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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410751886.3 (22)申请日 2014.12.10 G01N 21/71(2006.01) G01N 21/78(2006.01) G01N 33/53(2006.01) G01N 33/00(2006.01) (71)申请人 敖云霞 地址 550000 贵州省贵阳市云岩区北京路 4 号贵医 2006 级学生集体宿舍 (72)发明人 敖云霞 (74)专利代理机构 贵阳中新专利商标事务所 52100 代理人 程新敏 (54) 发明名称 一种初步探讨砷中毒大鼠肾损伤的敏感生物 学标志及其接触限值的方法 (57) 摘要 本发明公。
2、开了一种初步探讨砷中毒大鼠肾损 伤的敏感生物学标志及其接触限值的方法， 该方 法采用砷对大鼠进行经口亚慢性灌胃染毒， 采用 氢化物发生器 - 电感耦合等离子体离子发射光谱 法测定大鼠 UAs、 KAs， ELISA 法测定尿 U2-MG、 UAlB， 对 - 硝基苯酚比色法、 碱性苦味酸法、 脲酶 比色法分别测定 UNAG、 SCr、 BUN ； 以 UAs、 KAs 作为 暴露指标， 计算各肾损伤效应指标对应的 UAs 和 KAs 的基准剂量及其 95可信区间下限值， 以其 值筛选砷中毒大鼠肾损伤的敏感生物学标志及估 测其接触限值， 为砷中毒人群肾损伤生物接触限 值的探索提供了实验依据。 (。
3、51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 104502328 A (43)申请公布日 2015.04.08 CN 104502328 A 1/1 页 2 1.一种初步探讨砷中毒大鼠肾损伤的敏感生物学标志及其接触限值的方法， 其特征 在于 ： 该方法采用砷对大鼠进行经口亚慢性灌胃染毒， 采用氢化物发生器 - 电感耦合等 离子体离子发射光谱法测定大鼠尿砷 （UAs） 、 肾砷 （KAs） ， ELISA 法测定尿 2- 微球蛋白 (U2-MG） 、 尿白蛋白 (UAlB)， 对 - 硝基苯酚比色法、 碱性。
4、苦味酸法、 脲酶比色法分别测定尿 N- 乙酰 - D- 氨基葡萄糖苷酶 (UNAG)、 血肌酐 （SCr） 、 血尿素氮 (BUN） ； 以 UAs、 KAs 作为 暴露指标， 其余指标为肾损伤效应指标， 分析两者间的剂量效应关系 ； 计算各肾损伤效应 指标对应的 UAs 和 KAs 的基准剂量及其 95可信区间下限值， 以其值筛选砷中毒大鼠肾损 伤的敏感生物学标志及估测其接触限值。 2.根据权利要求 1 所述的一种初步探讨砷中毒大鼠肾损伤的敏感生物学标志及其接 触限值的方法， 其特征在于 ： SD 大鼠 40 只， 雌雄各半， 体重 80 100g 左右， 染毒前适应性 饲养 1 周， 自由。
5、进食饮水， 染毒前适应性饲养 1 周， 自由进食饮水。 3.根据权利要求 1 所述的一种初步探讨砷中毒大鼠肾损伤的敏感生物学标志及其接 触限值的方法， 其特征在于 ： 将大鼠分为 4 组 ： 正常对照组、 砷低剂量组、 砷中剂量组、 砷高 剂量组， 染砷剂量分别为 0mg/kg、 2.5mg/kg、 5.0mg/kg、 和 10.0mg/kg， 每组 10 只， 分笼喂 养 ； 其中正常对照组大鼠喂饲标准饲料 ； 各染砷组大鼠喂饲高砷煤烘烤的玉米粉与标准饲 料按比例配制的饲料， 喂养 90 天。 权 利 要 求 书 CN 104502328 A 2 1/5 页 3 一种初步探讨砷中毒大鼠肾损伤。
6、的敏感生物学标志及其接 触限值的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种初步探讨砷中毒大鼠肾损伤的敏感生物学标志及其接触限值的 方法， 属于卫生检测技术领域。 背景技术 0002 燃用高砷煤引起的砷中毒为中国特有的一种病型， 贵州省于 1976 年被确定为其 首个病区2。 相关研究显示砷中毒可导致多系统、 多器官病变， 鉴于肾脏为主要排毒器官， 当其受损时可影响体内砷及其代谢产物的排泄， 还可促进其蓄积， 导致肾脏在内的多器官 受损。目前， 临床上常选用尿素氮 （BUN） 、 血肌酐 （SCr） 等作为检测肾功能的指标， 以判断肾 损伤情况 ； 本课题组前期对砷中毒人群研究结果发现， 监测尿 。
7、2- 微球蛋白 (U2-MG） 、 尿 N- 乙酰 - D- 氨基葡萄糖苷酶 (UNAG) 、 尿白蛋白 (UAlB) 对判断早期肾损伤具有重要意 义。本实验以砷中毒大鼠肾脏毒性效应及其剂量效应关系为基础， 计算各肾损伤效应指 标对应的 UAs 和 KAs 的基准剂量及其 95可信区间下限值， 以其值筛选砷中毒大鼠肾损伤 的敏感生物学标志及估测其接触限值， 以达到快速、 灵敏、 早期发现肾损伤。 发明内容 0003 本发明的目的是 ： 提供一种初步探讨砷中毒大鼠肾损伤的敏感生物学标志及其接 触限值的方法， 能直观的发现肝脏的损害情况。 0004 本发明的技术方案 一种初步探讨砷中毒大鼠肾损伤的。
8、敏感生物学标志及其接触限值的方法， 该方法采用 砷对大鼠进行经口亚慢性灌胃染毒， 采用氢化物发生器 - 电感耦合等离子体离子发射光谱 法测定大鼠尿砷 （UAs） 、 肾砷 （KAs） ， ELISA 法测定尿 2- 微球蛋白 (U2-MG） 、 尿白蛋白 (UAlB)， 对 - 硝基苯酚比色法、 碱性苦味酸法、 脲酶比色法分别测定尿 N- 乙酰 - D- 氨基 葡萄糖苷酶 (UNAG)、 血肌酐 （SCr） 、 血尿素氮 (BUN） ； 以 UAs、 KAs 作为暴露指标， 其余指标为 肾损伤效应指标， 分析两者间的剂量效应关系 ； 计算各肾损伤效应指标对应的 UAs 和 KAs 的基准剂量及。
9、其 95可信区间下限值， 以其值筛选砷中毒大鼠肾损伤的敏感生物学标志及 估测其接触限值。 0005 前述的一种初步探讨砷中毒大鼠肾损伤的敏感生物学标志及其接触限值的方法 中， SD 大鼠 40 只， 雌雄各半， 体重 80 100g 左右， 染毒前适应性饲养 1 周， 自由进食饮水， 染毒前适应性饲养 1 周， 自由进食饮水。 0006 前述的一种初步探讨砷中毒大鼠肾损伤的敏感生物学标志及其接触限值的方法 中， 将大鼠分为 4 组 ： 正常对照组、 砷低剂量组、 砷中剂量组、 砷高剂量组， 染砷剂量分别为 0mg/kg、 2.5mg/kg、 5.0mg/kg、 和 10.0mg/kg， 每组 。
10、10 只， 分笼喂养 ； 其中正常对照组大鼠 喂饲标准饲料 ； 各染砷组大鼠喂饲高砷煤烘烤的玉米粉与标准饲料按比例配制的饲料， 喂 养 90 天。 说 明 书 CN 104502328 A 3 2/5 页 4 0007 由于采用了上述技术方案， 与现有技术相比， 由于砷中毒大鼠肾脏毒性效应及其 剂量效应关系为基础， 计算各肾损伤效应指标对应的 UAs 和 KAs 的基准剂量及其 95可 信区间下限值， 以其值筛选砷中毒大鼠肾损伤的敏感生物学标志及估测其接触限值， 其对 早期发现砷中毒肾损伤与原始检测方法对比更具价值， 并为砷中毒人群肾损伤生物接触限 值的探索提供了实验依据。 0008 具体实施。
11、方式下面对本发明进一步的详细说明， 但不作为对本发明的任何限制。 0009 本发明的实施例 ： 1 材料与试剂 1.1 实验对象 健康 Wistar 大鼠 40 只， 雌雄各半， 体重 80 100g 左右。 0010 1.2 主要试剂 盐酸， 尿素， 碘化钾， 氢氧化钠， 硼氢化钠， 硫酸， 高氯酸， 草酸铵， 硝酸 （以上试剂均为分 析纯） ； 血清 BUN、 SCr 检测试剂盒均购自中生北控生物科技股份有限公司 ； UNAG、 U2-MG、 UAlB、 UCr 检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。 0011 1.3 主要仪器 MPX 型电感耦合等离子体离子发射光谱仪 （ICP-OES。
12、） ； VGA-77 型氢化物发生器 （HG） ； AG285 型电子天平 ； Milli-Q Synthesis 纯水仪。 0012 2 方法 2.1 实验动物分组及染砷 将大鼠分为 4 组 ： 正常对照组、 砷低剂量组、 砷中剂量组、 砷高剂量组， 染砷剂量分别为 0mg/kg、 2.5mg/kg、 5.0mg/kg、 和 10.0mg/kg， 每组 10 只， 分笼喂养 ； 其中正常对照组大鼠 喂饲标准饲料 ； 各染砷组大鼠喂饲高砷煤烘烤的玉米粉与标准饲料按比例配制的饲料， 喂 养 90 天， 期间自由饮用自来水 ； 饲养环境 ： 温度 22-24 ； 湿度 60-70%。 0013 2。
13、.2 观察内容和方法 2.2.1 收集尿液 在处死大鼠前禁食 24h， 收集 24h 尿液， 保存于 -20冰箱， 待测。 0014 2.2.2 处死大鼠 0.9戊巴比妥麻醉大鼠后处死大鼠， 取出一侧肾脏， 轻除去表面的凝血及结蒂组织等 附属物， 再经冰冷生理盐水洗涤几次， 用滤纸吸干水份， 保存于 -20冰箱， 待测。 0015 2.2.3 尿砷 （UAs） 和肾砷 （KAs） 的检测 2.2.3.1 采用 HG-ICP-OES 检测 UAs、 KAs 含量 取尿 （0.5ml） 或肾脏 （0.5g） 于干净三角烧瓶 ； 取硝酸 1.8ml、 硫酸 1.2ml（尿液） 或硝酸 3ml、 硫酸。
14、 2ml（肾组织） 于三角烧瓶中， 置 于电热板上加热至液体清透 ； 待室温冷却后， 用去离子水将液体转移至 25ml 棕色容量瓶并定容 ； 采用 HG-ICP-OES 分别测定 UAs、 KAs 含量。 0016 2.2.4 肾损伤效应指标检测 2.2.4.1 采用对 - 硝基苯酚比色法测定 UNAG 含量 ； 2.2.4.2 采用 ELISA 法测定 U2-MG 含量 ； 说 明 书 CN 104502328 A 4 3/5 页 5 2.2.4.3 采用 ELISA 法测定 UAlB 含量 ； 2.2.4.4 采用碱性苦味酸法测定 SCr 含量 ； 2.2.4.5 采用脲酶比色法测定 BU。
15、N 含量。 0017 2.2.5 BMD 和 BMDL 的计算 2.2.5.1 应用可信区间衡量变异因素， 以正常对照组各效应指标的 95上限作为正 常参考值上限。当大鼠各肾损伤效应指标小于该值时， 判为正常 (-)， 反之为异常 (+)， 据此 将数据进行二分变量处理作为效应终点。通过卡方 （X2） 检验， 选择异常发生率具有统计学 意义的肾损伤效应指标进行 BMD 及 BMDL 计算。 0018 2.2.5.2 因 10% 反应率接近大多数非癌症生物鉴定的敏感限值， 则本次以 10 反应率计算砷中毒大鼠 UAs、 KAs 的 BMD 和 BMDL。 0019 2.2.5.3 计算 BMD 。
16、及 BMDL， 选择 AIC 值最小的模型为最适合的剂量反应模型。 0020 2.2.5.4 依据 BMDL 大小判断肾功能指标敏感性， BMDL 越小该指标相对越敏感 ； BMDL 最小值作为砷中毒大鼠肾损伤的接触限值。 0021 2.3 统计学处理 所有资料进行正态性检验， 方差齐性分析。 多组间均数比较采用单因素方差分析， 率的 比较采用趋势 X2 检验， 各指标间的相关分析采用 Spearman 等级相关或 pearson 相关， 检验 水准 =0.05。 0022 3. 结果 3.1 暴露指标检测结果 各剂量组大鼠 UAs、 KAs 均显著高于对照组 (P0.05) ； 砷低剂量组 。
17、UNAG 与对照组相比， 差 异有统计学意义 （P0.05) ； 砷中剂量组 U2-MG、 UNAG 均高于对照组 （P0.05) ； 砷高剂量 组 UNAG 与砷低剂量组比较， 差异有统计学意义 （P0.05)， 见表 2。 说 明 书 CN 104502328 A 5 4/5 页 6 0024 3.3 暴露指标与效应指标间的相关性分析 UAs 与 KAs 呈正相关关系， 差异有统计学意义 (P0.01) ； UAs、 KAs 与各肾功能指标之间 存在明显的正相关关系 (P0.05 或 P0.01)。 0025 3.4BMD 和 BMDL 计算结果 选择异常发生率有统计学意义的肾损伤效应指标。
18、， 采用BMDS V 2.1.2计算其各自对应 UAs、 KAs 的 BMD 和 BMDL， 见表 5。 说 明 书 CN 104502328 A 6 5/5 页 7 0026 4. 讨论 较多研究表明， 肾脏是环境毒物的主要靶器官之一， 当其受损伤时会影响砷及其代谢 产物的排出或蓄积， 造成严重的健康损害。在此基础上， 本次实验研究以 UAs、 KAs 作为暴露 指标， SCr、 BUN、 U2-MG、 UAlB、 UNAG 为肾损伤效应指标， 观察以上各指标的变化及其剂量 效应关系， 筛选砷中毒大鼠肾损伤的敏感生物学标志及估测其接触限值， 为砷中毒患者的 肾毒性研究提供实验依据。 0027。
19、 UAs 作为暴露指标可反映近期砷的暴露水平， KAs 可反映砷在肾脏的蓄积状况。本 次实验结果显示， 各染砷组大鼠 UAs、 KAs 含量均高于正常对照组 （P0.05） ， 表明随着砷接 触量的增加， 机体吸收的砷逐渐增多， 尿液中砷的排泄量升高， 肾脏砷负荷增加， 蓄积于肾 脏中的砷也增多 BUN 和 SCr 是临床常用于反映肾功能的指标， 本课题组前期对砷中毒人群 研究发现， BUN 和 SCr 正常的砷暴露者或患者， 其 UNAG、 U2-MG、 UAlB 出现异常改变， 提示 监测 UNAG、 U2-MG、 UAlB 对判断早期肾损伤有重要意义。本实验研究采用上述指标作为砷 中毒大。
20、鼠肾损伤效应指标， 结果发现， 与正常对照组相比， 砷中、 高剂量组大鼠除 SCr 外， 余 指标含量显著升高 （P0.05。将 UAs、 KAs 与肾损伤效应指标进行相关性分析， 结果发现随 UAs、 KAs 的增加， 各效应指标水平也逐渐增高， 并具有明显的剂量效应关系， 鉴于其 UAs 与KAs间也存在显著正相关， 提示监测UAs并结合肾损伤效应指标的变化情况， 对判断砷中 毒肾损伤具有应用价值。 0028 本实验研究拟合最佳的剂量反应模型得出相应的 BMD 和 BMDL， 当以 UAs 为暴 露指标时， U2-MG、 UNAG、 UAlB 对应的 BMD 和 BMDL 分别为 998.。
21、9g/gCr 和 660.5g/gCr、 1213.5g/gCr 和 803.6g/gCr、 1386.9g/gCr 和 909.4g/gCr ； 以 KAs 为 暴 露 指 标 时， U2-MG、 UNAG、 UAlB对应的BMD和BMDL分别为1.48g/g和0.94g/g、 3.54g/g和2.35g/ g、 1.50g/g 和 1.08g/g， 可初步认为当砷中毒大鼠上述指标大于相应的 BMDL 时有可能引 起肾功能损伤。根据 BMDL 的大小， 以 UAs、 KAs 为暴露指标， 肾损伤效应指标的敏感性依次 均为 ： U2-MG UAlB UNAG， 提示 U2-MG 是评价砷中毒大鼠肾损伤的相对最敏感生物 学标志， 但联合监测 U2-MG、 UNAG、 UAlB 对早期发现砷致肾损伤更具价值 ； 动态观察它们 的变化可较全面了解砷中毒大鼠肾损伤程度。以各效应指标对应 UAs、 KAs 的 BMD 和 BMDL 最小值确定砷中毒大鼠肾损伤的接触限值， 得到其 UAs 接触限值为 660.5g/gCr， KAs 的接 触限值为 0.942g/g ； 鉴于该实验研究染砷剂量设计是根据病区患者暴露量、 结合亚慢性 动物实验计算而得， 故此接触限值可为砷中毒患者肾损伤的相关研究提供实验依据。 说 明 书 CN 104502328 A 7 。