用于检测多特异性结合物的方法.pdf

本文中报道了一种用于检测样品中多特异性抗体的方法，其中i)与多特异性抗体的第一结合特异性结合的第一抗独特型抗体和ii)与多特异性抗体的第二结合特异性结合的第二抗独特型抗体特异结合多特异性抗体，并且确定形成的复合物。

1.  用于确定样品中多特异性抗体的量的方法，包括步骤：
－通过将复合物同与多特异性抗体的第二结合特异性特异结合的抗独特型抗体温育，确定复合物的量，其中所述复合物是在i)与多特异性抗体的第一结合特异性特异结合的抗独特型抗体和ii)多特异性抗体之间形成的复合物，所述多特异性抗体的第二结合特异性不同于多特异性抗体的第一结合特异性，和由此确定样品中多特异性抗体的量。

2.  根据权利要求1所述的方法，特征在于与多特异性抗体的第一结合特异性特异结合的抗独特型抗体与固相缀合。

3.  根据前述权利要求中任一项所述的方法，特征在于与多特异性抗体的第二结合特异性特异结合的抗独特型抗体与可检测标记物缀合。

4.  根据前述权利要求中任一项所述的方法，特征在于样品包含血清或血浆，和/或是细胞裂解物，和/或包含多特异性抗体的一种或多种抗原。

5.  根据权利要求4所述的方法，特征在于样品是血清或血浆。

6.  根据前述权利要求中任一项所述的方法，特征在于多特异性抗体是双特异性抗体。

用于检测多特异性结合物的方法
本发明涉及一种用于检测样品中的多特异性结合物的方法，其中使用针对该多特异性结合物的不同结合特异性的抗独特型抗体，检测该多特异性结合物。
发明背景
使用抗体的标准固相免疫测定法涉及在固相上吸附/固定的抗体(捕捉抗体)、抗原和针对与酶或可检测标记物(示踪抗体)缀合的抗原的另一个表位的抗体之间形成复合物。在该测定法中，形成夹心物(sandwich)：固相/捕捉抗体/抗原/示踪抗体。在夹心物等催化的反应中，抗体缀合的酶的活性与温育介质中的抗原浓度成比例。抗独特型抗体测定法在例如US 5,219,730；WO 87/002778；EP 0 139 389和EP 0 170 302中提及。Wadhwa,M.等人(J.Immunol.Methods 278(2003)1-17)报道了用于检测、测量和表征由治疗性生物制品诱导的不想要的抗体的对策。EP 1 917 854中报道了用于产生抗独特型抗体的方法。
在WO 2008/119353中报道了双特异性抗体和用于产生它的方法。用于确定蛋白质和抗体治疗药的二价的方法在WO 2006/096697中报道。在WO 2008/134046中报道了强力、稳定和无免疫抑制的抗CD4抗体。Muller,K.M.等人报道了抗体的第一恒定域(CH1和CL)可以用作双特异性微型抗体的异二聚化结构域。
发明概述
已经发现在用于确定样品中多特异性抗体的量的夹心免疫测定法中，通过使用两种抗独特型抗体作为捕捉抗体和作为示踪抗体，其中每种抗独特型抗体与多特异性抗体的不同结合特异性结合，可以最小化因样品基质(例如血清或人血浆，抗原等)所致的影响。额外地，可以使用这样的测试设置，所述测试设置更灵敏，更不受样品基质影响、可以更快地进行，需要样品基质的最小移除/稀 释并分别提供捕捉抗体和/或示踪抗体标记/衍生化/固定的更大灵活性。这通过使用两种抗独特型抗体实现，一种针对双特异性抗体的第一结合特异性并且一种针对双特异性抗体的第二结合特异性。
因此，本文中报道了一种用于(免疫)确定样品中多特异性结合物的量的方法，包括步骤：
－通过将复合物同与多特异性结合物的第二结合特异性特异结合的抗独特型抗体温育确定复合物的量，其中所述复合物是在i)与多特异性结合物的第一结合特异性特异结合的抗独特型抗体，和ii)多特异性结合物之间形成的复合物，所述第二结合特异性与多特异性抗体的第一结合特异性不同，并且因而确定多特异性结合物在样品中的量。
在一个实施方案中，与多特异性结合物的第一结合特异性特异结合的抗独特型抗体与固相缀合。
在一个实施方案中，与多特异性结合物的第二结合特异性特异结合的抗独特型抗体与可检测标记物缀合。
在一个实施方案中，样品包含(人)血清或(人)血浆，和/或是细胞裂解物，和/或包含多特异性结合物的一种或多种抗原。在一个实施方案中，样品是(人)血清或(人)血浆。
在一个实施方案中，多特异性结合物选自抗体、包含抗体或抗体片段和非抗体多肽的融合多肽、包含抗体或抗体片段和可溶性受体的融合多肽，或者包含抗体或抗体片段和肽结合分子的融合多肽。
在一个实施方案中，多特异性结合物是抗体。在一个实施方案中，抗体是双特异性抗体、或三特异性抗体、或四特异性抗体、或五特异性抗体、或六特异性抗体。在一个实施方案中，抗体是双特异性抗体。
在一个实施方案中，结合特异性是结合位点或成对的抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域。
在一个实施方案中，与多特异性结合物的第一结合特异性特异结合的抗独特型抗体是生物素酰化的并且固相经链霉亲和素包被。在一个实施方案中，固相是链霉亲和素包被的顺磁珠或链霉亲和素包被的琼脂糖珠。
在一个实施方案中，与多特异性结合物的第二结合特异性特异性结合的抗独特型抗体是洋地黄毒苷化的(digoxigenylated)。
在一个实施方案中，该方法包括步骤：
－通过确定形成的复合物中的可检测标记物来确定复合物的量，其中所述复合物是在i)与多特异性结合物的第一结合特异性特异结合的抗独特型抗体，ii)多特异性结合物，和iii)与多特异性结合物的第二结合特异性特异结合并包含可检测标记物的抗独特型抗体之间形成的复合物。
在一个实施方案中，通过借助N端氨基和/或ε-氨基(赖氨酸)、不同赖氨酸的ε-氨基、药物抗体的氨基酸主链的羧基、巯基、羟基和/或酚官能团和/或药物抗体的糖结构的糖醇基化学结合，实施抗独特型抗体与其缀合配偶体的缀合。
在一个实施方案中，抗独特型抗体是这样的混合物，其包含通过至少两种不同氨基与固相缀合的抗独特型抗体。这类通过不同氨基的偶联可以通过如下实施，在第一步中用化学保护剂酰化(例如通过柠康酰化(citraconylation))ε-氨基的一部分。在第二步中，通过剩余的氨基实施缀合。随后，移除柠康酰化，并且将抗体通过剩余的游离氨基与固相缀合，即，将获得的抗体通过未受柠康酰化保护的氨基与固相缀合。合适的化学保护剂在未保护的侧链胺上形成键，比N末端处的那些键更不稳定且不同。许多这类化学保护剂是已知的(参见例如EP 0 651 761)。在一个实施方案中，化学保护剂包括环状二羧酸酐，例如马来酸酐或柠康酸酐(citraconylic acid anhydride)。
在一个实施方案中，抗独特型抗体通过被动吸附与固相缀合。被动吸附例如由Butler,J.E.在“Solid Phases in Immunoassay”(1996)205-225和Diamandis,E.P.和Christopoulos,T.K.(编者)在“Immunoassay”(1996)Academic Press(San Diego)中描述。
在一个实施方案中，抗独特型抗体通过特异性结合对缀合(固定)。在一个实施方案中，这种结合对(第一组分/第二组分)选自链霉亲和素或亲和素蛋白/生物素、抗体/抗原(参见例如，Hermanson,G.T.等人，Bioconjugate Techniques,Academic Press(1996)、凝集素/多糖、类固醇/类固醇结合蛋白、激素/激素受体、酶/底物、IgG/蛋白A和/或蛋白G等。在一个实施方案中，抗独 特型抗体与生物素缀合，并且通过固定的亲和素或链霉亲和素实施固定。
附图描述
图1用于确定血清样品和细胞样品中双特异性抗体浓度的示意性药物代谢动力学ELISA测定原理(基于抗独特型抗体的ELISA)。
图2用于检测抗VEGF/ANG2抗体的基于抗原的夹心ELISA。将重组人血管生成素(angiopoietin)2直接包被至微量滴定板。平行地，将含有抗VEGF/ANG2抗体的样品与洋地黄毒苷标记的重组VEGF预温育。在包被后，将板洗涤并且与预温育的混合物温育。抗VEGF/ANG2抗体和洋地黄毒苷标记的VEGF的复合物与微量滴定板表面上的ANG2结合。用抗洋地黄毒苷抗体-HRP缀合物和ABTS检测结合的洋地黄毒苷标记的VEGF。
图3比较对检测双特异性抗VEGF/ANG2抗体的基于抗原的ELISA(A)和基于抗独特型抗体的ELISA(B)所获得的校准曲线。
图4在5％、10％和20％人血清存在下比较基于抗独特型抗体的ELISA和基于抗原的ELISA的校准曲线。
发明详述
本文中报道了确定临床前样品和临床样品中多特异性结合物(如双特异性抗体/药物)的量的体外方法。
已经发现必须通过使用与多特异性结合物的不同结合特异性结合的两种抗独特型抗体检测样品中的多特异性结合物，以最小化样品基质所致的影响并且以允许在建立并实施样品中多特异性结合物的量的免疫确定方面更大程度的灵活性。
在下文，如本文中报道的方法以多特异性抗体作为多特异性结合物的实施方案举例。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖各种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性。
在某些实施方案中，多特异性结合物是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，一种结合特异性针对第一抗原并且另一种结合特异性针对不同的第二抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合相同抗原的2个不同的表位。双特异性抗体可以被制备为全长抗体或抗体片段。在一个实施方案中，抗体是特异性结合第一和第二抗原的双特异性抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体具有i)特异性结合第一抗原或抗原上的第一表位的第一结合特异性，和ii)特异性结合第二抗原或相同抗原上的第二表位的第二结合特异性。在一个实施方案中，相同抗原上的第二表位是不重叠的表位。
多特异性抗体描述在WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792或WO 2010/145793中。
“抗体片段”指不同于完整抗体的分子，所述分子包含完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')₂；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。存在五个大类的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类(同种型)，例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。
术语“游离抗原”表示这样的抗原，其可以被抗体的结合特异性特异的结合，但目前还没有结合该结合特异性。在一个实施方案中，游离抗原是未结合抗体的抗原或未与抗体复合的抗原。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域，其含有恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变异Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文另外说明，否则Fc区或恒定区的氨基酸残基编号是根据EU编号系统，也被称为EU索引，如Kabat,E.A. 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242。
“构架”或“FR”指除高变区(HVR)残基之外的可变域残基。可变域的FR通常由以下4个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常按以下序列出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
“人抗体”是具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列，或源自利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的这种定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少1个、并且一般2个可变域的基本上全部部分，其中全部或基本上全部HVR(例如，CDR)与非人抗体的那些对应并且全部或基本上全部FR区与人抗体的那些对应。人源化抗体任选地可以包含从人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体的“人源化形式”例如非人抗体，指已经历过人源化的抗体。
如本文中使用的，术语“超变区”或“HVR”指抗体可变结构域中序列高度变化和/或形成结构定义的环(“超变环”)的每个区域。一般而言，天然的四链抗体包含6个HVR；3个在VH中(H1、H2、H3)，3个在VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包括来自超变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列可变性和/或参与抗原识别。示例性的超变环出现在第26-32位(L1)、第50-52位(L2)、第91-96位(L3)、第26-32位(H1)、第53-55位(H2)和第96-101位(H3)氨基酸残基(Chothia,C.和Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)出现在L1的第24-34位、L2的第50-56位、L3的第89-97位、H1的第31-35B位、H2的第50-65位和H3的第95-102位氨基酸残基(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest， 第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242)。除了VH中的CDR1外，CDR一般包括形成超变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，它们是接触抗原的残基。SDR含于称作缩写-CDR或a-CDR的CDR区域内部。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)出现在L1的第31-34位、L2的第50-55位、L3的第89-96位、H1的第31-35B位、H2的第50-58位和H3的第95-102位氨基酸残基(Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633)。除非另外说明，否则HVR残基和可变域中的其他残基(例如，FR残基)在本文中根据上文Kabat等人编号。
如本文中使用的，术语“单克隆抗体”指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除可能的变体抗体外，包含在群体中的单个抗体是相同的和/或结合相同表位，例如含有天然存在的突变或在生产单克隆抗体制品的过程中产生的突变，这类变体一般只以微量存在。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆的”指示该抗体的特征为从基本上同质的抗体群体获得，并且不得解释为要求通过任何特定方法产生该抗体。例如，可以通过多种技术产生根据本发明待使用的单克隆抗体，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于产生单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链的参与抗体结合抗原的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)一般具有相似的结构，每个结构域包含4个保守的构架区(FR)和3个超变区(HVR)(参见例如Kindt,T.J.等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman和Co.,N.Y.(2007),第91页)。单个VH或VL结构域足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用结合抗原的来自抗体的VH或VL结构域来分离结合特定抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH结构域文库(参见例如Portolano,S.等人，J.Immunol. 150(1993)880-887；Clackson,T.等人，Nature 352(1991)624-628)。
术语“抗独特型抗体”表示特异性结合至亲本抗体的结合特异性(如结合位点)的抗体，即，针对例如亲本抗体的抗原结合位点。在一个实施方案中，抗独特型抗体特异性结合亲本抗体的一个或多个CDR。在一个实施方案中，亲本抗体是治疗性抗体。在一个实施方案中，亲本抗体是多特异性抗体。在一个实施方案中，亲本抗体是双特异性抗体。
如果通过表面等离子体共振(SPR)测定法检测到信号降低50％或更多，在一个实施方案中，降低75％或更多，则两个表位是重叠的，所述SPR测定法使用固定的抗体和可溶性抗原，或反之亦然，其中研究的表位的浓度是20-50nM，需要检测表位重叠的抗体的浓度是100nM。备选地，可以使用这样的方法，其中结合相同抗原的两个抗体的表位重叠是在竞争性测试系统的帮助下确定的。出于该目的，例如在基于细胞的酶免疫测定法(ELISA)的帮助下，应用表达重组抗原表位的细胞，测试需要检测表位重叠的抗体是否与其它抗体竞争结合固定抗原。为此目的，孵育固定抗原与标记形式的抗体和需要确定表位重叠的过量抗体。通过检测结合的标记，可以容易地验证表位重叠。如果关于已知抗体，确定了在相同浓度下，信号降低大于70％，在一个实施方案中，降低大于80％，或在更高浓度下，替换大于80％，在一个实施方案中，替换大于90％，在一种情形下，具有10⁵倍过量的需要被测定表位重叠的抗体，则存在表位一致性或重叠，且两种抗体结合相同抗原上相同的或重叠的表位。
不同免疫测定法的原理例如由Hage,D.S.(Anal.Chem.71(1999)294R-304R)描述。Lu,B.等人(Analyst 121(1996)29R-32R)报道了用于免疫测定法中的抗体的定向固定。例如Wilchek,M.和Bayer,E.A.在Methods Enzymol.184(1990)467-469报道了亲和素蛋白-生物素介导的免疫测定法。
作为蛋白质，单克隆抗体和其恒定域含有多个反应性侧链，用于偶联至结合配偶体，如表面、蛋白质、聚合物(例如，PEG、纤维素或聚苯乙烯)、酶或结合对的成员。抗体的化学反应基团是例如氨基(赖氨酸(lysin)、α-氨基)、巯基(胱氨酸(cystin)、半胱氨酸(cysteine)和甲硫氨酸(methionin))、羧酸基(天冬氨酸、谷氨酸)和糖醇基。这类方法描述在例如Aslam M.和Dent,A.的 “Bioconjugation”，MacMillan Ref.Ltd.1999,第50-100页中。
最常见的蛋白质的反应基团之一是氨基酸赖氨酸的脂族ε-胺。一般而言，几乎全部蛋白质均含有丰富的赖氨酸。在高于pH 8.0时(pKa＝9.18)，赖氨酸胺是相当好的亲核基团，因此容易地且完全地与多种试剂反应，形成稳定的键。胺反应性试剂主要与赖氨酸和蛋白质的α-氨基反应。活性酯，特别是N-羟-琥珀酰亚胺(NHS)酯，是修饰胺基的最常用试剂。用于在含水环境中反应的最佳pH是pH 8.0至9.0。异硫氰酸盐/酯是胺修饰试剂，与蛋白质形成硫脲键。它们在含水溶液中与蛋白质胺反应(最佳是在pH 9.0至9.5)。醛类在温和的含水条件下与脂肪族和芳香族胺类、肼类和酰肼类反应，形成亚胺中间物(希夫氏碱)。希夫氏碱可以用温和的或强的还原剂(如硼氢化钠或氰硼氢化钠)选择性还原，衍生出稳定的烷基胺键。已经用于修饰胺类的其他试剂是酸酐。例如，二乙烯三胺五乙酸酐(DTPA)是含有2个胺反应性酐基的双功能螯合剂。它能够与蛋白质的N端和ε-胺基反应以形成酰胺键。酐环打开以产生能够与配位复合物中的金属紧密结合的多价金属螯合臂。
抗体中另一种常见的反应基团是来自含硫氨基酸胱氨酸及其还原产物半胱氨酸(或半个胱氨酸)的巯基残基。半胱氨酸含有比胺更亲核并且一般是蛋白质中最有反应性的官能团的游离巯基。硫醇类一般在中性pH是反应性的，因此可以在存在胺的条件下与其他分子选择性偶联。由于游离的巯基是相对反应性的，在具有这些基团的蛋白质中这些基团通常以二硫基或二硫键的氧化形态存在。在这类蛋白质中，用试剂如二硫苏糖醇(DTT)还原二硫键是生成反应性游离巯基必需的。巯基反应试剂是这些试剂，所述试剂与蛋白质上的巯基偶联，形成硫醚偶联的产物。这些试剂在弱酸性至中性pH下快速反应，因此可以在胺基存在下选择性反应。文献报道了几种硫醇化交联剂的用途，如Traut试剂(2-亚氨基硫烷(2-iminothiolane))、琥珀酰亚氨基(乙酰硫基)乙酸酯(SATA)和磺基琥珀酰亚氨基6-[3-(2-吡啶基二硫基)丙酰氨基]己酸酯(Sulfo-LC-SPDP)，以通过活性氨基提供引入多个巯基的有效方式。卤乙酰基衍生物(例如碘乙酰胺)形成硫醚键，并且也是用于巯基修饰的试剂。其他有用的试剂是马来酰亚胺。马来酰亚胺与巯基反应性试剂的反应基本上和与碘乙酰胺的反应相同。马 来酰亚胺在弱酸性至中性pH时快速的反应。
抗体中另一个常见的反应基团是羧酸。蛋白质在C末端位置上、在天冬氨酸和谷氨酸的侧链中含有羧酸基。羧酸在水中相对低的反应性通常导致难以利用这类基团选择性的修饰蛋白质和其他生物分子。当进行修饰时，通常利用水溶性碳二亚胺将羧酸基转化为反应性酯，并且与亲核试剂如胺、酰肼或肼反应。含胺的试剂应该是弱碱性的，从而在存在赖氨酸的更强碱性的ε-氨基的条件下，与活化的羧酸选择性反应，形成稳定的酰胺键。当pH升高到高于8.0时，可以发生蛋白质交联。
高碘酸钠可用于将与抗体相连的碳水化合物部分中的糖的醇部分氧化为醛。每个醛基可以与针对羧酸所述的胺、酰肼或肼反应。由于碳水化合物部分主要出现在抗体的可结晶片段(Fc)区中，可以通过定点修饰远离抗原结合位点的碳水化合物来实现缀合。形成希夫氏碱中间物，可以通过用氰硼氢化钠(温和的和选择性的)或硼氢化钠(强)水溶性还原剂还原中间物，将其还原成烷基胺。
术语“样品”包括但不限于来自活物或之前的活物的任意量的物质。这类活物包括但不限于人、小鼠、猴、大鼠、兔和其他动物。在一个实施方案中，样品获自猴，尤其获自食蟹猴、或兔、或小鼠、或大鼠。在一个实施方案中，这类物质包括但不限于来自个体的全血、血清或血浆，这是临床常规中最广泛使用的样品源。
术语“固相”表示非液体的物质，包括由例如聚合物、金属(顺磁、铁磁颗粒)、玻璃和陶瓷的材料制成的颗粒(包括微粒和珠子)；胶物质，如硅石、矾土和聚合物胶；毛细管，可由聚合物、金属、玻璃和/或陶瓷制成；沸石和其他多孔物质；电极；微滴定板；固态条(stripe)；和比色杯、管或其他分光光度计的样品容器。固相组分与惰性固体表面的区别在于“固相”在其表面上含有至少一个部分预期与样品中的物质相互作用。固相可以是固定组分，如管、条、比色杯或微滴定板，或者可以是不固定的组分，如珠子和微粒。可以使用多种允许蛋白质和其他物质非共价或共价连接的微粒。这类颗粒包括聚合物颗粒，如聚苯乙烯和聚(甲基丙烯酸酯)；金粒，如金纳米颗粒和金胶体；以及陶瓷 颗粒，如硅石、玻璃和金属氧化物颗粒。参见例如，Martin,C.R.等，Analytical Chemistry-News & Features,70(1998)322A-327A，或Butler,J.E.,Methods 22(2000)4-23。
在一个实施方案中，从色素原(荧光或发光的基团和染料)、酶、NMR-活性基、金属颗粒或半抗原(如洋地黄毒苷)中选择可检测标记物。可检测标记物还可以是可以光可激活的交联基团，例如，叠氮基或1H-氮杂环丙烯基(azirine group)。还在一个实施方案中，可以通过电化学发光检测的金属螯合物是信号发射基团，特别优选的是钌螯合物，例如，钌(双吡啶基)₃²⁺螯合物。合适的钌标记基团在例如EP 0 580 979、WO 90/05301、WO 90/11511和WO 92/14138中描述。
术语“治疗性多特异性结合物”指意在用于人类中的多特异性结合物。在一个实施方案中，多特异性结合物是多特异性抗体。在一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。在一个实施方案中，多特异性或双特异性抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，多特异性抗体或双特异性抗体是人单克隆抗体或人源化单克隆抗体。
术语“实验动物”指任何哺乳动物，包括家养动物和农场动物以及高级灵长类，然而，不包括人。在一个实施方案中，如本文中报道的方法用从实验动物获得的样品进行，所述实验动物选自包括小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、犬、猫和灵长类如狐猴、猴、狨猴和猿的组。如果实验动物是小猿(lesser ape)，人类的最近亲，则排除大猿，尤其黑猩猩、倭黑猩猩、大猩猩和猩猩群组。
术语“总治疗性多特异性结合物”指实验动物的样品中存在的任何治疗性多特异性结合物，无论治疗性多特异性结合物是否有活性(即，仍然与其一种或多种结合配偶体反应)、无活性和/或是结合配偶体复合的。
术语“有活性的治疗性多特异性结合物”指实验动物的样品中存在的仍然能够结合一个或多个其结合配偶体的治疗性多特异性结合物。
术语“结合配偶体复合的治疗性多特异性结合物”指实验动物的样品中存在的其中至少一种结合特异性与其结合配偶体特异结合的治疗性多特异性结合物。
本文中报道了一种用于确定样品中多特异性结合物的量的免疫测定方法。
使用捕捉分子、示踪分子和检测分子，将该免疫确定法作为桥接测定法进行。
在一个实施方案中，捕捉分子与固相结合。捕捉分子可以是多特异性结合物的任一种结合配偶体(例如双特异性抗体的抗原之一)、多特异性结合物的通用复合剂(例如在全长抗体的情况下的Fc-受体或在全长抗体的情况下的抗Fc区抗体)，或结合对的第一配偶体(如果多特异性结合物用结合对的第二配偶体衍生化)，或与多特异性结合物的结合特异性特异结合的抗独特型抗体。
示踪分子可以是多特异性结合物的任何结合配偶体(例如，双特异性抗体的抗原之一，但如果使用一种抗原作为捕捉分子，则必须使用不同的抗原作为示踪分子)、多特异性结合物的通用复合剂(例如，在全长抗体的情况下的Fc-受体，条件是尚未使用该分子作为捕捉分子，或者在全长抗体的情况下的抗Fc区抗体，条件是如果还使用相同类型的抗体作为捕捉分子，则该抗体与不同的表位结合)、或结合对的第一配偶体(如果多特异性结合物用结合对的第二配偶体衍生)(条件是使用与用来固定捕捉分子的结合对不同的结合对)、或与多特异性结合物的结合特异性进行特异结合的抗独特型抗体(条件是该抗体与作为捕捉分子使用的抗独特型抗体不同的结合特异性结合)。
现在已经发现为了确定样品中多特异性结合物的量，有利的使用抗独特型抗体作为捕捉分子和作为示踪分子，其中抗独特型抗体与多特异性结合物的不同结合特异性结合。
与使用多特异性结合物的抗原作为捕捉分子和示踪分子的方法相比，通过在免疫确定样品中的多特异性抗体中使用抗独特型抗体作为捕捉分子和作为示踪分子，该方法i)更稳健/样品基质中的物质遭遇更少干扰，ii)需要更少样品稀释，iii)可以更快进行，iv)在捕捉抗体和/或示踪抗体的标记/衍生化/固定方面灵活性更大。
已经发现如果使用多特异性结合物的抗原作为捕捉和示踪分子，则免疫确定样品中、特别地在从实验动物获得的含有血清或人血浆的样品中多特异性结合物的量受样品基质强烈影响。
如果样品从实施例如药物代谢动力学研究的实验动物获得，则除多特异性结合物之外，样品还将含有源自实验动物的其他密切相关组分。例如，如果样品是从实验动物的血液获得的血清，则它还将含有多特异性结合物(例如多特异性抗体的抗原)的一种或多种结合配偶体(例如受体或Shed受体分子的可溶性配体)、量比多特异性结合物的量更高或更低的不同亚类的免疫球蛋白、非特异性复合分子等。这些分子均可以在免疫测定方法中起到干扰作用。
例如在双特异性抗体的情况下，除特异性抗体之外，样品还包含双特异性抗体的一种或两种抗原。这导致游离双特异性抗体、与一种抗原复合的双特异性抗体、与两种抗原复合的双特异性抗体和与其他血清组分或人血浆组分非特异性复合的上文所列每种分子的混合物的存在。可以用如上文概述的捕捉及示踪分子的任何可能组合检测到游离双特异性抗体。抗原复合的抗体还可以原则上用前述任一组合检测到，但是方法的灵敏度将降低，因为随着抗原复合的抗体与未复合的形式处于平衡，一些双特异性抗体从样品中存在的抗体总量撤除。抗原复合的抗体的量是高度可变的并且因此以高度可变方式影响测定法。这可以至少部分地通过使用延长的温育时间来对抗，在另一方面这迟滞了分析的实施。
现在已经发现，可以通过使用与双特异性抗体的不同结合特异性的CDR特异性结合的抗独特型抗体作为捕捉分子和作为示踪分子，改进免疫确定从实验动物获得的血清样品或血浆样品中的双特异性抗体量的方法的灵敏度。同样地，可以减少用于实施确定的所需时间，因为尤其不需要延长的温育时间以移动结合平衡。额外地，可以减少固体表面上所需的捕捉分子量/捕捉分子密度，因为可以捕捉双特异性抗体，无论是否与抗原复合，并且因此需要较少的捕捉分子。
如本文中报道的一个方面是一种用于从实验动物获得的样品中确定治疗性多特异性结合物的量或浓度、在一个实施方案中多特异性抗体、尤其双特异性抗体的量或浓度的方法，所述方法包括按以下顺序的以下步骤：
i)将样品与特异结合至多特异性结合物的第一结合特异性的第一抗独特型抗体温育，
b)将样品与特异结合至多特异性结合物的第二结合特异性的第二抗独特型 抗体温育，其中第二结合特异性与第一结合特异性不同，和
c)使步骤b)中形成的复合物与治疗性多特异性结合物的量或浓度相关。
在一个实施方案中，多特异性结合物是多特异性抗体。
在一个实施方案中，多特异性结合物是双特异性抗体。
在一个实施方案中，结合特异性是一对的抗体重链可变域和其相关抗体的轻链可变域。
在一个实施方案中，具有多特异性结合物的一种或多种结合特异性的结合配偶体是抗原。在一个实施方案中，就来自可溶性抗原和膜结合抗原的每种结合特异性彼此独立地选择抗原。在一个实施方案中，就来自受体配体和细胞表面受体的每种结合特异性彼此独立地选择抗原。
在一个实施方案中，方法是免疫测定法。在一个实施方案中，免疫测定法是夹心免疫测定法。
在一个实施方案中，通过借助N端和/或ε-氨基(赖氨酸)、不同赖氨酸的ε-氨基、抗体的氨基酸主链的羧基、巯基、羟基和/或酚官能团和/或抗体的糖结构的糖醇基化学结合，实施多特异性结合物与其缀合配偶体的缀合。
在一个实施方案中，捕捉抗独特型抗体通过特定结合对固定。在一个实施方案中，捕捉抗独特型抗体与生物素缀合，并且通过固定的亲和素或链霉亲和素实施固定。
在一个实施方案中，示踪抗独特型抗体通过特定结合对与可检测标记物缀合。在一个实施方案中，示踪抗独特型抗体与洋地黄毒苷缀合并且通过针对洋地黄毒苷的抗体进行与可检测标记物的连接。
在一个实施方案中，实验动物选自以下组，所述组包含狨猴和绢毛猴、旧世界猴、侏儒狐猴和鼠狐猴、长臂猿和小猿、真狐猴的家族成员以及其杂种。
在一个实施方案中，治疗性抗体是人抗体或人源化抗体。在一个实施方案中，人抗体或人源化抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，检测总治疗性抗体，在另一个实施方案中，检测活性治疗性抗体，并且在一个实施方案中，检测与其抗原结合的治疗性抗体。
在一个实施方案中，抗独特型抗体与顺磁珠缀合。
在一个实施方案中，抗独特型抗体与固相缀合。
可能必须在临床前研究期间评估与实验动物中施加治疗性多特异性结合物有关的多个方面。在某些情况下，这可能涉及到分析样品中存在的治疗性多特异性结合物的总量，或可能重要的是分析样品中治疗性多特异性结合物的某些片段、样品中治疗性多特异性结合物的某些修饰、与样品中一种或多种结合配偶体结合的治疗性多特异性结合物在样品中的浓度或样品中仍然能够与一种或多种其结合配偶体结合的治疗性多特异性结合物的部分。在一个实施方案中，如本文中报道的方法分别用于检测总治疗性多特异性结合物，或活性治疗性多特异性结合物，或结合配偶体复合的治疗性多特异性结合物。
可以在如本文中报道的方法中检测总治疗性多特异性结合物、活性治疗性多特异性结合物或结合配偶体复合的治疗性多特异性结合物。
此外，还可能间接评估任何“无活性”治疗性多特异性结合物。这类无活性治疗性多特异性结合物可以例如是与一种或两种其抗原结合的治疗性双特异性抗体，或与交叉反应性抗原结合的治疗性双特异性抗体，或被针对治疗性双特异性抗体的自身抗体阻断的治疗性双特异性抗体。在总多特异性结合物达到多于活性多特异性结合物和结合配偶体复合的多特异性结合物的总和的情况下，存在额外部分的多特异性结合物，其包含与相应结合配偶体不结合的无活性多特异性结合物。
将获得多种测定法系统来分析例如总治疗性多特异性结合物、活性治疗性多特异性结合物或结合配偶体复合的治疗性多特异性结合物。
例如可以在所谓的竞争性免疫测定体系中或在所谓的夹心型测定体系中检测总多特异性结合物。
此类测定法可以在无洗涤步骤(均相免疫测定法)的情况下或在有洗涤步骤(异质免疫测定法)的情况下进行。
在一个实施方案中，在夹心型免疫测定中检测总治疗性多特异性结合物的量，其中将抗独特型抗体用在这类夹心测定法的两侧处，因而两种抗独特型抗体与多特异性结合物的不同结合特异性特异结合。在这类夹心的一侧处使用的抗独特型抗体结合或能够结合至固相(经常称作捕捉抗独特型抗体)，而在这类夹 心的另一侧处的抗独特型抗体以促进直接或间接检测的方式标记(所谓的示踪抗独特型抗体)。在这类夹心测定法中结合的示踪抗独特型抗体的量与研究的样品中治疗性多特异性结合物的量直接相关。
在本领域(例如US 2003/0068664)中，已知允许检测活性治疗性抗体的测定体系。这类体系需要抗原与固相结合、治疗性抗体与这种结合的抗原结合以及检测借助抗原与固相结合的治疗性抗体。
可以通过常规现有技术方法实现对样品中活性多特异性结合物的检测。但是，对总治疗性多特异性结合物或对与其结合配偶体复合的治疗性多特异性结合物部分的检测是相当复杂的并且需要完全不同的测定建置并且尤其需要用于每种不同测定法的定制试剂。采用如本文中报道的方法，可能评估检验系统中彼此类似的活性治疗性多特异性结合物、总治疗性多特异性结合物或结合配偶体复合的治疗性多特异性结合物的部分。就其本质而言，一旦在治疗性多特异性结合物的这些多种部分之间进行定量比较，则对总治疗性多特异性结合物、活性治疗性多特异性结合物或结合配偶体复合的治疗性多特异性结合物的这种类型的比较评估应当具有优势。
在一个实施方案中，建立夹心型测定模式以检测活性治疗性多特异性结合物。在一个实施方案中，使用与治疗性多特异性结合物的一种结合特异性结合的抗独特型抗体作为捕捉抗独特型抗体并且这类夹心测定法的检测一侧利用由处于标记形式的多特异性结合物的相应另一种结合特异性特异结合的抗原，或备选地在结合由多特异性结合物的相应另一种结合特异性特异结合的抗原后，利用不与治疗性多特异性结合物识别的表位结合的或与之竞争的第二抗体，其中第二抗体是特异性可检测的和/或以促进直接或间接检测的方式标记。
在一个实施方案中，使用与多特异性结合物的一种结合特异性特异结合的抗独特型抗体作为捕捉抗独特型抗体，以夹心型测定模式检测结合配偶体复合的治疗性多特异性结合物。在检测中，使用与下述结合配偶体结合的第二抗体，其中所述结合配偶体在不与治疗性多特异性结合物的表位竞争的表位处被多特异性结合物的不同结合特异性特异结合。在一个实施方案中，所述第二抗体以促进直接或间接检测的方式标记。
对于直接检测，标记基团可以选自任何已知的可检测标记基团，如染料、发光标记基团如化学发光基团，例如吖啶酯或二氧杂环丁烷(dioxetane)、或荧光染料，例如荧光素、香豆素、罗丹明、嗪、试卤灵、花青和其衍生物。标记基团的其他例子是发光金属络合物，如钌或铕络合物，酶，例如用于ELISA或用于CEDIA(克隆的酶供体免疫测定法)的酶，和放射性同位素。还在一个实施方案中，能通过电化学发光检测的金属螯合物是作为可检测标记物使用的信号发射基团，特别优选的是钌螯合物。在一个实施方案中，标记基团是钌(双吡啶基)₃²⁺螯合物。
间接检测体系例如包含用生物亲和结合对的第一配偶体标记检测试剂，例如标记示踪抗独特型抗体。合适的结合对的例子是半抗原或抗原/抗体、生物素或生物素类似物如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素/亲和素或链霉亲和素、糖/凝集素、核酸或核酸类似物/互补的核酸、和受体/配体，例如，类固醇激素受体/类固醇激素。在一个实施方案中，第一结合对成员包含半抗原、抗原和激素。在一个实施方案中，半抗原选自包含洋地黄毒苷、茶碱、碳硼烷和生物素以及其类似物的组。这种结合对的第二配偶体，例如抗体、链霉亲和素等，通常经标记以允许直接检测，例如，通过如上文提到的标记物标记。
免疫测定法是技术人员熟知的。用于实施此类测定的方法以及实际应用和操作步骤汇总于相关教材中。相关教材的例子是Tijssen,P.,Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates,引自"Practice and theory of enzyme immunoassays"(1990)221-278,R.H.Burdon和v.P.H.Knippenberg编著,Elsevier,Amsterdam)和"Methods in Enzymology",S.P.Colowick,N.O.Caplan和S.P.编著,Academic Press中处理免疫检测方法的各卷，尤其第70、73、74、84、92和121卷。
在以上全部免疫检测法中，选择允许所用试剂结合的试剂条件，例如允许抗体与其相应抗原结合的试剂条件。技术人员使用术语复合物来指这种结合事件的结果。本发明测定法中形成的复合物通过现有技术方法与样品中治疗性多特异性结合物的相应浓度相关。取决于所用的检测试剂，这种相关步骤将导致产生总治疗性多特异性结合物、活性治疗性多特异性结合物或结合配偶体复合 的治疗性多特异性结合物的浓度。
归因于在不同测定法中使用一种且相同的试剂，即，抗独特型抗体，获得的值可以容易地彼此比较并且甚至与其所评估的比率比较。在一个实施方案中，本发明涉及活性治疗性多特异性结合物对总治疗性多特异性结合物的比率。这个比率可以很好地充当治疗性多特异性结合物的效力的指示。
在一个方面，本文中报道了一种用于免疫确定样品中多特异性结合物的量的方法，包括步骤：
－通过将复合物同与多特异性结合物的第二结合特异性特异结合的第二抗独特型抗体温育，确定复合物的量，其中所述复合物是在i)与多特异性结合物的第一结合特异性特异结合的第一抗独特型抗体，和ii)多特异性结合物之间形成的复合物，所述第二结合特异性与多特异性抗体的第一结合特异性不同，和由此确定多特异性结合物在样品中的量。
在一个实施方案中，通过桥接免疫测定法确定多特异性结合物的量。在一个实施方案中，免疫测定法包括捕捉抗体和示踪抗体，其中捕捉抗体与固相缀合，而示踪抗体与可检测标记物缀合。在一个实施方案中，捕捉抗体和示踪抗体均是与多特异性结合物的不同结合特异性结合的抗独特型抗体。
在一个实施方案中，捕捉抗体与固相缀合。
在一个实施方案中，示踪抗体包含可检测标记物。
用于如本文所报道的方法中的抗独特型捕捉抗体可以与固相缀合。在一个实施方案中，通过借助N端和/或ε-氨基(赖氨酸)、不同赖氨酸的ε-氨基、抗体的氨基酸主链的羧基、巯基、羟基和/或酚官能团和/或抗体的糖结构的糖醇基化学结合，实施缀合。在一个实施方案中，抗独特型捕捉抗体是与固相缀合的至少两种抗体的混合物，其中与固相缀合的至少两种抗体在与固相缀合的位点方面是不同的。例如，与固相缀合的至少两种抗体的混合物可包含通过抗体的氨基酸主链的氨基酸与固相缀合的抗体，和通过抗体的糖结构的糖醇基与固相缀合的抗体。还例如，与固相缀合的至少两种抗体的混合物可以包含通过其氨基酸主链的不同氨基酸残基与固相缀合的抗体。表述“不同的氨基酸残基”表示两种不同类型的氨基酸，如赖氨酸和天冬氨酸、或酪氨酸和谷氨酸，或氨基酸主 链的在抗体氨基酸序列中位置不同的两个氨基酸残基。在后一种情况下，氨基酸可以是相同种类或不同种类的。表述“在抗体位点方面不同”表示位点类型方面的不同，例如氨基酸或糖醇基，或氨基酸骨架的氨基酸数方面不同，例如在所述的氨基酸数处抗体与固相缀合。相同的应用也可以用于本文报道的方法中使用的示踪抗体。
在方法的一个实施方案中，免疫测定法包含捕捉抗体、示踪抗体和检测抗体，其中捕捉抗体是通过链霉亲和素与固相缀合的、与多特异性结合物的第一结合特异性特异结合的生物素酰化的抗独特型抗体，示踪抗体是缀合至洋地黄毒苷的、与多特异性结合物的不同于第一结合特异性的第二结合特异性特异结合的抗独特型抗体，并且检测抗体是与辣根过氧化物酶缀合的针对洋地黄毒苷的抗体。
在一个实施方案中，该方法包括下列步骤：
－将包含多特异性结合物的样品与第一抗独特型抗体温育，所述第一抗独特型抗体与多特异性结合物的第一结合特异性特异结合，由此形成第一抗独特型抗体和多特异性结合物之间的复合物，
-将抗独特型捕捉抗体和多特异性结合物之间的复合物与第二抗独特型抗体温育，所述第二抗独特型抗体与多特异性结合物的第二结合特异性特异结合，所述第二结合特异性与结合至第一抗独特型抗体的结合特异性不相同，即，与之相异，由此在第一抗独特型抗体、多特异性结合物和第二抗独特型抗体之间形成复合物，和
－确定先前步骤中形成的复合物的量。
在一个实施方案中，通过使用校准曲线确定多特异性结合物的量。
在一个实施方案中，第二抗独特型抗体与可检测标记物缀合。
在一个实施方案中，通过确定固定的可检测标记物的量确定多特异性结合物的量。
在一个实施方案中，多特异性结合物是双特异性结合物。在一个实施方案中，双特异性结合物是双特异性抗体。
提供下列实施例和附图以帮助理解本发明，本发明的实际范围在所附的权 利要求中陈述。应理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以修改所述的方法。
实施例
实施例1
用于确定样品中双特异性抗体的量的一般方法
用酶联免疫吸附测定法(ELISA)确定多特异性结合物/双特异性抗体的浓度。
对于小鼠血清样品或血浆样品和眼裂解物中的双特异性抗体的定量，用针对双特异性抗体的不同结合特异性的生物素酰化和洋地黄毒苷化的单克隆抗独特型抗体作为捕捉抗体和检测抗体进行固相系列夹心免疫测定以验证双特异性抗体的双特异性的完整性。在这种针对双特异性抗VEGF/ANG2抗体的设置中，生物素酰化的抗独特型捕捉抗体与VEGF结合位点特异性结合，而洋地黄毒苷化的抗独特型检测抗体与ANG2结合位点特异性结合。用与抗洋地黄毒苷抗体偶联的辣根过氧化物酶检测在链霉亲和素包被的微量滴定板(SA-MTP)的固相上的捕捉抗体、双特异性抗体和检测抗体的结合性免疫复合物。从SA-MTP洗去未结合的材料并添加ABTS-底物后，获得的信号与SA-MTP的固相上结合的双特异性抗体的量成比例。通过将样品的测量信号换算成平行分析的校准物的浓度，进行定量。
检测双特异性抗VEGF/ANG2抗体的设置
在第一步骤中，将SA-MTP以500转/分钟在MTP摇板机上用100μl/孔的生物素酰化抗独特型捕捉抗体溶液(抗抗VEGF抗体抗体M-2.45.51-Bi)按浓度1μg/ml包被1小时。同时，准备校准物、QC样品和样品。将校准物和QC样品稀释成2％血清矩阵。将样品稀释直至信号处于校准物的线性范围内。
在SA-MTP用抗独特型捕捉抗体包被后，将板用300μl/孔洗涤缓冲液洗涤3次。随后，将100μl/孔的校准物、QC样品和样品吸到SA-MTP上并且以500转/分钟温育1小时。
双特异性抗VEGF/ANG2抗体现在以其VEGF结合位点，通过抗独特型抗VEGF抗体捕捉抗体与SA-MTP的固相结合。在温育后，通过洗涤板移除未结 合的分析物。此后，将100μl/孔抗独特型检测抗体(抗抗ANG2抗体抗体M-2.6.81-Dig)按浓度250ng/ml添加至SA-MTP的各孔。此后，将板以500转/分钟在摇板机上温育1小时。在洗涤后，将100μl/孔的第二检测抗体(抗洋地黄毒苷多克隆抗体-Fab-POD缀合物)以浓度50mU/ml添加至SA-MTP的各孔并且将板以500转/分钟温育1小时。在除去过量第二检测抗体的最终洗涤步骤后，添加100μl/孔底物(ABTS)。抗体-POD缀合物催化底物的颜色反应。随后通过ELISA读数仪在405nm波长测量信号(参比波长：490nm([405/490]nm))。
实施例2
使用实施例1的测定法，用于在人FcRn转基因的FcRn小鼠中药物代谢动力学表征双特异性抗体
在生活阶段
本研究包括雌性C57BL/6J小鼠(背景)，所述小鼠是小鼠FcRn缺陷并对人FcRn为半合子转基因的小鼠(huFcRn，品系276-/tg)。
第1部分：
将全部小鼠用2μl/动物的适宜溶液(即21μg化合物/动物(无突变I253A、H310A和H435A的抗VEGF/ANG2抗体(根据Kabat的EU索引编号)，关于所用抗体和氨基酸序列的进一步细节，参见EP 12176299.1)或23.6μg化合物/动物(包含突变I253A、H310A和H435A的抗VEGF/ANG2抗体(根据Kabat的EU索引编号))以玻璃体内方式注射至右眼中1次。
将小鼠分成2个组，每组6只动物。血液样品在施加相应的双特异性抗体后的2、24和96小时取自组1并且在7、48和168小时后取自组2。
通过使用来自德国柏林World Precision Instruments,Inc.的用于纳升注射的NanoFil微量注射器系统，进行注射至小鼠右眼的玻璃体中。小鼠用2.5％异氟烷(Isoflurane)麻醉并且为了使小鼠眼可视化，使用具有40倍放大率和采用Leica KL 2500 LCD照明的环形光源的Leica MZFL3显微镜。随后，使用35号针注射2μl化合物。
从每只动物经对侧眼的眼球后静脉丛采集血液，以确定血清中的化合物水 平。
通过在4℃离心(9,300xg)3分钟，在室温1小时后从血液获得至少50μl血清样品。将血清样品离心后直接冷冻并在-80℃冷冻贮藏直至分析。
在处理后96小时分离组1的动物的处理眼并且在处理后168小时分离组2的动物的处理眼。
将样品在-80℃冷冻贮藏直至分析。
第2部分：
将全部小鼠用200μl/动物的适宜溶液(即21μg化合物/动物(无突变I253A、H310A和H435A的抗VEGF/ANG2抗体(根据Kabat的EU索引编号))或23.6μg化合物/动物(包含突变I253A、H310A和H435A的抗VEGF/ANG2抗体(根据Kabat的EU索引编号))经尾静脉以静脉内方式注射1次。
将小鼠分成2个组，每组5只动物。血液样品在施加相应的双特异性抗体后的1、24和96小时取自组1并且在7、48和168小时后取自组2。
从每只动物经眼球后静脉丛采集血液，以确定血清中的化合物水平。
通过在4℃离心(9,300xg)3分钟，在室温1小时后从血液获得至少50μl血清样品。将血清样品离心后直接冷冻并在-80℃冷冻贮藏直至分析。
全眼裂解物(小鼠)的制备
通过物理-化学瓦解来自实验室动物的全眼获得眼裂解物。对于机械破坏，将每只眼转移至1.5ml带圆锥底的微量小瓶中。在冷冻和解冻后，将眼用1ml细胞洗涤缓冲液洗涤1次(Bio-Rad,Bio-Plex细胞裂解试剂盒，目录号171-304011)。在后续步骤中，添加500μl新鲜制备的细胞裂解缓冲液并使用1.5ml组织碾磨杵(Kimble Chase，1.5ml杵，产品编号749521-1500)研磨眼。将混合物随后冷冻并融化5次并再次研磨。为了将裂解物与残留的组织分开，将样品以4,500g离心4分钟。在离心后，收集上清液并贮存在-20℃直至在定量ELISA中进一步分析。
分析
根据实施例1进行样品中双特异性抗体的量的确定。
药物代谢动力学评价
使用药物代谢动力学评价程序WinNonlin^TM(Pharsight)5.2.1版，通过非房室分析计算药物代谢动力学参数。
结果
A)血清浓度
表1至2中显示血清浓度的结果。
表1：比较玻璃体内施加和静脉内施加无突变I253A、H310A和H435A的抗VEGF/ANG2抗体后的血清浓度。

表2：比较玻璃体内施加和静脉内施加具有突变I253A、H310A和H435A的抗VEGF/ANG2抗体后的血清浓度。


B)左眼和右眼的眼裂解物中的浓度
表3至4中显示眼裂解物中浓度的结果。
表3a：玻璃体内施加入右眼后眼裂解物中无突变I253A、H310A和H435A的抗VEGF/ANG2抗体的浓度。

表3b：静脉内施加后眼裂解物中无突变I253A、H310A和H435A的抗VEGF/ANG2抗体的浓度。

表4a：玻璃体内施加入右眼后眼裂解物中具有突变I253A、H310A和H435A的抗VEGF/ANG2抗体的浓度。


表4b：静脉内施加后眼裂解物中具有突变I253A、H310A和H435A的抗VEGF/ANG2抗体的浓度。

实施例3
用于药物代谢动力学表征双特异性抗体的测定法
用基于抗原的ELISA(A)和基于抗独特型抗体的ELISA(B)分析在10％人EDTA/血浆中包含抗VEGF/ANG2抗体的同一组样品。
用于检测抗VEGF/ANG2抗体的基于抗原的ELISA：
在第一步骤中，将重组人血管生成素2(ANG2)直接包被到Maxisorb微量滴定板上1小时。平行地，将洋地黄毒苷标记的重组人VEGF与分别含有未知量的抗VEGF/ANG2抗体或参比标准物的样品预温育。在与洋地黄毒苷标记的VEGF预温育之前，将样品稀释10倍。在包被并洗涤微量滴定板后，将抗VEGF/ANG2抗体和洋地黄毒苷标记的VEGF的预温育溶液吸至微量滴定板并温育另一小时。与来自预温育溶液的洋地黄毒苷标记的VEGF结合的抗VEGF/ANG2抗体结合至固定的ANG2。在另一个洗涤步骤后，将HRP标记的(辣根过氧化物酶标记的)多克隆抗洋地黄毒苷抗体添加至板并温育另一小时。此后，洗涤板并添加ABTS底物溶液以触发颜色反应(参见图2)。
用于检测抗VEGF/ANG2抗体的基于抗独特型抗体的ELISA：
在第一步骤中，将SA-MTP(链霉亲和素包被的微量滴定板)用生物素酰化的抗独特型捕捉抗体溶液(抗抗VEGF抗体抗体(M-2.45.51-BI))包被。同时，准备 校准物、对照样品(QC样品)和样品。将校准物和QC样品稀释成10％食蟹猴血浆矩阵。将样品稀释直至信号处于校准物的线性范围内。
在SA-MTP用抗独特型捕捉抗体包被后，将板洗涤3次。随后，QC样品和样品吸至SA-MTP上并且以500转/分钟温育1小时。
双特异性抗VEGF/ANG2抗体借助其VEGF结合位点，通过抗独特型抗VEGF抗体捕捉抗体与SA-MTP的固相结合。在温育后，通过洗涤板移除未结合的分析物。此后，将抗独特型检测抗体(抗抗ANG2抗体抗体(M-2.6.81-DIG)，0.5μg/ml)添加至SA-MTP的各孔。此后，将板以500转/分钟在摇板机上温育1小时。在洗涤后，将第二检测抗体(抗洋地黄毒苷多克隆抗体-Fab-POD缀合物(POD＝过氧化物酶))添加至SA-MTP的各孔并且将板以500转/分钟温育1小时。在除去过量第二检测抗体的最终洗涤步骤后，添加底物(ABTS)。抗体-POD缀合物催化底物的颜色反应。随后通过ELISA读数仪在405nm波长测量信号(参比波长：490nm([405/490]nm))。在405nm测量10％人血浆中从0.1-30ng/ml的校准标准物的OD信号。
表5：比较用于检测抗VEGF/ANG2抗体的测定法(A)和测定法(B)。