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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410592877.4 (22)申请日 2014.10.30 C09B 23/08(2006.01) C09K 11/06(2006.01) G01N 21/64(2006.01) C07K 1/13(2006.01) (71)申请人 顾新华 地址 200000 上海市杨浦区开鲁二村 29 弄 401 室 (72)发明人 顾新华 郭大川 (54) 发明名称 一种用于巯基标记的五甲川花菁类染料的合 成方法 (57) 摘要 一种用于巯基标记的五甲川花菁类染料的合 成方法， 它涉及巯基的荧光标记技术领域， 它的合 成步骤如下 ： 第一步，。
2、 反应一 ： 将 1-1.5 当量的化 合物 I 和 1-1.2 当量的化合物 II 在 1.5-3.5 当 量的醋酸酐中加热搅拌 0.5-1 小时， 得到中间产 物 III ； 第二步， 反应二 ： 将 1 当量的中间产物 III 与 1.1-1.5 当量的碘化钠在有机溶剂 1 中加热至 40-70回流2-24小时， 得到目标产物IV， 即水溶 性荧光化合物。它将五甲川花菁素类的化合物引 入了多个亲水性的磺酸基团， 提高了水溶性 ； 进 一步减少了连接位点与荧光基团的距离， 提高了 探针的刚性 ； 从而解决了目前蛋白质荧光探针亲 水端与疏水端分布不均匀、 探针连接基团较长的 问题。 (51)。
3、Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104479392 A (43)申请公布日 2015.04.01 CN 104479392 A 1/1 页 2 1.一种用于巯基标记的五甲川花菁类染料的合成方法， 其特征在于它的合成步骤如 下 ： 第一步， 反应一 ： 将 1-1.5 当量的化合物 I 和 1-1.2 当量的化合物 II 在 1.5-3.5 当量 的醋酸酐中加热搅拌 0.5-1 小时， 得到中间产物 III ； 第二步， 反应二 ： 将 1 当量的中间产物 III 与 1.1-1.5 当量。
4、的碘化钠在有机溶剂 1 中加 热至 40-70回流 2-24 小时， 得到目标产物 IV， 即水溶性荧光化合物。 权 利 要 求 书 CN 104479392 A 2 1/3 页 3 一种用于巯基标记的五甲川花菁类染料的合成方法 技术领域 ： 0001 本发明涉及巯基的荧光标记技术领域， 具体涉及一种用于巯基标记的五甲川花菁 类染料的合成方法。 背景技术 ： 0002 五甲川花菁素类化合物是一类重要的有机染料广泛应用于生物分析、 激光染料、 纳米材料等领域。 该类化合物具有很高的摩尔消光系数， 其最大的吸收波长可在600-700nm 区域， 可以有效地过滤生物体内的背景荧光， 提高实验检测的信。
5、噪比。 0003 在激发波长在 600-700nm 的荧光探针的商业化产包括 GE 公司的 Cy5-NHS-ester、 Cy5Maleimide 等产品， 然而这些产品水溶性较差， 不利于对水溶液中的大分子进行标记， 且连接的碳链较长， 其较大的柔性不利于对生物大分子的结构和动态学特征进行精确地描 述。而 Alexei Toutchkine 等人发展了 Cy5.2-IA、 neo-Cy5 等一系列的化合物， 虽具有较好 的水溶性， 但是由于化合物的亲水和疏水基团分布不均匀， 存在明显的亲水端和疏水端， 使 得探针在溶液中的分布不均匀， 从而影响实验结果的准确性。 发明内容 ： 0004 本发。
6、明的目的是提供一种用于巯基标记的五甲川花菁类染料的合成方法， 它将五 甲川花菁素类的化合物引入了多个亲水性的磺酸基团， 提高了水溶性 ； 进一步减少了连接 位点与荧光基团的距离， 提高了探针的刚性 ； 从而解决了目前蛋白质荧光探针亲水端与疏 水端分布不均匀、 探针连接基团较长的问题。 0005 为了解决背景技术所存在的问题， 本发明是采用以下技术方案 ： 它的合成步骤如 下 ： 0006 第一步， 反应一 ： 将 1-1.5 当量的化合物 I 和 1-1.2 当量的化合物 II 在 1.5-3.5 当量的醋酸酐中加热搅拌 0.5-1 小时， 得到中间产物 III ； 0007 第二步， 反应二。
7、 ： 将 1 当量的中间产物 III 与 1.1-1.5 当量的碘化钠在有机溶剂 1 中加热至 40-70回流 2-24 小时， 得到目标产物 IV， 即水溶性荧光化合物。 0008 所述的化合物 I 结构中， 对应的阳离子为钾离子或钠离子。 0009 所述的化合物 II 结构中， 对应的阳离子为钾离子或钠离子。 0010 所述的有机溶剂 1 为甲醇与氯仿的混合溶剂或者甲醇与二氯甲烷的混合溶剂。 0011 本发明具有以下有益效果 ： 将五甲川花菁素类的化合物引入了多个亲水性的磺酸 基团， 提高了水溶性 ； 进一步减少了连接位点与荧光基团的距离， 提高了探针的刚性 ； 从而 解决了目前蛋白质荧光。
8、探针水溶性差、 亲水基团与疏水基团分布不均匀、 连接基团较长的 问题 ； 该荧光化合物作为一种蛋白质巯基标记的探针， 可以有效降低背景荧光干扰， 提高 信噪比， 同时， 该荧光探针的柔性较小， 有利于对生物大分子的结构和动态学特征的精确描 述。本发明的荧光化合物的合成方法合成方法简便、 毒性较小。 说 明 书 CN 104479392 A 3 2/3 页 4 附图说明 ： 0012 图 1 是本发明中背景技术结构示意图。 0013 图 2 是本发明最终产物的结构示意图。 0014 图 3 是本发明中反应示意图。 0015 图 4 是本发明中的最终合成物与 HPrK79C 蛋白在 pH 7.41。
9、0mM Tris 的体系在 25混合 4 小时后， 过脱盐柱除去小分子后收集的 HprK79C 的蛋白的激发发射图谱。其中 ： 虚线表示激发光谱， 实线表示发射光谱。 具体实施方式 ： 0016 下面结合附图， 对本发明作详细的说明。 0017 为了使本发明的目的、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合附图及具体实施 方式， 对本发明进行进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施方式仅用以解释本 发明， 并不用于限定本发明。 0018 具体实施方式一 ： 参看图1-图4， 本具体实施方式是采用以下技术方案 ： 它的合成 步骤如下 ： 0019 第一步， 反应一 ： 取 1 当量化合物。
10、 I 的钾盐与 1.2 当量的化合物 II 的钠盐， 加入 1.5 当量的氯乙酸酐， 室温搅拌 0.5 小时 ； 旋蒸除去溶剂， 柱层析， 用甲醇丙酮 1 7 洗 脱， 得到相应的化合物 III ； 0020 第二步， 反应二 ： 将所得到的1当量的化合物III与1.1当量的碘化钠在甲醇氯 仿 1 1 的溶剂中 60反应 24 小时， 过滤， 旋蒸除去溶剂， 得到对应的最终的产物 IV ； 经 核磁谱确认与目标产物吻合。 0021 所述的化合物 I 结构中， 对应的阳离子为钾离子或钠离子。 0022 所述的化合物 II 结构中， 对应的阳离子为钾离子或钠离子。 0023 所述的有机溶剂 1 为。
11、甲醇与氯仿的混合溶剂或者甲醇与二氯甲烷的混合溶剂。 0024 本具体实施方式具有以下有益效果 ： 将五甲川花菁素类的化合物引入了多个亲水 性的磺酸基团， 提高了水溶性 ； 进一步减少了连接位点与荧光基团的距离， 提高了探针的刚 性 ； 从而解决了目前蛋白质荧光探针水溶性差、 亲水基团与疏水基团分布不均匀、 连接基团 较长的问题 ； 该荧光化合物作为一种蛋白质巯基标记的探针， 可以有效降低背景荧光干扰， 提高信噪比， 同时， 该荧光探针的柔性较小， 有利于对生物大分子的结构和动态学特征的精 确描述。本发明的荧光化合物的合成方法合成方法简便、 毒性较小。 0025 具体实施方式二 ： 本具体实施方。
12、式与具体实施方式一不同之处在于 ： 它的合成步 骤如下 ： 0026 第一步， 反应一 ： 取 1 当量的化合物 I 的钠盐与 1.1 当量的化合物 II 的钠盐， 加入 2当量的氯乙酸酐， 加热搅拌0.6小时 ； 旋蒸除去溶剂， 柱层析， 用甲醇丙酮15洗脱， 得到相应的化合物 III ； 0027 第二步， 反应二 ： 将所得到的1当量的化合物III与1.5当量的碘化钠在甲醇氯 仿 1 2 的溶剂中 70反应 20 小时， 过滤， 旋蒸除去溶剂， 得到对应的最终的产物 IV ； 经 核磁显示与目标产物吻合。 0028 具体实施方式三 ： 本具体实施方式与具体实施方式一不同之处在于 ： 它的。
13、合成步 骤如下 ： 说 明 书 CN 104479392 A 4 3/3 页 5 0029 第一步， 反应一 ： 取化合物 I 的钾盐 0.40g 与 0.62g 的化合物 II 的钾盐， 溶加入 0.21g 的醋酸， 加热搅拌 1 小时 ； 旋蒸除去溶剂， 柱层析， 用甲醇丙酮 1 5 洗脱， 得到 相应的化合物 III ； 0030 第二步， 反应二 ： 将所得到的 0.42g 的化合物 III 与 0.11g 的碘化钠在甲醇 氯仿 1 10 的溶剂中 65反应 24 小时， 过滤， 旋蒸除去溶剂， 得到对应的最终的产物 IV0.42g ； 经核磁与质谱显示与目标产物吻合。 0031 对于。
14、本领域技术人员而言， 显然本发明不限于上述示范性实施例的细节， 而且在 不背离本发明的精神或基本特征的情况下， 能够以其他的具体形式实现本发明。 因此， 无论 从哪一点来看， 均应将实施例看作是示范性的， 而且是非限制性的， 本发明的范围由所附权 利要求而不是上述说明限定， 因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有 变化囊括在本发明内。 0032 此外， 应当理解， 虽然本说明书按照实施方式加以描述， 但并非每个实施方式仅包 含一个独立的技术方案， 说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见， 本领域技术人员应当 将说明书作为一个整体， 各实施例中的技术方案也可以经适当组合， 形成本领域技术人员 可以理解的其他实施方式。 说 明 书 CN 104479392 A 5 1/2 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104479392 A 6 2/2 页 7 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 104479392 A 7 。