.0—7.1的水1升，灭菌121℃/30min。
(3)胶冻样芽孢杆菌斜面培养基配比同上。
(4)枯草芽孢杆菌斜面培养基配比同上。
(5)产黄纤维单胞菌斜面培养基配比：NaCl4—8克、MgSO4·7H2O 0.05—0.2克、KH2PO4 0.4—0.6克、CaCl2 0.05—0.2克、K2HPO4 1—3克、(NH4)2SO4 1—4克、酵母膏0.5—2克、滤纸条1片、PH7.0—7.5的蒸馏水1升、灭菌121℃/30min。
(6)荧光假单胞菌斜面培养基配比同(2)。
(7)恶臭假单胞菌斜面培养基配比同上。
(8)苏云金芽孢杆菌松躅亚种斜面培养基配比同上。
各种生产菌的三角瓶摇床发酵培养基配比同斜面培养基配比减去琼脂即可。
第三步三角瓶摇床深层发酵的温度为30℃，时间是48小时。
然后，把经过深层发酵的八株菌种混合再经过一级种子罐发酵→二级种子罐发酵→三级种子罐发酵→四级种子罐发酵四步工艺，最后第四级发酵罐放罐标准含菌数为20—150×108个/ml。其中四步发酵工艺的参数如下：
(1)发酵温度：30℃±1℃；
(2)PH：7.0—7.2；
(3)无菌空气通入量：M3/min；
(4)发酵时间：连续48小时；
(5)罐压控制：0.3—0.5Kg/cm2左右；
(6)接种量：10％(含菌数10×108—15×108个/ml)。
一级到四级发酵罐培养液的配比如下：
一级发酵罐培养液的配比是：重过磷酸钙28—34克、氯化钾28—34克、尿素56—64克、用玉米糖浆调糖度至4°—5°(依糖度代调整)、自来水26—30千克、灭菌108℃/40min；
以下各级发酵罐培养液逐步以10倍量放大，其培养参数相同。
最后拌载体(矿粉)制成本发明的产品。
本发明的积极效果是：具有固氮，解磷、钾，分解纤维素、木质素，分解蛋白质及有害有机酸和酸素，抑制和杀灭病原菌，克服连作障碍等多种功能。可以起到促进增根、促早熟、防虫抗病、改善品质、改良土壤、提高产量、增加效益等综合作用。另外，施用有益的微生物菌群与土壤微生物协同作用，能够促进植物(农作物)生长，保证动物(主要是人类)生存、生活条件，维护自然界生态平衡(以物质交换、能量交换为基础)，构成了农业战线上的绿色工程。
以下是本发明应用效果的实施例：
一、本发明的生物菌剂在玉米上应用效果地实施例：
(一)试验材料与方法
1、供试土壤：黑土，肥力中等，PH值近中性。
2、试验处理：处理1—常规施肥＋菌剂250克/亩作底肥一次性施入土壤；处理2—常规施肥＋菌剂500克/亩作底肥一次性施入土壤；处理3—常规施肥。
3、试验设计：试验采用小区试验，小区面积20平方米，三次重复，三次处理，随机区组排列。
(二)试验结果与分析
1、在玉米生长期，对不同处理的玉米生育情况进行调查研究中发现，采用本发明处理的玉米，改善了玉米的生长发育性状，与对照相比，株高增高7—12cm，叶色深绿，穗长增长2.1—3.5cm，每穗粒数增加20—35个，百粒重增加2.3—3.8克。(见表1)
表1 玉米生育性状调查表试验地点 处理 株高 (cm) 叶色 穗长 (cm) 穗粒数 (个) 百粒重 (g) 平 安 乡 1 230 浓绿 19.8 770 30.2 2 238 浓绿 20.1 785 32.3 3 226 绿 17.7 750 28.5 建 设 乡 1 250 浓绿 18.8 769 33.5 2 251 浓绿 19.5 772 34.8 3 247 绿 16.8 751 32.5 双 龙 乡 1 246 浓绿 21.0 810 30.6 2 248 浓绿 22.1 815 31.5 3 241 绿 18.6 790 29.1
2、试验中对玉米的生育时期进行了调查，调查结果发现，施用本发明的玉米，比对照早出苗2—3天，拔节、抽穗期提前2—3天，成熟期提前4—5天。(见表2)
表2 玉米生育时间调查表试验地点 处理 播种期 出苗期 拔节期 抽雄期 成熟期 平 安 乡 1 4.30 5.12 6.16 7.20 9.24 2 4.30 5.11 6.15 7.19 9.23 3 4.30 5.14 6.18 7.22 9.28 建 设 乡 1 4.29 5.12 6.17 7.20 9.26 2 4.29 5.12 6.17 7.19 9.25 3 4.29 5.13 6.19 7.22 9.30 双 龙 乡 1 5.01 5.13 6.19 7.23 9.23 2 5.01 5.12 6.16 7.22 9.22 3 5.01 5.14 6.20 7.25 9.27
3、施用本发明的生物菌剂对玉米产量的影响进行统计分析。(见表3)
表3 玉米产量调查表 Kg/小区试验地点 处理 重复 1 2 3(ck) 增产率 ％平安乡 I 140.5 151.0 138.5 II 142.0 154.2 139.7 III 139.8 149.3 136.8 X 140.8 151.5 138.3 9.5建设乡 I 152.5 159.3 147.8 II 150.5 161.2 151.1 III 148.8 160.0 146.6 X 150.6 160.2 148.5 7.9双龙乡 I 160.3 164.6 155.8 II 161.5 167.8 157.0 III 159.6 163.9 150.0 X 160.5 165.4 154.2 7.2
4、对建设乡玉米的增产调查结果进行差异显著性检验，以验证其可靠性。
表4 资料的方差分析变异因素df SS MS F F0.05 F0.01处理间误差2 0.6 0.3 156 0.1 0.02 6.94 18.00总变异8二、本发明的生物菌剂在蔬菜上应用效果的实施例：
(一)试验材料与方法
1、试验土壤：草甸土，肥力中等，PH值7.5。
2、试验作物：黄瓜。
3、试验处理：处理1—常规施肥＋生物菌剂250克/亩作底肥一次性施入土壤；处理2—常规施肥＋生物菌剂500克/亩作底肥一次性施入土壤；处理3—常规施肥。
4、试验设计：本试验采取小区试验法，小区面积20平方米，三次重复，随机区组排列。
(二)试验结果与分析
1、通过观查与分析，施用本发明的生物菌剂的黄瓜叶色明显比对照浓绿，单果重增加，单株果数增加，增产效果显著。(见表5)
表5 黄瓜生育性状调查表试验地点处理 采收期 株高 (cm) 叶色 单果重 (g)单株果数 (个)始期 末期 红 旗 乡 1 6.25 7.10 285 绿 152 14 2 6.23 7.14 290 绿 160 16 3 6.27 7.9 270 黄绿 145 11 卧 虎 乡 1 6.27 7.15 255 浓绿 135 13 2 6.27 7.18 265 浓绿 143 15 3 6.28 7.11 250 绿 130 10 永 加 乡 1 6.21 7.13 235 绿 148 15 2 6.19 7.17 240 浓绿 153 17 3 6.23 7.12 230 绿 142 13
2、选取红旗乡的试验数据对施用本发明的生物菌剂的黄瓜产量性状影响进行统计分析，增产率达8.3％。(见表6)
表6 黄瓜产量调查表 单位：Kg/平方米 处理重复 1 2 3 最高增 产率％ I 5.35 5.70 5.25 8.5 II 5.40 5.70 5.30 7.6 III 5.42 5.80 5.33 8.8 T 16.17 17.2 15.88 - X 5.39 5.73 5.29 8.3
3、为进一步证实其增产效果的可靠性，需对其进行差异显著性检验，证实了本发明的生物菌剂是一种促使黄瓜增产的优良生物菌剂。(见表7)
表7 资料的方差分析变异因素df SS MS F F0.05 F0.01处理间误差2 0.31 0.155 51.76 0.02 0.003 6.94 18.00总变异8
下面结合实施例对本发明进行详细描述。取八株原始菌种分别放在各自的斜面培养基上常温下培养4—5天，其中，各种斜面培养基配比如下：
(1)固氮菌斜面培养基配比：KH2PO4 0.2克、MgSO4·7H2O 0.2克、CaSO4·2H2O 0.01克、FeCl3微量、Na2MoO4·2H2O微量、酵母膏0.5克、甘露醇20克、琼脂20克、葡萄糖2％、PH7.2的蒸馏水1升，灭菌121℃/30min，培养温度30℃。
(2)巨大芽孢杆菌斜面培养基配比：蛋白胨5克、牛肉膏3克、NaCl 5克、琼脂20克、PH7.0—7.1的水1升，灭菌121℃/30min。
(3)胶冻样芽孢杆菌斜面培养基配比同上。
(4)枯草芽孢杆菌斜面培养基配比同上。
(5)产黄纤维单胞菌斜面培养基配比：NaCl 6克、MgSO4·7H2O 0.1克、KH2PO4 0.5克、CaCl2 0.1克、K2HPO4 2克、(NH4)2SO4 2克、酵母膏1克、滤纸条1片、PH7.0—7.5的蒸馏水1升、灭菌121℃/30min。
(6)荧光假单胞菌斜面培养基配比同(2)。
(7)恶臭假单胞菌斜面培养基配比同上。
(8)苏云金芽孢杆菌松躅亚种斜面培养基配比同上。
然后，把八株斜面菌种再分别放到装有200ml各自的培养基的500ml容量的三角瓶中，进行深层发酵，各种生产菌的三角瓶摇床发酵培养基配比同斜面培养基配比减去琼脂即可，发酵温度为30℃，经过48小时以后，分别取出八株菌种混合依次放进一级种子罐、二级种子罐、三级种子罐、四级种子罐里发酵，最后第四级发酵罐，放罐标准含菌数为20—150×108个/ml。其中发酵参数如下：
(1)发酵温度：303±1℃；
(2)PH：7.0—7.2；
(3)无菌空气通入量：M3/min；
(4)发酵时间：连续48小时；
(5)罐压控制：0.3—0.5Kg/cm2左右；
(6)接种量：10％(含菌数10×108—15×108个/ml)。
一级发酵罐培养液的配比是：重过磷酸钙30克、氯化钾30克、尿素60克、用玉米糖浆调糖度至4°—5°(依糖度代调整)、自来水28千克、灭菌108℃/40min；
以下各级发酵罐培养液逐步以10倍量放大，其培养参数相同。
最后经拌载体沸石∶蛭石粉(80—100目)＝9∶2，制成本发明所述的产品。