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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410803217.6 (22)申请日 2014.12.22 G01N 33/66(2006.01) G01N 21/78(2006.01) (71)申请人 宁波美康生物科技股份有限公司 地址 315104 浙江省宁波市鄞州中心区启明 南路 299 号 (72)发明人 邹炳德 邹继华 汪屹 贾江花 (74)专利代理机构 宁波市鄞州甬致专利代理事 务所 ( 普通合伙 ) 33228 代理人 代忠炯 (54) 发明名称 检测人血液中 1,5- 脱水山梨醇的试剂盒 (57) 摘要 本发明公开一种检测人血液中 1,5- 脱水 山梨醇的试剂盒。
2、， R1 ： 缓冲液 20 200mM4- 氨 基 安 替 比 林 1 10mMATP0.2 2mMPEP1 10mM,ATP-HK 150KU/L,丙酮酸激酶150KU/ L抗坏血酸氧化酶150KU/L钒酸钠0.0510mM 表面活性剂0.015稳定剂0.110防腐剂 0.01 1 ； R2: 缓冲液 20 200mM， TOOS 1 10mM， POD 1 100KU/L， PROD 10 200KU/L， 表 面活性剂0.015， 稳定剂0.110， 防腐剂 0.01 1。具有效防止葡萄糖、 胆红素、 抗坏血 酸、 血脂等内源性干扰， 稳定性好的优点。 (51)Int.Cl. (19)中。
3、华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书9页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104483487 A (43)申请公布日 2015.04.01 CN 104483487 A 1/2 页 2 1.一种检测人血液中 1,5- 脱水山梨醇的试剂盒， 其特征在于 ： 该试剂盒包含试剂 1 和 试剂 2， 上述两试剂中的各组分和含量包括 ： 试剂 1 ： 试剂 2 ： 2.根据权利要求 1 所述的检测人血液中 1,5- 脱水山梨醇的试剂盒， 其特征在于 ： 该试 剂盒包含试剂 1 和试剂 2， 上述两试剂中的各组分和含量包括 ： 试剂 1 ： 权 利 要 求 书 CN。
4、 104483487 A 2 2/2 页 3 试剂 2 ： 3.根据权利要求 1 或 2 所述的检测人血液中 1,5- 脱水山梨醇的试剂盒， 其特征在于 ： 所述的缓冲液为磷酸缓冲液， Tris-HCl 缓冲液， MES， MOPS， HEPES 中的一种。 4.根据权利要求 1 或 2 所述的检测人血液中 1,5- 脱水山梨醇的试剂盒， 其特征在于 ： 所述表面活性剂为 SDS， 吐温， 曲拉通， 司班， Brij35 中的一种。 5.根据权利要求 1 或 2 所述的检测人血液中 1,5- 脱水山梨醇的试剂盒， 其特征在于 ： 所述稳定剂为海藻糖， 蔗糖， 甘露醇中的一种。 6.根据权利要求。
5、 1 或 2 所述的检测人血液中 1,5- 脱水山梨醇的试剂盒， 其特征在于 ： 所述防腐剂为叠氮钠， proclin300， G418， 苯甲酸钠中的一种。 7.根据权利要求 1 所述检测人血液中 1,5- 脱水山梨醇的试剂盒， 其特征在于， 试剂 1 中还含有 0.1 100mM 钾离子， 或者 0.1 100mM 镁离子。 8.根据权利要求 1 所述检测人血液中 1,5- 脱水山梨醇的试剂盒， 其特征在于， 试剂 1 和试剂 2 中的缓冲液的 pH 值为 5.0 9.0。 权 利 要 求 书 CN 104483487 A 3 1/9 页 4 检测人血液中 1,5- 脱水山梨醇的试剂盒 技。
6、术领域 0001 本发明涉及医学检验技术领域， 具体涉及一种检测人血液中 1,5- 脱水山梨醇的 试剂盒。 背景技术 0002 糖尿病属于临床常见病、 多发病， 原因是胰岛素分泌不足引起， 血液中 1， 5- 脱水 山梨醇 (1， 5-AG) 与葡萄糖 (GLU)、 糖化血红蛋白 (HbAlc)、 糖化白蛋白 (GA) 呈显著的负相 关。有资料表明， 血浆葡萄糖 (GLU) 8.3mmol/L 者， 无一例伴有高水平的血浆 1， 5- 脱水 山梨醇 (1， 5-AG)。 0003 1， 5- 脱水山梨醇 (1， 5-AG) 与现有的糖尿病指标均呈现出显著的负相关， 血液 中 1， 5- 脱水葡。
7、萄糖醇的减少程度与糖尿病的严重程度显著相关。1， 5- 脱水葡萄糖醇 (1， 5-AG) 与其他指标最显著的区别是反映糖尿病病情变化的周期不同， 血糖 (GLU) 反映 病人当时血糖状况， 糖化白蛋白 (GA) 反应病人半个月内血糖的平均状况， 糖化血红蛋白 (HbAlc)反映病人最近23个月左右的血糖平均水平， 而1， 5-脱水葡萄糖醇(1， 5-AG)可 以反映近几天至 1 周的平均血糖水平。 0004 测定 1， 5- 脱水山梨醇有高效液项色谱、 微柱层析法、 化学发光法等。这些方法比 较准确， 但操作费事难以批量检测， 并且这些方法只能现配现用， 不能长期保存。而酶法测 定由于其无污染。
8、， 并可试用与生化仪， 操作简单等特点， 有利于大规模推广。目前国内外主 要采用酶法测定 1， 5- 脱水山梨醇 (1， 5-AG)， 主要有氧化酶法与脱氢酶法两种方法。氧化 酶法的原理为， 通过吡喃糖氧化酶 (PROD) 催化 1， 5- 脱水山梨醇 (1， 5-AG) 生成 1， 5- 脱水 果糖和 H2O2， H2O2在过氧化物酶的作用下使 4-AAP 和 TOOS 反应生成醌类有色物质。脱氢酶 法的原理为 ： 1， 5- 脱水山梨醇在 ADP 依赖性己糖激酶 (ADP-HK) 的作用下生成 AG-6 磷酸 (AG-6-P)。AG-6-P 再和 NADP 进行反应， 生成 NADPH。N。
9、ADPH 具有还原性， 和显色剂作用生 成显色物质。 但目前市场上的酶法试剂盒存在着稳定性差， 易受葡萄糖、 胆红素、 抗坏血酸、 血脂等内源性干扰。 发明内容 0005 本发明针对现有技术的上述不足， 提供一种能有效防止葡萄糖、 胆红素、 抗坏血 酸、 血脂等内源性干扰， 稳定性好的检测人血液中 1,5- 脱水山梨醇的试剂盒。 0006 为了解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案为 ： 一种检测人血液中 1,5- 脱水 山梨醇的试剂盒， 该试剂盒包含试剂 1 和试剂 2， 试剂 1 和试剂 2 中的组分和含量包括 ： 0007 试剂 1 ： 0008 说 明 书 CN 104483487 。
10、A 4 2/9 页 5 0009 试剂 2 ： 0010 0011 0012 作为优选， 本发明上述的试剂盒， 其中试剂 1 和试剂 2 中的各组分和含量包括 ： 0013 试剂 1 ： 0014 说 明 书 CN 104483487 A 5 3/9 页 6 0015 试剂 2 ： 0016 0017 0018 本发明上述的缓冲液为磷酸缓冲液， Tris-HCl缓冲液， MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)， MOPS(3-(N- 吗啉基 ) 丙磺酸 )， HEPES( 羟乙基哌嗪乙硫磺酸 ) 中的一种。 0019 本发明所述表面活性剂为 SDS( 十二烷基硫酸钠 )， 吐温， 曲拉通， 司班， 。
11、Brij35 中 的一种。 0020 本发明所述稳定剂为海藻糖， 蔗糖， 甘露醇中的一种。 0021 本发明所述防腐剂为叠氮钠， proclin300， G418( 遗传霉素 )， 苯甲酸钠中的一种。 说 明 书 CN 104483487 A 6 4/9 页 7 0022 本发明还提供一种利用上述试剂盒测定血液中 1， 5- 脱水山梨醇的方法， 该方法 是依据氧化酶法为基础， 利用吡喃糖氧化酶(PROD)催化1， 5-脱水山梨醇(1， 5-AG)生成1， 5- 脱水果糖和 H2O2， H2O2在过氧化物酶的作用下使 4-AAP 和 TOOS 反应生成醌类有色物质。 利用比色分析原理可以得出血液。
12、中 1， 5- 脱水山梨醇 (1， 5-AG) 水平 ； 0023 其原理示意如下 ： 0024 0025 本发明所述的缓冲液可以为磷酸缓冲液， Tris-HCl 缓冲液， MES， MOPS， HEPES 中的 一种， 经试验证明， 其在合适的浓度范围内均有良好的反应， 例如当缓冲液的浓度在 20 200mM 之间时， 其能够提高合适的缓冲能力， 同时又有较高的酶活反应。另外对于缓冲液的 pH 值， 通过试验发现， 在 pH 处于 5.0 9.0 之间时， 酶处于合理的 pH 范围中， 其稳定性好， 试剂盒的灵敏度高。 0026 本发明提供的测定 1,5- 脱水山梨醇的方法， 具有排除血液更。
13、高浓度葡萄糖影响 的能力， 其原理是， 利用了酶法将样本中的葡萄糖先消除反应掉， 使得 PROD 只能与 1,5- 脱 水山梨醇反应。在这一点上专利 CN 102154442A 是利用己糖激酶将葡萄糖催化生成葡萄 糖 6 磷酸和一磷酸腺苷， 再用磷酸己糖异构酶将葡萄糖 6 磷酸转换成果糖 6 磷酸， 再利用 6 磷酸果糖异构酶将果糖 6 磷酸转换成果糖 1,6 二磷酸， 从而去除葡萄糖干扰。而专利 CN 102175670B 中则是用葡萄糖氧化酶将葡萄糖氧化成葡萄糖酸内酯和过氧化氢， 再利用过氧 化氢酶将过氧化氢分解， 以去除葡萄糖干扰。而本发明专利的原理完全不同于上述现有技 术的两种， 创造。
14、性的先是利用己糖激酶将葡萄糖和 ATP 催化生成葡萄糖 6 磷酸和 ADP， 再利 用丙酮酸激酶将ADP和磷酸烯醇式丙酮酸催化生成ATP和丙酮酸， 进而消除葡萄糖干扰。 本 发明相对于上述两现有技术， 具有彻底去除葡萄糖干扰， 同时成本低廉的优势， 本发明的反 应原理如下 ： 0027 0028 为了更有效地去除葡萄糖的干扰， 可在试剂 1 中加入 0.1 100mM 钾离子， 或者 0.1 100mM 镁离子。以此激活丙酮酸激酶， 能更有效地去除 ADP， 从而使反应向消除葡萄 糖的方向进行。本发明的试剂 1 中还含有 0.1 100mM 钾离子， 或者 0.1 100mM 镁离子， 所述钾。
15、离子为 KCl， 所述镁离子为 MgCl2。 0029 本发明所提供的试剂盒具有良好的抗干扰性能， 包括抗维生素 C 干扰， 抗胆红素 干扰等。由于本发明的试剂 2 中添加了抗坏血酸氧化酶 ( 维生素 C 氧化酶 )， 能够使得样本 中的维生素C能够以极快的速度被氧化分解掉， 进而不会影响后续的Tridner反应， 使得维 生素 C 对检测系统的干扰被彻底排除在外。这里所述的抗坏血酸氧化酶应当具有合理的浓 度， 例如 1 50KU/L 之间， 才能使得维生素 C 被快速地氧化分解掉。 说 明 书 CN 104483487 A 7 5/9 页 8 0030 对于临床检验来说胆红素干扰一直是一个头。
16、痛的问题， 会使得检验结果不准确。 人们通过不同的方式提出改进， 例如专利 CN 102175670B 中提出利用亚铁氰化钾和表面活 性剂的组合能够有效地去除胆红素干扰。本发明所提供的试剂盒由于利用了偏钒酸 钠和 表面活性剂的组合， 出人意料地发现， 其抗胆红素干扰的性能尤其良好。发现， 当偏钒酸钠 在 0.05 10mM 之间， 表面活性剂在 0.01 5之间时， 其抗胆红素干扰作用明显。这里所 述的表面活性剂可以是 SDS， 吐温， 曲拉通， 司班， Brij35 中的一种。 0031 本发明所提供的试剂盒中， 含有稳定剂和防腐剂， 所述稳定剂可以是海藻糖， 蔗 糖， 甘露醇中的一种或几种。
17、， 所述防腐剂可以是叠氮钠， proclin300， G418， 苯甲酸钠中的一 种或几种。这使得试剂盒具有良好的稳定性。 0032 本发明的创新点在于以下几个方面， 首先， 利用里己糖激酶和丙酮酸激酶系统， 以 除去样本中葡萄糖的干扰 ； 其次， 利用抗坏血酸氧化酶去除维生素干扰， 利用偏钒酸钠和表 面活性剂的组合去除胆红素干扰 ； 最后， 利用稳定剂和防腐剂提高了试剂盒稳定性， 延长了 试剂盒有效期。 0033 使用本发明提供的检测试剂测定血液中 1， 5- 脱水山梨醇 (1， 5-AG) 含量， 具有操 作简单、 安全， 具有特异性好、 灵敏度高等特点， 并且试剂 1 与待测样本先作用几。
18、分钟后即 可清除血液中葡萄糖， 维生素 C， 胆红素等的干扰， 有效提高了本发明试剂检测的特异性和 准确度。为临床提供准确有效的诊断信息。可以很好有效地作为糖尿病检测的重要指标。 附图说明 0034 图 1 实施例 1( 配方 1) 与对照试剂测定对比图。 0035 横坐标为按照配方1进行配制的试剂来测定40份血清样本的值， 纵坐标为进口的 试剂盒 (GlycoMark) 测定相同 40 份血清样本的值。由图可知， 本试剂与进口试剂具有良好 相关性， 测样本值准确。 具体实施方式 0036 下面通过实施例进一步详细描述本发明， 但本发明不仅仅局限于以下实施例。 0037 实施例一 0038 1。
19、,5- 脱水山梨醇检测试剂的配制。 0039 1、 按照下表 1 的配方进行配制 0040 表 1 1,5- 脱水山梨醇检测试剂配方 0041 说 明 书 CN 104483487 A 8 6/9 页 9 0042 说 明 书 CN 104483487 A 9 7/9 页 10 0043 2、 制备1， 5-脱水山梨醇校准品、 质控品 ： 称所需量纯品(Sigma公司购买)溶于纯 净水中， 并加入 0.1的叠氮钠做防腐剂， 封闭储存备用。 0044 3、 在全自动生化仪上设定如下参数 ： 反应 10min， 反应温度 37， 主波长 546nm， 副 波长 700nm， 样本 ： 试剂 1 ：。
20、 试剂 2 6ul ： 180ul ： 60ul， 反应类型 ： 终点法。 0045 实施例二 0046 1,5- 脱水山梨醇检测试剂盒性能验证 0047 1、 灵敏度与精密度试验 0048 用浓度为 152.3uM 的 1， 5AG 纯品作为标准品， 进行测试 , 其中 S1 点为水， S2 0049 点为 152.3uM 的 1,5AG， 具体见表 2 ： 0050 表 2 0051 吸光度 (S1) 吸光度 (S2) 配方 1 0.0122 0.0648 配方 2 0.0118 0.0639 配方 3 0.0128 0.0650 0052 表 3 精密度检测 0053 批内精密度 批间精。
21、密度 配方 1 2.5 3.8 配方 2 3.1 4.2 配方 3 3.6 4.9 0054 2、 抗干扰性能见表 4 0055 表 4 0056 说 明 书 CN 104483487 A 10 8/9 页 11 0057 0058 由上表可以看出， 以下干扰物质对本试剂盒无明显干扰 ： 维生素 C 小于 20mg/dL， 结合胆红素小于 30mg/L， 非结合胆红素小于 20mg/L， 葡萄糖小于 30mmol/L， 血红蛋白小于 200mg/dL。因此本发明所提供的试剂盒具有良好的抗干扰性能。 0059 对比试验见图 1 0060 以本发明的配方 1 试剂为例， 选用进口的 1,5AG 试剂盒 (GlycoMark) 作为对照试 剂， 分别同时测定 40 个随机样本。由上可知， 本发明试剂盒与对照试剂盒具有良好的相关 性， 相关系数达 0.998。 0061 3、 稳定性试验， 见表 5 0062 表 5 说 明 书 CN 104483487 A 11 9/9 页 12 0063 0064 由上表可以看出， 试剂盒在 37， 7 天后， 空白吸光度 (S1) 变化不明显， 同时灵敏 变化也不大， 由此可以看出试剂盒具有良好的稳定性。 说 明 书 CN 104483487 A 12 1/1 页 13 图 1 说 明 书 附 图 CN 104483487 A 13 。