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一种化学药物盐酸阿考替胺中有关物质的检测方法
技术领域
本发明是一种化学药物盐酸阿考替胺中有关物质的检测方法，属于药物的 技术领域。
背景技术
盐酸阿考替胺片由日本泽里新药工业株式会社开发，是经日本药品与医疗 器械局(PMDA)批准于2013年6月6日在日本上市的化学药物，用于治疗功能 性消化不良(FD)的餐后饱胀、上腹部腹胀、早饱等症状。盐酸阿考替胺片作 为治疗功能性消化不良的新型药物，在安全性方面明显优于同类型促胃肠动力 药物，目前治疗功能性消化不良市场因多潘立酮的适应症被严格限制，盐酸阿 考替胺的开发应用填补了没有特效药的空白，市场十分广阔。
盐酸阿考替胺产品杂质有：盐酸阿考替胺的中间体2-[N-(2,4,5-三甲氧基苯 甲酰基)氨基]-4-(乙氧基羰基)-1,3-噻唑(杂质A)在生产的过程中可能带入最终 的产品当中，盐酸阿考替胺的降解杂质2-[N-(2-羟基-4,5-二甲氧基苯甲酰基)氨 基]-4-(乙氧基羰基)-1,3-噻唑(杂质B)，在生产过程中和贮藏过程中容易产生。 还有其他生产工艺过程杂质N-(2-(二异丙氨基)乙基)-2-羟基-4,5-二甲氧基 苯甲酰胺盐酸盐(杂质C)、N-[2-双(二异丙基氨基)-乙基]-2-](2，4,5-三甲氧基 苯甲酰基)氨基]-1,3-噻唑-4-羧酰胺盐酸盐三水合物(杂质D)、2-氨基-N-(2-(二 异丙氨基)乙基)噻唑-4-甲酰胺(杂质E)、2-氨基-N-(2-氨基乙基)噻唑-4- 甲酰胺(杂质F)、N-[2-双(二异丙基氨基)-乙基]-2-](5-羟基-2,4-二甲氧基苯甲酰 基)氨基]-1,3-噻唑-4-羧酰胺盐酸盐三水合物(杂质G)。上述杂质在原料合成(原 料杂质)、制剂生产过程中(工艺杂质)可被带入终端产品，或在产品贮存过程 中(降解杂质)产生。上述杂质A～杂质G结构式见下式：

因此建立专属性强、准确度高、重现性好、简便实用且能检测出任何途径 下产生的杂质的检验方法，对于生产企业、检验部门和保证人民用药安全，是 非常需要和重要的。
发明内容
本发明人对盐酸阿考替胺在原料及成品中实际出现的降解产物进行了详 尽的研究。由于降解产物数量多，物理化学性质差异较大，导致了各杂质在色 谱柱上表现差异较大，采用目前使用的等度的洗脱方法很难将各个杂质较好的 分离出来，具体的，等度洗脱方法对盐酸阿考替胺和杂质D无法分离且杂质与 杂质之间的分离度差，因此发明人选择了梯度洗脱的方法，该方法经过系统的 方法学验证，可针对被带入盐酸阿考替胺终端产品中的杂质A～杂质G，进行 定性和定量的分析检测，具有明显超越和实用性。
本发明的目的在于：提供一种化学药物盐酸阿考替胺有关物质的检测方 法，这种方法针对盐酸阿考替胺原料及其制剂相关的生产、检测提供检测的指 标、检测的手段、技术方法等，便于更好的控制产品的质量，指导生产工艺控 制和生产，保证用药安全。
本发明采用的技术方案如下：
采用高效液相色谱法检测化学药物盐酸阿考替胺中的有关物质。采用高效 液相色谱分析方法，选用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相A为甲醇，流 动相B为含0.1％-1％扫尾剂和0.1％-1％pH调节剂的水溶液，流动相采用梯度 洗脱方式，其中，流动相A与流动相B之间的体积比及梯度洗脱时间为35-40 ％：60-65％，0-8min；70-75％：25-30％，8-50min；70-75％：25-30％，50-55min， 流速0.8-1.2mL/min，柱温25～40℃，样品的检测波长为275nm～285nm。
本方法具有简单可行，流动相易配制，灵敏度高的优点。发明人采用梯度 洗脱的方式，前期甲醇比例比较小，主要洗脱极性比较大的杂质，后面慢慢增 大甲醇比例，保证所有有关物质完全冲出并达到基线分离。
所述的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱填料的颗粒度为3-5μm，规格为 250mm×4.6mm或150mm×4.6mm。
所述的扫尾剂为二乙胺或三乙胺或氨水或醋酸铵。
所述的pH调节剂为磷酸或冰醋酸或甲酸或高氯酸。
优选的，流动相A与流动相B之间的体积比及梯度洗脱时间为，40％： 60％，0-8min；70％：30％，8-50min；70％：30％，50-55min。
采用该体积比进行梯度洗脱，分离度达到基线分离，可以明显的看出每个 峰的分离程度，分离度越大，杂质与杂质、杂质与主成分分的越开。柱效越高， 半峰宽越小，峰越瘦，最大可达到20万。拖尾因子小于等于1.5，越接近1， 峰越对称。
本方法还包含以下步骤：1)取盐酸阿考替胺或含盐酸阿考替胺的制剂适 量，选取甲醇-水(1:1)或乙醇-水(1:1)或甲醇或乙腈或流动相为溶剂，加溶 剂溶解，配制成含盐酸阿考替胺1.0-2.0mg/mL的供试品溶液；2)精密量取供 试品溶液1mL，置100mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，再从该100mL 溶液中精密量取5mL，置10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照 溶液；3)取对照溶液10-20μL，注入高效液相色谱仪，调节检测器灵敏度，使 主成分峰高为满量程的10％，再精密量取供试品溶液和对照溶液各10-20μL， 注入高效液相色谱仪进行洗脱，按自身对照法或加校正因子的自身对照法或外 标法以峰面积计算盐酸阿考替胺中有关杂质A～杂质G含量。
选用甲醇-水(1:1)或乙醇-水(1:1)或甲醇或乙腈或流动相作为溶剂配制的 供试品溶液及对照溶液，溶解性好、稳定性好，可保存长达7天，同时，检测 时没有溶剂峰，具有更好的分离效果。
具体地，本发明所述的检测方法，可按照以下方法实现：
照高效液相色谱法，用十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相A为甲醇， 流动相B为含0.1％-1％扫尾剂和0.1％-1％pH调节剂的水溶液，其中，所述的 扫尾剂为二乙胺或三乙胺或氨水或醋酸铵；所述的pH调节剂为磷酸或冰醋酸 或甲酸或高氯酸，按表1进行梯度洗脱，检测波长275nm～285nm，柱温25-40 ℃，流速0.8-1.2mL/min，精密称取盐酸阿考替胺原料药15mg或相当于盐酸 阿考替胺15mg的盐酸阿考替胺制剂适量，选取甲醇-水(1:1)或乙醇-水(1:1) 或甲醇或乙腈或流动相为溶剂，加溶剂溶解，配制成含盐酸阿考替胺1.5mg/mL 的供试品溶液；精密量取供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，加溶剂稀释至刻 度，摇匀，再从该100mL溶液中精密量取5mL，置10mL量瓶中，加溶剂稀 释至刻度，摇匀，作为对照溶液。取对照溶液10-20μL，注入高效液相色谱仪， 调节检测器灵敏度，使主成分峰高为满量程的10％，再精密量取供试品溶液和 对照溶液各10-20μL，注入高效液相色谱仪。按自身对照法或加校正因子的自 身对照法或外标法以峰面积计算盐酸阿考替胺中有关物质含量。
表1 梯度洗脱表


实验例：有关物质检验的方法研究
本品作为原料药，杂质主要包括起始原料杂质、工艺杂质和降解杂质。针 对盐酸阿考替胺的有关物质，我们建立了有效的检测方法，并进行全面的方法 学验证，包括：
1、色谱条件的拟定
检测波长确定：采用紫外分光光度计对盐酸阿考替胺及其所含杂质A～杂 质G在200-400nm之间进行了紫外光谱扫描，结果显示最大吸收在279nm至 294nm。选定280nm作为检测波长。
2、方法学验证
2.1色谱条件
流动相：流动相A为甲醇，流动相B为含0.1％-1％扫尾剂和0.1％-1％pH 调节剂的水溶液，其中，所述的扫尾剂为二乙胺或三乙胺或氨水或醋酸铵；所 述的pH调节剂为磷酸或冰醋酸或甲酸或高氯酸。
流速：1.0mL/min。
柱温：30℃。
2.2专属性考察
盐酸阿考替胺、杂质A～杂质G分离度
取盐酸阿考替胺、杂质A～杂质G各适量，选用甲醇-水(1:1)为溶剂， 加溶剂溶解制成混合溶液，取20μL，注入高效液相色谱仪，结果显示各峰之间 的分离度均符合要求。
2.3最低检测限和最小定量限
参照中国药典2010版二部附录XIX A检测限下的信噪比法进行测定。
取盐酸阿考替胺、杂质A～杂质G对照品适量，选用甲醇-水(1:1)为溶 剂，加溶剂溶解并逐级稀释，量取待测溶液10μL，注入高效液相色谱仪，记录 峰高，取信噪比为10的浓度为最小定量限，信噪比为3的浓度为最小检测限。
测得结果为：盐酸阿考替胺检测限为0.36μg/mL，定量限为0.72μg/mL； 杂质F检测限为0.15μg/mL，定量限为0.30μg/mL；杂质E检测限为0.23μg/mL， 定量限为0.46μg/mL；杂质C检测限为0.8μg/mL，定量限为1.60μg/mL；杂质 D检测限为0.32μg/mL，定量限为0.64μg/mL；杂质G检测限为0.32μg/mL，定 量限为0.65μg/mL；杂质B检测限为0.19μg/mL，定量限为0.38μg/mL；杂质A 检测限为0.19μg/mL，定量限为0.37μg/mL。
2.4线性关系
称取盐酸阿考替胺对照品适量，分别制成一定浓度的储备液，用溶剂将储 备液稀释成不同浓度的溶液，分别取20μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积， 以峰面积为纵坐标(Y)，进样浓度为横坐标(X)，得到线性回归方程为：y＝ 16678x+2668.3，相关系数r＝0.9999，结果表明在0.7μg/mL-120μg/mL浓度范 围内有良好的线性关系，具体数据见表2。
表2 盐酸阿考替胺线性关系结果

2.5稳定性实验
称取盐酸阿考替胺原料药适量，选用甲醇-水(1:1)为溶剂，加溶剂溶解， 配制成含盐酸阿考替胺1.5mg/mL的供试品溶液，分别于室温放置0h、2h、4h、 6h、8h，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，考察供试品溶液的稳定性。按 3.2.S.4.2.3.2有关物质分析方法进行测定，记录色谱，溶液稳定性试验结果见表 3。从表3可以看出，在8小时内盐酸阿考替胺的平均峰面积为25796729， RSD＝0.59％，故可以认为盐酸阿考替胺8小时内的稳定性较好。
表3 溶液稳定性试验结果

2.6仪器精密度实验
称取盐酸阿考替胺或含盐酸阿考替胺的制剂适量，选取甲醇-水(1:1)为 溶剂，加溶剂溶解，配制成含盐酸阿考替胺1.5mg/mL的供试品溶液，精密量 取供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，再从该100mL 溶液中精密量取5mL，置10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照 溶液。
每次吸取盐酸阿考替胺的对照品溶液20μL，注入高效液相色谱仪，连续 进样5次，测定峰面积，盐酸阿考替胺主峰峰面积见表4。从表4可以看出，盐 酸阿考替胺精密度测定结果的RSD＝0.28％，故可以认为仪器精密度良好。
表4 仪器精密度实验结果

2.7重复性实验
称取盐酸阿考替胺原料药6份，选用甲醇-水(1:1)为溶剂，加溶剂溶解， 配制成含盐酸阿考替胺1.5mg/mL的供试品溶液，从每个供试品溶液吸取20μL， 注入高效液相色谱仪，测定主峰面积百分比，盐酸阿考替胺峰面积百分比见表5。 从表5可以看出，稳定性测定结果的RSD＝0.01％，说明本方法进行本品的有 关物质检查，重复性良好。
表5 重复性实验结果

2.8有关物质检查
分别精密称取盐酸阿考替胺原料药三批各约15mg，选用甲醇-水(1:1) 为溶剂，加溶剂溶解，配制成含盐酸阿考替胺1.5mg/mL的供试品溶液，精密 量取供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，再从该 100mL溶液中精密量取5mL，置10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀， 作为对照溶液。
吸取对照溶液10μL，注入高效液相色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成 分峰高为满量程的10％，再精密量取供试品溶液和对照溶液各10μL，注入高 效液相色谱仪。
结果显示如表7和附图1-6所示，三批盐酸阿考替胺原料药供试溶液色 谱图中均未检出杂质A～杂质G，主成分自身对照法未知杂质含量不超过盐酸 阿考替胺含量的0.1％。
表7 三批盐酸阿考替胺检测结果

检查项目 样品1 样品2 样品3 杂质A 未检出 未检出 未检出 杂质B 未检出 未检出 未检出
检查项目 样品1 样品2 样品3 杂质C 未检出 未检出 未检出 杂质D 未检出 未检出 未检出 杂质E 未检出 未检出 未检出 杂质F 未检出 未检出 未检出 杂质G 未检出 未检出 未检出 其他单个杂质 0.03％ 0.03％ 0.02％ 总杂质 0.07％ 0.06％ 0.04％
附图说明
图1是盐酸阿考替胺原料第1批有关物质检查0.5％对照液HPLC图谱
图2是盐酸阿考替胺原料第1批有关物质检查供试液HPLC图谱
图3是盐酸阿考替胺原料第2批有关物质检查0.5％对照液HPLC图谱
图4是盐酸阿考替胺原料第2批有关物质检查供试溶液HPLC图谱
图5是盐酸阿考替胺原料第3批有关物质检查0.5％对照液HPLC图谱
图6是盐酸阿考替胺原料第3批有关物质检查供试品溶液HPLC图谱
图7是盐酸阿考替胺与杂质混合溶液HPLC图谱，图中1～8依次为杂质 F、杂质E、杂质C、杂质D、阿考替胺、杂质G、杂质B、杂质A
具体实施方式
实施例1：盐酸阿考替胺原料药的有关物质及特定杂质A～杂质G的检 测方法
照高效液相色谱法，用十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相A为甲醇， 流动相B为含0.1％二乙胺和0.1％冰醋酸的水溶液；流动相A与流动相B之间 的体积比及梯度洗脱时间为40％：60％，0-8min；70％：30％，8-50min；70 ％：30％，50-55min；检测波长280nm；柱温30℃；流速1.0mL/min；配制 盐酸阿考替胺和杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G 的混合溶液，作为对照品溶液；精密称取盐酸阿考替胺原料药15mg，置10mL 量瓶中，选用甲醇-水(1:1)为溶剂，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供 试品溶液。精密量取供试品溶液1.0mL，置100mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度， 摇匀，再从该100mL溶液中精密量取5.0mL，置10mL量瓶中，加溶剂稀释至 刻度，摇匀，作为对照溶液。取对照品溶液、供试品溶液、对照溶液各10μL， 分别注入高效液相色谱仪。采用主成分自身对照法或标准曲线法进行定量，结 果如图7所示，对照品溶液中杂质A～杂质G均可与主峰分离；供试品溶液中， 杂质A～杂质G均未检出，其他单个杂质≤0.1％，总杂质≤0.5％。
实施例2：盐酸阿考替胺原料药的有关物质及特定杂质A～杂质G的检 测方法
照高效液相色谱法，用十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相A为甲醇， 流动相B为含0.1％三乙胺和0.1％甲酸的水溶液；流动相A与流动相B之间的 体积比及梯度洗脱时间为40％：60％，0-8min；70％：30％，8-50min；70％： 30％，50-55min；检测波长280nm；柱温30℃；流速1.0mL/min；精密称取 盐酸阿考替胺原料药15mg，置10mL量瓶中，选用甲醇-水(1:1)为溶剂，加 溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1.0mL， 置100mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，再从该100mL溶液中精密量取 5.0mL，置10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。取供试 品溶液、对照溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪。采用主成分自身对照法 或标准曲线法进行定量，结果显示杂质A～杂质G均未检出，其他单个杂质 ≤0.1％，总杂质≤0.5％。
实施例3：盐酸阿考替胺原料药的有关物质及特定杂质A～杂质G的检 测方法
照高效液相色谱法，用十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相A为甲醇， 流动相B为含1％氨水和1％高氯酸的水溶液；流动相A与流动相B之间的体 积比及梯度洗脱时间为40％：60％，0-8min；70％：30％，8-50min；70％：30 ％，50-55min；检测波长280nm；柱温30℃；流速1.0mL/min；精密称取 盐酸阿考替胺原料药15mg，置10mL量瓶中，选用甲醇-水(1:1)为溶剂，加 溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1.0mL， 置100mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，再从该100mL溶液中精密量取 5.0mL，置10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。取供试 品溶液、对照溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪。采用主成分自身对照法 或标准曲线法进行定量，结果显示杂质A～杂质G均未检出，其他单个杂质 ≤0.1％，总杂质≤0.5％。
实施例4：盐酸阿考替胺原料药的有关物质及特定杂质A～杂质G的检 测方法
照高效液相色谱法，用十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相A为甲醇， 流动相B为含1％醋酸铵和0.1％磷酸的水溶液；流动相A与流动相B之间的体 积比及梯度洗脱时间为40％：60％，0-8min；70％：30％，8-50min；70％：30 ％，50-55min；检测波长280nm；柱温30℃；流速1.0mL/min；精密称取 盐酸阿考替胺原料药15mg，置10mL量瓶中，选用甲醇-水(1:1)为溶剂，加 溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1.0mL， 置100mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，再从该100mL溶液中精密量取 5.0mL，置10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。取供试 品溶液、对照溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪。采用主成分自身对照法 或标准曲线法进行定量，结果显示杂质A～杂质G均未检出，其他单个杂质 ≤0.1％，总杂质≤0.5％。
实施例5：盐酸阿考替胺原料药的有关物质及特定杂质A～杂质G的检 测方法
照高效液相色谱法，用十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相A为甲醇， 流动相B为含1％二乙胺和1％冰醋酸的水溶液；流动相A与流动相B之间的 体积比及梯度洗脱时间为40％：60％，0-8min；70％：30％，8-50min；70％： 30％，50-55min；检测波长280nm；柱温30℃；流速1.0mL/min；精密称取 盐酸阿考替胺原料药20mg，置10mL量瓶中，选用甲醇-水(1:1)为溶剂，加 溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1.0mL， 置100mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，再从该100mL溶液中精密量取 5.0mL，置10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。取供试 品溶液、对照溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪。采用主成分自身对照法 或标准曲线法进行定量，结果显示杂质A～杂质G均未检出，其他单个杂质 ≤0.1％，总杂质≤0.5％。
实施例6：盐酸阿考替胺原料药的有关物质及特定杂质A～杂质G的检 测方法
照高效液相色谱法，用十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相A为甲醇， 流动相B为含0.1％醋酸铵和1％磷酸的水溶液；流动相A与流动相B之间的体 积比及梯度洗脱时间为40％：60％，0-8min；70％：30％，8-50min；70％：30 ％，50-55min；检测波长280nm；柱温30℃；流速1.0mL/min；精密称取 盐酸阿考替胺原料药15mg，置10mL量瓶中，选用甲醇-水(1:1)为溶剂，加 溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1.0mL， 置100mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，再从该100mL溶液中精密量取 5.0mL，置10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。取供试 品溶液、对照溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪。采用主成分自身对照法 或标准曲线法进行定量，结果显示杂质A～杂质G均未检出，其他单个杂质 ≤0.1％，总杂质≤0.5％。
实施例7：盐酸阿考替胺原料药的有关物质及特定杂质A～杂质G的检 测方法
照高效液相色谱法，用十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相A为甲醇， 流动相B为含0.5％二乙胺和0.5％冰醋酸的水溶液；流动相A与流动相B之间 的体积比及梯度洗脱时间为40％：60％，0-8min；70％：30％，8-50min；70 ％：30％，50-55min；检测波长285nm；柱温30℃；流速1.0mL/min；精密 称取盐酸阿考替胺原料药10mg，置10mL量瓶中，选用甲醇-水(1:1)为溶剂， 加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1.0mL， 置100mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，再从该100mL溶液中精密量取 5.0mL，置10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。取供试 品溶液、对照溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪。采用主成分自身对照法 或标准曲线法进行定量，结果显示杂质A～杂质G均未检出，其他单个杂质 ≤0.1％，总杂质≤0.5％。
实施例8：盐酸阿考替胺原料药的有关物质及特定杂质A～杂质G的检 测方法
照高效液相色谱法，用十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相A为甲醇， 流动相B为含0.5％二乙胺和0.5％冰醋酸的水溶液；流动相A与流动相B之间 的体积比及梯度洗脱时间为40％：60％，0-8min；70％：30％，8-50min；70 ％：30％，50-55min；检测波长275nm；柱温30℃；流速1.0mL/min；精密 称取盐酸阿考替胺原料药10mg，置10mL量瓶中，选用甲醇-水(1:1)为溶剂， 加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1.0mL， 置100mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，再从该100mL溶液中精密量取 5.0mL，置10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。取供试 品溶液、对照溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪。采用主成分自身对照法 或标准曲线法进行定量，结果显示杂质A～杂质G均未检出，其他单个杂质 ≤0.1％，总杂质≤0.5％。
实施例9：盐酸阿考替胺原料药的有关物质及特定杂质A～杂质G的检 测方法
照高效液相色谱法，用十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相A为甲醇， 流动相B为含0.5％二乙胺和0.5％冰醋酸的水溶液；流动相A与流动相B之间 的体积比及梯度洗脱时间为35％：65％，0-8min；75％：25％，8-50min；75 ％：25％，50-55min；检测波长280nm；柱温25℃；流速1.0mL/min；精密 称取盐酸阿考替胺原料药15mg，置10mL量瓶中，选用乙腈为溶剂，加溶剂溶 解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1.0mL，置100mL 量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，再从该100mL溶液中精密量取5.0mL，置 10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。取供试品溶液、对 照溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪。采用主成分自身对照法或标准曲线 法进行定量，结果显示杂质A～杂质G均未检出，其他单个杂质≤0.1％，总杂 质≤0.5％。
实施例10：盐酸阿考替胺原料药的有关物质及特定杂质A～杂质G的检 测方法
照高效液相色谱法，用十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相A为甲醇， 流动相B为含0.5％二乙胺和0.5％冰醋酸的水溶液；流动相A与流动相B之间 的体积比及梯度洗脱时间为35％：65％，0-8min；75％：25％，8-50min；75 ％：25％，50-55min；检测波长280nm；柱温40℃；流速1.0mL/min；精密 称取盐酸阿考替胺原料药15mg，置10mL量瓶中，选用甲醇为溶剂，加溶剂溶 解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1.0mL，置100mL 量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，再从该100mL溶液中精密量取5.0mL，置 10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。取供试品溶液、对 照溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪。采用主成分自身对照法或标准曲线 法进行定量，结果显示杂质A～杂质G均未检出，其他单个杂质≤0.1％，总杂 质≤0.5％。
实施例11：盐酸阿考替胺原料药的有关物质及特定杂质A～杂质G的检 测方法
照高效液相色谱法，用十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相A为甲醇， 流动相B为含0.5％二乙胺和0.5％冰醋酸的水溶液；流动相A与流动相B之间 的体积比及梯度洗脱时间为40％：60％，0-8min；70％：30％，8-50min；70 ％：30％，50-55min；检测波长280nm；柱温30℃；流速0.8mL/min；精密 称取盐酸阿考替胺原料药15mg，置10mL量瓶中，选用流动相为溶剂，加溶剂 溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1.0mL，置 100mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，再从该100mL溶液中精密量取
5.0mL，置10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。取供试 品溶液、对照溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪。采用主成分自身对照法 或标准曲线法进行定量，结果显示杂质A～杂质G均未检出，其他单个杂质 ≤0.1％，总杂质≤0.5％。
实施例12：盐酸阿考替胺原料药的有关物质及特定杂质A～杂质G的检 测方法
照高效液相色谱法，用十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相A为甲醇， 流动相B为含0.5％二乙胺和0.5％冰醋酸的水溶液；流动相A与流动相B之间 的体积比及梯度洗脱时间为40％：60％，0-8min；70％：30％，8-50min；70 ％：30％，50-55min；检测波长280nm；柱温30℃；流速1.2mL/min；精密 称取盐酸阿考替胺原料药15mg，置10mL量瓶中，选用乙醇-水(1:1)为溶剂， 加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1.0mL， 置100mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，再从该100mL溶液中精密量取 5.0mL，置10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。取供试 品溶液、对照溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪。采用主成分自身对照法 或标准曲线法进行定量，结果显示杂质A～杂质G均未检出，其他单个杂质 ≤0.1％，总杂质≤0.5％。
实施例13：盐酸阿考替胺片的有关物质及特定杂质A～杂质G的检测方 法
照高效液相色谱法，用十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相A为甲醇， 流动相B为含0.5％二乙胺和0.5％冰醋酸的水溶液；流动相A与流动相B之间 的体积比及梯度洗脱时间为40％：60％，0-8min；70％：30％，8-50min；70 ％：30％，50-55min；检测波长280nm；柱温30℃；流速1.0mL/min；精密 称取盐酸阿考替胺片细粉适量(相当于盐酸阿考替胺15mg)，置10mL量瓶中， 选用甲醇-水(1:1)为溶剂，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。 精密量取供试品溶液1.0mL，置100mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，再 从该100mL溶液中精密量取5.0mL，置10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇 匀，作为对照溶液。取供试品溶液、对照溶液各10μL，分别注入高效液相色谱 仪。采用主成分自身对照法或标准曲线法进行定量，结果显示杂质A～杂质G 均未检出，其他单个杂质≤0.1％，总杂质≤0.5％。
实施例14：盐酸阿考替胺片的有关物质及特定杂质A～杂质G的检测方 法
照高效液相色谱法，用十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相A为甲醇， 流动相B为含1％三乙胺和1％甲酸的水溶液；流动相A与流动相B之间的体 积比及梯度洗脱时间为40％：60％，0-8min；70％：30％，8-50min；70％：30 ％，50-55min；检测波长280nm；柱温30℃；流速1.0mL/min；精密称取 盐酸阿考替胺片细粉适量(相当于盐酸阿考替胺15mg)，置10mL量瓶中，选 用甲醇-水(1:1)为溶剂，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。 精密量取供试品溶液1.0mL，置100mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，再 从该100mL溶液中精密量取5.0mL，置10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇 匀，作为对照溶液。取供试品溶液、对照溶液各10μL，分别注入高效液相色谱 仪。采用主成分自身对照法或标准曲线法进行定量，结果显示杂质A～杂质G 均未检出，其他单个杂质≤0.1％，总杂质≤0.5％。
实施例15：盐酸阿考替胺片的有关物质及特定杂质A～杂质G的检测方 法
照高效液相色谱法，用十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相A为甲醇， 流动相B为含0.1％氨水和0.1％高氯酸的水溶液；流动相A与流动相B之间的 体积比及梯度洗脱时间为40％：60％，0-8min；70％：30％，8-50min；70％： 30％，50-55min；检测波长280nm；柱温30℃；流速1.0mL/min；精密称取 盐酸阿考替胺片细粉适量(相当于盐酸阿考替胺15mg)，置10mL量瓶中，选 用甲醇-水(1:1)为溶剂，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。 精密量取供试品溶液1.0mL，置100mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，再 从该100mL溶液中精密量取5.0mL，置10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇 匀，作为对照溶液。取供试品溶液、对照溶液各10μL，分别注入高效液相色谱 仪。采用主成分自身对照法或标准曲线法进行定量，结果显示杂质A～杂质G 均未检出，其他单个杂质≤0.1％，总杂质≤0.5％。
实施例16：盐酸阿考替胺片的有关物质及特定杂质A～杂质G的检测方 法
照高效液相色谱法，用十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相A为甲醇， 流动相B为含0.5％二乙胺和0.5％冰醋酸的水溶液；流动相A与流动相B之间 的体积比及梯度洗脱时间为40％：60％，0-8min；70％：30％，8-50min；70 ％：30％，50-55min；检测波长285nm；柱温30℃；流速1.0mL/min；精密 称取盐酸阿考替胺片细粉适量(相当于盐酸阿考替胺15mg)，置10mL量瓶中， 选用乙醇-水(1:1)为溶剂，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。 精密量取供试品溶液1.0mL，置100mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，再 从该100mL溶液中精密量取5.0mL，置10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇 匀，作为对照溶液。取供试品溶液、对照溶液各10μL，分别注入高效液相色谱 仪。采用主成分自身对照法或标准曲线法进行定量，结果显示杂质A～杂质G 均未检出，其他单个杂质≤0.1％，总杂质≤0.5％。
实施例17：盐酸阿考替胺片的有关物质及特定杂质A～杂质G的检测方 法
照高效液相色谱法，用十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相A为甲醇， 流动相B为含0.5％二乙胺和0.5％冰醋酸的水溶液；流动相A与流动相B之间 的体积比及梯度洗脱时间为40％：60％，0-8min；70％：30％，8-50min；70 ％：30％，50-55min；检测波长275nm；柱温30℃；流速1.0mL/min；精密 称取盐酸阿考替胺片细粉适量(相当于盐酸阿考替胺15mg)，置10mL量瓶中， 选用乙醇-水(1:1)为溶剂，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。 精密量取供试品溶液1.0mL，置100mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，再 从该100mL溶液中精密量取5.0mL，置10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇 匀，作为对照溶液。取供试品溶液、对照溶液各10μL，分别注入高效液相色谱 仪。采用主成分自身对照法或标准曲线法进行定量，结果显示杂质A～杂质G 均未检出，其他单个杂质≤0.1％，总杂质≤0.5％。
实施例18：盐酸阿考替胺片的有关物质及特定杂质A～杂质G的检测方 法
照高效液相色谱法，用十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相A为甲醇， 流动相B为含0.5％二乙胺和0.5％冰醋酸的水溶液；流动相A与流动相B之间 的体积比及梯度洗脱时间为35％：65％，0-8min；75％：25％，8-50min；75 ％：25％，50-55min；检测波长280nm；柱温25℃；流速1.0mL/min；精密 称取盐酸阿考替胺片细粉适量(相当于盐酸阿考替胺15mg)，置10mL量瓶中， 选用甲醇为溶剂，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量 取供试品溶液1.0mL，置100mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，再从该 100mL溶液中精密量取5.0mL，置10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀， 作为对照溶液。取供试品溶液、对照溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪。 采用主成分自身对照法或标准曲线法进行定量，结果显示杂质A～杂质G均未 检出，其他单个杂质≤0.1％，总杂质≤0.5％。
实施例19：盐酸阿考替胺片的有关物质及特定杂质A～杂质G的检测方 法
照高效液相色谱法，用十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相A为甲醇， 流动相B为含0.5％二乙胺和0.5％冰醋酸的水溶液；流动相A与流动相B之间 的体积比及梯度洗脱时间为35％：65％，0-8min；75％：25％，8-50min；75 ％：25％，50-55min；检测波长280nm；柱温40℃；流速1.0mL/min；精密 称取盐酸阿考替胺片细粉适量(相当于盐酸阿考替胺15mg)，置10mL量瓶中， 选用甲醇为溶剂，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量 取供试品溶液1.0mL，置100mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，再从该 100mL溶液中精密量取5.0mL，置10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀， 作为对照溶液。取供试品溶液、对照溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪。 采用主成分自身对照法或标准曲线法进行定量，结果显示杂质A～杂质G均未 检出，其他单个杂质≤0.1％，总杂质≤0.5％。
实施例20：盐酸阿考替胺片的有关物质及特定杂质A～杂质G的检测方 法
照高效液相色谱法，用十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相A为甲醇， 流动相B为含0.5％二乙胺和0.5％冰醋酸的水溶液；流动相A与流动相B之间 的体积比及梯度洗脱时间为40％：60％，0-8min；70％：30％，8-50min；70 ％：30％，50-55min；检测波长280nm；柱温30℃；流速0.8mL/min；精密 称取盐酸阿考替胺片细粉适量(相当于盐酸阿考替胺15mg)，置10mL量瓶中， 选用流动相为溶剂，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密 量取供试品溶液1.0mL，置100mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，再从该 100mL溶液中精密量取5.0mL，置10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀， 作为对照溶液。取供试品溶液、对照溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪。 采用主成分自身对照法或标准曲线法进行定量，结果显示杂质A～杂质G均未 检出，其他单个杂质≤0.1％，总杂质≤0.5％。
实施例21：盐酸阿考替胺片的有关物质及特定杂质A～杂质G的检测方 法
照高效液相色谱法，用十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相A为甲醇， 流动相B为含0.5％二乙胺和0.5％冰醋酸的水溶液；流动相A与流动相B之间 的体积比及梯度洗脱时间为40％：60％，0-8min；70％：30％，8-50min；70 ％：30％，50-55min；检测波长280nm；柱温30℃；流速1.2mL/min；精密 称取盐酸阿考替胺片细粉适量(相当于盐酸阿考替胺15mg)，置10mL量瓶中， 选用乙腈为溶剂，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量 取供试品溶液1.0mL，置100mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，再从该 100mL溶液中精密量取5.0mL，置10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀， 作为对照溶液。取供试品溶液、对照溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪。 采用主成分自身对照法或标准曲线法进行定量，结果显示杂质A～杂质G均未 检出，其他单个杂质≤0.1％，总杂质≤0.5％。